（物理化学专业论文）染料荧光探针与蛋白质、核酸相互作用的研究.pdf

摘要 染料荧光探针与蛋白质、核酸相互作用的研究 摘要 本文提出以染料碱性品红和偶氮氯膦i 作为蛋白质的探针，碱性品红和铝试 剂作为核酸探针。研究结果表明： 1 研究了以三苯甲烷类阳离子染料碱性品红( r l ) 与牛血清白蛋白( b s a ) 的 结合模型，发现结合反应符合p e s a v c n t o 提出的相分配模型，求得不同温度下r l 与b s a 相互作用的结合常数，依据热力学常数确定了r l 与b s a 之间的作用力 类型为疏水作用力。以r l 为荧光探针建立蛋白质的定量分析方法。在近中性范 围内，碱性品红与蛋白质有较强的结合，该产物的荧光强度与蛋白质的量呈线性 相关关系。线性响应范围为o 0 2 5 0 ug m l ，最低检出限可达1 9 6 i xg l ，用于 实际样品中蛋白质含量的测定，结果满意。 2 以三苯甲烷类阳离子染料碱性品红( r l ) 为荧光探针建立d n a 的定量分析 方法。在近中性范围内碱性品红与d n a 有较强的结合，生成复合物的荧光强度 与d n a 的量成线性上升关系，线性响应范围为o 0 4 8 3 3 0 卫g m l ( r = 0 9 9 0 4 ) ， 检测限3 8 9 uw e 。并用于样品中d n a 含量的测定，得到满意的结果，并对作用 机理进行了探讨，认为r l 与d n a 相互作用存在插入结合形式。 3 在p h 9 2 5b r i t t o n r o b i n s o n ( b - r ) 缓冲介质中，用荧光光度法研究了酸性 染料偶氮氯膦i ( c pi ) 与蛋白质的相互作用，牛血清白蛋白( b s a ) 对c pi 的 荧光有猝灭现象，使c pi 最大荧光峰从5 7 8 n m 红移至6 1 0 n m ，通过对荧光猝灭机 理进行了探讨，认为两者之间的猝灭是由于生成不发荧光的复合物，属于静态猝 灭过程，求得不同温度下的形成常数及热力学函数h 、a g 、as 分别为 一2 3 k j ，一3 1 2 k j ，9 8 5 j ，根据热力学函数确定了两者是通过静电作用力结合的。 还对荧光猝灭的实验条件进行了优化，建立了蛋白质定量的线性方程f = 2 0 8 c 一6 8 ( ug m l ) ，线性响应范围0 0 4 3 0 0ug m l 、检出限0 0 3 1u g m l ( r = o 9 9 5 6 ) ，并应用于实际及合成样品中b s a 含量的分析。 4 探究铝试剂在不同p h 值下的光谱特征时，发现p h 为4 0 4 的b r i t t o n - r o b i n s o n 缓冲介质中，铝试剂能与d n a 形成复合物，荧光光谱发生紫移，且荧光强度与 d n a 的量呈线性关系。确定了最佳反应条件，制定了四种核酸的工作曲线，其 线性范围宽，灵敏度较高，并用于实际样品的测定。本方法中试剂及反应体系稳 定，分析手续简便经济。 关键词：荧光分析法，碱性品红，牛血清白蛋白，d n a ，偶氮氯膦( i ) ， 荧光猝 灭法，铝试剂 s t u d i e so rt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nd y ep r o b e a n dp r o t e i no r n u c l e i ca c i d a b s t r a c t r o s a n i l i n ea n d c h l o r o p h o s p h o n f l z o 1w e r e p r o p o s e d a s p r o b e s o fp r o t e i n r o s a n i l i n ea n da u r i n t r i e a r b o x y l i ca c i dw e r ep r o p o s e da sp r o b e so fn u c l e i ca c i d r e s u l t ss h o w e dt h a t ： 1 i n t e r a c t i o no fr o s a n i l i n ew i t hb o v i n es e r u ma l b u m i na n di t sa n a l y t i c a l a p p f i e a t i o n s ：1 1 1 ef o r m a t i o nc o n s t a n to f r lw i t hb s aw a so b t a i n e da td i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s a c c o r d i n gt ot h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s ，t h e m a i ns o r to f b i n d i n g f o r c ew a sf o u n dt ob eh y d r o p h o b i cf o r c e an e wm e t h o df o rt