（环境科学专业论文）天津市典型土壤及相关水体中常用抗生素残留分析.pdf

南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：呈匾面2 0 1 0 年6 月1 日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 口限制( 旦年)口秘密任1 0 年)口机密仨2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号 批准日期 2 0 年月日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密l o 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长1 0 年，可少于l o 年) 摘要 抗生素被广泛应用于人类及动物疾病的防治，在人类的生产生活中发挥着 不可替代的作用。进入动物体内的抗生素有相当一部分随粪、尿等排泄物排出， 而粪便、尿液又作为有机肥大量施用于农田，长此以往将会使抗生素在土壤中 不断累积。此外，部分抗生素可随污水排放进入污水处理厂，但污水厂常规处 理工艺并不能被完全去除抗生素，它们会随着污水厂出水排放再次进入环境中， 当受污染的水体被用于灌溉时，抗生素可从水相转移到土壤相。为了实现对土 壤环境中抗生素类污染物的高通量快速测定，本论文建立了高效液相色谱一串联 质谱法同时检测土壤中氟喹诺酮类、四环素类及磺胺类1 8 种抗生素的分析方法。 土样经含5 0 乙腈的磷酸缓冲液( p h = 3 ) 提取后，以s a x h l b 串联小柱净化 富集，经k r o m a s i lc 1 8 柱( 2 5 0 4 6t o n i ，5 岬) 分离，进行h p l c m s m s 多反 应监测模式下的定性及定量分析。实验结果表明，黏壤土中2 0 0 , g k g 、5 0p g l ( g 两个加标浓度下氟喹诺酮类、四环素类、磺胺类的回收率分别为6 7 - 8 9 ，6 2 - 8 5 ，5 6 - - 9 7 ，其相对标准偏差为1 1 7 。粉沙质粘壤土的回收率情况与其相似。 以3 倍信噪比估算出氟喹诺酮类、四环素类、磺胺类的检出限分别为3 和8 9 i t e d k g ，o 6 , - 0 9i t e k g0 1 1 9p g l 【g 。 此外，本论文将土壤中抗生素检测方法与水体中抗生素检测方法相结合， 对天津市于桥水库和南、北排污河土壤及相关水体中三类抗生素的含量进行了 调查。所有水样中，主要检出的药物有氧氟沙星、土霉素和磺胺甲基异恶唑和 磺胺吡啶，水体中抗生素含量在o 8n e l 至1 9 4 7n g l 之间。固体介质样品中除 粪肥中检出的药物类型、药物含量明显较多和较高外( 1 8 个目标物种有1 3 种抗 生素检出，诺氟沙星含量高达1 9 9 8 2r t e ：k g ，金霉素含量甚至达到2 0 3 4 3 2 t e d k g ) ， 其它土壤样品抗生素含量在0 5 3 0 6 9i t e k g 之间。 关键词氟喹诺酮，四环素，磺胺，固相萃取，高效液相色谱串联质谱 a b s t r a c t a b s t r a c t a n t i b i o t i c sa r ew i d e l yu s e di np r e v e n t i o na n dc o n t r o lo fh u m a na n da n i m a l d i s e a s e s ，a n dp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nh u m a na n dv e t e r i n a r ym e d i c i n e m o s t a d m i n i s t e r e da n t i b i o t i c sa r ee x c r e t e db yf a e c e sa n du r i n e ，w h i c hm a yb ei n t r o d u c e d i n t oa g r i c u l u t r u a lf i e l d sa sm a n u r e ，r e s u l t i n gi nt h ea c c u m u l a t i o no fa n t i b i o t i c si ns o i l s s o m ea n t i b i o t i c si nt h es e w a g et r e a t m e n tp l a n t c a nn o tb ec o m p l e t e l yr e m o v e d t h r o u g hc o n v e n t i o