（材料学专业论文）丝素膜仿生矿化与羟基磷灰石受控生长.pdf

浙江理： 人学硕士学位论文 摘要 天然生物矿化过程赋予骨组织高度有序的纳米羟基磷灰石与胶原纤维矩阵分子级别 的独特组装，从而使天然骨具有优异的机械性能，如低刚度、对拉仲压缩的高抵抗、特定 的柔性、高断裂韧性等。为了研究具有良好生物相容性的材料作为骨组织修复或替换材料， 纳米羟基磷灰石聚合物复合材料已经成为生物材料研究的热点。家蚕丝素因其优越的力学 性能，生物相容性和生物可降解性成为生物材料的重要材料之一。此外，研究表明其具有 在模拟生物矿化中调控羟基磷灰石晶体生长的能力：由于目前丝素蛋白诱导矿化的机制还 未明确，因此研究和探索丝素蛋白仿生矿化的过程是有必要的。 本论文选择厚度适当的丝素蛋白膜作为载体，对丝素膜采取不同方法处理，研究模拟 体液中羟基磷灰石以及其他磷酸盐在丝素膜上的生长情况以及结构的转变。用x r d 、s e m 、 t e m 、f t i r 等分析沉积在丝素膜上的磷灰石晶相组成、微观形貌、物理和化学结构。结 果表明：对丝素膜采取不同的预处理如预钙化、p b s 浸泡、e d c n h s 溶液处理后，沉积 的羟基磷灰石呈现出不同的形貌。其中，实验制备的针状h a 晶须晶体取向在沿c 轴方向 有显著增强。对此我们认为：晶体在丝素膜表面上异相成核过程中，丝素膜上本身具有的 基团以及吸附或者结合的离子参与成核，膜表面上参与成核的基团或者离子形成的“准点 阵 对羟基磷灰石晶体的结构和晶面的择优形成具有决定作用；不同处理改变了这种“准 点阵 的排列方式从而导致了溶液中富集于丝素膜界面的离子和被丝素膜表面束缚的基团 或者离子共同协调组装组形成不同形貌和结构的羟基磷灰石晶体。本研究将为制备理想形 态的羟基磷狄石提供一些理论依据，对制备仿生矿化材料具有一定的参考价值，同时对蛋 白质生物矿化过程及其生物分子控制机理也具有重要意义。 关键词：丝素蛋白羟基磷灰石仿生矿化模拟体液 浙江理j 二人学硕+ 学位论文 a b s t r a c t t h en a t u r ep r o c e s so fb i o m i n e r a l i z a t i o ne n d o wt h el i v i n gb o n e 、析mt h eu n i q u es y n e r g ya n d t h eh i e r a r c h i c a la s s e m b l ya tt h em o l e c u l a rl e v e lb e t w e e nn h aa n dc o l l a g e nm a t r i x ，w h i c h p r o v i d e sn a t u r eb o n ee x c e l l e n tm e c h a n i c a lp r o p e r t i e s ，s u c ha sl o ws t i f f n e s s ，h i g hr e s i s t a n c et o t e n s i l ea n dc o m p r e s s i v ef o r c e s ，a p p r e c i a b l ef l e x i b i l i t ya n dh i g hf r a c t u r et o u g h n e s s i no r d e rt o p r o v i d ea p p r o p r i a t em a t e r i a l s 、析t l lb i o c o m p a t i b i l i t ya n de x c e l l e n to s t e o c o n d u c t i v i t yf o rb o n e t i s s u er e p a i r i n go rr e p l a c i n g ，t h ep r e p a r a t i o no fn h a p o l y m e rn a n o - c o m p o s i t e sh a v eb e e np a i d m o r ea t t e n t i o ni nb i o m a t e r i a l sf i e l d b o m b y xm o r i 阻m o r 0s i l kf i b r o i n ( s f ) p r o v i d e sa l l i m p o r t a n ts e to fm a t e r i a lo p t i o n sf o rb i o m a t e r i a l sb e c a m eo fi t si m p r e s s i v em e c h a n i c a l p r o p e r t i e s ，b i o c o m p a t i b i l i t ya n db i o d e g r a d a b i l i t y a n di t i sa l s ow e l lk n o w nf o ri t sa b i l i t yo f i n d u c i n ga p a t i t ec r y