h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s o fb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) w a se s t a b l i s h e db yt r i p h e n y l m e t h a n ec a t i o n i cd y e s r o s a n i l i n e ( i 也) u s e da sf l u o r e s c e n tp r o b e t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h e r ei ss t r o n g i n t e r a c t i o nb e t w e e nr la n db s ai nt h en e a rn e u t r a lm e d i u m t h ed e t e r m i n a t i o n c o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d n l ed e t e c t i o nl i m i to ft h i sm e t h o di s19 6hg lw i t l lt h e l i n e a rr a n g eo f 0 0 2 5 。0 且g m l t h em e t h o dh a sm a n y a d v a n t a g e ss u c h a sf a s t n e s s ， h i g hs e n s i t i v i t ya n ds i m p l i c i t y i tw a sa p p l i e dt oa n a l y s i ss y n t h e t i c a n dp r a c t i c a l s a m p l e s w i n ls a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h e i n t e r a c t i o no f r l w i t h b s a w a s i n a c c o r d w i t h p e s a v e n t om o d e l 2 1 ：n u o r i m e t r i c m e t h o do f d n a w i t h r o s a a i l i n e a s t h e p r o b ea n d t h e s t u d yo u t h e r e a c h m e c h a n i s m ：an e wm e t h o df o rt h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) w a se s t a b l i s h e db yu s i n gt r i p h e n y i m e t h a n e c a t i o n i c d y e s r o s a r d l i n ea s f l u o r e s c e n tp r o b e o u rr e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h e r ew a ss t r o n gi n t e r a c t i o nb e t w e e nr l a n dd n ai nt h en e a rn e u t r a lm e d i u m t h ei n c r e a s ei nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f t h e c o m p l e xw a sl i n e a rw i t ht h ea m o u n to f d n aw i t i lt h el i n e a rr a n g eo fo 0 4 8 3 3 0p g m l ( r = o 9 9 0 4 ) 髓ed e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d t h ed e t e c t i o nl i m i to f t h i sm e t h o dw a s3 9 0ug l t h em e t h o dh a sm a n ya d v a n t a g e ss u c ha sf a s t s i m p l e a n dh i g hs e n s i t i v i t y tw a sa p p l i e dt oa n a l y z es y n t h e t i ca n dp r a c t i c a ls a m p l e sw i t h 2 摘要 s a t i s f a c t o r yr e s u l t s a n dw e h a v eh a da p r e l i m i n a r yd i s c u s s i o no n r e l a t i v em