n a ls e w a g et r e a t m e n tp r o c e d u r e s ，a n dw i l le n t e rt h ee n v i r o n m e n t 诵t l le f f l u e n td i s c h a r g e s f o re x a m p l e ，i r r i g a t i o n 、) l ，i t ht r e a t e dw a s t e w a t e ri n t r o d u c e s e f f l u e n t - a s s o c i a t e dc o n t a m i n a n t si n t or e c e i v i n gs o i l s i nt h i sp a p e ra na n a l y t i c a l m e t h o dw a sd e v e l o p e df o rt h es i m u l t a n e o u se x t r a c t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fe i g h t e e n a n t i b i o t i c s ，i n c l u d i n gf l u o r o q u i n o l o n e s ( f q s ) ，t e t r a c y c l i n e s ( t c s ) a n ds u l f o n a m i d e s ( s a s ) ，f r o ms o i l su s i n gl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y s o i l s a m p l ew a sf i r s t l ye x t r a c t e db yp h o s p h a t eb u f f e r ( p h = 3 ) c o n t a i n i n g5 0 o fo r g a n i c m o d i f i e ra c e t o n i t r i l e t h ee x t r a c t sw e r ep u r i f i e da n dc o n c e n t r a t e db ys a xa n dh l b c a r t i d g e s q u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sw e r ec a r r i e do u tf o rt h ea n a l y t eu n d e r t h em r mm o d ea f t e rt h ec h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o no nk r o m a s i lc18 ( 2 5 0 x 4 6i r o n , 50 m ) c o l u m n r e c o v e r i e sf o rf q s ，t c s ，a n ds a si nt h ec l a yl o a ms o i lw e r e6 7 - 8 9 ， 6 2 - 8 5 ，a n d5 6 , - - 9 7 ，r e s p e c t i v e l y , 诵mr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no f1 17 a t t w od i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s r e s u l tw a ss i m i l a rf o rt h es i l t yc l a yl o a ms o i l t h el i m i t o fd e t e r m i n a t i o n ( l o d ) w a sd e t e r m i n e da s3 4 - - 8 9l l g k g ，o 钏9l x g k ga n d0 1 1 9 l 上g k gf o rf q s ，t c sa n ds a s ，r e s p e c t i v e l y , 谢t l las i g n a l t o n o i s er a t i o no f3 t h i sm e t h o d w a ss u c c e s s f u l l ye m p l o y e dt oa n a l y z es o i la n dw a t e rs a m p l e s c o l l e c t e df r o my u q i a or e