赵亚华版基础分子生物学复习资料.doc

1、 DNA、RNA的一级结构，二级结构2、 DNA的变性、复性特点，影响因素3、 翻译的步骤，参与的蛋白质因子，GTP计算4、 tRNA的结构，几种主要的稀有碱基，校正tRNA的原理5、 PCR的原理，发明人，Nobel prize time6、 China contribution in Human genome project我国于1999年参与人类基因组计划，承担其中1%的测序任务。7、 Structure and organization of bacterium promoter(细菌启动子) Promoter启动子：是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列位点。启动子本身不被转录。 细菌启动子普遍具有以下基本特征：含有转录起始点，-10序列、-35序列以及在-10序列与-95序列之间较严格的距离。 启动子区域的功能：-35区序列可增强启动子与聚合酶因子的识别作用。-10区序列对于DNA解旋作用十分重要。起始位点附近的序列影响转录的起始效率。8、 SD sequence （SD序列）书P331细菌的mRNA通常含有一段富嘌呤碱基的序列，称作SD序列。位于起始AUG序列上游10个碱基左右的区域，能与细菌16s核糖体RNA 3端反SD序列7个嘧啶碱基进行互补识别,以帮助从起始AUG处开始翻译.一般为AGGA或GGAG。9、 乳糖操纵子的原理，色氨酸衰减子的原理乳糖操纵子机制： 培养基中没有乳糖时，存在操纵子上游的调节基因编码表达的阻遏蛋白结合到操纵子的操纵基因上，组织了结构基因于的表达（即不能调节基因编码表达的阻遏蛋白所阻遏）不能合成乳糖代谢的酶。当转到乳糖培养基中时，由于诱导物分子结合在阻遏蛋白的特异部位，引起阻遏蛋白的构像变化，不能结合到操纵基因上，使RNA聚合酶能够正常催化转录存在于操纵子上的基因，即操纵子诱导表达，-半乳糖苷酶分子数量迅速增加。 乳糖操纵子的结构：长约5000个碱基对，有3个结构基因，分别为lacZ、lacY、lacA，可编码3种酶。 色氨酸衰减子（弱化子）的原理（色氨酸操纵子转录的弱化效应） 衰减子对RNA聚合酶转录的终止依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置，而细胞中Trp存在与否，决定了mRNA转录的弱化子结构，使弱化子中1.2.3.4区域呈现竞争性配对，从而产生了弱化效应乳糖操纵子结构和功能：细菌相关功能的结构基因常连在一起，形成一个基因簇。它们编码同一个代谢途径中的不同的酶。一个基因簇受到同一的调控，一开俱开，一闭俱闭。也就是说它们形成了一个被调控的单位，其它的相关功能的基因也包括在这个调控单位中，例如编码透过酶的基因，虽它的产物不直接参与催化代谢，但它可以使小分子底物转运到细胞中。乳糖分解代谢相关的三个基因，lacZ、Y、A就是很典型的是上述基因簇。它们的产物可催化乳糖的分解，产生葡萄糖和半乳糖。它们具有顺式作用调节元件和反式作用调节基因。三个结构基因图的功能是：lacZ编码-半乳糖苷酶，此酶由500kd的四聚体构成，它可以切断乳糖的半乳糖苷键，而产生半乳糖和葡萄糖lacY编码一半乳糖苷透性酶，这种酶是一种分子量为30kDd膜结合蛋白，它构成转运系统，将半乳糖苷运入到细胞中。lacA编码-半乳糖苷乙酰转移酶，其功能只将乙酰-辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上。无论是lacZ发生突变还是lacY发生突变却可以产生lac-型表型，这种lac表型的细胞不能利用乳糖。 lacZ-突变体中半乳糖苷酶失去活性，直接阻止了乳糖的代谢。lacY-突变体不能从膜上吸取乳糖。