（环境工程专业论文）典型富营养化湖泊微囊藻毒素分布特征及主要影响因子差异性分析.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 我国湖泊分布广泛，数量众多，为全国城镇提供了5 0 以上的饮用水水源，但我 国湖泊富营养化问题突出，那些饮用受富营养化影响的水源水的人群摄入m c s 的危险 性极高。因此，为了保障居民生活饮用水的安全，降低m c s 对人类健康的影响，开展 我国典型富营养化湖泊中m c s 含量分布特征的调查，了解不同湖区富营养化湖泊中受 m c s 的影响程度迫在眉睫。 首先，本研究选择高效液相色谱法( h p l c ) 建立能同时分析环境水样中5 种m c s ( m c r r 、y r 、l r 、l a 和l y ) 的分析方法，以用于环境水样中痕量m c s 的快速分 析。该方法的回收率在7 3 9 1 0 3 3 之间，5 种m c s 的最低检测限在0 0 1 5 0 0 3 5ug l 之间。在建立快速分析方法的基础上，本研究分别选取东部平原湖区的太湖、巢湖、 蒙新高原的呼伦湖、云贵高原的滇池和洱海，5 大典型富营养化湖泊作为研究对象，分 析表层水中5 种m c s 的含量，对不同湖泊中5 种m c s 含量与常规指标进行相关性分 析、回归分析，明晰不同湖泊m c s 的主要影响因素，为湖泊富营养化的分区和分期控 制提供依据。本研究分析的常规项目包括叶绿素a ( c l l l 口) 、总磷( 1 1 p ) 、温度( t ) 、 溶解性磷( p 0 4 + ) 、总氮( t n ) 、氨氮( n h 4 n ) 、溶解氧( d o ) 、p h 值、透明度 ( s d ) 、总有机碳( t o c ) 1 0 项。主要结论如下： ( 1 ) 本论文建立的同时检测水体中痕量5 种m c s ( m c r r 、y r 、l r 、l a 和l y ) 的分析方法与以往方法比有经济、快速、灵敏、准确的且检测m c s 种类多的优点。 ( 2 ) 通过对三大湖区典型湖泊中m c s 的分析，发现，各湖区检出m c s 种类由多 到少的顺序依次为云贵高原湖区、东部平原湖区和蒙新高原湖区。 ( 3 ) 同一湖区不同湖泊中5 种m c s 的检测结果表明，同一湖区内t l i 指数越高 的，检出m c s 的种类较多、含量较高。巢湖和太湖的t l i 指数分别达6 9 4 5 和7 1 1 3 ， 巢湖中3 种m c s ( m c r r 、m c l a 和m c l y ) 的检出频率较高；太湖中4 种m c s ( m c r r 、m c l r 、m c l a 和m c l y ) 的检出频率较高；滇池和洱海的平均t l i 指 数分别达6 3 1 6 和5 4 4 1 ，滇池5 种m c s 均检出，洱海4 种m c s ( m c r r 、y r 、l r 、 l a ) 的检出频率较高。 ( 4 ) 通过对各个湖泊环境因子的主成分分析、湖泊中m c s 与环境因子相关性分 析及多元回归分析发现：影响各湖泊中m c s 的主要环境因子、各湖泊中m c s 与环境 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 l 页 因子的相关性、以及各湖泊中与m c s 存在线性关系的环境因子存在较大的差异性。 关键词富营养化；微囊藻毒素；主成分分析；相关性分析；回归分析；区域差异性 西南交通大学硕士研究生学位论文第l ii 页 a b s t r a c t m a n yl a k e sh a v ew i d ed i s t r i b u t i o ni nc h i n aa n dt h el a k e sp r o v i d e sm o r et h a n5 0 o f t h ed r i n k i n gw a t e rs o u r c 。= st ot o w n s ，b u tt h e i re u t r o p h i c a t i o ni s p a r t i c u l a r l yo u t s t a n d i n g ， p e o p l et h o s ew h od r a n kf r o mt h ei n f l u e n c e dw a t e rb ye u t r o p h i c a t i o nh a v eah i g h e rr i s ko f i n t a k i n go fc y a n o b a c t e r i a lt o x i n s t h e r e f o r e ，i no r d e rt og u a r a n t e et h es a f e t yo fr e s i d e n t s l i v i n ga n dd r i n k i n gw a t e r , r e d u ct h ec y a n o b a c t c r i a ( m i c r o c y s t i n s ，m c s ) t h a ta f f e c th u m a n h e a l t h ，i ti si m m i n e n tt