（环境工程专业论文）产几丁质酶菌株的筛选及酶的性能研究.pdf

中山大学硕士研究生毕业论文 产几丁质酶菌株的筛选 及酶的性能研究 专业：环境工程 硕士生：朱晓东 指导教师：王国惠 摘要 几丁质酶能够催化几丁质水解生成几丁寡糖和n - 乙酰氨基葡萄糖，而几丁 质是虾蟹壳的主要成分。近年来随着水产废物日益增多，几丁质酶在几丁类废物 资源化以及生物防治等方面体现出了巨大的应用潜力，因此研究几丁质酶具有重 要的意义。 本研究以筛选高产几丁质酶菌株为目的，采用几丁质选择性培养基从深圳红 树林取回的土样中初筛得到1 2 株产几丁质酶茵，再通过d n s 法测菌株发酵液酶 活力的方法复筛，选择其中酶活力较高且稳定的菌株j - 6 ，对其进行发酵产酶、 酶的分离、纯化及酶学性质的研究。 通过实验，初步确定了菌株j - 6 的最佳培养条件。其最适培养基配方为：胶 体几丁质0 2 ，蛋白胨o 3 ，k h 2 p 0 40 0 1 ，m g s 0 40 1 3 ，k 2 i t a 0 40 0 7 ，f e s 0 4 0 0 0 2 ，t w e e n 8 0o 0 0 7 ：最佳摇瓶装样量为：于2 5 0 m l 三角瓶中装入4 0 砌发酵 液；最佳接种量为发酵液体积的1 ；最适温度为3 0 ；最适起始p h 值为5 5 。 该菌株的最终酶活达0 51 9u m l 。 用饱和度为6 0 的硫酸铵对菌株j - 6 进行盐析，获得活力为0 4 9 3 u m l 的几 丁质酶粗酶液。对其理化性质进行的研究表明，该酶的最适反应温度为4 0 0 ， 最适反应p h 为5 ，水浴中最适保温时间为3 0 r a i n ，最适沸水浴显色时间为6 m i n 。 该酶在p h 值为4 - 6 间，低于5 0 c 时相对比较稳定，高于5 0 c 酶活性下降。 菌株j - 6 所产的几丁质酶不仅能降解胶态几丁质，对几丁质粉和虾壳粉也有 中山大学硕士研究生毕业论文 一定的降解活性。本文研究了该酶对这三种底物的降解活性及底物浓度对酶降解 活性的影响。0 5 m l 粗酶液分别与浓度为o 5 的胶体几丁质、2 的几丁质粉、 1 的虾壳粉反应，混合反应体系中还原糖的浓度分剐高达2 0 0 9 9 m o l m l 、 2 1 4 7 t m o l m l 、9 3 2 i _ t m o f m l 关键词：几丁质；几丁质酶；菌株筛选；酶的性质；降解 l l 中山大学硕士研究擞毕业论文 i s o l a t i o no f c h i t i n a s e p r o d u c i n gs t r a i n s a n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fc h i t i n a s e m aj o r ：嚣珏vir o 鑫毽e 纛t 鑫l e n gi n e e ri n g n a m e ：z h ux i a o d o n g s u rs o r ：w a n gg u o h u s u p o r v 1s 0w a n gg u o h u1 。 a b s t r a c t c h i t i n a s ec a t a l y s e st h er e a c t i o no fh y d r 0 1 ) ，z i n gc h i t i nw h i c hi sa l li n t e g r a l s t r u c t u r a lc o m p o n e n to fs h r i m ps h e l li n t on a c e t y l g l u c o s a m i n e ( g l c n a c ) a n d ( g l c n a c ) n w i t ht h ed e v e l o p m e n to fa q u i c u l t u r e , c h i t i n a s ch a sh i g h l yp o t e n t i a lf o rb i o l o g i c a l c o n t r o l l i n ga n dr e c l a m a t i o no f c h i t i o u sw a s t e , s oi ti si m p o r t a n tt os t u d yc h i t i n a s e i nt h i s s t u d y , 12 s t r a i n sp r o d u c i n gc h i t i n a s ew e r e _ i s o l a t e df r o ms o i ls a m p l e s c o l l e c t e d 筋ms h e n z h e nm a n g r o v ei nc h i t i o u sm p , d i u m at r a i n sw i t hh i g hc h i t i n a s e a c t i v i t yo b t a i n e da f t e rr e s c r e e n i n gb yd n sm