s e r v o i r , d a g ud i s c h a r g er i v e ra n db e i t a n gd i s c h a r g er i v e r t h ec o n c e n t r a t i o no fa n t i b i o t i c si nt h ew a t e rs a m p l er a n g e df r o m0 8t o1 9 4 7n g l t h em a j o ra n t i b i o t i cp o l l u t a n t sw e r eo f l o x a c i n , o x y t e t r a c y c l i n e ，s u l f a m e t h o x a z o l ea n d s u l f a p y r i d i n e t h ec o n c e n t r a t i o no fa n t i b i o t i c si ns o i ls a m p l e sr a n g e df r o m0 5 - 3 0 6 9 p g k g f a e c e ss a m p l e sh a v eh i g h e ra n t i b i o t i c sl e v e l sa n dm o r ed e t e c t e da n t i b i o t i c s s p e c i e s k e yw o r d sf l u o r o q u i n o l o n e s ，t e t r a c y c l i n e s ，s u l f o n a m i d e s ，s o l i dp h a s e e x t r a c t i o n h p l c m s m s 目录 摘要i a b s t r a c t i i 目录i i i 第一章引言1 第一节抗生素在环境中的残留及危害1 1 1 1 抗生素的危害3 1 1 2 抗生素在水介质中的残留4 1 1 3 抗生素在固相介质中的残留4 第二节抗生素的环境归趋和行为5 1 2 1 抗生素在环境中的分布5 1 2 2 抗生素在环境中的持久性6 第三节环境中抗生素残留分析技术方法概况8 1 3 1 环境中抗生素的前处理方法8 1 3 2 环境中抗生素含量的检测方法9 1 3 3 抗生素药物检测方法的应用9 第四节论文研究内容及意义1 0 第二章环境介质中1 8 种抗生素的同时分析测定方法研究1 2 第一节仪器与试剂1 2 2 1 1 仪器设备1 2 2 1 2 试剂及标准品1 2 2 1 3 标准溶液及缓冲液的配制1 3 第二节水样中抗生素的分析方法及讨论1 7 2 2 1 实验方法1 7 2 2 1 1 水样的前处理1 7 2 2 1 2 色谱条件1 7 2 2 1 3 质谱条件1 7 2 2 1 4 实验流程1 8 2 2 2 结果与讨论1 9 i h 2 2 2 1 质谱条件的优化1 9 2 2 2 2 固相萃取柱类型的选择1 9 2 2 2 3 工作曲线及其线性范围、检出限和测定限2 0 2 2 2 4 方法回收率2 1 第三节土样实验分析方法2 2 2 3 1 实验方法2 2 2 3 1 1 土样的前处理2 2 2 3 1 2 土样检测方法2 3 2 3 1 3 土样分析实验流程示意图2 3 2 3 2 结果与讨论2 4 2 3 2 1 样品提取液的选择2 4 2 3 2 2 固相萃取柱填料量的选择及串联2 5 2 3 2 3 提取液稀释对回收率的影响2 6 2 3 2 4 工作曲线、检出限及测定限2 6 2 3 2 5 方法回收率2 8 第三章抗生素在天津市饮用水源地于桥水库水体及周边土壤中的分 布3 2 第一节研究区域简介3 2 第二节抗生素在于桥水库水体及周边土壤中的含量水平3 2 3 2 1 样品采集和分析3 2 3 2 1 i 水样的采集和分析3 2 3 2 1 2 土样的采集和分析3 2 3 2 2 结果和讨论3 3 3 2 2 1 不同土地利用类型及粪肥中的抗生素药物含量3 4 3 2 2 2 不同药物在于桥水库周边的残留3 6 第三节本章小结3 8 第四章抗生素在大沽排污河水体及其灌溉土壤中的分布3 9 第一节研究区域简介3 9 第二节抗生素在大沽排污河水体及其灌溉土壤中的含量水平3 9 4 2 1 样品采集和分析3 9 4 2 1 1 水样的采集和分析3 9 i v 目录 4 2 1 2 土样的采集和分析4 0 4 2 2 结果和讨论4 1 4 2 2 1 大沽排污河水样中抗生素药物分析4 1 4 2 2 2 大沽排污河灌溉十样中抗生素药物分析4 2 第三节本章小结4 4 第五章抗生素在北塘排污河水体及其灌溉土壤中的分布4 6 第一节研究区域简介4 6 第二节抗生素在北塘排污河水体及其灌溉土壤中的含量水平4 