（发酵工程专业论文）产植酸酶木霉菌的遗传基因改良.pdf

at h e s i ss u b m i t t e df o rt h ea p p l i c a t i o no f t h em a s t e r sd e g r e eo f e n g i n e e r i n g t h eg e n e t i cm o d i f yo fp h y t a s et r i c h o d e r m a s t r a i n c a n d i d a t e ：w uy a n p i n g s p e c i a l t y ： f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o ry a n gp i n g p i n g s h a n d o n gi n s t i t u t eo fl i g h ti n d u s t r y , j i n a n ，c h i n a m a y , 2 0 1 0 k 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义匕 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 摊 h 期：互生年厶月么二_ 同 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权y 属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公丌阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向困家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与陔论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：础煎章门期：量l 年上月l 日 导师签名：拉翌至 山东轻t 业学院硕i j 学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第1 章绪论1 1 1 木：霉1 1 2 1 木霉形态1 1 2 1 木霉在农业中的应用l 1 2 植酸简介2 1 3 植酸酶3 1 3 1 植酸酶的分类4 1 3 2 植酸酶的理化性质4 1 3 3 植酸酶的应用5 1 4 基因组改组技术7 1 5 本研究的内容和目的7 第2 章产植酸酶木霉菌种的初筛和紫外诱变9 2 1 实验材料和方法1 0 2 1 1 实验材料11 2 1 2 实验方法13 2 2 结果与讨论1 6 2 2 1 植酸钙平板透明圈初筛1 6 2 2 2 木霉紫外诱变l6 2 - 3 本章小结2 0 第3 章亚硝基胍诱变2 l 3 1 实验材料和方法2 1 3 1 1 实验材料2l 3 1 2 实验方法2 2 目录 3 2 实验结果和讨论2 3 3 2 1 木霉亚硝基胍诱变曲线和n t g 诱变剂量的选择2 3 3 2 2 木霉亚硝基胍诱变菌株选育2 3 3 3 小结2 4 第4 章木霉原生质体的制备2 7 4 1 实验材料和方法2 7 4 1 1 实验材料2 7 4 1 2 主要仪器和设备2 7 4 1 3 主要试剂和溶液配制2 7 4 1 4 主要培养基2 7 4 1 5 原生质体的制备2 9 4 2 结果和讨论2 9 2 9 3 4 3 5 3 7 3 8 3 8 3 9 4 0 4 0 4 1 4 4 4 5 4 6 4 7 4 7 4 8 4 9 4 9 山东轻r 业学院硕i j 学位论文 6 2 1 液体发酵培养基筛选4 9 6 2 2 接科，量发酵工艺优化5 0 6 3 小结。5 2 参考文献5 3 致谢。5 9 在学期间主要科研成果6 1 一、发表学术论文6 1 二、其它科研成果6 1 山东轻t 业学院硕【：学位论文 摘要 植酸酶( m y o i n o s i t o lh e x a k i s p h o s p h a t ep h o s p h o h y d r o l a s e s ) ，是催化植酸及植酸 盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称。植酸酶主要存在于植物、微生物和一些动 物组织中。单胃动物如猪、鱼和家禽类不能消化植酸，饲料中加入植酸酶分解植 酸，促进单胃动物对磷和金属元素的吸收和利用，另外还可以降低环境中的磷污 染。 本文以木霉为研究对象，以各地采集木霉为基础筛选高产植酸酶菌株。通过 植酸钙透明圈筛选法，再经过植酸酶液体发酵酶活最终选择1 1 号菌株为出发菌 株进行基因组改组( g e n o m es h u f f l i n g ) 技术。