s t a lg r o w t hi nt h ep r o c e s so ff i b r o i nb i o m i n e r a l i z a t i o n h o w e v e r ，t h e m e c h a n i s m so fs i l kf i b r o i nm e d i a t e dm i n e r a li n i t i a t i o na r ef a rf r o mu n d e r s t o o d s ot h a t ，i ti s e s s e n t i a lt oi n v e s t i g a t ea n du n d e r s t a n dt h eh i e r a r c h i c a la s s e m b l yo fs i l k f i b r o i n b i o m i n e r a l i z a t i o n i nt h ep r e s e n tw o r k ，s i l kf i b r o i nf i l m s ( s f f ) 谢t ha p p r o p r i a t et h i c k n e s sw e r ep r e p a r e d i n o r d e rt os t u d yt h ee f f e c to fs i l kf i l m s s u r f a c es t r u c t u r eo nt h ep r o t e i nb i o m i n e r a l i z a t i o n ，t h e s t r u c t u r a lt r a n s i t i o nw a si n d u c e db yd i f f e r e n tt r e a t m e n t s s u b s e q u e n t l y , t h ef i l m sw e r es o a k e d i n t o1 5t i m e ss i m u l a t e db o d yf l u i d ( 1 5 x s b f ) a t3 7 0 c a f t e rt h ea p a t i t ed e p o s i t i o n ，t h e s a m p l e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yx r a yd i f f r a c t i o n ( x r d ) ，s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) ， f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( f t i r ) ，t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) ， e t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：h y d r o x y a p a t i t e ( h a ) 诵t hv a r i o u sm o r p h o l o g y , a p p e a r e do nt h e s u r f a c eo fs f ft r e a t e dw i t l lp r e c a l c i f i c a t i o n , p b s ，e d c e s p e c i a l l yt h en e e d l e l i k et u f tc r y s t a l w h i s k e r sd i s t r i b u t i n go r d e r l yh a v eo b v i o u s l yc r y s t a lo r i e n t a t i o na l o n gca x i s i ti st h o u g h tt h a tt h e s u r f a c es t r u c t u r e ，d i s p o s i t i o na n dd e n s i t yo ff u n c t i o ng r o u p so nt h es u r f a c eh a v ec r u c i a le f f e c to n t h ep r o p e r t yo fh a ni st h o u g h tt h a tt h es u r f a c es t r u c t u r e ，d i s p o s i t i o na n dd e n s i t yo ff u n c t i o n a l g r o u p so nt h es u r f a c eh a v ec r u c i a le f f e c to nt h ep r o p e r t yo fh a n eq u a s il a t t i c ea s s e m b l e db y f o u n d a t i