这一个完整的调节系统包括结构基因和控制这些基因表达的元件，形成了一个共同的调节单位，这种调节单位就称为操纵子（opron）。操纵子的活性是由调节基因控制的，调节基因的产物可以和操纵子上的顺式作用控制元件相互作用。lacZ、Y、A基因的转录是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白所控制。lacI一般和结构基因相毗连，但它本身具有自己的启动子和终止子，成为独立的转录单位。由于lacI的产物是可溶性蛋白，按照理说是无需位于结构基因的附近。它是能够分散到各处或结合到分散的DNA位点上（这是典型的反式-作用调节物。）通过突变的效应是可以将结构基因和调节基因相区别的，结构基因发生突变，细胞中就失去这些基因合成的蛋白。但是调节基因发生突变会影响到它所控制的所有结构基因的表达。调节蛋白的突变的结果可以显示调节的类型。lac基因簇是受到负调节（negative regulation）。它们的转录可被调节蛋白所关闭。若调节蛋白因突变而失活就会导致结构基因组成型表达。表明调节蛋白的功能是阻止结构基因的表达，因此称这些蛋白为“阻遏”蛋白。乳糖操纵子的阻遏蛋白是由4个亚基（38kDa）组成的四聚体。一个野生型细胞中大约有10个四聚体。调节基因转录成单顺反子的mRNA，它和操纵子的比率与RNA聚合酶和启动子之比是相似的。lacI的产物称为lac阻遏物（lac repressor），其功能是和lacZ、Y、A基因簇5端的操纵基因（Olac）,操纵基因位于启动子(Plac)和结构基因（lac2yA）之间。当阻遏物结合在操纵基因上时就阻碍了启动子上的转录起始。Olac从mRNA转录起始点的上游-5处延伸到转录单位+21处。这样它和启动子的末端发生重叠。新近的观点认为阻遏物影响了RNA聚合酶，从操纵基因和启动子二者相关位置来看阻遏物结合在DNA上会阻碍RNA聚合酶转录结构基因。但我们必须注意其它一些操纵子上的操纵基因其位置和乳糖操纵子并不相同，因而阻遏蛋白可以通过多种方式与操纵操纵基因结合阻断转录。色氨酸衰减子：当细胞中色氨酸含量高时，一般是不会合成色氨酸的，在转录水平就会中止，但有时候阻遏蛋白实效或其他原因导致合成色氨酸的转录开始，由于原核生物的转录与翻译是耦联的，在进行翻译时，色氨酸操纵子使转录的好的DNA片段结构发生变化，使转录中止。意义：转录水平上的调节，控制转录10、 Components and functions of protein factors in DNA replication复制的起始1.螺旋的松弛与解链拓扑异构酶-能改变DNA空间构像的酶 作用：DNA复制时松弛超螺旋，以利复制叉的行进及DNA合成，合成后再引向超螺旋。功能：不清楚，可催化体外拓扑异构化反应，拓扑异构酶分两型。拓扑异构酶I （topoisomerase- I ）作用：松弛超螺旋，不需ATP, 作用机制：切开环状一条链、打结与解结原核：拓扑异构酶I对负超螺旋作用正超螺旋 真核：拓扑异构酶I对正、负超螺旋均有作用。拓扑异构酶-旋转酶（gyrase）作用：松弛超螺旋，作用机制： 切开环状两条链、打结与解结、环连与解环连解链酶 （helicase）-复制蛋白rep 作用：ATP供能时，解开DNA双链。 原核：编码解链酶的基因是dnaB。前导链结合rep蛋白，随从链结合解链酶II、单链结合蛋白（SSB）作用：SSB与解开DNA单链结合，保护稳定DNA。与新复制DNA单链结合，以防其降解。螺旋松弛与解链过程如图所示2.引发引物酶（primase）作用：以DNA为模板，自53合成RNA小片段约十几到几十个核苷酸， 3末端为-OH。原核：dnaG基因编码DnaG蛋白即引物酶。引发前体（preprimosome） 由多种蛋白因子组成复合物。