1 1 号菌株通过紫外诱变和亚硝基胍诱 变，筛选优良诱变子，将两种诱变子的原生质体分别进行热灭活和紫外灭活，然 后随机融合，筛选融合子。 紫外诱变和亚硝基胍诱变均以出发菌株为诱变菌株，选着合适的剂量进行诱 变改良。从大量的诱变子中通过初筛和复筛筛选出合适的诱变子。紫外诱变子i i 的酶活为最高，且5 代后培养未发生回复突变，酶活为1 2 1 0 0 1 3u l ，将此菌 株编号为u v - i i ( p o 0 5 ) 。亚硝基胍诱变中n t g 4 酶活为0 9 4 0 0 1 4u l ( p 0 0 5 ) 。 对木霉的原生质体制备和再生条件进行了研究。分别考察了菌体菌龄、酶浓 度、酶解时间、酶解温度等因素对木霉原生质制备和再生的影响。霉菌细胞壁主 要成分是多糖，大多数是几丁质、少数种类是纤维素。以u v i i 出发菌株，以 蜗牛酶为溶菌酶制备木霉原生质体。研究得到木霉原生质体制备条件：蜗牛酶浓 度2 0 m g m l ，菌龄为2 0 h ，酶解时间2 0h ，酶解温度3 0 。 基因组改组技术将u v - i i 和n t g 4 的原生质体分别进行热灭活和紫外灭活， 然后随机结合，使用p e g 为融合剂进行原生质体融合。两两结合进行4 轮基因 组改组，筛选到融合子f u ，酶活为2 4 0 0 1 6u l ，比原始菌株分别高出3 2 0 。 融合子遗传特性稳定。 对融合子f u 进行液体培养基优化实验，得到优化培养基i i 培养基：葡萄 糖3 0g ，可溶性淀粉3 0g ，麸皮o 0 5g ，n h 4 n 0 3 0 5g ，m g s 0 4 7 h 2 0o 0 5g ， m n s 0 4 7 h 2 00 0 0 3g ，f e s 0 4 。7 h 2 00 0 0 3g ，c a c 0 3o 5g ，p h 值5 5 6 0 ，1 1 5 3 0 m i n 灭菌。同时对融合子f u 进行液体发酵条件优化：转速115 r m i n ，装液 量1 0 0m l ( 5 0 0 m l 三角瓶) ，接种量为3 ，温度3 0 ，发酵时间1 2 0 h ，酶活3 6 8 u l ，酶活提高3 3 3 。 7一_， 摘要 关键词：植酸酶；木霉；原生质体；基因组改组；发酵优化 i l il-i-ijl_ a b s t r a c t p h y t a s e s ( m y o i n o s i t o lh e x a k i s p h o s p h a t ep h o s p h o h y d r o l a s e s ) c a t a l y z e t h e h y d r o l y s i s o fp h y t a t e st om y o i n o s i t o la n dp h o s p h a t e s p h y t a s e sa r ev a r i e da n d w i d e s p r e a di nn a t u r e ，w h i c ho c c u r ri np l a n t s ，m i c r o o r g a n i s m s ，a n da n i m a lt i s s u e s p h y t a s e s ，i ng e n e r a l ，a r ek n o w nt o e n h a n c ep h o s p h a t ea n dm i n e r a l u p t a k e i n m o n o g a s t r i ca n i m a l ss u c ha sh u m a nb e i n g s ，p o u l t r y , s w i n e ，a n df i s h ，w h i c hc a n n o t m e t a b o l i z ep h y t a t eb e s i d e sr e d u c i n ge n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o ns i g n i f i c a n t l y i nt h i sp a p e r , p h y t a s eo ft r i c h o d e r m aw a ss t u d i e d ，a n dt r i c h o d e r m as t r a i n so f h i g hp h y t a s ey i e l dw e r e s e l e c t e df r o mt h o s es t r a i n sc o l l e c t e df r o mm u l t i p l e a r e a s n o 11s t r a i no fh i g hp h y t a s ey i e l dw a si s o l a t e df r o ms o i ls