o n a lg r o u p so nt h es u r f a c eo fs f fd e t e r m i n e st h eh e t e r o g e n e o u sn u c l e a t i o na n dc r y s t a l g r o w t h t h a ti st os a yu s i n gs f ft e m p l a t et oc o n t r o lt h eg r o w t ho fc r y s t a li sa ne f f e c t i v ew a y t o o b t a i ni d e a lh ac r y s t a l s 晰t l lv a r i o u sp r o p e r t i e s t h e s er e s u l t sm a yp r o v i d es o m ei n f o r m a t i o no n t h ep r e p a r a t i o no fh aw i t hi d e a lm o r p h o l o g y m o r e o v e r , t h er e s u l t sm a yr e f l e c tt h er o l eo ft h e p r o t e i nb i o - m i n e r a l i z a t i o na n di t sb i o m o l e c u l a rc o n t r 0 1 k e yw o r d s ：b i o m i n e r a l i z a t i o n ，s i l kf i b r o i nf i l m s ，h y d r o x y a p a t i t e ，s i m u l a t e db o d yf l u i d ( s b f ) t 1 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名椭 同期：砷年，月i ：i ，i e ：i 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密讶。 学位论文作者签名：舢 日期：7 年，月，p 日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名：舶副乏 日期：夕矽年厂月，r 日 浙江理工大学硕士学位论文 第一章绪论 生物矿化材料是指由生命系统参与合成的天然生物陶瓷和生物高分子材料，如骨骼、 牙齿、珍珠、贝壳等。虽然生物矿化材料的主要无机质广泛存在于自然界中，甚至有些矿 物在组成和结晶方式均于天然岩石圈中相应的矿物相同，但是这些矿物在形成过程中由于 特殊的生命系统的调控，便具有了常规陶瓷材料无法比拟的优点，如极高的强度、良好的 断裂韧性、优异的抗冲击性能、良好的表面光洁度、特殊的光学性能以及特有的生物学性 能和许多特殊功能。这些不同寻常的性能来源于特定生物条件下，材料的巧妙组装过程及 其所特有的高度复杂精细的微观结构；这便是生物矿化的魅力所在i lj 。天然骨组织便是经 过这样的特殊生物矿化过程调控下组装而成的纳米羟基磷灰石胶原蛋白纤维复合材料。 天然骨是由无机矿物与生物大分子规则排列所组成的复合体；成熟的骨除了细胞之 外，其基质中有大量规则排列的有机质胶原纤维束和无机盐羟基磷灰石。有机质构成骨支 架，赋予骨弹性及韧性；无机质则使骨硬挺峰实。天然生物矿化过程赋予骨组织高度有序 的纳米羟基磷灰石与胶原纤维矩阵分子级别的独特组装，从而使天然骨具有优异的机械性 能，如低刚度、对拉伸压缩的高抵抗、特定的柔性、高断裂韧性等【2 5 1 。随着对生物矿化过 程的了解不断深入，利用模拟生物矿化的方法制备在结构和功能上与天然骨组织相似的生 物材料用于骨损伤的治疗和修复成为最具潜力的研究方向。然而，天然大分子蛋白在生物 矿化过程中的分子调控机制至今尚不明确，对于自然界的生物矿化过程，仍然需要进一步 研究；弄清生物矿化过程中蛋白质调控无机质晶体生长的规律和耄t s j j 对生物材料的仿生制 备具有重要的指导意义。 1 1 生物矿化概述 生物矿化领域具有明显的学科交叉与渗透特点，它处于生命科学与无机化学、生物物 理学和材料科学的交汇点：为人工合成具有特种功能晶体材料和生物智能材料提供了一种 新的思路【6 】。仿生矿化是模拟生物矿化的方法合成人工晶体的一种方法，在生物矿化中的 无机矿物往往是在有机基质的参与下形成的，它们在有机基质上成核，并且在整个结晶过 程中受到了有机基质及其它生命活动的调控因而在晶体的形态、尺寸、以及取向上都具有 高度的统一和有序性，而这些特性又使这些无机材料具有一些特殊的功能。受到这一自然 现象的启发，人们开始研究生物矿化的基本原理并利用这些原理去模拟生物矿化过程从 浙江理i 大学硕+ 学位论文 而探索理想的无机材料及其制备途径1 7 1 。国内外的研究已取得了许多成就，现在已经利用 仿生生物矿化这种方法合成了大量晶体，通过有机一无机界面分子识别和协同作用，有机质 选择性地与无机矿物晶体特定方向的面网相互作用，从而对矿物的生长、形貌、多形及取 向等产生明显的控制作用【8 】。