e t h o df o rd e t e r m i n i n ge n z y m a t i ca c t i v i t y t h e n f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s , p u r i f i c a t i o na n de 越y m ep r o p e r t i e so f s 魄遮j 一6 龋啪s t u d i e d t h ec h i t i n a s co f t h es t r a i nj - 6w a se x t r a c t e db ya m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n6 0 ，a n di t s p r o p 酬c sw 粼s t u d i e d o p t i m u mc o n d i t i o ma c h i e v e d ：i n o c u l a t e dw i t h1 o fs t a r t e ri na 2 5 0 l i l lf l a s kc o n t a i n i n g4 0 m lm e d i u m , a n di n c u b a t e dp hw a s5 5 ，7 2 ha t3 0 ，t h e o p t i m i z e dm e d i u mf o rs t r a i nj - 6t op r o d u c ec h i t i n a s ew a s 然f o l l o w s ：c o l l o i d a l c h i t i n o 2 ，p e p t o n eo 5 5 ，k h 2 p 0 40 0 1 ，m g s 0 40 13 ，k 2 h p 0 4o 。0 5 ，f e s 0 4 0 0 0 2 ，t w e e n 8 00 。0 0 7 t h ec h i t i n a s ea c t i v i t yr e a c h e d519 6 3 7u m l p r o p e r t i e so fc h i t i n a s e w a ss t u d i e d ：t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp hf o rc h i t i n h y d r o l y s i sw e r e4 0 。ca n dp h5 , r e s p e c t i v e l y ；t h ec h i t i n a s ca c t i v i t yw a ss t a b l ei np h r a n g eo f 4 0 6 。0a n dt e m p e r a t u r eu n d e r5 0 。c 趣 中山大学硕士研究生毕业论文 t h ee n z y m ec a l lh y d r o l y z ec o l l o i d a lc h i t i n , c h i t i np o w d e ra n ds h r i m ps h e l l p o w d e r t h et i m ec o t l r o fc h i t i nh y d r o l y s i sa n de f f e c t so fv a r i o u sp r e t r e a t m e n t st o s h r i m ps h e l lp o w d e rw e r ei n v e s t i g a t e d s o m er e s u l t sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w e d ：t h e r e d u c m gs u g a rr e a c h e d2 0 。0 9 p m o l m lw h e n0 5 m ll c o l l o i d a lc h i t i nw a s h y d r o l y z e dw i t h0 5 m lc r u d ee n z y m e s , r e d u c i n gs u g a rr o a c h e d21 4 7 p m o l m lw h e n 2gp o w d e rc h i t i nw a sh y d r o l y z e d ，w h i l et h er e d u c i n gs u g a rw a so n l y9 3 2 p m o l m l w h e n1gs h r i m ps h e l lp o w d e rw a sh y d r o l y z e d k e yw o r d s ：c h i t i n , c h i t i n a s e ，i s o l a t i o n , e n z y m ep r o p e r t i e s , e n z y m a t i ch y d r o l y s i s w 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名形朱谚幽、 日期：砷年6 月7 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：j b 散肖 导师签名：三ia 磐 吼卟厶月7 日 眺沙7 年6 月夕日 中山大潋硕士研究生毕业论文 第一章前言 我国湖泊众多，海域辽阔，水产养殖业发达，虾资源丰富，像基围虾、龙虾、 对虾等，每年捕捞量可达数酉万吨。