6 5 2 1 样品采集和分析4 6 5 2 1 1 水样的采集和分析4 6 5 2 1 2 土样的采集和分析4 8 5 2 2 结果和讨论4 8 5 2 2 1 北塘排污河水样中抗生素药物分析4 8 5 2 2 2 北塘排污河绿化区土样中抗生素药物分析5 1 第三节本章小结5 2 第六章结论5 4 第一节主要结论5 4 第二节不足及展望5 5 参考文献5 6 致谢6 0 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果6 1 v 第一章引言 第一节抗生素在环境中的残留及危害 抗生素( a n t i b i o t i c s ) 是微生物( 包括细菌、真菌、放线菌属) 或高等动植 物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物。2 0 世 纪中期以来，大量天然的和人工合成的抗生素药物被广泛的应用于人类及动物 感染性疾病的防治，在人类生活中发挥着不可替代的作用。在我国，这类药物 的使用也十分普及。然而，由于抗生素在低剂量下即可发挥效用，并且在人或 动物体内短暂残留后随即排出体外，因此近年来抗生素等药物在水、土环境介 质中不断被检出，出现了众多有关地表水、地下水、饮用水以及水体底泥和土 壤中检出药物类污染物的报导【l 5 】。残留的抗生素质粒直接或间接的从非致病体 向致病菌转移从而引起病原体抗性。残留抗生素和抗性微生物将影响土壤微生 物群落结构并破坏和降低土壤功能，进而通过食物链危害动物和人类1 6 j 。此外， 由于病原体抗性出现使得抗生素治疗疾病的能力下降。因此人们开始关注抗生 素在环境中的行为及其可能造成的负面影响。所谓抗生素( a n t i b i o t i c s ) ，就是生 物，包括微生物、植物和动物在内，在其生命活动过程中所产生的( 或由其他 方法获得的) ，能在低浓度下有选择地抑制或影响它种生物功能的有机物质 唧捌】。也就是说抗生素是能以低浓度抑制或影响活的机体生命过程的次级代谢 产物及其衍生物。抗生素的概念是不断扩大的，最初只包括对微生物的作用， 现在已经有抗真菌、抗病毒、抗寄生虫以及杀虫、除草的抗生素。近年来把来 源于微生物的酶抑制剂也包括在抗生素中，总数己超过9 0 0 0 种。 目前，在众多的抗生素药物中，b 内酰胺类、四环素、喹诺酮类、大环内脂 类和磺胺类是最主要的几类依其化学结构，抗生素又可分为p 内酰胺类、喹诺 酮类、大环内酯类、磺胺类和四环素类，其主要物理化学性质见表1 1 。 表1 1 几类典型抗生素药物的主要物理化学性质【7 1 塑堕姿塑耋 堕壁耋婴窭耋耋垒：凼坠堕耋 盔堕凼堕耋 分子 量 g m o l 溶解 度 m g l l o g k w p k a 亨利 常数 2 2 9 5 4 1 7 61 7 2 2 - 3 0 0 3 4 4 4 。5 6 2 7 63 3 3 4 - - 4 7 0 36 8 7 9 - 9 1 6 1 3 2 1 7 7 9 07 5 1 5 0 0 2 3 0 一5 2 0 0 02 2 - 1 0 1 0 00 4 5 - 1 5 1 o 1 6- 0 1 1 7- 1 3 o 0 5 0 9 , - - 2 91 d 0 1 8 6 2 - , 3 4 5 1 0 63 3 7 7 9 3 5 2 x 1 0 1 7 。1 3 x l o 2 3 1 7 x l o 。2 3 3 2 x 1 0 8 1 8 x 1 0 。84 8 x 1 0 。2 2 2 7 2 5 x l o 1 9 1 2 1 0 1 2 7 7 - 8 9 7 8 x l o 。6 2 0 x1 0 2 6 磺胺嘧啶、磺 嘉荔誉 e y戮霪耄掌氧黧麓誓攀 纠例 恩诺星等哒嗪、磺胺甲 8 “ 盘尼西林等素 氧哒嗪等 抗生素类药物已被广泛应用于人类及动物疾病感染的防治，在抗菌抑菌方 面发挥着不可替代的作用。此外，抗生素类药物作为生长促进剂被广泛应用于 家禽的饲养中，对养殖业的发展起了重大的推动作用。目前，在众多的抗生素 药物中，1 3 内酰胺类、四环素、喹诺酮类、大环内脂类和磺胺类是最主要的几 类，其主要物理化学性质见表1 1 。 ( 1 ) 1 3 内酰胺类：1 3 内酰胺类抗生素是指化学结构中具有一内酰胺环， 呈抗菌活性的天然或经化学改造的化合物的总称。目前，它是抗生素中使用量 最大的一类，但呈下降趋势。其中有青霉素、头孢菌素和最近发现的一系列抗 生素，如头孢呱酮、头孢匹罗、亚胺培南、米罗培南等。该类抗生素可通过抑 制转肽酶干扰细胞壁的合成，主要用于抗革兰氏阳性菌，但有些经过改造的1 3 一 内酰胺类药物可抗阴性菌。1 9 8 0 年全世界抗生素总产量为2 5 0 0 0 吨，其中青霉 素1 7 0 0 0 吨，头孢菌素1 2 0 0 吨。