有机无机界面的分子识别机制包括静电，品格几何匹配和立 体化学互补等一j 。 生物矿化过程是一个极为复杂的晶体生长过程，一般的晶体生长概括起来可以分为四 个阶段，即溶质溶解一生长基元的形成一生长基元在界面上的叠合晶体形成。在生物矿化中 晶体的形成具体可以分为四个阶段【1 0 , 1 1 】：1 ) 有机质的预组织( 超分子预组织) ，有机质的 预组织是生物矿化的模板前提，预组织原则是指有机基质与无机相在分子识别之前将识别 无机物的环境组织的愈好，则它们的识别效果愈佳，形成的无机相愈稳定。2 ) 界面分子 识别，在已形成的有机基质组装体( 底物) 的控制下，无机物从溶液中在有机无机界面成核； 其中的分子识别表现为有机基质分子在界面处通过晶格几何特征、静电相互作用、极性、 立体化学互补、氢键相互作用、空间对称性和形貌等方面影响和控制无机物的成核的部位、 结晶物质、选择、晶形、取向及形貌等。3 ) 生长调制( 化学矢量调节) ，无机相通过晶 体生长进行组装得到亚单元，同时形状、大小、取向和结构受有机质分子组装体的控制； 由于实际生物体内矿化中有机质是处于动态的所以在时问和空问上也受有机质分子组装 体的调节。在许多生物体系中，分子构造的第三个阶段即通过化学矢量调节赋予了生物矿 化物质具有独特的结构和形态的基础。4 ) 外延生长( 细胞水平调控与在加工) ，在细胞 参与下，亚单元组装成更高级的结构；该阶段是造成天然生物矿化材料与人工材料差别的 主要原因，而且是复杂超精细结构在细胞活动中进行最后的修饰的阶段。 有机质对无机晶体的成核，生长，晶形及取向等的控制是一个相当复杂的过程，目前 一般将这种过程称为分子识另l j ( m o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ) 。在生物矿化过程中，有机无机界面 的分子识别机制上不明确，在诸多研究中认为：静电相互作用和电荷在界面的富集【1 2 1 4 1 、 晶体晶面网的几何匹配 1 5 , 1 6 】、空间立体化学结构互补1 刀等是有机质对无机晶体结晶控制的 重要因素；各种因素协同作用于有机大分子无机晶体体系，构成了对晶体生长的精确控制。 然而关于生物矿化的具体机制仍需进一步研究澄清。 1 2 羟基磷灰石研究概况 羟基磷狄石( h y d r o x y a p a t i t e ，简称h a ) 是动物和人体骨骼的主要无机矿物成分， 分子 式为c a i o ( p 0 4 ) 6 ( 0 h ) 2 ，简称为h a 或h a p ，密度为3 1 6 9 c m 3 ，性脆，折射率是1 6 4 1 6 5 ，微 2 浙江理t 大学硕士学位论文 溶于纯水，呈弱碱性( p h = 7 - 9 ) ，易溶于酸而难溶于碱【1 8 】。在正磷酸盐家族中，h a 的溶解 度是最小的，且具有负溶解度性质，即h a 的溶解度随温度的升高而降低。由于羟基磷灰石 具有良好的生物相容性、生物活性、骨传导性及其与人体骨矿物相组分的相似性，在许多 骨替代物中脱颖而出，被广泛用于生物医用材料领域，如硬组织修复材料【1 9 】。 目前有关羟基磷灰石的研究已经取得了很大的进展，人工合成h a 的方法有多种，如： 液相沉淀法 2 0 , 2 、水热合成法【2 2 矧、溶胶一凝胶法【2 4 ，2 5 1 、微乳液法 2 6 1 、固相反应法 2 t i 、自然 烧法【2 8 】等。由于单一组分的羟基磷灰石烧结性能差，作为种植材料其度较低、韧性较差、 力学性能不足，致使其难以承受负荷或冲击1 2 9 3 0 1 ，这就限制了其作为人体材料种植体的使 用。m y o s h i m u r a 等人p i j 研究表明晶须状羟基磷灰石有望成为增韧增强的材料。 1 2 1 羟基磷灰石晶体结构及其生物学特性 图1 1沿c 轴投影到( 0 0 1 ) 面上h a 结构图 f i g 1 1s t r u c t u r eo fh ap r o j e c t e dd o w nt h eca x i so n t ot h ep l a n e ( 0 01 ) 羟基磷灰石是磷酸钙盐家族的典型代表，其晶体属六方晶系，属l 6 p c 对称型和p 6 3 m 空间群，其结构为六方柱体，与c 轴垂直的面是一个六边形，a 、b 轴夹角为1 2 0 。，晶格 常数为晶胞常数为a = b = 9 4 3a ，c - - 6 8 8a ，c a p 原子比为1 6 7 ，单位晶胞含1 0 个c 矛+ ， 6 个p 0 4 3 和2 个o h ，晶体中原子基团排列沿c 轴的投影如图1 1 所示【3 2 1 。从图中可看到 o h 位于晶胞的4 个角上，1 0 个c a 2 + 分别占据2 种位置；4 个c a 2 + 占据c “1 ) 位置，即z = 0 和z = l 2 位置各2 个；6 个c a 2 + 位于c “2 ) 位置，即z = l 4 和z = 3 4 位置各3 个；6 个p 0 4 3 。 3 浙江理t 大学硕士学位论文 四面体分别位于z = l 4 和z = 3 4 的位置。 h a 是强离子交换剂，分子中的c a 2 + 易被c d 2 + 、h 9 2 + 等有害金属离子和s 一、b a 寸、 p b 2 + 等重金属离子置换，还可以与含羧基的氨基酸、蛋白质、有机酸等发生交换反应。