广东省是中国水产大省，海洋生物资源达 3 0 0 0 余种。2 0 0 7 年，广东省水产品总产量6 6 4 3 万吨，居全国第二位鬣，0 8 年 中国的养殖虾产量同比下降将接近2 0 ，0 9 年预计又将有所圈升。各种水产加 工厂在沿海遍布，其加工废弃物量大，仅虾壳废料就达3 0 0 0 吨年以上。如何利 用这些丰富的甲壳资源呢? 近年来甲壳资源综合利用研究越来越引起豳内外的 重视。 虫下壳中的各种成份全部是宝，具有很高的开发利用价值。虾壳中几丁质含量 为1 5 3 0 ，蛋白质含量为2 0 ，其余为矿物质元素类等，其中含量最丰 富的是钙，含量达3 0 4 0 ，其次是磷，色素含有4 5 。 从虾壳中可以提取出纯天然的红色素、多种氨基酸、虾青素、制备蹴几丁质、 壳聚糖等。提取出的色素色泽鲜艳，稳定性好，无毒、溶解性能好，是食品添加 剂中最好的着色荆，虾壳色素在抗氧化和抗肿瘤增殖方面具有明显的生物学功 能。提取出的氨基酸含量丰富，可塑用于制作营养液等，几丁质、壳聚糖以及它 们的衍生物在坊织、印染、造纸、食品、医药、环保等领域都有广泛的应用，且 + 可出口，满足国际市场需要。 几丁质昀生产原理较简单，只要将虾蟹甲壳甭碱脱去乙酰基后，经加工就能 生成几丁质。利用虾蟹壳开发生产几丁质具有投资少，成本低，经济和社会效益 明显等特点。但西前国际市场上凡丁质产量低，需求爨大，价格贵，据有关信息 资料，仅日本、美国每年就需1 0 0 0 盹以上，并大半是从国外进口，产品供不应求； 而我国篱内也需要大量凡丁质货源，市场前景看好。 许多学者相继探讨了有关几丁资源的综合利用，薛惠琴等【l 】综述了虾壳的综 合和用工艺，以及从虾壳巾提取天然红色素，氨基酸、凡丁质、壳聚糖等产品的 方法。夏文水掣2 】提出酶法和化学法相结合的综合利用河虾加工下脚料的工艺路 线，与单一提取几丁旗王艺相比，不仅可莉用蛋白质，且在提取几丁质时，酸碱 中山犬学硕十研究生毕业论文 处理次数和用量都相应减少；刘芳f 3 等对对虾加工副产品的综合利用进行了初步 探讨，建立了整套虾头、壳综含利用工艺，最终获取甲壳素、壳聚糖、氨基葡 萄糖盐酸盐，还得到碳酸钙以及蛋白粉。 近年来，海洋渔业发展迅速，我国虾蟹年产量和消费量都很大，几丁类废弃 物的产量也会大量增加，因而甲壳资源的开发利用前景十分广阔。 1 。1 几丁质及其衍生物 1 重。1 几丁质的结构及性质 几丁质( c h i t i n ) ，又称甲壳素或甲壳质，是由n 一乙酰- - d - - 氨基葡萄糖以p - - 1 ，4 键连接而成的生物多聚体( 图1 1 ) 。几丁质广泛分布于自然界中，在天然 聚合物中其贮量仅次于纤维素，是地球上第二大生物资源，假比纤维素具有更多 的特殊功能，它是真菌、甲壳类动物、昆虫、藻类等的重要结构物质，也是昆虫 中肠豳食膜的重要成分。 几丁质是白色或灰白色无定型、半透明固体，相对分子质量因原料不同而有 数十万至数百万，但因其分子内部的结晶结构和很强的氢键作用导致形成胶态分 子团结构，所以它在水、稀酸、稀碱、浓碱以及一般的有机溶帮中很难溶解，高 温下也不熔化，只溶于浓盐酸、硫酸、磷酸和无水甲酸中，但同时主链发生降解， 因而限制了它的应用和发展。 图1 1 蔻丁质豹讫学结梅式 f i g1 1t h es t r u c t u r eo f c h i t i n c h i t o s a n n 中山大学硕士研究生毕业论文 1 1 2 几丁质的衍生物及其应用 几丁质是天然高分子物质，具有很好的组织相容性和生物降解性、安全无毒、 无刺激性、无抗原性。但因几丁质不溶于水，限制了它的应用，采用适当的方法将 其降解，可以得到低聚合度的几丁寡糖( c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，c o s ) 、壳聚糖 ( c h i t o s a n ) 、壳寡糖( c h i t o o l i g o s a c c h a i r d e ) 等几丁类衍生物。几丁寡糖是一种 在b 1 , 4 糖苷键连接，含有2 1 0 个 n 乙酰基葡糖胺的低聚糖，由几丁质部分水解 得到；壳聚糖是几丁质的脱乙酰基化物；壳寡糖是以b 1 , 4 糖苷键连接，含有2 l o 个d 葡糖胺的一种低聚糖，可由壳聚糖部分水解得到。几丁质及其衍生物的基 本结构之间的相互关系如图l 一2 。 甲壳鬃 壳聚锖 l i 甲壳襄暮糖i d 一蕾蕾胺盐醴煞 j 甲充胺寡羹 i l n 一乙晓一d 一葡糖胺d 一萄籀胺 图1 2 几丁质、几丁寡糖、壳聚糖及其衍生物之间的关系 f i g1 - 2r e l a t i o no f c h i t i 玛c h i t o s a na n d n a ce t h y l g l u c o s a m i n 研究表明，上述这些不同大小的分子易被肠道粘膜吸收，能提高人体的生态 调节功能。