a m p l e sa n d ，w h i c h w a ss e l e c t e db yt r a n s p a r e n tc i r c l em e t h o da n dt h ep h y t a s ea c t i v i t ym e t h o do fl i q u i d f e r m e n t a t i o n t h er e s e a r c hi sa i m e dt oi m p r o v ep h y t a s ea c t i v i t yb yg e n o m es h u f f l i n g ， a n dt h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s n o 11s t r a i nw a st r e a t e d 晰t l lu l t r a v i o l e tr a d i a t i o na n d n t g , r e s p e c t i v e l y t h e ng o o dm u t a n t sw e r eo b t a i n e d t h ep r o t o p l a s t s o fg o o gm u t a n t s w e r eh e a t k i l l e da n du v - i n a c t i v a t e d ，a n dc o m b i n e dr a n d o m l y a tl a s tf u s a n t sw h i c h w e r eh i g hp h y t a s ey i e l dw e r es e l e c t e d w i e d t y p es t r a i nw a st r e a t e dw i t hu l t r a v i o l e tr a d i a t i o na n dn t g , r e s p e c t i v e l y t h e nt h eo p t i m a ld o s ef o rm u t a n tw e r es e l e c t e d l o t so fm u t a n t sw e r es e l e c t e dw i t h p h y t a s ea c t i v i t ym e t h o d t h eh i g hp h y t a s ey i e l d s t r a i no fu vr a d i a t i o na n dn t g m u t a n tw a su v 二i ia n dn t g 4 t h ep h y t a s ea c t i v i t yo fw h i c hw e r e1 214 - 0 0 13u l p 0 0 5 ) a n do 9 44 - 0 0 1 4u lp 0 0 5 ) ，r e s p e c t i v e l y t h ec o n d i t i o n sf o rp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o nw e r es t u d i e d t h e e f f e c t so fs t r a i na g e ，t h el y s o z y m ec o n c e n t r a t i o n ，t h el y s o z y m et r e a t i n gt i m ea n d t e m p e r a t u r eo np r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t w e r es t u d i e d t h ec h i e f c o n s t i t u e n to ff u n g a lc e l lw a l li sp o l y s a c c h a r i d e ，w h i c hi sm a d ec h i e f l yo fc h i t i na n d f e wc e l l u l o s e i tw a sp r e p a r e df o rt r i c h o d e r m al y s o z y m ep r o t o p l a s t sw i t hu v - i i s t r a i na n ds n a i le n z y m e t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so ft r i c h o d e r m ap r o t o p l a s ta r ea s f o l l o w ：s n a i