h a 通道结构如图1 2 所示。附加阴离子x 填充于通道中，且位于结构通道中的6 3 轴与c a ( 2 ) 三角形面( m 面) 中心交汇处，x 位置可被c i 一、o h 、b f 、i 一、c 0 3 2 、0 2 。等阴离子替换形成 复杂的固溶体3 3 1 。所以存在于自然界中的羟基磷灰石晶体结构不完善，结合有少量的碳酸 根、氟、镁、钠及柠檬酸等离子。 图1 2h a 通道结构示意图 f i g 1 2p r o j e c t i o no fh a s t r u c t u r ei nc o l u m n h a 是典型的生物活性陶瓷，它与骨形成键合表现在：光学显微镜下，新骨和羟基磷 灰石植入体在界面上直接接触，其间无纤维组织存在；羟基磷灰石植入体与骨界面的结合 强度等于甚至超过植入体或骨自身的结合强度，如果发生断裂则往往是发生在陶瓷或骨的 内部而不是在界面上；羟基磷灰石植入体与骨界面的高分辨透射电镜显示新生骨中盐晶体 系由植入体中晶体外延生长形成 3 4 1 。羟基磷灰石具有良好的生物特性，已作为天然骨的替 代物广泛应用于医疗领域。 h u l b e r t 3 5 】的研究表明，多孔陶瓷材料的孔径在1 5 4 0g r n 时，纤维组织可以长入陶瓷 的内部；孔径为4 5 1 0 0l u n 时，允许非矿物的骨样长入；孔径在1 5 0g m 时，已能为骨组织 长入提供理想的场所。另有研究表明1 3 6 多孔h a 植入体内后，能为纤维细胞和骨组织向羟 基磷灰石生长提供通道和生长空间，增大组织与羟基磷灰石接触表面积，使界面的软硬组 织都能长入孔隙内，形成纤维组织和新骨组织交叉结合的状态，这种界面结构能保持正常 的代谢关系，骨一材料的界面结构具有生理性结合。1 9 9 0 年n s 越f 3 7 】报道了植入狗皮下 4 浙江理1 二大学硕+ 学位论文 的多孔羟基磷灰石陶瓷中有骨形成。1 9 9 1 年，张兴栋等【3 8 j 和r i p a m o n t i 3 9 1 分别报n t 植入 狗和狒狒非骨部位的多孔羟基磷灰石中有新骨生成。将大孔羟基磷灰石陶瓷植入狒狒的腹 直肌中，在没有外源性骨形成蛋白存在时，植入3 0d 后在羟基磷灰石孔壁就发现了骨形成 蛋e i ( b m p 3 ，0 p 一1 b m p 7 ) ，植人9 0d 后，4 1 的样品中伴有骨髓的新骨组织，这表示了大 孔羟基磷灰石的骨诱导性能。对于羟基磷灰石的生物活性机理，g r o s s 、d u c h e y n e 、j a r c h o 等曾做过讨论【4 1 嘲】，认为h a 植入机体与邻近骨和体液作用，发生钙、磷等离子交换，这 种交换维持动态平衡，在h a 与骨界面产生新的h a 。h a 中弥散出钙、磷离子，在体液中 的钙和磷离子也向h a 表面聚集，在h a 表面形成钙、磷离子层并与骨细胞中的蛋白质分 子结合，这样h a 与骨就紧密地集合为一个整体。随着离子交换的不断进行，影响细胞的 增殖分化，引起h a 表面的骨生长1 4 5 , 4 6 1 。 另外，研究表明【4 7 1 多孔h a 具有生物降解性，在人体环境下，多孔h a 会发生物理化学 溶解，或在晶界等活性较高的区域发生化学变化而分解成较小的颗粒，此外，一些生理因 素的影响都会使多孔h a 发生降解。另外，材料的多孔结构使接触面积增大，加速了降解过 程。材料结晶度的下降、晶粒尺寸的减小及c 0 3 2 。、m 9 2 + 、s p 等杂质离子的存在都可以加 速多孔h a 的降解速度。 1 2 2 羟基磷灰石应用 h a 属于生物活性材料，含有能通过人体正常的新陈代谢途径进行置换的钙和磷元素， 同时含有能与人体组织发生键合的羟基基团。因此，自7 0 年代以来，h a 在临床上得到了 广泛的应用，其合成方法也得到了迅速的发展。目前，羟基磷狄石的应用研究，主要集中 在生物复合材料、涂料、药物缓释等一下几个方面： 一、新型骨修复材料人体骨主要由有机骨基质结构与无机骨盐框架结构组成【4 8 】。羟 基磷灰石高分子复合材料通过对天然骨组织的模仿，以期得到性能良好的骨修复材料。冯 庆玲等【1 9 1 将采用仿生沉淀法制得的纳米h a 胶原骨修复材料植入兔骨髓腔中后发现，植入 体的界面层发生了溶解一沉积的动态快速更新，巨噬细胞可在植入体表面或植入体内通过吞 噬和细胞外降解吸收这种材料，植入体表面及内部被吸收后伴随有新骨的沉积，并与新生 骨组织形成化学键合。李玉宝等4 9 , 5 0 1 通过共沉淀法制备了高纳米h a 含量和分散均匀的纳 米h a 聚酰胺复合材料，并且通过体外实验及体内动物实验结果表明，纳米h a 聚酰胺复 合材料具有良好的生物相容性和生物活性，研究发现在兔下颌骨组织中有诱导成骨的特 性，是一种较为理想的骨修复材料。 气 浙江理t 大学硕+ 学位论文 二、新型涂层材料在组织修复过程中，由于金属、陶瓷等植入材料的生物活性低， 难以和周围组织形成键合。h a 作为表面涂层材料，可以将金属的良好力学性能与h a 的 优良的生物活性、生物相容性有机的结合起来。