高分子量的几丁寡糖，如几丁五糖甜a c e t y l p e n t a o s e ) 、六糖 ( n a c e t y m e x a o s c ) 和七糖具有显著的抗肿瘤作用，能激活人巨噬细胞、淋巴细胞、 n k 细胞和补体系统，并诱导许多细胞因子产生，提高机体免疫机能。几丁寡糖还能 通过作用于肿瘤发生处的血管来直接抑制肿瘤细胞的生长、转移，并能诱导肿瘤 细胞凋亡【4 】；几丁寡糖可以调节动物肠道内微生物的代谢情况，抑制大肠杆菌与 腐败菌的生长，增加肠道内有益菌，有利于菌群生态平衡，黑曲霉素中得到的一种 果胶酶的同功酶具有降解壳聚糖的作用，得到低分子量壳聚糖、2 - 6 聚合度的寡糖 和单体混合物，这一混合物有抗芽胞杆菌和大肠杆菌的活性，其中壳六糖活性最 明显，其次是五、四、三和二糖，氨基葡萄糖单体只有轻微的抑菌作用【5 l ；几丁寡 糖还可以用于保健品和健康食品添加剂，具有降低胆固醇，保护肝脏，强化免疫， 减低尿酸，医治溃疡，减肥美容等功效【6 1 。 几丁寡糖可以作为绿色饲料添加剂，能增强动物的抗病能力，而且无毒，无副 中山大学硕士研究缴毕业论文 作用，避免了药物残留对畜产品品质的影响【7 l ；另外，乙丁寡糖可作为植物调节剂， 能诱导植物组织的发育，活化植物细胞，促进植物的快速生长；并能诱导植物内几 丁质酶的活性，阻碍病原蔼生长繁殖，提高植物的抗病能力。因此，几丁寡糖及其 衍生物可以广泛应用于生物医药、食品、化妆品、纺织、农业等领域。 1 2 几丁质的降解 目前几丁质的降解主要通过化学、物理和酶法三类途径，其中化学降解的方 法开展最早，健存在的溺题较多。霉前研究的热点主要倾向于酶法。 1 2 1 化学法 化学法降解几丁质是工业化生产中最早、最常用的方法，主要有酸降解法和 氧化降解法。酸水解法最常用的试痢是浓盐酸。1 9 6 4 年r u p l e y 蔫浓盐酸承解凡 丁质，获得的产物经活性碳柱和硅藻土柱纯化，得到大量二糖和兰糖、四糖，五糖 很少，水解度与盐酸浓度及反应温度减正冼。n i s h i m u r a 等人强l 在焉盐酸水解凡丁 质时同时采用超声处理，提高了几丁六糖的产量，但不能得到七糖及以上的寡糖， 实验中健们用s e p h a d e xg 2 5 层折过滤除盐，非常费时。张虎等l 研究了酸水解凡 丁质的条件，在4 0 时用浓盐酸作用2 h ，加入氢氧化钠中和，反应液通过活性炭 柱，先用5 的乙醇溶液洗去部分单糖和中和反应生成的盐，孬崩的乙醇溶 液将寡糖洗脱出来，飞行质谱法分析目的产物，主要是四到六糖和少量七糖。酸水 鳃法制各几丁寡耱工艺篱单，开展鞍旱，是一种非特异酌降解过程，反应过程及产 物的分子量分布较难控制，产量低，且易对环境造成污染。 氧化降解法是采硼h n 0 2 、0 2 、过醵酸钠秘程硝酸盐等试剂将甲壳素的 b 1 , 4 糖苷键氧化而断裂，得到的主要是四糖以下的低聚物，有些氧化反应还会 弓| 莛反应产物结构的破坏艄。c h a n g 等l n 】髑飓0 2 研究潮备凡t 寡糖，先崩酸溶 解几丁质后，加入h 2 0 2 利用氧化作用进行均相随机降解反应，碱中和反应产物， 无水乙醇分离，在趵以上时得到寡糖产物，反应温度、趣0 2 浓度对实验结果有 较大影响。这种方法速度快，产率高，但产物分子量仍较大。尽管化学方法可降j 韵5 甲壳素制备凡丁寡糖，但爱应条俘苛刻、难以控割；反瘴的稳定性帮重复性较差； 产物提纯困难，成本高；消耗大量的浓酸和浓碱，造成环境污染，应用前景有限。 中山大学硕士研究生毕业论文 1 2 2 物理法 物理法降解凡丁质主要采用微波、辐射、超声等方法。x i l 塔等f 1 2 l 用微波辐 射法来水解几丁质，改变水解时间和微波强度可以得到不同分子量的产物，在反 应液中加入少量无机盐，如n a c i ，可以有效促进水解的速度，而且产物的分子量 比不加要低，盐离子的强度变化不影响分子量，两者无相关性。陈忻等【l3 】以甲壳 素为原料，用超声波法制备高黏度的壳聚糖并用于活性橙的染料废水有嘴显的脱 色效果，对活性椴的脱色率可达9 9 s 。丁盈红等【1 4 1 利用微波辐射，用过氧化氢作 氧化剂，非均楣酶解高分子量壳聚糖。在反应条件为5 过氧纯氢、5 壳聚糖，微 波辐射功率约4 0 0 w , 辐射3 m i n ，所得水溶性壳聚糖分予量为l 。1x 1 0 4 d ，收率可达 6 0 。产品外观纯自，分予量有规雉可控制。 1 2 3 酶法 甲壳素作为一种高分子聚合物，可以被一些酶降解，切断糖链，水解成寡糖 分子。有些酶同时还具有转糖基活性，可以以低分子誊寡糖为起始物在酶作用下 延长糖链得到高聚合度寡糖。酶法降解甲壳素条件温和，水解过程和产物分布容 易控制，无污染，已经成为人们研究的熟点。 酶法又可分为专一性酶和非专一性酶两种。许多非专一性酶对几丁质和壳聚 糖有部分或完全水解作用，如溶菌酶、纤维素酶、蛋自酶、脂肪酶等约三十多种， 这些酶来源广泛，作用机理还不清楚。