作用：合成RNA引物，沿随从链复制叉的行进方向移动，在不同部位，合成RNA引物。小结：合成RNA引物，在引物3-OH末段进行DNA片段合成。 DNA链的延长反应体系：DNA模板，DNA聚合酶，dNTP，引物，Mg2+反应式：DNA+dNTP（DNA）n+1+ppi真核与原核中DNA聚合酶（DNA polymorase-DNApol）：有几种类型，作用方式相同，但各具特性及功能。1.大肠杆菌DNA聚合酶（3种）pol I：催化53的聚合作用，合成20个核苷酸即离开模板，填充空隙。35外切酶活性，去除错误碱基，有校对作用。53外切酶活性，去除RNA引物及修正错误碱基。pol II：催化53 DNA合成并具有35外切酶活性，体内功能不清楚。pol : DNA链延长起主要作用，细菌中以1000dNTP/秒进行聚合反应。 35外切酶活性，校对作用，与pol I配合使错误率降至10-6。如图所示DNA复制的保真性：遵守严格的碱基配对规律。-聚合酶对碱基的选择功能。聚合酶对错误碱基的校读作用。以上三种作用确保了DNA复制的准确性。2、真核生物DNA聚合酶特性与大肠杆菌相似，共五种：、pol：催化前导链及随从链的合成，需增殖细胞核抗原蛋白PCNA的参与。pol：与引发酶配合，参与随从链的合成。 RFA（replication factor A）：DNA延长中RFA与单链结合起到SSB的作用。终止：连接酶（ligase）：使相邻的DNA片段,以3,5磷酸二酯键相连，需ATP供能。 11、 Degeneracy of condon,摇摆假说，反密码子中的AUCGI分别可以和几个碱基配对（最多可以和4个碱基配对）摆动假说：由克里克1966年提出。此假说课解释密码子第三位的简并性。即当tRNA的反密码子与mRNA的密码子配对时前两个碱基严格遵守碱基互补配对法则，但第三个碱基有一定的自由度。也称三中读二（2 out of 3 reading）反密码子5 端碱基密码子3 端可配对碱基GCAUI（次黄嘌呤）U或CGA或GA、U或C一个反密码子最多可识别4个密码子。12、 起始密码和终止密码，最多密码和最少密码的A.A起始密码子：AUG(甲硫氨酸) GUG（缬氨酸）某些微生物的起始密码就是GUG 大多数生物是以AUG为起始密码终止密码子：UAG,UAA,UGA最多密码 6：Arg精氨酸 Leu亮氨酸 Ser丝氨酸最少密码 1：Met甲硫氨酸 Trp色氨酸13、 复制、转录、翻译的抑制剂复制的抑制剂一、 与DNA共价结合的抑制剂这类抑制剂可与DNA共价结合使其失去模板功能。1、 丝裂霉素临床常用的丝裂霉素C和自力霉素、甲撕裂霉素属这一类。2、 烷化剂包括氮芥、乙撑亚胺、磺酸酯等。鸟嘌呤烷基化后极不稳定，易被水解脱落，留下的空缺可导致错误碱基掺入。烷基化的鸟嘌呤亦可与胸腺嘧啶错误配对，影响DNA的正常复制。烷化剂一般都有较强的毒性，甚至细胞突变导致癌变。二、 作用域DNA复制酶类的抑制剂1、 DNA聚合酶抑制剂膦羟基乙酸：是一种人工合成的低分子有机酸，能选择性抑制病毒DNA聚合酶，而对宿主细胞DNA聚合酶的抑制能力仅为1%一下。因此选用低浓度膦羟基乙酸，即可有效地一直疱疹病毒和痘病毒的增值，而对宿主细胞DNA合成基本上没有影响。对RNA或蛋白质的合成也无影响。这类抑制剂还有特意地抑制DNA聚合酶III。2、 DNA旋转酶（拓补异构酶II）抑制剂萘啶酮酸可专一地与细菌nalA蛋白结合，抑制DNA旋转酶。香豆霉素和新生霉素是链霉素衍生物，亦可与DNA旋转酶结合抑制其活性。转录的抑制剂一、嘌呤和嘧啶类似物（干扰、抑制核酸的合成）1、作为代谢拮抗物，直接抑制核苷酸生物合成有关酶类。加6-巯基嘌呤进入体内后可转变成巯基嘌呤核苷酸，可阻断次黄嘌呤转变为腺嘌呤核苷酸及鸟嘌呤核苷酸而抑制核酸的合成。