le n z y m ec o n c e n t r a t i o n2 0 m g m l ，s t r a i na g e2 0 h ，l y s o z y m et i m e2 0h ， l y s o z y m et e m p e r a t u r e3 0 u v 二i ia n dn t g 4p r o t o p l a s t sw e r eh e a t - k i l l e da n du v - i n a c t i v a t e d ，a n d c o m b i n e dr a n d o m l yw i t hp e ga st h ei n t e g r a t i o na g e n t so fp r o t o p l a s tf u s i o n f u - w a so b t a i n e df r o mg e n o m er e o r g a n i z a t i o n ，p h y t a s ea c t i v i t yo fw h i c hw a s2 44 - 0 0 16 u la n dh i g h e r3 2 0 c o m p a r e dw i t ht h eo r i g i n a ls t r a i n s t h ef u s a n ti sg e n e t i c a l l y i i i a b s t e a c t s t a b l e t h er e s u l tw a sf o u n dt h a ti i l i q u i dm e d i u mw a st h eb e s tm e d i u m t h em e d i u m i i ：g l u c o s e3 0g ，s o l u b l es t a r c h3 0g ，w h e a tb r a no 0 5g ，n h 4 n 0 3 0 5g ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5g ，m n s 0 4 7 h 2 00 0 0 3g ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 3g ，c a c 0 3 0 5g ，p hv a l u e o f5 5 6 0 ，1l5 3 0 m i ns t e r i l i z a t i o n t h ec o n d i t i o n so ff u ( 至) o p t i m i z a t i o n ：s h a k i n g s p e e d1 15 r m i n ，m e d i u mv o l u m e 10 0m l ( s 0 0m lv o l u m e t r i cf l a s k ) ，i n o c u l a t i o n n u m b e r3 ，t e m p e r a t u r e3 0 ，f e r m e n t a t i o nt i m e12 0 h ，p h y t a s ea c t i v i t y3 6 8u l a n dt h ee n z y m ea c t i v i t yw a si n c r e a s e d3 3 3 k e y w o r d s ：p h y t a s e ，t r i c h o d e r m a ，p r o t o p l a s t ，g e n o m es h u f f l i n g ，o p t i m i z a t i o no f f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n i v 山东轻i 。业学院硕i j 学位论文 1 1 木霉( t r i c h o d e r m as p ) 1 1 1 木霉形态 第1 章绪论 木霉属f 半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，粘孢菌类( g l o i o s p o r a e ) ，是一类普 遍存在的真菌，常见于土壤中，是士壤微乍物的重要群。常见的木霉有绿色木霉、 康宁木霉等。 木霉菌落丌始时为白色，致密，圆形，向阴周扩展，后从芮落中央产生绿色 孢子，中央变成绿色。菌落周围有白色菌丝的生长带。最后整个菌落全部变成绿 色。绿色木霉菌丝白色，纤细，宽度为1 5 - - 2 4 微米。产生分生孢子。分生孢子 梗垂直对称分岐，分生孢子单生或簇生，圆形，绿色。绿色木霉菌落外观深绿或 蓝绿色：康氏木霉菌落外观浅绿、黄绿或绿色。 绿色木霉适应性很强，孢子在p d a 培养基平板i 二2 4 时萌发，菌落迅速扩 展。