纪莹等【l 习用复合纤维素酶降解壳聚糖得到 以每7 耱为主的壳寡糖，壳寡糖粗提物的得率为3 0 * , 6 左右。z h a n g 等t 翻用纤维素酶、 q2 淀粉酶和蛋囱酶复合降解2 4 乙酰化度的壳聚糖，并与膜分离耦合使用，得到 聚合度为3 1 0 的寡糖产物。黑蓝霉索是一种采胶酶的潮功酶，其有多聚半乳糖醛 酸酶活性，在p h 3 5 条件下降解壳聚糖，得到低分子量壳聚糖、2 - 6 聚合度的寡糖和 单体混合物瑟l 。周湘池等【瓣l 从虾壳中分离到一株乳杆菌b r - 3 ，翻用该乳拇菌进行 了虾壳制备甲壳素的研究。结果表明，当接种量为1 0 、葡萄糖浓度为4 5 、固 液魄为l ：3 、发酵温度为 ，掰且这些因素与各种水平是越相交织在一起的。为了寻 求最优化的生产条件，就必须对各种因素以及各种因素的不同状态进行试验，这 就是多因素的试验【溺。 本研究发酵培养基配方选取采用正交实验法。以胶体几丁质、蛋白胨等为分 析因素，驭7 因素3 求平的1 8 个组合配置培养萋，并根据最逶起始豫值、温 度、时间等进行摇瓶发酵试验，取其发酵液进行酶活测定。具体因素水平分配方 案如表3 1 所示。( ) 袭3 - 1 正交设计的因素及水平 t a b l e3 - 1f a c t o r sa n dr a n k i n g so f o r t h o g o n a ld e s i g n l 2 3 o 2 氇5 1 5 0 3 氇5 s o 8 o - o l 疆懿 0 0 5 o 0 5 疆国 0 1 3 o 0 5 氇0 7 o 0 9 o 0 0 1 氇0 0 2 0 0 0 3 o 0 0 3 绩0 0 5 o 0 0 7 1 8 个组合分配方案如下： 中山大学硕士研究生毕业论文 3 。3 结果与分析 3 3 1 碳源对几丁质酶活的影响 由图3 1 可以看出，氮源的选择对菌株的酶活具有强烈的影响。在以胶体几 丁质为碳源的情况下，菌株j - 6 酶活性最高：以蔗糖和麦芽糖为碳源，酶的相对 活性较低，不到以胶体几丁质为碳源时的l o ；以葡萄糖和淀粉为碳源，发酵液 中山大辫硕士研究生毕业论文 中检测不到酶活。实验表明，蔗糖、麦芽糖对菌株j _ 6 产几丁质酶的诱导作用较 小，葡萄糖、淀粉对菌株 6 产几丁质酶不是诱导作用。结果表明，胶体几丁质 可作为较理想的碳源。 蒜 一 烘 溢 蓑 翼 葡萄稽蔗糖麦芽糖淀粉胶体几丁质 碳源 圈3 - i 碳源对几丁质酶活的影响 f i g 3 - 1i n f l u e n c eo f d i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e so nc h i t i n a s ea c t i v i t y 葡萄糖、淀粉等对菌株没有诱导作用，可能是由于葡萄糖效应，即，由于葡 萄糖的代谢产物，细胞的环腺蕾酸譬减少，因而环腺替酸扶酶合成系统的正控制 物c a m p 受体蛋白质与c a m ) 的复体分离，从而降低了酶的台成率。 3 3 2 氮源对几丁质酶活的影响 由图3 - 2 可看出，以鬣白胨为氮源，最有利于菌株6 发酵产酶，其酶活最 高；以牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、硝酸铵为供试氮源，菌株j - 6 都能显 示出较高酶活，栩对酶活均在7 0 以上，显示出菌株j - 6 对氮源的适应范隧较宽。 但对菌株j - 6 来说，有机氮与无机氮更好，牛肉膏、崔自胨、酵母粉作为氮源时， 菌株j _ 6 的相对酶活都在9 0 以上。 媾 h 一 烬 灌 麓 瓣 牛肉青蛋由脒酵母粉硫酸铵硝酸铵 爨源 图3 2 氮源对几丁质酶活性的影响 f i g 3 - 2i n f l u e n c eo f d i f f 嚣e n tn i t r o g e ns o u r c e so nc h i t i n a s ea c t i v i t y 3 3 3 温度对尼丁质酶活的影响 由图3 3 可以看出，菌株j 6 在不同培养温度下，几丁质酶活力曲线起伏明 显。从馥线懿走势可以看出，萤株羹6 对培莽温度表现较免敏感。当培养湿度魏 3 0 时，几丁质酶产量最高。在2 8 一3 0 之间，相对酶活较高，都谯9 0 以 上，低予或高于此范凑酶活力均较低，2 5 、3 5 c 时褶对酶活不到4 0 。3 0 为 菌株 6 的最佳产酶发酵温度。 爨 、 鲢 黻 贸 霹 圈3 。3 滚发对酶潘的影响 f i g 3 - 3i n f l u e n c eo f c u l t u r a lt e m p e r a t u r e so nc h i t i n a s ea c t i v i t y 。穗一 中i l i 火学硕士研究坐毕业论文 3 3 4 培养基起始p h 对几丁质酶活的影响 由圈3 4 可以看出，菌株孓6 在酸性环境中酶活离于碱性环境。当培养基起 始p h 为5 5 时，酶活最大；p h 在5 - - 5 5 之间时菌株相对酶活较高，p h 在7 或7 以下的徽酸环境时，相对酶活在6 5 以上，p h 在7 以上时，相对酶活均不 到3 0 ，下降幅度较为明显。