h a tc a r r y i n go u tt h ee u t r op h i cl a k e si nt h ei n v e s t i g a t i o no ft h em c s d i s t r i b u t i o nc h a r a c t e r i s t i c sa n du n d e r s t a n d i n gt h ed i f f e r e n te u t r o p h i cl a k e st h a ti n f l u e n c e db y t h e m c s f i r s t l y , t h i sp a p e ri n t e n d st oc h o s eh p l ct oe s t a b l i s ht h em e t h o dw h i c hc a na n a l y s e f i v ek i n d so fm c s ( m c r r , y r , u 乙l a ，l y ) a tt h es a m et i m et oa d a p tt oa n a l y s et h et r a c e m c s r a p i d l yi nw a t e re n v i r o n m e n t r e r u l t ss h o w nt h a tt h er i o v 甜e so ft h i sm t h o df o rf i v e v a r i a n t sw e r ei nt h er a n g eo f7 3 9 - 10 3 3 ，t h el i m i t so fd e t e c t i o n ( l e d ) o ft h i sm t h o dw e r e o 015 - 0 0 35pg l t h i sp a p e rs e l e c t se a s t e r np l a i n ，m o n g o l i a - s i n k i a n gp l a t e a u , y u nn a n - g u i z h o up l a t e a ut y p i c a lo fe u t r o p h i c a t i o nt h r e eg r e a tl a k e - a r e aw h i c hi n c l u d et e dl a k e ，c h a o l a k e ，d i a n c h il a k e ，e r h a il a k eh u l u nl a k ef i v et y p i c a le u t r o p h i cl a k ea so b j e c t ，a n a l y s ef i v e k i n d so fm c si ns u r f a c ew a t c r , d i s g u s st l l ec h a r a c t e r i s t i c so fm c sc o n t e n ti nt h es a m es e a s o n b u td i f f e r e n tl a k e - a r e a , t h e na n a l y s et h er e l e v a n t , r e g r e s s i o ne q u a t i o nb e t w e e nt h em c s c o n t e n ta n dc n v i r o n m e n r a lq e n c aw h i c hi n c l u d ec h l o r o p h y l la ( c h l 口) ，t o t a lp h o s p h o r u s ( t p ) ，t e m p e r a t u r e ( t ) ，s o l u b i l i t yp h o s p h o r u s ( p 0 4 + ) ，t o t a ln i t r o g e n ( t n ) ，a m m o n i a n i t r o g e n ( 山- n ) ，t h ed i s s o l v e do x y g e n ( d o ) ，p hv a l u e ，t r a n s p a r e n c y ( s d ) ，t o t a l o r g a n i cc a r b o n ( t o c ) i nd i f c r e n tl a k ea n dl a k e - a r e a st or e a l i z et h ed i v i s i o na n ds t a g i n g p r e v e n t i o na n dc o n t r o lt h el a k e sm c sp o l l u t i o n n l em a i nc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h em e t h o dt h a ta n a l y s ef i v ek i n d so fm c si sm o r ee c o n o m i c