可作为抗癌药物，治疗急性白血病等。此类物质一般需转变为相应的核苷酸才能表现出抑制作用。2、进入核酸分子，形成异常RNA或DNA，影响核酸的功能并导致突变，5-氟尿嘧啶类似尿嘧啶，可进入RNA，与腺嘌呤配对或异构成烯醇式与鸟嘌呤配对，使A-T对转变为G-C对。因为正常细胞可将其分解，而癌细胞不能，所以可以选择性抑制癌细胞生长。二、DNA模板功能的抑制物1、烷化剂：带有活性烷基，能使DNA烷基化，鸟嘌呤烷化后易脱落，双功能烷化剂可造成双链交联，磷酸基烷化可导致DNA链断裂。通常有较大毒性，引起突变或致癌。2、放线菌素类：可与DNA形成非共价复合物，抑制其模板功能。包括一些抗癌抗生素。3、嵌入染料：含有扁平芳香族发色团，可插入双链DNA相邻碱基对之间。三、RNA聚合物的抑制物1、利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶活性。2、利链菌素：与细菌RNA聚合酶亚基结合，抑制RNA链的延长。3、-鹅膏蕈碱：抑制真核生物RNA聚合酶。翻译的抑制剂一、抗生素是微生物来源的药物，可通过直接阻断细菌蛋白质生物合成而起抑菌作用。抗生素作用机理四环素类阻止AA-tRNA与核糖体结合氯霉素阻止mRNA与核糖体结合链霉素、新霉素、卡那霉素干扰AA-tRNA与核糖体结合，而引起读码错误嘌呤霉素结合在核糖体的A位，抑制AA-tRNA的进入二、干扰素是真核细胞感染病毒后能分泌的一类由抗病毒的作用的蛋白质，能抑制病毒的繁殖。干扰素诱导的蛋白激酶使真核elf2磷酸化失活。14、 启动子一定在转录起始点上游吗？不是，启动子一般在原核生物基因中，位于转录起始点+1的上游。真核生物的细胞核基因由三类不同的RNA聚合酶转录。分别对应三种不同的启动子：类型启动子、类型启动子、类型启动子，前两者启动子位于起始点上游，但类型启动子相反。类型启动子有两类：1、基因内启动子：启动子位于基因编码区内部，eg：5SrRNA、tRNA、Alu基因家族基因的启动子都位于转录点的下游。2、转录起点上游启动子。Eg: snRNA、U6和TSK RNA等基因中都已发现，位于转录起点的上游。这类启动子的4中元件TATA框；进端序列元件（PSE）；远端序列元件（DSE）；八聚体基序元件（OCT）15、 ppGpp全局调控的机理（1）严格反应；在严峻的营养条件下，没有足够的必需氨基酸来维持蛋白质合成。此时，细胞发生一系列变化，节约地使用营养，最小限度地进行其生命活动。严格反应所引起的后果是多方面的。rRNA和tRNA的合成大大减少(1020倍)某些mRNA的合成也减少了，使mRNA的总量减少大约3倍；蛋白质的降解速度增加；发生了许多代谢调节作用，表现在核苷酸、碳水化合物、脂类的合成减少了。引起严格反应的关键步骤是未负载的tRNA(即没有与氨基酸相结合的tRNA)进入核糖体的A部位。在正常情况下，由于EFTu的作用，只有氨酰一tRNA可以进入A部位。但是在缺乏氨基酸的情况下，某一特定的密码缺乏相应的氨酰jtRNA与之结合时，则未负载的tRNA就可以进入。这就使得蛋白质合成发生空反应，肽链不可能延伸下去。（2）ppGp的形成：在严峻条件下，伴随着严格反应出现的是两种稀有核苷酸，即即G pP(鸟苷四磷酸)和啪G即(鸟苷五磷酸)在细胞中积累起来。它们是典型的小效应分子。它们的活性是通过与蛋白质相结合，使蛋白质的构型发生变化而得到发挥的。应用遗传学的方法，通过对松弛突变体(即在严峻条件下不发生严格反应的突变体)的研究，发现这些稀有核苷酸是基因relA的产物，即严格反应因子(Stringent、factor)催化合成的。由ATP提供焦磷酸，形成pppGpp或ppGpp。 pppGpp可在多种核糖体蛋白质和EF-Tu、EF-G的催化下转变成ppGpp，这是生成ppGpp的最普遍的途径。 （3）ppGpp的作用：ppGpp可能是许多反应的效应因子，它对转录有抑制作用。rRNA操纵子转录的起始被特异地抑制了。这种抑制发生在启动子部位。因为如果启动子发生突变，这种抑制作用就不复存在。这说明，特定的启动子序列可能与这种抑制作用有关。 许多mRNA的转录延伸过程受到抑制，造成转录效率的下降。 ppGpp调控系统在原核生物中具有普遍性，在真核生物中是否存在尚不清楚。16、 正调控、负调控，可诱导的调控，可阻遏的调控17、 原核生物DNA pol III的组成，催化特点，真核生物三种RNA pol的比较18、 氨酰-tRNA的催化过程19、 真核生物hnRNA的加工步骤5端加帽：场所：核内7-甲基鸟苷三磷酸（m7GPPP）类型：剪接前加帽，剪接后加帽有帽子结合蛋白（CBP）与帽子结合（有利于mRNA运输过核膜进入胞质；保护5端不被酶降解；翻译时供e/f和核糖体结合）3端加尾：场所：核内尾：ployA加尾信号：AAUAAA相关酶RNse,多聚腺苷酸聚合酶作用：防止外切酶对mRNA3端序列的降解修饰：mRNA内部甲基化，主要N6-甲基腺嘌呤（m6A）RNA的剪接：型自我剪接：（1）无需Pr的酶参与作用，而自我催化完成-核酶（2）机制：三次转酯反应（概念：酯键从一个位置转入另一个位置）（3）类内含子的结构特点：5剪接点的序列绝大部分UG；具有中部核心结构；有内部引导顺序。型自我剪接：（1）型内含子本身也具有催化功能，能够完成自我剪接（2）与型区别：1转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷启动，而是由内含子靠近3端腺苷酸2-羟基攻击5-磷酸基引起的2只有两次转酯反应3内含子形成套索结构被切除核mRNA剪接体的剪接：（1）结构特点：1边界顺序：符合GU-AG法则2分支点的顺序：为Py80NPy87PU75APy95 3内含子5端有一保守序列可以喝U1snRNA的5端的保守顺序互补（2）作用特点：需要一些剪接因子snRNA的参与，U1-U6（3）两次连续的转酯反应（4）以套索形式释放（5）snRNPs（最大的剪接体）有三个功能：识别5剪接位点和3支位点；把这些位点结合在一起；催化RNA cleavage（裂缝，裂痕）RNA的编辑：RNA的剪辑：转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。20、 原核生物、真核生物基因组的特点原核生物基因组特征：基因组小重复序列和不编码序列少一般无内含子和重复基因，即原核生物基因是连续基因功能上密切相关的基因构成操纵子或高度集中，常转录成许多基因mRNA(多顺反子mRNA)有重叠基因结构基因通常是单一的DNA序列，除rRNA和tRNA基因外，原核生物结构基因都是单拷贝。真核生物基因组特征：真核生物基因组数目庞大，结构复杂，基因组大部分位于细胞核中一般由多条染色体组成，每条染色体又是由DNA分子与蛋白质稳定结合成染色体的多级结构每条染色体的DNA分子具有多个复制起始点真核基因多裂断基因编码序列仅占基因组DNA的一小部分存在大量奢侈基因没有重复基因。一般结构基因DNA经翻译只形成一种功能的RNA或多肽基因中有大量重复序列21、 原核生物、真核生物基因的结构和特点，顺反子顺反子：一个顺反子就是一个基因，它是由一群突变单位和重组单位组成的线性结构，是一段核苷酸序列，能编码一条完整的多肽链。Benzer把反式构型中不能互补的各个突变型在染色体上所占的一个区域称为一个顺反子。22、 几种DNA损伤修复机制（书P174-179）一、 直接修复：把损伤的碱基恢复到原来状态的一种修复。二、 切除修复：在一系列酶的作用下，细胞可将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成切去的部分，然后使DNA结构恢复正常。