由此可以看出弱酸环境有利于该菌株合成几丁质酶。 岔 烬 潞 韶 娶 * 0 0 0 0 4 0 p h 值 圈3 4 培养基起始p | l 对酶活的影响 f i g 3 - 4i n f l u e n c eo f i n i t i a lp hv a l u e so nc h i t i n a s ea c t i v i t y 3 3 5 瓶装量对几丁质酶活的影响 由图牟5 可以看出，当瓶装量为4 0 m l 时，酶活最大。从总体走势看，曲线 起扶交化小，说明瓶装量对菌株6 产酶的影响不是很大，各个不同装波量的发 酵液酶活均在7 0 以上，由于瓶装鬣是影响摇瓶发酵溶氧的主要因素，说明氧不 是影响薄栋产酶的主要因素。 中山火学硕士研究嫩毕业论文 2 0帅7 0 瓶装量m u 图3 5 瓶装量对酶活的影响 f i g 3 - 5i 鳗u e n c eo f v o l u m eo f c u l t u r em e d i u mo nc h i t i n a s ea c t i v i t y 3 3 6 接种量对几丁质酶活的影响 由图3 - 6 可以看出，接种量对菌株j - 6 发酵产酶有较大影响。接种量为发酵 液体积的1 时酶活最大，接种量为3 、5 时，相对酶活较低，均不足4 5 。 接种量会影响发酵过程里延滞期的长短。适宜的接种量能缩短细菌生长达到 高峰的时闯，若早期生物量过大会使发酵液； ，的营养成分过度消耗，从瓶影响酶 的合成。实验中1 的接种量比3 、5 要好，可能是由于接种量小，发酵液巾 营养丰富，菌种繁殖迅速，延滞期较短，很快进入对数生长期，因而酶活力高。 02 | 3 450 镘种量( 薯) 图3 - 6 接种夔对酶活的影响 f i g 3 - 6i n f l u e n c eo f i n o c u l a t i o nd o s e so nc h i t i n a s ea c t i v i t y 一鸵 辩 o 举v磐灌篱罂 鼯 幻 o 群v翳黻羹爨 中山大学硕士研究生毕业论文 3 3 7 培养基配方优化结果 表3 - 3 正交实验结栗表 t a b l e3 - 3r e s u l to f o r t h o g o n a le x p e r i m e n t 根据上表可以看出，1 8 次实验中，以1 7 号的酶活最高，相应的水平组合是 当前觳好的搭配，下面对所得的数据进行直观分析。 中i i j 人学硕十研究生毕业论文 计算诸因素在每个水平下的酶活得到的四个平均值的极差( r ) 。从表4 3 的 级差图可以看出胶体几丁质的含量为0 5 ，蛋白胨的含量为0 5 5 ，k h 2 p 0 4 的含 量为0 0 1 ，m g s 0 4 的含量为0 1 3 ，k 2 h p 0 4 的含量为0 0 7 ，f e s 0 4 的含量为 0 0 0 2 ，t w e e n 8 0 的含量为0 0 0 7 时，为实验最佳配比，综合起来为 a 2 8 2 c l d 3 e 2 f 2 g b 。利用s p s s 对实验结果进行方差分析，其结果见表3 - 4 ： 表3 4 方差分析 t a b l e3 - 4a n a l y s i so f v a r i a n c e 在实验水平a = 0 1 下分别检验各冈素的显著性，查表可得，r 1 ( 2 ，1 7 ) = 2 6 4 。 根据，检验，m g s 0 4 对酶活有显著影响，需取3 水平；k h 2 p 0 4 、k 2 h p 0 4 、 f e s 0 4 、t w e e n 8 0 对酶活有弱显著影响，需分别取l 、2 、2 、3 水平；而胶体几丁 质、蛋白胨对酶活无显著影响，放两冈素可以从节约的角度选择水平，可取l 水 平。综合评定后确定最佳配比：胶体几丁质的含量为0 2 蛋白胨的含量为 0 3 ，k h 2 p 0 4 的含量为0 0 1 ，m g s 0 4 的含量为0 1 3 ，k 2 h p 0 4 的含量为 0 0 7 ，f e s 0 4 的含量为0 0 0 2 ，t w e e n 8 0 的含量为0 0 0 7 。根据综合分析所得的 结果，对菌株j 6 发酵配方做验证实验，该蔺发酵培养后酶活测定结果为0 5 1 9 u m l ，比1 7 号配方测定的酶活提高约0 0 6 ，表明了此配方的合理性，达到了 优化试验配方的目的。 3 4 小结 本章通过单冈素实验及正交实验，初步确定了j - 6 的最佳培养条件。其最适 培养基配方为：胶体几丁质o 2 ，蛋白胨0 3 k h 2 p 0 40 0 1 ，m g s 0 4 中山大学硕士研究坐毕业论文 o 1 3 ，k 2 h p 0 4o 0 7 ，f e s 0 4o 0 0 2 ，t w e e n 8 00 0 0 7 ；最佳摇瓶装样量为：于 2 5 0 m l 三角瓶中装入4 0 戚发酵液；最佳接种嫠为发酵液体积分数的1 ；最适温 度为3 0 ，最适起始p h 值为5 5 。该菌株的最终酶活达0 5 1 9u m l ，与未进行 优化之前比较，酶活力提高了一倍多，证明了该方法的合理性。 