而到了2 0 0 2 年，我国仅青霉素的产量就超过 2 2 万吨，占全世界的7 0 。 ( 2 ) 喹诺酮类：喹诺酮类药物已经在我国人医和兽医临床上被广泛应用， 被认为是理想的抗菌药物。喹诺酮类药物按发明的年代先后和抗菌性能的不同， 分为三代。第一代为6 0 年代开发，抗菌谱较窄，抗菌作用弱，主要包括萘啶酸、 吡咯酸、嗯喹酸等。第二代为7 0 年代开发，抗菌谱有所扩大，抗菌作用有所增 2 第一章引言 强，主要对革兰氏阴性菌具有有效的抗菌性。主要包括新嗯酸、噻喹酸、吡哌 酸等。第三代即氟喹诺酮类药物，效果要远远高于第一代和第二代喹诺酮类药 物。主要包括环丙沙星( c i p r o f l o x a c i n ) 、氧氟沙星( o f l o x a c i n ) 、诺氟沙星 ( n o r f l o x a c i n ) 等。氟喹诺酮类药物对链球菌和表皮葡萄球菌有抑菌和杀菌作用， 抗菌力强、体内分布广、低残留、安全性高、价格低廉，且与第一、第二代相 比，抑菌和杀菌作用更加迅速、彻底。 ( 3 ) 大环内酯类：以一个大环内酯为母体，通过羟基，以苷键和1 3 个分 子的糖相联结的一类抗生物质。按其大环结构含碳母核的不同，可分为1 4 、1 5 和1 6 元环大环内酯类抗生素。其中在医疗上比较重要的有红霉素、柱晶白霉素、 麦迪加霉素等。目前在我国大环内酯类抗生素市场上，红霉素用量正在逐步减 少，而其一系列衍生物如罗红霉素，阿奇霉素，克拉霉素，地红霉素、氟红霉 素由于较好地解决了副作用在临床上使用日益广泛。 ( 4 ) 磺胺类药物：为氨苯磺胺( 简称磺胺) 的衍生物。磺胺的分子中含有 一个苯环，一个对位氨基和一个磺酰胺基。各种化学基团来取代磺酰胺基上的 氢原子，合成了大量有效的衍生物。临床常用的有磺胺嘧啶( s u l f a d i a z i n e ) 、磺 胺甲嗯唑( s u l f a m e t h o x a z o l e ) 和磺胺甲氧嘧啶( s u l p h a m o n o m e t h o x i n ) 、磺胺二 甲氧嘧啶( s u l f a d i m e t h o x i n e ) 、磺胺甲基嘧啶( s u l f a m e r a z i n e ) 、磺胺二甲基嘧啶 ( s u l f a m e t h a z i n e ) 、磺胺甲氧嗪( s u l f a m e t h o x y p y r i d a z i n e ) 等。磺胺类药物属于 广谱抗菌药，血液中最低有效浓度为0 0 5m g m l 。具有抗菌谱广、疗效强、方 便安全等优点。 ( 5 ) 四环素类：该类抗生素具有共同的基本母核( 氢化骈四苯) ，但取代 基不同，是两性物质，可与碱或酸反应而成盐，通常在碱性水溶液中易降解， 在酸性水溶液中则较稳定，故临床一般用其盐酸盐。主要包括四环素 ( t e t r a c y c l i n e ) 、土霉素( o x y t e t r a c y c l i n e ) 、金霉素( c h l o r t e t r a c y c l i n e ) 等。为 快速抑菌剂，在高浓度具有杀菌作用，抗菌谱广，价格便宜。 1 1 1 抗生素的危害 抗生素可能造成的危害主要表现在以下两个方面： 1 ) 抗生素及其代谢物可能会对物质生物转化的一些关键过程( 反硝化过程、 氮的固定、有机物的降解等) 产生影响，并且有毒物可能会在植物体内积累， 并通过食物链富集到人体和动物体中，危害人畜健康，引发疾病【8 以o 】。 3 第一章引言 2 ) 由于土壤的淋洗及径流冲刷作用，进入地表水和地下水的药物或其代谢 产物，影响沉积物和水生环境中的生物，从而最终将对人体健康产生不利影响。 1 1 2 抗生素在水介质中的残留 已有一些文献报导在污水处理厂入水口和出水口、地表水、地下水甚至饮 用水中各类抗生素及其代谢产物以很低的浓度( n g l g l 级) 存在。1 9 9 9 和 2 0 0 0 年，在美国1 3 9 条江河中检测到包括四环素类、大环内酯类、磺胺类和氟 喹诺酮类抗生素共31 种抗生素在内的9 5 种有机废水污染物，抗生素浓度水平 在6 0 6 9 0n g l 之间 1 l 】。德国1 0 0 多个地下井水样品中共检出6 0 种药物，其中 红霉素和磺胺甲嗯唑两类抗生素检出率最高，达2 0 ，最高含量达到lg l l l 2 j 。 近年来，在我国也有研究人员开始关注环境中抗生素的残留，徐维海等人在香 港维多利亚港检出较低含量的氟喹诺酮和大环内酯类抗生素，在珠江广州河段 河水中检出了多种抗生素，而且含量较高( 分别在7 0 - - 4 8 9n g l 和1 3 - 6 9n g l 之间) 其含量水平明显高于美、欧等国河流中相应污染物的含量，其中红霉素、 磺胺嘧啶等与国外污水处理厂所检出的含量水平相当【l 引。 