培养2 天，菌落直径为3 5 , - - 5 0 c m ；培养3 天，菌落直径为7 3 8 o c m ；培 养4 天，菌落直径为8 1 9 o c m 。 通常菌落扩展很快，特别在高温高湿条件下几天内木霉菌落可遍佰整个料 面。菌丝生长温度4 - 4 2 ，2 5 - 3 0 生长最快，孢子萌发温度1 0 3 5 ，1 5 3 0 萌发率最高，2 5 - 2 7 菌落由白变绿只需4 5 昼夜，高温对菌丝生长和萌 发有利。孢子萌发要求相对湿度9 5 以上，但在十燥环境也能生长，菌丝生长 p h 值为3 5 - - 5 8 ，在p h 值4 - 5 条件下生长最快。 1 1 2 木霉在农业中的应用 ( 1 ) 木霉的生物防治作用 在该属的9 个已知种中，其中绿色木霉、哈茨木霉、康氏木霉、钩状木霉和 多孢木霉作为生防因子被报道的较多，它们至少对1 8 个属的2 9 种病原菌任体外 或在活体上具有拮抗作用。木霉菌对植物病害的生防作用机制包括竞争作用、重 寄生作用、抗生作用和诱导植物抗性作用等。不同作用方式之间往往存在着协同 作川。 ( 2 ) 木霉的促进植物生长作用 c h a n g 通过实验证实，当用泥土或糠为基质的哈茨木霉培养物或其分生孢子 悬浮液处理土壤后，辣椒、长春花和菊花等植物均出现高发芽率、丌花早而多、 植株高及植株湿重增加的现象【4 0 1 。木霉与根际微生物具有相互作用，木霉与菌 第1 章绪论 根菌混合后，生防菌对植物根际大多数真菌有抑制作用或重寄生作用，或两者皆 有，引起真菌种群数量的减少和区系组成变化。根际能力强的木霉菌株能有效地 利用复杂的碳水化合物，如棉绒，纤维素，木质素及木聚糖作为碳源，菌丝在根 表面生长较快，能随着根的生长进行拓展，木霉中有些菌株具有溶解可溶性或微 溶性矿物质的能力，促进了植物对矿物质的吸收，从而促进植物的生长。木霉代 访 产物，如哈茨木霉和康宁木霉能产生一种扩散的因子，刺激植株生长。 ( 3 ) 木霉可诱导植物产生抗病性 木霉能够产生诱导因子诱导植物组织产生防御反应。分子质鼍2 2 0 0 0u 的木 聚糖酶诱导植物产生的防御反应包括：k + ，h + 及c a 2 + 离子通道的打开，pr 蛋白 的生物合成以及乙烯生物合成。y e d i d i ai ，b e n h a m o un 和c h e ti 观察到木霉穿入 黄瓜根部主要抑制了根部表皮和外表皮，在真菌刺穿位点外发现形成障碍的沉积 物，壁添加物包括大量胼胝质。生物化学分析表明，接种木霉可分别在4 8 、7 2 h 提高过氧化物酶、几丁质酶的活性。 ( 4 ) 木霉在生物有机肥中的应用 在农业生产中生物有机肥的而是用会越来越普遍。王慧中和赵培沽【4 i 】报道 应用r h a r z i a n u m 生产的多效荫肥可以明显地增加蔬菜的株高、叶宽、鲜重，并 对对白绢病的防效町达7 7 6 。 1 2 植酸( p h y t a t e ) 简介 植酸 m y o - i n o s i t o l ( 1 ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 ) h e x a k i s p h o s p h a t e ( i u p a c - i u b ，1 9 6 8 ) 】，又称肌 醇六磷酸，是植物籽实中磷的主要贮存形式。在谷物、豆类、油料等作物的籽实 中，磷的基本储存形式是植酸磷，其含量高达种子干重的l 3 ，约占植物中 总磷的6 0 0 旷8 0 。植酸足在p h l 6 酸性条件下带有3 - 6 个阴离子，以一种聚阴 离子形式存在于物体质中，如谷物、( 鸟、昆虫、蚯蚓等的) 前胃、家禽的胃和 人的胃【4 1 。植酸一一种阴离子螫合剂一与多种二价阳离子形成复合物，如c a 2 + ， m 9 2 + ，z n 2 + ，c u 2 + ，f e 2 + ，a n dm n 2 + 等【5 1 。而且植酸能在酸性和碱性条件下与蛋白形成 复合物，它们之间的相互作用力影响到蛋白的窄间结构，从而降低蛋f l l 酶活、蛋 白的水溶性以及水解能力等p j 。 2 山东轻丁业学院顾l ：学位论文 u i o h 9 一p 。o h 妙。一r 删、啦、佣o h h o i l，o h h 。趸一弋研否叫 。一拳o h 图1 1 植酸的化学结构式( c 6 h 1 8 0 2 4 p 6 ) 簟胃动物体内缺乏能分解植酸( 六磷酸肌醇) 的酶，凶此以植酸形式存在的 磷难以被动物吸收和利用，其利用率仅为0 4 0 ，从而造成了许多问题引。首 先，饲料中的有机磷源不能被水解利用，因此必须添加无机磷( 主要磷酸氢钙) 以满足动物生长对磷的需求。其次，单胃动物不能吸收和利用植物性饲料中的有 机磷，其中不能利用的磷占8 5 左右，这些磷有机磷从而直接排出体外，造成t 壤和水源磷污染。再次，植酸磷还是一种抗营养凶子。