a l ，f a s t e r , m o r es e n s t i v e ， m o r ea c c u r a t ea n dm o r es o r t so fm c s c o m p a r et ot h ef o m e r m e t h o d s ( 2 ) t h r o u g ht h em c s a n a l y s i so ft h et h r e eg r e a tl a k e - a r e a sw a t e r , i tc o u l df o u n dt h a t y u n n a n g u i z h o up l a t e a ul a k ea r e ad e t e c t e dm o s tk i n d so fm c s ，e a s t e r np l a i nl a k ea r e aa n d m o n g o l i a s i n k i a n gp l a t e a ul a k ea r e at a k e ns e c o n dp l a c e ( 3 ) c o n t e c t so fm c ss h o w nl a k ew h i c hh a dh i g h e rt l ii n d e xi nt h es a m el a k ea r e ah a dm o r e s o r t so fm c s ，c o n t e n t sw e r eh i g l l e rt o o t h et l ii n d e xo fc h a ol a k ea n dt a i h ul a k ew e r e 6 9 4 5a n d71 13 ，r e s p e c t i v e l y , i nc h a ol a k ew a t e r ，m c - r r ，m c - l aa n dm c l yd e t e c t e d h i g h e rf r e q u e n c y ，i nt a il a k em c - r r ，m c - l r ，m c l a ，m c - l yd e t e c t e dh i g h e rf i e q u e n c y , 西南交通大学硕士研究生学位论文第l v 页 a v e r a g et l ii n d e xo fe r h a il a k ea n dd i a n c h il a k ew e r e6 3 16a n d5 4 4 1 ，r e s p e c t i v e l y , 5 k i n d so fm c sa led e t e c t e di nd i a n c h il a k e ，f o u rm c s ( m c - r r , y i l 珉l a ) w e r ed e t e c t e d h i g h e rf r e q u e n c yi ne r h a il a k e ( 4 ) r e r u l t so fp r i n c i p a lb yt h el a k e se n v i r o n m e n t a lf a c t o r s ，t h ec o r r e l a t i o na n a l y s i sa n d m u l t i p l er e g r e s s i o ne q u a t i o na n a l y s i sb e t w e e nm c sa n de n v i r o n m e n t a lq e n es h o w nl a r g e d i f f e r e n c e so ft h ei m p a c tf a c t o r si nl a k e se n v i r o n m e n t a l ，t h el i n e a ra n dr e l e v a n c eb e t w e e n m c sa n de n v i r o n m e n t a lf a v o r si nd i f f e r e n tl a k e s k e yw o r d se u t r o p h i c a t i o n ；m i c r o c y s t i n s ；p r i n c i p a lc o m p o n e n t ；r e l a t i v i t y ；r e g r e s s i o n a n a l y s i s ；o t h e m e s s 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 1 1 研究背景及意义 第1 章绪论 当前，水体富营养化已成为全球性的环境问题。联合国环境规划署发布的全球 环境展望2 0 0 4 年年度报告( g e o y e a rb o o ko f , 2 0 0 4 ) 表明，在其所调查的6 6 个水 域中，有4 0 正遭受中、重程度富营养化的影响。近年来，我国各类水体也存在不同 程度的富营养化现象，湖泊水库表现尤为突出。