1 1 3 抗生素在固相介质中的残留 相比水介质来说，土壤、沉积物等固相介质中抗生素污染情况研究的较少。 h a m s c h e r 等在液体粪肥中检测到四环素( t c ) 含量为4 0m g k g ，而金霉素( c t c ) 为0 1m g k g ；在施用粪肥的土壤层中检测到四环素( 1 0 - 2 0c m ) 和金霉素( 0 3 0 c m ) 的最高平均浓度分别高达1 9 8 7g k g 和4 6 7 3g k g 1 4 l o t h o r s t e n 等用e l i s a 法在液体粪肥施用7 个月后的田间土壤中，检测到残留的磺胺二甲嘧啶含量为 1 5 9 k g 1 5 j 。k f i s p i ns t o o b 等利用改进的萃取技术测得土壤中磺酰胺浓度在3 个月 的时间中从4 5 0g k g 减少到1 5 0g k g ( 蚓。m a r t i n e z c a r b a l l o ，e 等利用液相色谱串 联质谱法检测了动物排泄物及其施肥土壤中四环素类、磺胺类、甲基苄氨嘧啶 和氟喹诺酮类的含量，在猪排泄物中，土霉素( c t c ) 含量达到了4 6m g k g ， 金霉素( o t c ) 达到2 9m g k g ，四环素( t c ) 达到了2 3m g k g ，恩诺沙星( e f x ) 仅在鸡和火鸡排泄物中检出【l ”。p a u la b l a c k w e l l 选取英国4 种典型的土壤，壤 土、砂粘壤上、砂壤土和粘壤土为研究对象，检测出其中含有土霉素、磺胺氯 哒嗦、泰乐菌素药物i l 引。j a c o b s e n ，a m 选取丹麦两种典型农业土壤砂壤土和砂 土，土样采自施加含有金霉素和泰乐菌素a 的猪粪的农田，通过调查1 5 5 天土 4 第一章引言 壤中抗生素的含量变化情况，发现金霉素从1 0 - - 1 5p g k g 、泰勒菌素a 从2 0 - - 5 5 p g l ( g 降至检测限附近或以下i l 卅。 在我国，抗生素在固相基质中的检测方法尚在探索阶段，仅有南方一些地 区报导了土壤中抗生素的残留水平。张慧敏等提出在浙北地区施用畜禽粪肥的 农田表层土壤中土霉素、四环素和金霉素的检出率分别为9 3 、8 8 和9 3 ， 残留量分别在检测限以下至5 1 7 2 、0 5 5 3 和0 5 8 8m g k g 之间【2 0 j 。陈界等人于 2 0 0 5 - - 2 0 0 6 年采集了江苏省各市不同种类的集约化畜禽养殖场共1 7 8 个畜禽粪便 样品，检测结果表明磺胺类药物残留的检出率普遍较高，各种药物检出总量变 化较大，总量大于3 0 0 0n g g 的小于5 ，而总量小于2 0 0n g g 的约占5 0 ，且 各类药物同时检出的现象较为明显【2 1 1 。赵娜研究了珠三角地区不同类型菜地土 壤中磺胺类和四环素类抗生素的含量，研究显示养猪场菜地土壤中抗生素的总 含量远远高于无公害蔬菜基地、普通蔬菜基地和绿色蔬菜基地，说明菜地土壤 大量在施加含有抗生素的有机肥后，加重了土壤抗生素污染1 2 2 。 第二节抗生素的环境归趋和行为 1 2 1 抗生素在环境中的分布 通过各种途径进入人畜体内的抗生素，大部分以原药和代谢产物的形式经 动物的粪便和尿液排出体外【2 3 1 。a d d i s o n t 2 4 j 研究表明，给食品动物使用的兽药有 2 5 - - - 7 5 以母体药物形式排出体外，并在施用粪肥的土壤中长期持留。k r o k e r l 2 5 j 甚至认为从动物粪便和尿液中排出的兽药高达用药量的9 0 ，显然有相当大比 例的兽药以母体药物或代谢产物的形式通过禽畜粪便进入环境。图1 1 显示了人 用和畜用抗生素在环境中的迁移途径【2 6 l ，其中，作为灌溉用水的含抗生素的污 水和作为肥料施用的畜禽粪便是造成土壤抗生素污染的重要途径。虽然人畜医 疗的大部分抗生素污水进入污水处理厂，但许多研究表明，污水处理厂并不能 完全去除抗生素类药物【2 7 瑚】，它们又将伴随处理出水排放进入环境中。受污染 的水体用作农业生产的灌溉水时，抗生素又从水相转移到土壤相。s t u m p f t 2 9 l 等 检测了生活废水灌溉植物后流出的水中仍有多种药物残留，各种药物残留的平 均浓度多在0 1 一lm g l 之间。药物随废水通过这些植物之后，其浓度下降了 1 2 9 0 。有研究认为【3 0 1 ，植物本身并不能降解污染物，只是靠蒸腾作用将土壤 或地下水中的污染物转移到空气中。畜禽排泄物通常作为有机肥大量施用于农 第一章引言 田，尤其是施用于蔬菜和果树生产，受到抗生素污染的粪便用作肥料将导致大 部分兽药及其残留物最终将进入土壤，成为新的土壤有机污染物。未经处理的 畜禽粪便年复一年地施于农田，将会增加抗生素在土壤中的累积。有研究表明 每年由此而进入农业土壤的抗生素数量一点也不比农药用量岁引3 2 j 。