这样既可以克服金属易腐蚀的缺点，又能 充分发挥h a 优异的生物学性斛5 1 , 5 2 1 。但h a 的形状、尺寸和结晶度对涂层的生物学性能 影响很大，所以制备出高品质的h a 粉体是其在涂层材料领域被广泛应用的前提。 三、新型生物复合材料由于h a 的脆性大、韧性不足及力学性能差，使它在承重骨 的应用方面暴露出不可避免的缺陷。为改善h a 的机械性能经常把h a 和其他材料复合制 各h a 生物复合材料【5 3 5 8 1 ，例如：金属一h a 生物复合材料( 己报道的金属增强体有t i 颗粒、 a g 颗粒、不锈钢纤维等，其中a g 颗粒增强体除了强韧化作用外，还有抗菌效果) 、生物 惰性陶瓷h a 生物复合材料( 已报道的生物惰性陶瓷增强体有颗粒、纤维和晶须，如t i 0 2 颗粒、a 1 2 0 3 晶须或纤维、s i c 纤维等) 、高分子聚合物h a 生物复合材料( 己报道的高分 子聚合物主要有聚乙烯、聚乳酸、胶原等) 。这些h a 复合材料的力学性能均有不同程度的 提高。但是，自然骨中h a 为纳米尺寸并有序沉淀于骨胶原机体中，目前制备达到或者接 近天然骨组织结构和力学性能的新材料尚有很大困难。 四、医用填充材料由于h a 的脆性大，力学性能差，多被用作缺损部位的填充材料， 不能用于应力集中的部位 2 9 3 0 1 。但h a 可以用于制作骨填充材料、人造齿根、人造领骨、 人造鼻软骨、皮肤内移植、人工中耳通气管材料等。 五、药物载体a o k i 掣5 9 】将羟基磷灰石纳米微晶用作药物载体，对其吸附和释放药物 的性能进行了细致的研究。体外动物细胞培养实验证明，粒子大小为4 0n l i lx1 5n l nx 1 0n l n 的纳米h a 溶液对阿霉素的最大吸附量为0 2 - 1m g ；阿霉素和阿霉素h a 对癌细胞 均有抑制作用，但阿霉素h a 的抑制作用明显长于阿霉素。i j n t e m a 等1 6 0 】采用共沉淀法将蛋 白类药物b s a 包裹于纳米h a 晶粒中获得了具有缓释功能的药物释放体系。体外缓释实验 结果表明，药物的释放速率由h a 的溶解过程控制。 六、抗肿瘤活性h a 作为骨组织的无机成分，具有良好的生物相容性，且能被组织细胞 消化分解，是理想的抗癌药物的材料。h a 纳米粒子由于粒径小，具有更大的表面能，因而 易被恶性肿瘤细胞所吞噬，其可以通过细胞膜和核膜导致d n a 损伤，对细胞周期有阻断， 并抑制癌基因c 2 m y c 的表达。a o k i 等【6 i 】将纳米h a 微晶作为抗癌药物的载体，研究发现： h a 对c a - 9 癌细胞的增殖有明显的抑制。同时还发现，大量纳米h a 进入细胞内部，引起 细胞空胞变形，导致细胞大量死亡。张士成等1 6 2 】研究表明，h a 微晶在一定的浓度( 最低1 0 5 m o l l ) 和时间条件下，对h e l p 2 细胞、m g c 等细胞的生长、增殖均有明显的抑制作用。 6 浙江理： 大学硕十学位论文 进一步研究发现，h a 微晶对胃癌m g c 一8 0 3 细胞的微管和微丝有明显的解聚和破坏作用， h a 微晶作用后，癌细胞的微结构发生明显变化。夏清华等【6 3 j 研究也表明：经h a 处理的 w - 2 5 6 癌肉瘤细胞，其形态和结构也发生了明显的变化。h a 微晶对w - 2 5 6 癌肉瘤细胞的 d n a 含量及细胞周期有一定的影响，对g 1 期和s 期的细胞最具杀伤力，同时h a 微晶还 可以阻止癌细胞的增殖分化，使g 2 期细胞积累，阻止g 2 m 期的进程。李世普等1 6 5 1 发现 5 0n l n 的h a 对人肺癌及胃癌细胞具有抑制作用。 1 3 丝素蛋白研究概况 蚕丝是人类最早利用的蛋白质纤维之一，其具有优良的生物相容性，作为生物材料用 于临床如用作手术缝合线等，也已经有近百年的历史。丝素蛋白是源于蚕丝的天然高分子， 具有独特的物理化学性质和对人体有良好的相容性；由于丝素蛋白具有良好的生物相容 性、生物活性、可生物降解等特性，其在药物缓释材料、生物传感器、生物医学材料、软 组织相容材料、组织工程等领域潜在的应用价值引起了社会的关注，成为国际上重点研究 的生物材料之一。 1 3 1 丝素蛋白的结构与性能 蚕丝蛋白是一种具有优良特性的天然蛋白质，由蚕体内的绢丝腺合成、分泌，主要由 丝胶和丝素两部分组成，丝素是主要成份，占蚕丝蛋白总量的7 0 8 0 。天冬氨酸和谷氨酸 在丝胶中的含量比丝素高得多，因而富含羧基的丝胶对调节磷灰石成核的作用强于丝素。 但是作为植入材料，丝胶的致敏性限制了其运用范围。相反，丝素蛋白却具有良好的生物 相容性，对水和氧气具有良好的通透性。 丝素蛋白富含1 8 种氨基酸，有8 种是人体所必需的，且无毒无污染，可生物降解。家 蚕丝素蛋白的氨基酸组成如表1 1 。蚕丝素蛋白结构是由结晶区和非结晶区两部分组成。 结晶区主要由侧链较小的氨基酸残基组成，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸共占8 5 ， 三者摩尔比为4 ：3 ：1 ，且按一定序列排列成较为规则的链段；而带有较大侧基的苯丙氨 酸( p h e ) 、酪氨酸( t 蚋、色氨酸( t r y ) 等主要存在于非晶区域。