1 9 9 9 年国家环保总局对全国1 3 0 余个 湖泊的调查表明，重富营养化湖泊占调查总数的4 3 5 ，中富营养化湖泊占调查总数 的4 5 o ，而分布在城市和近郊的一些湖泊甚至达到了超富营养化状态【l 】。水体的富营 养化导致藻类的迅猛生长，尤其是蓝藻的过度繁殖，造成水体腥臭、透明度下降、消 耗水体溶解氧，导致蓝藻水华的暴发。我国湖泊中最常见的水华蓝藻种类为铜绿微囊 藻，除此以外，其他水华蓝藻如束丝藻、鱼腥藻和颤藻也是常见的水华蓝藻种类。这 种藻类产生的毒素被称为微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n s ，m c s ) ，此毒素是淡水水体中危害 最严重的一类，由于未能及时检测水质的污染变化情况及采取相应的控制措施，致使 这些毒素存在于饮用水或娱乐水中，富集于鱼类或贝类并通过食物链传递，严重威胁 了人类的健康，全球已经发生了多起m c s 中毒并引起死亡的事故。例如，1 9 8 8 年在巴 西的b a h i a l t a p a r i c a 水库受到蓝藻毒素污染引发超过2 0 0 0 人感染肠胃炎，影响延续了 一个半月，共有8 8 人死亡，而引发这次m c s 污染的水华蓝藻正是铜绿微囊藻。1 9 9 6 年巴西c a r u a r u 爆发血透析肝炎事件，也是由于水库源水中含有m c s ，造成5 0 人死亡 【2 】 o 我国是一个湖泊众多的国家，全国约有2 万多个湖泊，总面积达9 万多平方千米， 其中面积大于1 虹2 的有2 3 0 0 多个，提供了全国城镇5 0 以上的饮用水水源，而湖泊富 营养化现象突出，那些饮用受富营养化影响的水源水的人群摄入m c s 的危险性极高。 因此，为了保障居民生活饮用水的安全，降低m c s 对人类健康的影响，开展我国富营 养化湖泊中m c s 含量分布特征的调查，了解不同湖区富营养化湖泊中受m c s 的影响程 度是迫在眉睫的工作。目前我国对m c s 的研究主要有：毒素毒理学、m c s 的降解、防 护和预处理、m c s 的环境影响因子等方面【2 d 们，但关于不同湖区水质指标对m c s 含量影 响的区域差异性研究甚少，本研究在调查具有不同水化学特征的富营养化湖区湖泊中 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 m c s 含量的基础上，系统分析不同湖区湖泊水质对m c s 含量的影响，探讨不同湖区影 响m c s 的主要水质指标，为控制m c s 的危害提供研究基础。 1 2 文献综述 1 2 1 世界范围淡水富营养化水体微囊藻毒素危害事件的回顾 随着社会生产力的大幅提高以及人口压力的不断增加，全球范围的淡水水体富营 养化现象日趋严重，湖泊和水库表现得尤为明显，由此引起的蓝藻水华在世界范围内 频繁爆发，并释放出大量有害次生代谢产物。m c s 是一种在蓝藻水华污染中出现频率 高、毒性大、危害严重的一类藻毒素【1 1 1 。m c s 可通过多中途径进入人体，包括饮水、 接触受污染的水体、口服受到污染的蓝藻类保健品、特殊情况下甚至可以通过静脉输 入。同时m c s 不仅可以在鱼等动物体内蓄积，还可通过水产品进入人体，从而对人类 健康造成潜在的威胁【1 2 】，历年来世界出现藻毒素中毒事件的基本情况如表1 1 【1 3 】。由表 1 1 可知，我国湖泊早在2 0 世纪7 0 年代就已经出现m c s 的危害事件，因此深入调查富营 养化湖泊中m c s 的分布及影响因素，对预防我国m c s 的危害是非常必要的。 西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页 表1 - 1 历年来世界藻毒素中毒事件 g i - 肠胃炎，l d - 肝损伤， i 【d 一。肾损伤，i d 一肠损伤，p l c 一原发性肝癌，s t 一喉痛，蹦一口腔起 泡，f - 发烧，e e 一眼睛和耳朵刺激，f l s 一类似于流感的症状，r 一皮症，m 1 一肌痛，c 一发寒，v 一 呕吐， p h 一有疼痛的肝肿大，v i d - 视力模糊：n 一恶心， a p 一腹痛， p c 一肺脏实变：木一未发表资料 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 rn i 1 2 2 微囊藻毒素的概述 1 2 2 1 微囊藻毒素的结构与性质 m c s 为一类具有生物活性的肝毒素，由七个氨基酸构成的环状肽链分子( d a l a x d m e a s p z - a d d d g l u m m d h a d h a ) 如图1 1 所示，其分子量约为1 0 0 0 ，至今已发现 其有8 0 多种同分异构体【1 4 】，其中毒性较大的有3 种，分别为m c l r 、m c r r 、m c y r 。 l 、r 、y 分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸【1 5 1 。世界上含量较多，分布较为广泛的是 m c l r 和m c r r 1 6 】。在我国爆发水华的淡水湖泊中，往往也会检测到m c l r 和 m c r r 【1 6 】。 