遭受抗生 素污染的土壤又通过纵向淋溶或横向地表径流等途径最终使抗生素进入江河等 水体，土壤又成为新的抗生素污染源。当受污染的水体用作农业生产的灌溉水 源时，抗生素又从水相转移到土壤相。年复一年，造成了土壤的严重污染。 图1 1 抗生素在环境中的迁移途径 1 2 2 抗生素在环境中的持久性 兽药类抗生素以动物的粪尿为载体，通过各种途径进入到土壤中，导致土 壤中各种抗生素含量的变化。抗生素在土壤中的持久性主要取决于它的吸附能 力和降解能力，另外它在水中的渗滤性，沉降速率也大大影响其半衰期【3 3 1 。 不同结构类型的抗生素在分子构成和物理化学性质上都具有很大差异，有 6 第一章引言 些物质呈疏水性或非极性，也有些具有很好的水溶性或在特定土壤p h 值时发生 解离【3 4 1 。抗生素吸附作用强弱顺序依次为四环素类 大环内酯类 氟喹诺酮类 磺胺类 氨基糖苷类 青霉素类【3 5 l 。在土壤基质和水体沉积物中各类抗生素的 分配系数( ) 具有较大差异，硒可从o 2 ( 氯霉素在海底沉积物中) 到5 6 1 0l k g ( 恩诺沙星在土壤中) 变化【3 6 】。大部分抗生素特别是磺胺类和氟喹诺酮类具有 很强的解吸滞后性，在实验中分配系数变大【3 7 1 。此外，土壤对抗生素药物的吸 附能力与土壤类型、p h 值有关。有研究表明，在潮土、红壤、水稻土、黄棕壤 4 种土壤中诺氟沙星的吸附系数k f 值变化较大，分别为8 2 0l k g 、4 3 2l k g 、5 6 7 7l k g 和8 7 9 0l k g ，它们与土壤p h 呈极显著负相关【3 引。一般来说，抗生素 对土壤有机质的吸附能力要比土壤矿物质强。土壤颗粒越小、兽药的脂溶性越 强、水溶性越弱，则兽药越易被土壤吸附。a l i s t a i r b a 等人通过实验室及田间实 验，研究了磺胺类抗生素的吸附行为，评价了磺胺类抗生素的进入地表水和地 下水的潜在风险，土壤中磺胺类化合物的分配系数磁在0 9 - 1 8l k g 之间，较 小的吸附常数表明这类物质的具有较高的迁移能力【3 圳。有研究表明，磺胺嘧啶 在不同土壤中的迁移状况差异较大，其迁移能力为砂土 粘土 壤土，并指出 土壤质地和有机质含量是影响磺胺嘧啶在土壤中淋溶向下迁移能力的重要因素 4 0 l 0 抗生素在土壤中的降解可分为化学降解( 光解、水解、氧化还原降解) 和 微生物降解，其中微生物降解是兽药在土壤中迁移转化的主要方式。生物降解 是指利用天然徽生物或人工培养驯化微生物的新陈代谢作用，以污染物为主要 生长碳源和能源，外加n 、p 等营养物，在好氧或厌氧条件下达到降解污染物的 目的。h a i l i n g s o e r e n s e n 等通过研究表明：0 1 lm g k g 磺胺嘧啶在土壤中的半 衰期为1 4 - - 2 8 天；土霉素在厌氧条件下半衰期为9 天，而在表面沉积物中半衰 期长达3 0 1 4 2 天，泰乐菌素通过生物降解，可在2 0 3 0 条件下快速失活，而 呋喃唑酮在表面沉积物中的半衰期可达5 0 小时至2 个月 2 3 j 。张从良等经实验表 明磺胺嘧啶在湖水和猪场废水中的厌氧微生物降解速率常数分别为0 0 0 1 2 和 0 0 2 0 5d 1 ，其在湖水中的降解主要是由水解和化学降解等非生物降解作用引起 的，而在猪场废水中的降解主要是由微生物降解作用引起的【4 l j 。 7 第一章引言 第三节环境中抗生素残留分析技术方法概况 由于环境介质具有较复杂的基质效应并且环境中抗生素通常处于较低的浓 度水平。因此，如何准确、快速测定环境中的抗生素及其代谢产物，一直是科 学界的研究热点问题。 环境中抗生素药物的分析方法主要包括样品的前处理方法及检测方法两部 分。 1 3 1 环境中抗生素的前处理方法 样品前处理过程通常包括提取和浓缩两个重要部分。传统的提取方法有组 织捣碎法、振荡法、索氏提取法等。萃取是一种利用待测组分与样品杂质在互 不相溶的两相中溶解性差异进行净化的方法，是一种经典的萃取方法，但操作 比较费时，特别是当需要连续萃取时，需要大量的高纯溶剂以及会发生样品乳 化。在此基础上根据不同组分在固相填料上作用力强弱不同使被测组分与其它 组分分离的原理，建立的固相萃取法( s p e ) 在药物分析中得到了较为广泛的使 用。固相萃取法采用高效、高选择性的固相萃取剂，使一定体积的样品溶液通 过装有固体吸附剂的小柱，样品中与吸附剂有强作用的组分被完全吸附，然后， 以合适的溶剂将被吸附的组分洗脱出来。研究中也出现一些其他的新型富集提 取方法如：固相微萃取( s p m e ) 【4 2 4 3 1 、搅拌棒吸附萃取( s b s e ) 4 4 1 、膜萃取 和液相微萃取( l p m e ) 【4 5 】。总的来讲，固相萃取法是在动物组织、废水、畜禽 排泄物、土壤和沉积物等复杂基质中提取抗生素药物的方法中应用最为广泛的 一种似8 】，它已经成为当前全球药物研究实验中必备的工具之一【4 9 观】。