e c h a n i s m ， i n d i c a t i n g t h a ti n t e r c a l a t i o nm o d e le x i s t sb e t w e e nr la n dd n a 3 s t u d y o fc b l o r o p h o s p h o n n z oif l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gb y p r o t e i n sa n d a p p l i c a t i o n ：a tp h 9 2 5b r i t t o n r o b i n s o nb u f f e rs o l u t i o n ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n c h l o r o p h o s p h o n a z o i ( c pi ) a n d p r o t e i n sh a sb e e ns t u d i e db yu s i n gf l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p ym e t h o d t h ee m i s s i o ns p e c t r u mo fc p i b s as h o w sab a t h o c h r o m i c s h i f tf r o m5 7 8 n mt o6 1 0 n m t h ed e v e l o p e dm e t h o dw a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no f p r o t e i ni ns a m p l e t h ef o r m a t i o nc o n s t a n ta td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s a n dt h et h e r m o d y n a m i cf i m c t i o n s ( s u c ha s ga ha n da s ) o fc p1w i t l lb s aw e r e o b t a i n e d t h em e c h a n i s mo ft h ef l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gw a sa l s oe x p l o r e d ，i ti s c o n s i d e r e dt h a tt h eq u e n c h i n gi sm a i n l yd u et og e n e r a t i n gq u e n c h a b l ec o m p l e xa n d t h a ti n t e r a c t i o no fc pia n dp r o t e i n sw a ss t a t i c e l e c t r i c i t yf o r c e s i na d d i t i o n ，t h e o p t i m u mc o n d i t i o no f f l u o r i m e t r i cd e t e r m i n a t i o no f p r o t e i nw a ss t u d i e d t h el i n e a r e q u a t i o nw a s f = 2 0 8 c 6 8 ( 1 a g m l ) t h ed e t e c t i o nl i m i to ft h i sm e t h o dw a s 0 ，0 3 1 p g m l w i t h t h e l i n e a rr a n g eo f o 0 4 - 3 0 o l x g m l ( r = 0 9 9 5 6 ) 4 f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r ys t u d yo nt h es y s t e mo f a u r i n t r i e a r b o x y l i ea c i d w i t hd n a ：t h ee n h a n c e m e n to ft h ef l u o r e s c e n c ed u et o t h ei n t e r a c t i o no f a u r i n t r i c a r b o x y l i ca c i d ( a t a ) w i t h d n a a t p h 4 0 4 b r i t t o n - r o b i n s o n w a s i n v e s t i g a t e d i ti sc o n s i d e r e dt h a tt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na t aa n dd n a g e