由于环状结构和间隔双键，m c s 具有极强的稳定性，加热到3 0 0 很长时间仍未能 使之分解，并且尽管m c s 是多肽类物质，但普通的蛋白质水解酶是不能将其分解【1 7 1 。 m c s 在阳光下也较稳定，但在蓝藻色素存在的条件下或在微生物的作用下，却能加快 光降解的速度【4 】。研究表明，m c s 的降解主要有吸附( 收) 作用、光解作用、微生物细 菌降解作用【18 1 。 g l u ( i s o ) m d l m 夕。 h nn l i i a r g 图1 1 微囊藻毒素化学结构图 1 2 2 3 微囊藻毒素的毒性 m c s 是细胞内毒素，它在细胞内合成，细胞破裂后释放出来并表现出毒性【1 9 1 。动 物饮用了含m c s 的水后，会出现腹泻、厌食、呕吐等症状，甚至死亡【2 0 1 。人类饮用或 直接接触藻类污染的水体会引起皮肤反应、腹泻、肠胃炎等症状，长期饮用可能会引 发肝癌，医学部门已发现饮水中微量m c s 与人群中原发性肝癌的发病率有很大相关性 西南交通大学硕士研究生学位论文第5 页 i i | 量量曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼量量量量量量量量皇量皇量量量量量量量曼量奠| 置皇量量皇一 【2 l 】。近年来，我国在m c s 的毒性研究方面做了大量的工作，主要是通过对大鼠、小鼠、 鱼类以及其他一些动物所做的实验来完成的，其结果发现，m c 可以对肝细胞、淋巴细 胞造成严重危害【2 2 1 。 1 2 2 4 微囊藻毒素的检测方法 由于m c l r 存在较为普遍，产毒量较大，毒性强，故关于m c s 研究方面，有一定 执行的标准：1 9 9 8 年，w h o 规定饮用水水体藻毒素的含量不得超过1 | lg l ；2 0 0 3 年， 规定娱乐性水体藻毒素的含量不得超过2 0i l l ：加拿大健康组织规定饮用水水体藻 毒素含量不得超过0 5 | lg l , 中国生活饮用水卫生标准( g b5 7 4 9 - - - 2 0 0 6 ) 和地 表水环境质量标准( g b 3 8 3 8 2 0 0 2 ) 中规定m c l r 的限定值为1 pg l t 9 1 。 目前针对m c s 的检测方法主要有：生物法、生化法、化学法。以下就各种检测方 法进行简要论述。 1 生物法 生物法主要包括动物毒性法和细胞毒性法。 ( 1 ) 动物毒性法主要是通过动物( 通常是小鼠) 口服或注射来间接评价m c s 的 毒性。用提取后纯化的m c s 进行测试，根据动物的生理病变及半致死剂量初步确定 m c s 的毒性。该法是毒理评价的常用方法，优点是操作简单，缺点是专一性和灵敏度 较差，且无法确定m c s 类型及结构。 ( 2 ) 细胞毒性法是利用m c s 对细胞的毒性作用来监测毒素的一种技术，不仅能判 断毒素存在与否，而且可对毒素总量进行精确定量【4 】。f l a d r n a r k 等建立了一种根据m c s 导致蛙鱼或大鼠肝细胞凋亡的程度来确定m c s 的方法【l l 】。 2 生化法 生化法有酶联免疫吸附( e l i s e ) 和蛋白磷酸酶( p p l a ) 两种。 ( 1 ) 酶联免疫分析( e li s a ) 法在对水中物质进行免疫检测时，最常用的方法是 竞争性非均相酶联免疫法。其检测顺序是先将m c s 抗体包被( 固定) 在酶标板上，使 用时加入水样和定量的m c l r 辣根过氧化物酶( h o rs e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h r p ) 偶联 物，最后加入显色底物，进行显色测定。在具备m c s 单克隆抗体、标准纯毒素和有关 试剂的前提下，该法是一种简便、快速、高效的方法，其缺点是不能较好地鉴别毒素， 会出现假阳性反应【4 1 。 ( 2 ) 蛋白磷酸酶抑制分析( p p 认) 法是通过对蛋白磷酸酶酶活力的抑制程度来检 测m c 。由于具有相同抑制功能的毒素对酶活力均有抑制作用，因此，该法测定的是具 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 有相同抑制作用的毒素的总量，而非单一某一毒素的量。因此，在结果处理中，将所 测的物质称为m c s 类物质，并以m c l r 当量作为测定结果【6 】。 3 化学法 化学法主要有：高效液相色谱( h p l c ) 、气相色谱( g c ) 、薄层层析色谱 ( t l c ) 、毛细管电泳( c e ) 以及液相色谱质谱( l c m s ) 联用等现代分析手段，依 据m c 的物化性质结合灵敏的光电技术对其进行定性、定量分析。 目前，检测水体中m c s 的常用方法有h p l c 法【2 3 之5 】和l c m s 法【2 0 1 。h p l c 法由于具有准确、灵敏、重现性好且能够同时分析多种m c s 异构体等优点而同时被 w h o 、美国、英国等推荐为m c s 的标准检测方法；我国水中微囊藻毒素的测定( g b t2 0 4 6 6 - - - 2 0 0 6 ) 也将h p l c 法列为m c s 的标准检测方法之一【9 】，由于缺乏标准毒素 限制了其被进一步应用。而l c m s 技术正好地解决了这一问题，尽管没有标准毒素， 且只要知道毒素的分子量，l c m s 技术就可以对毒素进行精确定量检测，仪器检出限 低，结果精确【l 们，但是其仪器价格昂贵，使其应用受到了限制。 