由于环 境样品的复杂性，在进行固相萃取等富集步骤前需要采取适当的预处理措施减 少杂质的干扰，特别是在固相基质中提取测定抗生素时，预处理步骤必不可少， 目前主要采取的技术有超声辅助溶剂提取( u s e ) 或者是利用极性溶剂进行简单 的机械搅拌混合来提取【1 7 郴l 。另外也有人尝试一些先进的提取方法，比如：微 波辅助溶剂萃取法( m a s e ) 【矧、加压液相萃取法( p l e ) 1 5 4 j 和超临界流体萃取 ( s f e ) s s l ，它也是在两相之间进行的一种萃取方法，所不同的是萃取剂不是液 体，而是超临界流体。 经过提取后待测组分的存在状态经常不能满足检测仪器的要求，无法直接 测定，这时必须对组分进行浓缩。浓缩指通过减少样品溶液中的溶剂或水分而 使组分的浓度升高，溶剂挥发是常规的浓缩方法，常见的有减压蒸馏和气流吹 8 1 3 2 环境中抗生素含量的检测方法 由于水环境中抗生素通常处于较低的浓度水平，并且存在复杂的基质效应 影响。因此，如何准确、快速测定水环境中的抗生素及其代谢产物，一直是科 学界的研究热点问题。目前常用的检测方法有下列几类【5 6 】： ( 1 ) 微生物检测法： 利用对抗菌药物敏感的菌株作为指示生物体，将提取液和标准溶液对照， 再根据最低抑菌浓度推算出提取液中的药物浓度。但是该方法程序较烦琐。 ( 2 ) 分光光度检测法： 此方法简单、易操作，但干扰大，灵敏度低，检测范围小，现在己经较少 使用了。 ( 3 ) 气相色谱法( g c ) ： 是检测药物常用的一种方法。氯霉素类的药物一般采用气相色谱法。但是 该方法不适合测定不容易气化的物质。 ( 4 ) 高效液相色谱法( h p l c ) ： h p l c 法是目前最为常用的方法，配有u v 或者荧光检测器。测定范围很广， 几乎所有的抗菌药物都可以采用h p l c 法进行测定，不受挥发度、热不稳定性 等的影响，分离效果好、精密度高、易操作。但是选择性不强，对于有些抗生 素的灵敏度不高。 ( 5 ) 电泳分析法： 毛细管电泳是近几年发展非常迅速的一种检测技术，具有灵活、高效、高 灵敏度的优点。 ( 6 ) 色谱质谱联用技术： 随着近年来质谱技术的发展，联用技术近几年发展迅速( 如l c m s ，g c - m s 等) ，可以极大提高检测的灵敏度。 1 3 3 抗生素药物检测方法的应用 由于环境介质基体复杂且抗生素药物种类繁多、含量低等特点，为获得可 靠的分析结果，应当选择具有高选择性、高灵敏度及应用范围广的检测手段， 目前用于检测环境中抗生素污染的方法主要为色谱分析法和色谱质谱联用分析 9 厂二 法。曾有文献报道用g c m s 来检测水环境中的氯霉素和磺胺甲嘧啶，但利用 g c 分离抗生素需先将其极性部分衍生化，众多的抗生素在功能基团的性质和数 量上的差异使得普遍适用的抗生素衍生化方法的确立极为困难。液相色谱( l c ) 是一种有效分离药物的方法，被用于检测水环境以及土壤中众的多种微量抗生 烈4 6 , 5 4 , 5 7 - 5 9 】，包括高效液相色谱紫外吸收检测技术( h p l c 几) ；高效液相色谱 荧光检测技术( h p l c f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n ，h p l c f d ) ；高效液相色谱与串联 质谱联用技术( h p l c m s m s ) 。最近1 0 年由于h p l c 。m s 接口技术的日益成熟 以及e s i 和a p c i 技术的出现，h p l c m s 由于具有分析速度快、灵敏度高、应 用范围广，一般不需衍生化处理等特点而成为抗生素分析最为有效的检测手段。 第四节论文研究内容及意义 尽管已有很多学者提出有关环境中抗生素的分析检测方法，但可同时富集、 检测土壤基质中多类目标抗生素的高通量快速分析方法尚不完善。本实验选择 的1 8 种抗生素包括氟喹诺酮、磺胺和四环素三类，通过比较不同提取液对土壤 中抗生素的提取效果、不同固相萃取柱对抗生素的富集效果，建立了同时提取 土壤中l8 种抗生素药物的f j 处理方法。通过调节流动相优化色谱条件，在质谱 m r m 检测方式下选择信噪比( s n ) 最高的离子对进行检测，建立了同时测定 土壤中1 8 种抗生素药物的超高效液相色谱串联质谱分析方法，在3 0m i n 内完 成1 8 种三类型抗生素的快速分离检测。结合抗生素环境污染特点和天津市的实 际情况，针对天津市饮用水源地于桥水库及周边地区土壤、天津市南北排污河 污水灌溉区域的水体及土壤开展分析调查，初步确定其抗生素污染物残留水平。 具体进程包括以下几个部分： 1 ) 选定目标污染物 结合天津市于桥水库以及南北排污河实际情况根据抗生素残留的初步调查 结果及有关文献对