不同的报道中对几丁质酶活力的定义往往不一致，他们测量酶活力的方法也 不尽相同，将其换算为统一单位以艨可发现，目前报道的多数产几丁质酶微生物， 其发酵液中的酶活力与本菌株相比都不高。张莉【5 4 l 等对从家蚕中肠围食膜中分 离的气单胞菌的产酶条件进行优化，其优化条件为：粉状几丁质1 2 ，k 2 h p 0 4 0 1 2 ，乙酸铵0 0 2 ，发酵7 2l l ，温度为3 0 4 c ，起始p h 值为8 0 ，培养基装量为 1 5 ，产几丁质酶活力达0 0 6 2u m l ；王海东f 5 5 】等从汕头海湾养殖区域的海底沉 积物中分离到l 株凡丁质酶活性较高的菌株，命名为s w c h 6 嗜水气单胞菌 ( a e r o m o n a sh y d r o p h l i l l a ) 。采用单因素优化方法结合芷交实验，得到菌株 s w c h 一6 产几丁质酶的最佳发酵条件：胶体几丁质2 5 0g 厄，胰蛋白胨1 0 0g l 陈海水1 0l ，p h8 5 ，3 2 ，1 5 0r r a i n 培养7 2h ，在该条件下酶活力达0 3 9u m l ； 孙菽蔚等p 翻报导的假交替单胞菌s s 0 1 菌株发酵液的几丁质酶酶活最高为 0 0 1 7 5 l n 1 l ，都远小于本研究中菌株j _ 6 的酶活。 中山大学硕士研究生毕业论文 第四章几丁质酶的纯化及酶学性质研究 本章对菌株舅6 所产凡丁质酶鲻硫酸铵分级盐折法进行提取。为发挥该蓥的 产酶潜能，对酶粗提液进行了一些酶学性质研究，如酶的最适反应p h 、最适反 应温度，酶对p 联及温度的稳定性等，并迸一步研究了酶对几丁类物质的降解性 能，为研究开发和利用该几丁质酶提供实验依据。 4 1 材料 4 1 1 菌种 菌株孓6 。 4 1 2 主要试剂 几丁质粉末、虾壳粉、菌株发酵液( 菌株弘6 按第三章所述最优化方案培养) ， 其余同第二章。 4 。2 实验方法 4 。2 1 硫酸铵分级盐析法提取粗酶液 一、原理 虽然几丁质酶广泛存在于环境巾，但它作为一种诱导酶，正常情况下，微生 物体内禽量很低，而很多微生物只有在含几丁质的培莽基，| l 产几丁质酶，致使产 量不高，另外，发酵液中的成分很复杂，有细菌的细胞、细菌产生的多种代谢产 物及未消耗的营养物质等，抗菌活性成分容易受其他物质的影响丽有可能使活性 下降，在客观上限制了对几丁质酶分子生物学功能的分析及进一步应用研究。因 此酶的分离纯化显得特别重要。 对于酶的纯化，己有套较为成熟的程序，一般情况下，采崩离子交换层析 中山大学硕十研究生毕业论文 和凝胶过滤层析相结合的方法即可得到纯度较高的酶。由于实验条件的限制及本 阶段研究重点的不月，本研究中只用硫酸铵分级盐析在对几丁质粗酶进行初步纯 化，以便进行酶的性能研究。几丁质酶主要成分是蛋白质，蛋囱质在水溶液中的 溶解度是由蛋白质周围的亲水基翻与水形成水化膜的过程以及蛋白质分子带有 电荷的情况决定的。当中性盐加入缮白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋 白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质 溶液屠，由于离予强度发生改交，蛋白质表面电荷大鼙被中和，更加导致蛋白质 溶解度降低，使蟹白质分子之阋聚集而沉淀。硫酸铵在蛋白质盐析中应用最广。 二、操作步骤 取菌株j - 6 发酵液于4 下5 0 0 0 r r a i n 离心2 0 分钟，收集上清液用硫酸铵进 行分级盐析。在冰浴条件下边加入硫酸铵粉末边温和搅拌至硫酸铵完全溶解，使 溶液中硫酸铵饱和度分别达到5 0 ，6 0 ，7 0 和8 0 ，4 c 静置8 小时后 5 0 0 0 r r a i n 离心2 0 m i n ，得到上清液和沉淀，收集沉淀待用。沉淀分别用少体积的 0 2 n m 的i l t r i s - h c l 缓冲液混匀溶解得到粗提液。 分剐测定不同饱和度糨提液的酶活力。由此确定凡丁质酶分缀盐析所需要的 硫酸铵的饱和度。 4 2 2 酶反应条件研究 取分离纯化得到的粗酶液作为样品，保存于4 冰箱中。以灭活粗酶液为空 自，分别按以下条件测定酶活。 4 2 2 1 酶最佳反应时间的确定 将糨酶液与胶体几丁质在3 7 下分别保温反应2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、 8 0 r a i n ，其余条件周2 。2 。5 所述几丁质酶活的测定方法，测定酶活力。 4 2 2 2 温度对酶活力的影响 将粗酶液与胶体几丁质分剐在2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、7 0 、8 0 下保温反应 3 0 r a i n ，其余条件嗣2 2 5 所述几丁质酶活的测定方法，测定温度对酶活力的影响。 以最适条件下的酶活力为1 0 0 。 中山大学硕士研究嫩毕业论文 4 2 2 3 几丁质酶的热稳定性 将粗酶液分别在2 0 、3 0 、豹、5 0 、醐、7 0 、8 0 c 下预保温反应6 0 m i n ，然后 按2 2 5 所述几丁质酶活的测定方法，测定几丁质酶的热稳定性。