它在动物胃肠道的消化过 程中会与多种会属离子以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，抑制一些消化酶 的作用，使多种氨基酸和微量元素的生物利用率下降，降低了动物埘以上营养物 质的生物利用率。第四，目日仃饲料生产中用于生产磷酸氧钙的原料足磷矿、石灰 和硫酸。全球磷矿的资源有限，且生产1 吨磷酸氧钙成品就要排出约1 吨以上的 废物( 磷石膏) ，大型磷酸氢钙生产企业一天的产量在数百吨以一h ，每人排出的废 物数量更火，企业附近磷石膏堆积成垃圾山，磷石膏容易下滑而成为附近的安全 隐患，而硫酸也造成，限重的空气、水源和土壤的污染；另一方面，饲料中添加无 机磷将造成磷源的浪费，饲料成本增加i t , 2 。 1 3 植酸酶( p h y t a s e ) 植酸酶( m y o i n o s i t o lh e x a k i s p h o s p h a t ep h o s p h o h y d r o l a s e s ) 是催化植酸及植酸 盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称，自然界存在很多能水解植酸盐的酶类，统 称“植酸酶”。植酸酶f “泛存在于动植物组织和微生物细胞中，在植物中主要存 在于谷物和豆科植物的种子和花粉中，而在动物中主要存在于脊椎动物的红细胞 和血浆以及哺乳动物的小肠内。产植酸酶的微生物有细菌、酵母和真菌等，饲料 中使用的植酸酶芒要来自真菌，比如黑曲酶( a s p e r g i l l u ss p ) ，其，产的植酸酶 第1 章绪论 被认为足活性最强的【6 7 】。 2 0 0 8 年2 月，欧盟发出了磷资源的红色预警，我国专家称中国的磷资源 也只能丌采2 0 年。世界能源危机加重， 原料价格普遍上涨，环保压力同益昭 显，这无疑为植酸酶的发展提供良机，科技的发展将促使植酸酶生产与应用进 入一个新的发展时期。如何从“植酸酶之困”转变为“植酸酶之盛”，是每个从 业者应该思考的问题。 1 3 1 植酸酶( p h 螂e ) 的分类 植酸酶是一个广义概念，依据不同的标准可对其进行分类。基于酶的最适 p h 可分为酸性植酸酶和碱性植酸酶；基于酶的来源可分植物植酸酶、真菌植酸 酶和细菌植酸酶；基于酶水解植酸的立体专一性可分为3 植酸酶( 3 p h y t a s e ，e c 3 1 3 8 ) 、6 - 植酸酶( 6 一p h y t a s e ，e c3 1 3 2 6 ) 和5 - 植酸酶( 5 p h y t a s e ，e c3 1 3 7 2 ) ； 基于酶的高级结构和催化机理可分为组氨酸酸性磷酸酶( h i s t i d i n ea c i d p h o s p h a t a s e s ，h a p ) 植酸酶、1 3 一螺旋桨植酸酶( b p r o p e l l e rp h y t a s e ，b p p h y ) 、半 胱氨酸磷酸酶( c y s t e i n ep h o s p h a t a s e s ，c p ) 植酸酶和紫色酸性磷酸酶( p u r p l ea c i d p h o s p h a t a s e s ，p a p ) 植酸酶。 1 3 2 植酸酶( p h y t a s e ) 的理化性质 1 3 2 1 植酸酶( p h y t a s e ) 的分子量 植酸酶的物理性质植酸酶的分子量依来源不同差异很大，主要分布在3 5 - - 一 2 0 0k d a 之间，最大达7 0 0k d a ，最小仅1 0 - - 1 3k d a 。真菌和酵母菌植酸酶的 分子量较大，应该归咎于它们在宿主系统中的糖基化。p e n i c i l l i u mo x a l i c u m 植酸 酶在酵母菌p i c h i a p a s t o r i s 中表达时蛋白分子最接近于6 2 5k d a ，分子量增长了 2 5 ，这是由n 糖基化引起的【b 】。 1 3 2 2 植酸酶( p h y t a s e ) 的催化作用及其机理 含有c a 2 + 的双配位基( p 3 c a 2 + _ p 4 ) i n s p 6 最初连接细菌植酸酶的两个磷酸集 团的活性位点，第一个磷酸集团水解在第三个碳位点开始，水解产物为 d i n s ( i ，2 ，4 j ，6 ) p 5 。第一个磷酸集团水解后，酶结合在i n s ( 1 ，2 ，4 ，5 ，6 ) p 5 中另一个 ，配位键( p 1 c a 2 + p 2 ) 。鉴于2 - d n m r 对反应中j 日j 体的分析，继第二个磷酸集团水 解后，水解产物为i n s ( 2 ，4 ，5 ，6 ) p 4 。最后，酶结合在i n s ( 2 ，4 ，5 ，6 ) p 4 的配位键 ( p 5 c a z + p 4 ) 上，最终在第五个碳位点水解磷酸集团，终产物为m y o i n s ( 2 ，4 ，6 ) p 3 【1 6 】 o 在植酸酶水解植酸的过程中，释放无机磷和被植酸螯合的大量金属元素，如 锌、铜、钙、锰等矿物元素，以及螯合的蛋白质类，释放出的物质能够被有效利 用。 