4 各种检测方法的优缺点 通过对比发现各种检测m c s 的优缺点如表1 2 所示： 西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页 表1 2 微囊藻毒素检测方法的优缺点【2 】 1 2 3 微囊藻毒素的影响因子 m c s 的产生受很多环境因子的制约，具体可归结为以下几个因素其中光照可能起 着非常重要的作用n 1 。 1 2 3 1 光照 低光强度能促进绿色微囊藻中m c s 的合成，同时，光强对毒素形成的影响受到温 度的调节【3 1 1 。研究表明通过增加光强，铜绿微囊藻的毒性可以增加四倍之多； 而低光照强度时颤藻的m c s 产量更大【3 2 1 。m c s 可被紫外线光解或通过异构化作用丧失 毒性。任何影响腺苷酸能荷的因素都会调节毒素的产生 3 3 】。u t l d l 3 卅发现温度在高光 强下对毒素的产生几乎没有影响，而低光强下温度才会影响毒素的产生，因此认为光 强是毒素产生的一个重要制约因子。 1 2 3 2 微量元素 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 在室内培养条件下，当m a e r u g i n o s a ( 铜绿微囊藻) 置于高铁浓度中，其毒素产生 量减少，m c l r 在铁离子缺乏时含量最高【7 】。相反，更多野外研究和室内实验表吲1 8 3 5 】： 低浓度铁离子的浓度抑制毒素的产生。当铁离子的浓度低于2 5 x 1 0 6 m o l i , 时，藻细胞 生长缓慢，但产毒量增加了2 0 - 4 0 。这可能是由于f e 在蓝藻的光合作用和叶绿素合 成中起着重要的生理作用。因此说明微量元素对藻毒素有一定的影响。 1 2 3 3 温度 s i v o n 饥【3 6 】认为温度对蓝藻产毒有明显的影响。一般在1 8 2 5 c ，微囊藻和鱼腥藻产 生的毒素含量较高，在其它温度下毒素含量较低。不同的温度能影响毒素不同异构体 的产生，当温度低于2 5 c 时，鱼腥藻产生m c l r ，当高于2 5 c 时主要产生m c r r l 3 1 】。 野外实验发现微囊藻毒素的含量和温度呈正相关关系，当高于2 3 时温度促进产毒株 和毒素产量【3 7 - 3 8 】。不同产毒藻株的产毒最适温度与生长最适温度也有差异川。 1 2 3 4 氮、磷 关于n 、p 对藻产毒的影响，目前还没有得到一致的结果。在室内条件下，高氮浓 度促进藻的生长和毒素的产生，降低氮浓度时毒素的含量也下斛3 9 1 ，也有研究发现n 、 p 的浓度减少时，藻类生长率明显下降，但对其产毒影响不大【加1 。其原因可能是在固 氮藻种和非固氮藻种中，氮影响毒素产生的作用不同【7 1 。固氮藻种( a n a - b a e n a 、 a p h a n i z o m c n o n ) 在氮缺乏的情况下毒素含量最高【3 1 1 ；非固氮藻种( m i 凹o c y s t i s 、 o s c i l l a t o r i a ) 在氮浓度较高时毒素含量最高【3 6 】。在对富营养湖泊的调查实验中，发现 m c l r 含量与n 0 3 - n 和n h 4 n 呈负相关关系，而与总氮呈正相关关系【3 1 3 7 4 1 1 ，其变 化可能与藻类的繁殖和营养物质的利用有关。 磷往往是湖泊中的限定因子，磷浓度的小小变化就能影响蓝藻生长和毒素的产生。 一般磷在较低浓度时毒素含量也较低，但也存在在磷浓度较低的条件下，单位干重藻 细胞毒素含量反而增加的报道。有野外调查报道【3 1 4 1 】称m c l r 含量与总磷、溶解磷呈 正相关，而与反应性磷呈负相关。氮磷比为1 6 时，藻类产生的m c s 量最大。 1 2 3 5 其它理化因素 研究表吲4 2 1 ，铜绿微囊藻的生长率在p h 值9 o 时最大，而低p h 值为7 或高p h 值为9 2 时有利于藻毒素的产生。另外，壬基酚能调控一些产毒藻的产毒【4 3 】：高浓度 的壬基酚破坏微囊藻细胞的结构，促使藻毒素释放：低浓度的壬基酚则抑制毒素的释 放并刺激一些产毒藻的生物量和生长速率的增加，具有重要的生态学意义。 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 1 2 4 结语 m c s 的研究历史已近百年，取得了不少有价值的研究成果，如在m c s 的产毒机理、 危害性、影响因子、检测技术方法和对其去除降解等方面。在影响因子方面已有研究 表明影响m c s 的因素主要有光照、温度、微量元素、氮磷、p h 、水生生物等【4 ，4 2 州5 舶】， 同时水体中m c s 的含量还随着季节的变化而变化即具有季节差异性【2 。4 ，7 删，这方面的 研究主要是针对野外调查某个湖泊中这些指标与m c s 相关性【8 】，或是在实验室模拟野 外条件下，相关影响因子与m c s 的相关性【4 8 】及其毒性存在季节差异性【4 7 1 。对m c s 与 其影响因子的相关性差异性( 主要是季节差异性) 研究只停留在某个湖泊的水平上【4 5 1 ， 关于这些相关性存在区域差异性的研究甚少，目前还没有相关研究系统地将我国典型 ( 具有典型水化学和理化特征) 富营养化湖泊m c s 含量的区域差异性体现出来。