n e r a t e sc o m p l e x ，a tt h e s a m et i m et h a tt h ee m i s s i o ns p e c t r u mo fa t a b s as h o war e ds h i f t t h ei n c r e a s eo f t h e c o m p l e x o ff l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y i sl i n e a rw i t ha m o u n to fd n a t h e d e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e da n dt h el i n e a r e q u a t i o n sw e r ed e t e r m i n e d r e s p e c t i v e l y t o d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，y e a s tr i b o n u c l e i c a c i d ，f i s h s p e r m d e o x y r i b o n u c l e i ca c i da n dc a l ft h y m u sd e o x y r i b o n u c l e i ea c i d as e n s i t i v ea n ds i m p l e m e t h o do ff l u o r e s c e n c ew a se s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd n a t h i sm e t h o d h a sb e e n a p p l i e d t od e t e r m i n a t i o no f d n a i ns a m p l e sw i t h s a t i s f a c t o r yr e s u l t s k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c ea s s a y , r o s a n i l i n e ，b o v i n es e r u ma l b u m i n ，d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d ，c h l o r o p h o s p h o n a z oi ，f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g m e t h o d ，a u r i n t r i c a r b o x y l i ca c i d 3 第1 章绪论 第l 章绪论 1 1 引言 蛋白质与核酸是最重要的生物大分子。蛋白质( p r o t e i n ) 在重量上占细 胞干重的一半以上，是肌肉、皮肤、血液和毛发等的重要成分，它还参与几乎 所有的生命活动过程，如生物体新陈代谢中起催化剂所用的酶、多种激素、细 胞生长分裂的调节因子和细胞表面与内部的各种受体等等，其主要成分都是蛋 白质。核酸包含了生命遗传信息，并参与这些信息在细胞内的表达，从而促成 并控制代谢过程。由于核酸介入了生物的生长、发育及繁殖等生命活动，且与 致癌等生理病变密切相关，所以研究核酸的结构与功能的关系，有利于人们从 分子水平上了解生命现象的本质。 众所周知，作为生命的物质基础蛋白质具有各种重要的生理功能，作 为遗传的物质基础核酸决定着遗传信息的传递。所以对它们进行深入的研 究很有必要。由于蛋白质和核酸的分子量巨大、结构复杂，常采用探针试剂对 其进行研究，揭示了蛋白质和核酸的结构、性质与生物功能之间的关系，阐明 生命的本质问题。 本文对近十年来利用各种方法研究蛋白质、核酸探针的情况进行了综述。 1 2 蛋白质探针的类型及研究进展 人们对蛋白质的研究。主要集中在蛋白质定量分析和作用机理两个方面。 它的定量分析是医学、生物、化学和其它学科中经常涉及的分析内容，又是f 临 床检验中诊断及评价疗效的重要指标：同时也是许多生物药物分离提纯中质量 检验以及食品检验中常见的分析项目；研究蛋白质与探针的相互作用机理，能 够间接地认识和探索生物大分子的结构、性质和行为。 1 2 1 有机分子型探针 有机小分子型蛋白质探针主要有分析试剂和药物两类。 ( 1 ) 分析试剂型 染料是常见的分析试剂，蛋白质的定量分析中研究最多、应用最广、操 作较为简便的分子光谱法就是基于染料与蛋白质的相互作用而建立起来的。常 见的染料有以下几种：( 1 ) 三苯甲烷类染料，如溴甲酚绿、溴甲酚紫、考马斯 4 第j 章绪论 亮蓝g 2 5 0 ( c b b g 2 5 0 ) 、铬天青s a i ( i i i ) ；( 2 ) 酸性咕吨类染料，如邻苯 三酚红钼( v i ) ，藻红等；( 3 ) 羟基葸醌类化合物，如茜素红等；( 4 ) 变色酸 双偶氮胂i 等。 