植酸酶根据水解植酸起始水解酯键不同，可以分为三类：3 植酸酶，6 植酸 4 山东轻i ：业学院硕i ：学位论文 酶5 植酸酶。3 植酸酶首先从植酸的c 3 开始水解酯键而释放出无机磷。6 植酸 酶首先从植酸的c 6 丌始。5 植酸酶从c 5 位丌始释放磷酸皋团，目日订发现仅存 于百合( l i l i u ml o n g i f l o r u m ) 花粉和一株瘤胃细菌( s e 彪n o m o n a sr u m i n a n t i u ms u b s p 1 a c t i l y t i c a ) 。o s t a n i n 等【l7 】对植酸酶催化机制做了详细阐述：当植酸酶的活性部 位与底物的磷酸群体接触时，活性中心r h g x r x p 中的两个精氨酸与底物的磷 酸基团相互作用，形成了酶底物的复合物，r h g 中组氨酸的咪哗基对磷酸基团 的磷原子发生亲核攻击，同时c 端h d 元件中的天冬氨酸为底物离去基团提供 一个质子，使底物以醇或酚的形式离去，磷酸基团从底物i 二脱离，与r h d 中组 氨酸形成磷酸一组氨酸复合物，环境水分子中的氧原子对磷原子再次进行亲核攻 击，活性中心某一推断的残基b 为组氨酸的咪唑基提供质子，使磷酸基离丌 第1 章绪论 1 3 3 2 植酸酶在人类营养中应用 发展中国家，饮食中矿物元素的缺乏往往是卜h 极端的饮食习惯照成的。谷物 和豆制品食物中的植酸抑制矿物元素的吸收【2 3 1 。植酸在人类消化道的酸性环境 下为不溶吉? ；：类，因此必须矿物元素降低其在体内的，- 物应用。另外人的小肠不易 消化未分解的植酸，导致余属离子吸收的不平衡。植酸酶的使用减少囡植酸引起 的矿物元素的缺乏得到广泛的关注。人们用来自谷物和豆类的植酸酶，经过预处 理计入到食物制作工艺中，如浸湿、出芽和发酵等工艺，可以降解其中的植酸【2 4 1 。 a n i g e r 中的植酸酶可以作为面包添加剂 2 5 1 。植酸酶用于各种面包的形成， 促使面包的加速醒发，增加体积，改善口感和形状。植酸酶的的加入除了能够在 不受f 卜面团p h 的影响下缩短发酵时间，还能降低，l 三面团和新鲜面包l l 的植酸。 在小麦面包制作的整个工艺中，l a c t o b a e i l l i 和b i f i d o b a c t e r i u m 两种菌株作为发酵 剂，显示了极强的植酸降解性【2 6 ，2 7 1 。 1 3 3 3 植酸酶在水产业中的应用 水产、i k 中的一个重要忧患就是鱼饲料中无机磷的使用对鱼类的生长和水环 境都有关键的影响，而其对两者的作用恰好足相反的，无机磷的添加成功的增加 了鱼类的生长，但其排泄的无机磷对水质照成严重的污染，因此人们添加植酸酶 研究它在其中的作用。大西洋鲑鱼喂养带有植酸酶的饲料，结果显示增加尘长的 同时也抵消了植酸抑制蛋白消化的负面效应【2 8 1 。p a n g a s i u sp a n g a s i u s 鱼苗的饲料 中含有3 5 的料蛋白，添加植酸酶，结果显示改善生长、干物质量和相蚩自的消 化【2 9 1 。水产业中添加植酸酶的研究充分表明植酸酶的供应能增强磷、氮和其他 矿物元素的生物学应用，从而降低水环境的磷负荷【3 0 1 。 1 3 3 4 植酸酶在土壤改良中的应用 植酸磷含量占土壤中有机磷含量的5 0 以上，而且又极少被植物利用。有报 道指f 十 在植酸压力下，多种植物如烟草、大麦、西红柿和苜蓿等具有胞外植酸酶 活性。当植物孵育在含有能够分泌植酸酶微生物的或者直接添加纯植酸酶的培养 基或者t ：壤中，植物能够在低磷酸盐或者低植酸的情况下利用分解的磷【3 1 , 3 2 , 3 3 】。 在磷含量一定的条件下，相比对照，植物与分泌植酸酶的b a m y l o l i q u e f a c i e n s f z b 4 5 戈一孵育时生长明显增加p 训。 1 3 3 5 植酸酶磷酸用于低肌醇磷酸生产 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 植酸酶广泛用于医学上重要化合物的制备，即 d - m y o - i n o s i t o l - 1 ，2 , 6 一t r i p h o s p h a t e ，d - m y o - i n o s i t o l - 1 ，2 ，5 一t r i p h o s p h a t e ， l m v o i n o s i t o l - 1 ，3 ，4 一t r i p h o s p h a t e ，a n dm y o - i n o s i t o l - 1 ，2 ，3 一t r i p h o s p h a t e 【3 5 ，3 6 】。