其相对分子质量约为3 6 万至t j 3 7 力 6 6 1 。丝素蛋白分子构象可分为2 类【6 7 1 ，f l j s i l ki 型和s i l ki i 型：s i l ki 型分子链是按0 【螺旋 和b 平行折叠构象交替堆积而成的，其晶胞属于正交晶系；s i l ki i 型呈反平行d 折叠( p s h e e t ) 层状结构。在温度和溶剂影响下s i l ki 型易向s i l ki i 型转变。在s i l ki 型、s i l ki i 型中，s i l ki i 型是蚕丝素蛋白的主要晶型，是蚕丝素蛋白具有高弹性模量和强度的主要原因。蚕丝素蛋 7 浙江理t 大学硕+ 学位论文 表1 1 桑蚕丝素蛋白的主要氨基酸组成1 6 5 l t a b l e1 1a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no f b m o r is i l kf i b r o i n 白以p s h e e t 为基础，形成直径大约为1 0 n m 的微纤维，无数微纤维密切结合组成直径大约为 l p m 的细纤维，大约1 0 0 根细纤维沿长轴排列构成直径大约为1 0 1 8 p r o 的单纤维，即蚕丝素 蛋白纤维【6 羽。 人类对于蚕丝的应用已经有千年历史，近年来，国内外将家蚕丝素蛋白用于组织工 程材料、药物控制释放材料和组织诱导材料的研究很活跃。a l t m a n 等认为丝素具有如下优 点【6 9 1 ：( 1 ) 与其他天然纤维和许多高性能合成纤维相比，有独特的力学性能；( 2 ) 在外科领域 的应用已有很长历史；( 3 ) 可以通过不同处理方法获得膜或其他形态，而且工艺相对简单； ( 4 ) 可以通过某些氨基酸的氨基和侧链的化学修饰较容易地改变表面性能；( 5 ) 在体内外可以 缓慢降解；( 6 ) 对生物体无危险性。 1 3 2 丝素蛋白在生物医学上的研究和应用 丝素的主要构成是甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，约占总组成的8 0 以上，极易形成反平 行的p 一折叠片层结构，使得丝素蛋白纤维具有良好的热稳定性和机械性能。丝线最早的生 物医学应用是作为手术缝合线，这体现了其良好的力学性能和生物相容性。丝素蛋白应用 于生物医学领域的优点在于f 7 7 3 】：( 1 ) 在外科领域有着悠久的应用历史，对生物体无危险 性，在体内外可缓慢降解；( 2 ) 相比其它天然纤维和许多高性能的合成纤维，有着独特的 力学性能；( 3 ) 可以通过某些氨基酸的氨基和侧链等的化学修饰改变其表面性能；( 4 ) 可以 通过不同的处理方法获得膜和其它的形状。 8 浙江理工大学硕十学位论文 近年来，丝素蛋白在生物医学上的研究和应用获得的进一步的发展，主要有一下几个 方面： 一、人工器官或组织 ( 1 ) 丝素在人造皮肤上的研究 人的皮肤由表皮层和真皮层构成，表皮层在外层，真皮层在内层，当真皮层被破坏后， 皮肤不会再生，这时需要进行皮肤移植，除了患者本人，移植来的皮肤一般极难生长愈合， 因此，现在人工皮肤的开发研究也仅能用来治疗真皮尚存的情况。张幼珠等1 7 4 1 研制的丝素 创面保护膜，具有良好的柔韧性、透水性、透气性、与创面的粘附性以及与人体的生物相 容性，可将药物从膜中先快后慢的释放出来，具有抑菌杀菌作用和创面覆盖材料保护创面 的作用。 ( 2 ) 人工肌腱与韧带的开发 由于蚕丝的强度和弹性系数与生物体的肌腱有近似的数值，又具有良好的生物亲和 性，在丝素蛋白中导入带电化合物后，可加速其与钙、磷酸基团的凝集，进一步将带有负 电荷的羧基、磷酸基导入丝素蛋白材料，可使其达到改性的要求，改性以后的丝素蛋白可 与生物骨基质中主要无机成分羟磷灰石结晶中的基团紧密凝聚，其钙的凝集量比无处理的 丝素蛋白有大幅度的增加，特别是导入磷酸基的丝素蛋白中，钙的凝聚量比未处理的蛋白 高过1 0 倍以上，可望用于开发人工肌腱与人工韧带7 5 1 。 二、生物传感器 ( 1 ) 葡萄糖生物传感器 东京农工大学工学部7 6 1 研究了丝素蛋白固定葡萄糖氧化酶的机理后，又进行了葡萄糖 生物传感器的研究，结果表明传感器对葡萄糖的线性响应范围随丝素膜中葡萄糖氧化酶的 含量增加而缩小。张雨青等【7 7 1 研制成的传感器在流动注射分析系统中每小时可以测试6 0 个 生物样品，可以重复使用1 0 0 0 次以上，并且贮存寿命长，可以超过2 年。 ( 2 ) 生物发光传感器 用丝素膜固定过氧化氢酶( p o d ) 后，可以开发光电传感器，其机理主要在于测定3 2 氨 基邻苯二甲酰坏肼反应中产生的过氧化氢的浓度，反应通过光电二极管检测发光来实现。 实验表明，反应中光电流强度与水溶液中过氧化氢的浓度呈正相关，光电反应的响应时间 和光电流强度取决于固定有p o d 丝素膜的特性【7 8 】。 ( 3 ) 神经递质传感器 脑内大部分神经递质及其代谢产物和一些神经肽化合物均可发生氧化反应，可用电化 9 浙江理工人学硕+ 学位论文 学法测定其电位变化。在生理p h 条件下，神经递质一般为阳离子，而代谢产物为阴离子。 