目前 对藻毒素影响因子已经有了大量的研究，然而大多数研究是基于室内培养结果，野外 数据较少m 】，而且很少将典型富营养化湖泊m c s 含量的区域差异性体现出来。本研究 选择我国具有显著代表性的富营养化湖泊作为研究对象，分析不同湖泊中m c s 含量的 区域差异性以及湖泊水质和理化指标( 如总氮，总磷，透明度，叶绿素a ，b o d ，c o d ， d o ，p h 等) 与湖泊m c s 含量的相关性的区域差异性，与此同时，针对不同湖区的特 征性水质指标对m c s 含量的影响进行分析。与以往的只选择某个湖泊来研究微囊藻毒 素的影响因子与其相关性【4 9 】或某个湖泊中m c s 的季节性差异性，本课题将比较系统的 调查，将我国典型富营养化湖泊中m c s 与其环境影响因子的区域和季节差异性突显出 来。 1 3 论文依托项目及相关性 本论文依托国家水体污染控制与治理科技重大专项基准标准课题，主要研究内容 与子课题“全国湖泊富营养化区域差异性调查及其演化规律研究 中的区域差异性调 查和“基于区域差异的我国湖泊营养物生态分区技术研究”中的分区技术方法研究， 为我国湖泊营养物基准和富营养化控制标准研究课题服务。 1 4 研究目的及内容 本研究根据近年我国湖泊的水质状况【5 l 】，拟选取我国东部平原、蒙新、云贵高原 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 0 页 典型富营养化湖区三大湖区的太湖、巢湖、呼伦湖、滇池、洱海五大典型湖泊表层水 中的5 种m c s 为研究对象进行分析，选择h p l c 的方法拟建立同时分析环境水样中5 种痕量m c s 的分析方法，以适应于环境水样中痕量m c s 的快速分析。并探讨不同湖 区湖泊具有特征水化学指标的m c s 含量区域差异性，对不同湖泊中水样中m c s 的含 量与常规指标的值进行相关性分析、回归方程分析，以实现分区和分期预防控制湖泊 中m c s 污染。本研究分析的常规项目包括叶绿素a ( c h l 口) 、温度( t ) 、总磷( 1 1 p ) 、 溶解性磷( p 0 4 + ) 总氮( t n ) 、氨氮( 山- n ) 、溶解氧( d o ) 、p h 值、透明度( s d ) 、 总有机碳( t o c ) 1 0 项。基于上述设想，本论文的任务为： 1 选择高效液相色谱法( h p l c ) 法，比较优化样品处理方法和色谱条件，考察不 同流动相成份和组成对m c s 的保留特性，分离选择性及分离度的影响，选择最 佳色谱条件以及样品预处理过程建立水体中5 种痕量m c s 分析方法。 2 完成5 大湖泊水体5 种m c s 和1 0 个常规指标样品的采集与分析，研究湖区及 湖泊中m c s 浓度分布及其含量与水质指标相关性的区域差异性。 1 5 研究创新点 目前对m c s 影响因子已经有了大量的研究，然而大多数研究是基于室内培养结果， 野外数据较少【伺，而且很少将典型富营养化湖泊m c s 含量的区域差异性体现出来。本 研究选择我国具有显著代表性的富营养化湖泊作为研究对象，分析不同湖泊中m c s 含 量的区域差异性以及湖泊水质和理化指标( 如总氮，总磷，透明度，叶绿素a ，b o d ， c o d ，d o ，p h 等) 与湖泊m c s 含量的相关性的区域差异性，与此同时，针对不同 湖区的特征性水质指标( 例如，云贵高原湖区的矿化度、东北平原山地湖区的腐殖质、 东部平原湖区的p h 等) 对m c s 含量的影响进行分析。与以往的只选择某个湖泊来研 究m c s 的影响因子与其相关性【4 9 】或某个湖泊中m c s 的季节性差异性，本课题比较系 统的调查，将我国典型富营养化湖泊中m c s 与其环境影响因子的区域和季节差异性突 显出来。 西南交通大学硕士研究生学位论文第11 页 旨皇曾鼍i lh 曼舅量| 暑曼量曼量曼量量量| | 量量音皇量量量量一 1 6 研究技术路线 水质资 图1 2 本研究技术路线 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 2 页 第2 章地表水中痕量m c s 检测方法的建立 蓝藻水华暴发引起的微囊藻毒素污染是世界各国共同面临的难题。我国是蓝藻水 华暴发较严重的国家之一，2 0 世纪8 0 年代中国科学院水生生物研究所藻类研究室对我 国发生蓝藻水华湖泊中的m c s 进行研究发现，我国淡水湖泊所发生的水华8 0 是有毒 的【5 2 】。郁唏等【5 3 1 的研究结果表明，常年接触淀山湖水的居民四项肝功能指标水平均较 不接触淀山湖水的居民高，认为长期接触受m c s 污染水源的居民肝脏可能会受到一 定程度的影响。为了保障湖泊周边居民的身体健康，开展富营养化湖泊中m c s 污染现 状调查已迫在眉睫。目前，我国研究人员已经对太湖、莲花湖、滇池、淀山湖、武汉 东湖等湖泊中m c s 的污染水平开展了调查研究【8 4 5 a 7 ，钵5 5 1 ，研究结果表明，富营养化 湖泊中m c s 的含量只有n g l 或p g l 级，因此，检测富营养化水体中痕量m c s 要求分析方 法具有较高的灵敏度、准确性和重复性。