植酸的 低磷酸派7 物对细胞内第二信使有重要作用。低肌醇磷酸不同的异构体对预防糖 6 山东轻t 业学院倾l ：学位论文 尿病并发症、抗炎，抗血管增生和抗癌都显示药理学效应。低肌醇磷酸也叮以控 制血胆脂醇过多和动脉粥样硬化来改善心脏疾病的条件，也能阻止肾脏结石的形 成。 1 4 基因组改组技术 虽然品种改良拥有合理的方法和成熟的技术，但是对于育种工程来说需要将 更加复杂的表型结合在一起。基因组改组技术( g e n o m es h u f f l i n g ) 一经提出便成为 一种新璎的令细胞表型融合技术，迅速改善基冈工程中的缺漏。这种方法需要提 供多亲株原生质体，经过递推融合，整合整个基冈组序列，不需要知道基冈组序 列编码或者染色体的网状结构。基凶组改组不仅能提高菌株的生产能力，还能融 合复杂的表型性状于一体。 基冈组改组技术是在传统诱变基础上，通过细胞融合，对诱变后的细胞进行 基因组重组，从而达到将其优良特征结合在一起的日的。近年来不断被应用于只 要、食品制造及环境工程等众多领域的菌种改良研究中。 第1 章绪论 1 2 技术路线图 山东轻丁业学院硕l j 学位论文 第2 章产植酸酶木霉菌种的初筛和紫外诱变 木霉属真菌广泛存在于自然界中，常见于土壤、腐烂的木材等其它植物的有 机体中，大部分木霉由于未发现其有性生殖阶段而归类于半知菌哑门。f 1 自，国内 外已经有5 0 多种木霉商品化制剂。最常用的木霉牛防因子有t h a r z i a n u m ，t v i r i d e ， 和zv i r e n s 特别是t h a r z i a n u m 的研究最为深入。木霉作为牛防因子，对病原菌 具有拈抗作用。据不完全资料统计，木霉至少对1 8 个属的2 9 种病原真菌在体外 或体内有拈抗作用。目前木霉在植物真菌病害的防治中得到广泛应用，特别是对 立枯丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 、镰刀菌( f u s a r i u m s p p ) 、齐整小核菌( s c l e r o t i u m r o l 弦l i ) 、疫霉菌( 尸砂t o p h t h o r a s p p ) 、腐霉菌( p y t h i u m s p p ) 、链格孢蔺( a l t e r n a r i a a l t e r n a t a ) 等引起的幼苗立枯病、白绢病、枯萎病、疫霉病、猝倒病等一t - 1 # 病害具 有较好的防治效果。困内专家近几年将木霉用于中药材病害以及草坪病害的，- 物 防治，如杜仲、人参、三七等这些中药植物效果也较好。木霉菌对植物病害的生 防作用机制包括竞争作用、重寄生作用、抗生作用和诱导植物抗性作用等。不同 作用方式之i 口j 往往存在着协同作用。 植酸酶分解植酸，生成无机磷和肌醇类物质，降低植酸的抗营养作用，提高 会属元素的生物利用，消除植酸对蛋白的抑制作用。近二十几年来，植酸酶已经 普遍应用到饲料工业中，给农业带来巨大创收的同时，也消除了往饲料中添加无 机磷造成的环境中磷负荷过重的影响。 植酸酶的研究已经有一百多年的历史了，植酸酶存在于植物的种子和花粉 中，以及广大的微生物中。目前已经从多种微生物中分离到植酸酶。细菌中有： 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、假单孢菌 ( p s e u d o m o n a s ) 等。枯草芽孢杆菌的植酸酶活性较高，而大肠杆菌经常作为其他 菌株基因表达的宿主。真菌产植酸酶：根霉( r h i z o p u s ) 、毛霉( m u c o r ) 、青霉 ( p e n i c i l l u m ) 和曲霉( a s p e r g i l l u s ) 。分离到2 0 0 多株产植酸酶的丝状真菌，其中绝 大多数属于曲霉。曲霉菌株经过检测，发现它们均有较高的酶活，而f l 酶活最高 的是黑曲霉( 彳n i g e r ) ，而最早发现有植酸酶活性的是无花果曲霉( 么) q c c u m ) ，并 且无花果曲霉的产酶效率最高。曲霉的植酸酶活性都较高，除了以上两种在工业 上已经应用，其它曲霉植酸酶活性也很高，如土曲霉( a t e r r e u s ) 、黄曲霉 似f l a v u s ) 、白曲霉似e a n d i d u s ) 币l l 烟曲霉0 f u m i g a t u s ) 。植酸酶在制备铡料添加剂 时，需要高温处理，所以研究者在研究植酸酶时着重研究了植酸酶的耐热情况， 除了在原有产植酸酶菌株的基础上的改造，研究人员也丌始关注极端微生物的产 植酸酶情况，如一些嗜热的极端微生物类，比如菌丝霉属的嗜热菌丝霉 ( m t h e r m o p h i l a ) ，蓝霉属的嗜热蓝霉( t t h e r m o p h i l u s )