以未保温时的 酶活力为1 0 0 。 4 2 2 。4p h 值对酶活力的影响 将粗酶液与胶体几丁质分别在p h 值为2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 的 磷酸缓冲液中反应，其余条件同2 2 5 所述凡丁质酶活的测定方法，测定p h 值对 酶活力的影响。以最适条件下的酶活力为1 0 0 。 4 2 2 s 几丁质酶的酸碱稳定性 将粗酶液分别在p h 毽为2 0 、3 0 、4 。0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 的磷酸缓冲液中， 室温下预保温6 0 m i n ，然后按2 2 5 所述几丁质酶活的测定方法，测定几丁质酶的 酸碱稳定性。以朱保温时的酶活力为1 0 0 。 4 2 2 6 酶反应的最佳显色时间 按2 2 5 所述几丁质酶活的测定方法，将粗酶液与胶体几丁质在反应体系巾 反应后，分别在沸水浴 扣保温l 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、1 0 m i n ，球水冷却后 测定酶活。以最适条件下的酶活力为1 0 0 。 4 2 3 酶的降解性能研究 以灭活褪酶液为空崮，分别按以下条件研究酶对胶体死丁质、几丁质粉、虾 壳粉的降解能力。 4 2 3 1 几丁质酶降解胶体几丁质 取咒丁质粗酶液0 。5 m 1 分剐与0 2 5 m l 浓发力o 。2 、0 5 ol 、2 、5 酶 胶态几丁质混合，将上述反应液分别在水浴i l - 保温2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、 8 0 m i n ，在4 。2 。2 所得毒的酶的最镰反应条件下，省2 2 ，4 。2 所述酶轰专力的测定方 中山大学硕士研究生毕业论文 法，测定反应体系中还原糖含量。 4 2 3 。2 凡丁质酶降解几丁质粉 取几丁质粗酶液0 5 m 1 分别与0 2 5 m l 浓度为0 。2 、0 5 、1 、2 、5 的 几丁质粉混合，将上述反应液分别在水浴中保温2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 r a i n ， 在4 2 2 所得出的酶的最佳反应条件下，用2 2 4 2 所述酶活力的测定方法，测定 反应体系中还原糖含量。 4 2 。3 3 几丁质酶降解虾壳粉 取几丁质粗酶液o 5 烈分别与0 2 5 m l 浓度为0 2 、o 5 、l 、2 、5 的 虾壳粉混合，将上述反应液分别在水浴中保温2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 n d n ， 在4 2 2 所得出的酶的最佳反应条件下，用2 2 4 2 所述酶活力的测定方法，测定 反应体系中还原糖含量。 4 。3 结果与分析 4 3 。1 硫酸铵饱和度对酶活的影响 o # o 4 翟孰3 3 1 g o 2 滋 0 1 o 0 0 qo 0 0 5，口7 6口 醵羧铵滗秘凌( 篝) 图4 1 不同硫酸铵饱和度对酶活的影响 f i g 4 - 1 i n f l u e n c eo f d i f f e r e n ts a t u r a t i o n so f a m m o n i as u l f a t eo nc h i t i n a s ea c t i v i t y 由上图可以看出，随着硫酸铵饱和度的增加，酶活显示出先增大后减小的趋 势，当硫酸铵饱和度为时酶活最大，达到0 。4 9 3 u 札。由此确定几丁质酶提 取的最佳硫酸铵饱和度为6 0 。 巾j j j 人学硕十研究也毕业论文 粗酶液的活性较对应等量的原发酵液低，可能的原因一是糨酶液中的酶量少 于对应等量的原发酵液，其二是粗酶液中存在磷酸盐和沉淀附着的硫酸铵对酶可 能产生不利影响，使酶交性失活从而弓| 起酶活的下降。 4 3 2 酶反应条件研究 4 3 。2 1 凡丁质酶的最适反应时间 由图禾2 可看出，粗酶液与底物作用的体系中，前3 0 m i n 酶、活随水浴反应时间 的增加而急剧增加，3 0 m i n 时酶相对活力最高，3 0 m i n 后酶相对活力随时闻的延 长保持在相对稳定的状态，在9 5 以上，反应到达至l j 7 0 m i n 时酶活下降至9 3 ， 说明酶反应速度随反应时阅的延长呈现先增大后减小的趋势。7 0 m i n 后反应速度 降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反成加强等 原因所至。要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶反应时间成正 比的这一段时间内进行测定。因此，3 0 r a i n 为本研究条件下最佳的酶反威时间。 2 03 04 05 0or oo 反应时间( h ) 圈秘反赢时阀对酶活酶影嚷 f i g 4 - 2i n f l u e n c eo fr e a c t i o nt i m eo nc h i t i