三、 错配修复：在含有错配碱基的DNA中，使正常核苷酸序列恢复的修复方式。四、 重组修复：通过从另一条链中获得同源单链来修补双链DNA一条链上缺口的补充方式。五、 易错修复和SOS反应：许多能造成DNA损伤或抑制DNA复制的过程能引起一系列复杂的诱导效应，这种效应称为应急反应（SOS response）.SOS反应包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等，细胞癌变也与SOS反应有关。23、 两种自我拼接的机制，mRNA剪接的参与剪接体一、剪接机制如下：1、首先在内含子靠近3端d6结构中的分支点保守序列上A的2OH向第一个外显子的3OH端发动亲核进攻，切下外显子1（第一次转酯反应）；2、随后，内含子5端的G以5P与分支点A的2OH基形成磷酸二酯键，产生套索结构；3、第一次外显子的3OH基继续对内含子3端剪接位点进行亲核攻击，切断外显子2的5P与内含子3OH形成的磷酸二酯键，并形成外显子1与外显子2之间的3，5磷酸二酯键，两份外显子被连接在一起，完成第二次转酯反应；4、释放含有套索结构的内含子。二、剪接体是mRNA前体在剪接过程中组装形成的多组分复合物，主要由细胞核内小分子RNA（snRNA）和蛋白质因子组成。换句话说，剪接体是一种具有催化剪接反应的核糖核蛋白复合体。参与反应的剪接体至少有5种，即U1snRNA、U2snRNA、U4snRNA/U6snRNA(两者结合在一起)和U5snRNA。24、 tRNA,mRNA,rRNA,siRNA,miRNA,hnRNA,snRNA,snoRNAtRNA : 转运RNA（transfer ribonucleic acidtRNA）是具有携带并转运氨基酸功能的一类小分子核糖核酸。转运RNA分子由一条长7090个核苷酸并折叠成三叶草形的短链组成的。）。三级结构是倒L型。它由3个环，即D环因该处二氢尿苷酸（D）含量高、反密码环（该环中部为反密码子）和TC环因绝大多数tRNA在该处含胸苷酸（T）、假尿苷酸（）、胞苷酸（C）顺序，四个茎，即D茎（与D环联接的茎）、反密码茎（与反密码环联接）、TC茎（与 TC环联接）和氨基酸接受茎也叫CCA茎，因所有tRNA的分子末端均含胞苷酸（C）、胞苷酸（C）、腺苷酸（A）顺序， CCA是连接氨基酸所不可缺少的，以及位于反密码茎与TC茎之间的可变臂构成。不同tRNA的可变臂长短不一，核苷酸数从二至十几不等。除可变臂和D环外，其他各个部位的核苷酸数目和碱基对基本上是恒定的。mRNA :携带从DNA编码链得到的遗传信息，并以三联体读码方式指导蛋白质生物合成的RNA，由编码区、上游的5非编码区和下游的3非编码区组成。约占细胞RNA总量的3%5%。真核生物mRNA的5端带有7-甲基鸟苷-5-三磷酸的帽子结构和3端含多腺苷酸的尾巴。rRNA : 核糖体中的RNA。真核生物核糖体中通常含28S、18S、5.8S和5S 四种rRNA；原核生物中则含23S、16S和5S 三种rRNA。siRNA: 是一种小RNA分子（21-25核苷酸），siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的，siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。miRNA: 是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（21-23个核苷酸），不编码蛋白质的短序列RNA ，具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作