2 0 世纪8 0 9 0 年代，我国主要使用酶联免疫吸 附( e l i s a ) 法检测富营养化水体中的m c s 5 4 5 d 5 9 1 ，e l i s a 方法具有高效、快速、灵敏 度高等特点，但是其抗体通常只是针对某一种m c 建立起来的，对其他类型m c s 的交叉 反应性不高，不能检测m c s 的一些异构体【矧。随着色谱和质谱技术的发展，已可以对 不同异构体的m c s 进行定性和定量检测，目前通常采用高效液相色谱( h p l c ) 法 2 5 , 6 1 和液相色谱质谱法( l c m s ) 法【2 3 2 7 , 6 2 - 6 4 检测富营养化水体中的m c s 。h p l c 具有准确、 灵敏、重现性好等特点，是w h o 、英美等发达国家和我国权威机构推荐的m c s 检测方 法【6 5 确】。目前利用i - i p l c 主要分析三种m c s ( l r 、y r 和r r ) ，分析时间一般都大于1 0m i n 。 梁丽丽等【1 0 】用高效液相色谱法检测水体中m c l r 、r r 需2 5 m i n ，沈红娜等【删分析高效 液相色谱法测定喀斯特型高原深水水库中m c l r 、r r 需1 8 m i n 。然而根据甲基化、羟 基化、表异构化程度以及可变氨基酸的不同，已经发现了8 0 种微囊藻毒素的亚型，因此， 仅仅检测m c l r 、y r 和l 浪三种m c s 已远远不能满足人们对饮用水安全的要求。鉴于 此，本研究建立一种经济、快速、灵敏、准确的且能同时分析富营养化湖泊水体中5 种 m c s ( m c r r 、y r 、l r 、l a 和l y ) 的分析方法，为我国全面了解富营养化水体中多 种m c s 污染状况提供科学的分析方法。 2 1 材料与方法 西南交通大学硕士研究生学位论文第13 页 2 1 1 仪器和试剂 仪器：高效液相色谱仪：安捷伦( a g i l e n t ) 1 2 6 0 ，配备二极管阵列( d a d ) 检测器， a g i l e n t 化学工作站，色谱柱：z o r b a x3 0 0s bc t 8 ( 4 6 x1 5 0 m m ，粒径5 | lm ) ；水浴 氮气吹干仪( n e v a p t m l l 2 ) ；2 4 孔固相萃取装置( j t b a k e r l 8 0 0 j t b a k e r ) ；h l b 固相萃取柱( w a t e r s ，5 0 0 r a g ，6 m l ) ；s u p e l c ov i s i p r e p t m 大体积采样器；溶剂抽滤装 置( 1 0 0 0 m l ，天津津腾) ；自动混匀机：m i l l i p o r e 纯水机；亲水性尼龙微孔滤膜( w h a t m a n ， 0 4 5um ) 。 试剂：甲醇( 色谱纯，b a k e r ) ；三氟乙酸( t f a ，色谱纯，d i k m a p m e ) ；磷酸二氢钠( 分 析纯， 9 9 ，a c r o s o r g a n i c s ) ，磷酸( 优级纯， 8 5 ，天津市光复精细化工研究所) ； m c r r 、y r 、l r 、l a 、l y ( 主9 5 a l e x i s ) 。 标准储备液：分别用l m l 的纯甲醇溶解1 0 0 i _ t g m c - r r 、y r 、l r 、l a 、l y 5 种标准样品， 配制成10 0 嵋m l 的5 种m c s 单标储备液。 混合标准使用液：分别取1 0 0 p lm c r r 、y r 、l r 、l a 、l y 单标储备液，用纯甲醇配 制成浓度为1 0 1 , t g m l 的混合标准溶液作为使用液，一2 0 ( 2 以下保存。 标准系列：用纯甲醇将混合标准使用液稀释成浓度分别为0 1 0 、o 5 0 、1 0 0 、1 5 0 p g m l 的混合标准溶液，用于标准曲线的绘制，2 0 0 以下保存。 磷酸缓冲溶液： ( 1 ) 磷酸盐溶液：称取3 9 0 0 3 9 磷酸二氢钠，用高纯水定容至5 0 0 m l 配制成o 0 5 m o l l 的磷酸盐溶液。 ( 2 ) 2 0 的磷酸( 2 0 r a l 磷酸定容至1 0 0 m l ) 将已配制好的磷酸盐溶液p h 调节至3 ， 即为磷酸缓冲溶液。 空白加标样品的制备：准确量取2 l 高纯水，向其中加入1 0 0 p l 的1 0 p g m l 5 种m c s 混合标使用液，充分摇匀，经0 4 5 1 m a 微孔滤膜进行负压抽滤，该实验设置三个平行样。 2 1 2 色谱条件 流动相以梯度的方式进行洗脱，甲醇：0 0 2 的t f a 水溶液的比例随时间变化分 别为l - 5 m i n ：5 5 ：4 5 ；在6 r a i n 时甲醇体积分数升至6 5 ，6 1 0 r a i n ：6 5 ：3 5 ：在l l m i n 时甲醇体积分数降至5 5 ，1 1 1 2 m i n ：5 5 ：4 5 。流速：1 0 m l m i n ：进样量：5i ll ；色谱 西南交通大学硕士研究生学位论文第14 页 柱恒温箱设为3 0 c ；二极管阵列( d a d ) 检测器，检测波长为2 3 8 n m 。 2 2 结果与讨论 2 2 1 流动相体系的选