胡晓波等【7 9 1 利用丝素膜的两性荷电特性，制备了丝素膜修饰电极，用以测定神经递质阳离 子。在生理p h 条件下，丝素膜荷负电，对神经递质脱氧酰苷( d a ) 和解一羟色胺( 5 - h a ) 有检 测信号，而在p h 3 溶液中对抗坏血酸( 5 一a a ) 并0 5 羟基吲哚乙酸( 5 一h i a a ) 有检测信号。这表 明丝素膜可用于开发神经递质传感器。 ( 3 ) 免疫传感器 彭图治等8 0 l 在丝素膜上采用盐酸活化化学交联法固定甲胎蛋白( a f p ) ，将此法制得的 膜片固定在自制的氯化银电极上，可测得丝素抗体膜的膜电位，表明样品血清膜与阴性血 清膜的膜电位与a f p 的浓度呈对数线性正相关关系，说明这是一种良好的免疫传感器。 三、酶的固定化载体 y o s h i m i z u 等【8 1 , 8 2 1 研究，表明蔗糖酶经丝素粉固定后其稳定性得到较大提高，这是由于 丝素分子无规卷曲向反向平行的p 一折叠过渡而引起丝素粉的不溶化。因此，丝素粉固定蛋 白质分解酶可用于化妆品生产；当丝素粉固定氨基苯丙氨酸酶后，可对苯酮尿症有更佳疗 效。d e m u r a 等进行了用丝素膜固定葡萄糖氧化酶、过氧化酶、脂肪酶的研究，结果表明 膜固定化酶的稳定性较高。 四、药物的控释材料 由于丝素的生物亲和性较好，可以作为药物的控释材料，增强或减缓药物在体内的作 用时间和效力。闵思佳等1 8 4 1 在丝素蛋白用于药物缓释载体方面的研究表明，丝素凝胶具有 一定药物透过性，在释放药物时，具有一定程度的p h n l j j 应性，在作为药物缓释载体时，具 有一定的酶分解性。 另外，丝素蛋白在其他方面的应用如：抗凝血活性药物【8 5 , 8 6 】、功能性细胞培养基质【8 7 】 等。 1 4 丝素羟基磷灰石材料研究进展 当前国内外的相关模拟生物矿化及相关的骨组织工程材料的研究中，选用的蛋白质大 多数为i 型胶原蛋白，清华大学崔福斋研究小组【8 8 】已经仿照人类骨头的生成机理，采用自 组装方法制各了纳米晶羟基磷灰石胶原蛋白的复合生物硬组织修复材料，并且该复合材料 的纳米有序结构与天然骨及其近似，曾被n a t u r em a t e r i a l s 杂志认为是“为采用仿生方法制备 材料提供了新的思路”。然而，作为天然骨的成分用于增韧羟基磷灰石的同时也存在如下问 题；首先，目前骨材料中选用的胶原蛋白的提纯工艺复杂，低纯度胶原则容易引起炎症反 l o 浙江理t 大学硕十学位论文 应等问题；其次，目前临床应用较多的是哺乳动物牛肌腱中提取的胶原蛋白，存在着疯牛 病等牲畜疾病与人交叉感染的潜在威胁1 8 9 j 。 丝素蛋白与胶原蛋白同属结构蛋白，来源广泛，价格低廉，不但具有优良的生物相容 性、对水、氧气的良好通透性及生物可降解性等优点1 6 9 并且有实验已经证明丝素蛋白可以 诱导羟基磷灰石的沉降1 9 0 ；目前将丝素蛋白应用于骨修复和替代材料也显示出了广阔的前 景。因此，采用丝素蛋白为模板诱导羟基磷灰石生长，制备s f h a 复合材料具有特殊的优 势和潜在的应用价值。 对于丝素蛋白无机质复合体系，已见报道，在国外，s e n n a 研究小组【9 l 】在聚丙烯酸作 分散剂条件下，初步研究了天然桑蚕丝蛋白粉术对磷酸钙晶体生长的影响，但是他们选用 的丝蛋白没有脱除丝胶蛋白，导致材料的生物相容性较差，所以该体系制备的材料尚不能 达到医用目的。t a k e u c h i 等【9 2 】研究了丝胶蛋白诱导羟基磷灰石的沉降，实验表明研究表明 含有大量p 折叠结构的丝胶蛋白可以促进磷灰石在仿生体液中的形成，但是丝胶蛋白存在 致敏性、脆性等缺点，不能直接用于骨替代材料，所以需进一步采用具有一定生物相容性 及韧性的丝素蛋白加以改进。目前，k i n o 等研究组凹】对丝素蛋白膜为模板诱导羟基磷灰石 的沉降加以研究，研究表明将丝素蛋白膜预钙化可能会对羟基磷灰石矿化材料起到一定的 诱导作用。国内，赵勇等【舛】也研究了丝素蛋白膜预钙化的作用，实验也表明丝素蛋白膜预 钙化对加快羟基磷灰石的沉降起到一定的作用，同时还研究了交替矿化法对丝素蛋白仿生 矿化的作用。这两组实验表明，预钙化可能会使丝素蛋白膜发生表面溶解，暴露出更多的 氨基酸基团，从而提供了更多的成核位点促进了矿化结晶，另一方面，氢氧化钙溶液能使 光滑的丝素蛋白膜表面溶胀或溶解，降低了丝素蛋白膜的表面能，形成更有利于晶核形成 的相对粗糙的表明形貌。但是预钙化的具体机理仍需进一步研究。孔祥东9 5 螂1 研究了天然 桑蚕丝蛋白对磷酸钙晶体生长的调控作用，发现丝素蛋自在近中性的条件下可以促进无定 型磷酸钙向稳定的羟基磷灰石晶体转变，结晶附着在丝素蛋白分子上形成长短不一的矿化 复合纤维，从大多数纤维的几十纳米到少量的几十微米，显示了丝蛋白有发生不同层次矿 化复合纤维形成的潜能。然而在矿化复合纤维形成过程中，丝蛋白分子发生了怎样的结构 变化，需要什么样的条件才能调控其结晶的生长以及纤维长度等上不清楚，仍有待于进一 步研究。另外孔祥东、崔福斋等还研究了不同的丝素蛋白浓度对羟基磷灰石结晶成核的调 控作用，发现丝素蛋白浓度对磷酸钙晶体的形状和大小起重要作用，但是丝素蛋白自身的 分子量、结构特征、浓度等对矿化复合纤维的形成与形态变化仍需进一步研究。本实验室 【