三苯甲烷类探针的研究工作主要有：s a i t oy i l j 研究了十种有关铬天青s 的染料与h s a 的相互作用，发现含羧基的染料与h s a 作用后其吸收光谱发生 红移，但荧光强度不变化，而铬天青r 与h s a 作用后的荧光强度增强，作者 认为这与羧基的离子化及染料的平面性有关。马春琪【2 进一步研究了蛋白质与 铬天青s 的相互作用，认为铬天青优先与b s a 上的色氨酸结合，然后与酪氨 酸结合，在b s a 等电点前以静电引力相结合，等电点以后以疏水力结合，反 应符合相分配模型。s u z u k iy t 3 1 研究了溴甲酚绿与蛋白质的相互作用，指出可 利用6 2 0 n m 处的最大吸收峰来分析血清中的全部蛋白质，加入甲醇可提高血 清球蛋白与溴甲酚绿的反应活性。魏永巨 4 j 研究了溴甲酚绿与b s a 的相互作 用，指出在酸性环境中b s a 由于肽链上的氨基酸残基质子化而带净电荷，可 与带负电荷形式的溴甲酚绿以静电引力结合，两者之间也有一定的疏水力。此 外，俞英等【5 】研究了酸性品红在酸性溶液中与牛血清白蛋白的结合反应，认为 两者主要是通过静电引力而结合，结合的反应符合p e s a v e n t o 提出的相分配模 型，并探讨了实验条件对结合反应的表观常数、结合常数、s a n d e l l 灵敏指数的 影响。 偶氮类染料探针的工作主要有：p e s a v e n t o m 【6 研究了p h i - - - 4 范围内b s a 与1 一四唑基偶氮一2 羟基萘一3 ，6 一二磺酸的相互作用，发现吸收光谱发生变化。李 娜【7 j 研究了一系列偶氮类小分子如：铬变酸、酸性铬黑、偶氮胂( i ) 、偶氮 胂羧、钙镁试剂、溴磺偶氮等与b s a 的相互作用，指出在p h 4 环境中蛋白质 全部质子化，并且分子呈伸展状态，与含有磺酸基的偶氮胂( 1 i d 依靠静电引 力结合，其结合模型符合s c a t h a r d 模型，且存在两种类型的结合。 其它分析试剂探针的工作主要有：冯喜增 8 1 研究了吖啶橙与b s a 之间的 相互作用，指出吖啶橙对b s a 是单一的静态猝灭过程：庄稼9 】研究了羟基葸醌 类化合物茜素红s 与b s a 之间的相互作用，实验中固定茜索红s 的浓度，改 变体系中缓冲液的酸度，观察相应的吸收光谱变化，发现随着溶液的p h 值的 升高，4 2 0 n m 处的吸收峰逐渐红移，说明茜素红s 的羟基逐步离解。当其它条 第1 章绪论 件不变只增大b s a 的浓度，而在5 3 0 r i m 处的吸收峰值渐渐升高，表明已质子 化的蛋白质与阴离子染料发生了结合反应。k a n gs i q i n 9 1 1 0 l 合成了一种新的荧光 试剂e p q s ，并利用它与h s a 相互作用。李东辉f 】l 】用荧光各向异性法研究四 磺基铝酞菁与b s a 的相互作用，体系荧光激发波长为3 5 8 n m ，发射波长为 6 8 5 m n ，认为b s a 对光敏剂四磺基铝酞菁有较强的结合能力，提示血清白蛋白 对酞菁类光敏剂可起到储存和转运的作用。此外，俞英等 12 】还用平衡透析法和 分光光度法研究了2 ( 8 - 羟基喹啉5 磺酸一7 一偶氮) 1 8 二羟基- 3 ，6 萘二磺酸 ( 8 q 5 s a c ) 与牛血清白蛋白在酸性溶液中的结合反应，认为8 q 5 s a c 与b s a 之间的结合力是以静电引力为主的非共键作用力，并探讨了其结合模型。在 2 9 8 k 下，测得这一反应的最大结合数为3 5 - - - 4 0 ，结合常数为6 1 1 0 5 l m o l 。 还研究了溶液基本条件如酸度和离子强度等对8 q 5 s a c 与b s a 分子复合物形 成的影响，在p h 3 3 4 条件下，标准工作曲线的线性范围为0 2 0 - - 4 6 9 0 m g l 。 ( 2 ) 药物型 人血清白蛋白( h s a ) 是人体中的药物输送蛋白，药物进入血液后，药物 先和血清自蛋白结合，然后再被运输到身体的各个部位。马贵斌等f 1 3 1 研究喹诺 酮类药物氟哌酸、萘啶酸对h s a 荧光的猝灭现象，认为药物与氨基酸残 基的相互作用使酪氨酸与色氨酸间发生了能量转移，两者的结合靠疏水作用 力。徐岩f 1 4 】利用保泰松、布洛芬作为白蛋白分子标定结合位置的标记物，研究 萘啶酸在b s a 上的结合位置。张晓威1 5 认为环丙沙星与b s a 的相互作用为单 一的动态猝灭过程；商志才【】6 】通过同步荧光光谱，认为环丙沙星使色氨酸所处 环境的疏永性增加，使b s a 的构象发生变化，两者之间的结合力主要是疏水 力。 还有一些其它药物作为蛋白质探针。异烟肼和氟哌酸较维生素b 脂溶性 好，水溶性差与h s a 结合在某一疏水性环境内1 1 3 j ；心血管病药物盐酸川 芎嗪可能结合在b s a 的疏水空腔中 1 7 】；降血压药物多沙唑嗪与b s a 的相 互作用力主要为疏水力；水杨酸在p h 9 5 0 含0 0 1 m o l l k c i 的硼砂缓冲液中 与h s a 发生了结合，形成了不发射荧光的复合物。 此外，有一些从中草药中提取的药物作为蛋白质的探针。甘草酸能与b s a 的亲水性部分发生作用1 7 】；金银花的主要有效成份氯原酸与自蛋白的相互 第1 章绪论 作用使白蛋白的荧光猝灭【2 0 】；张保林 2 1 , 2 2 1 研究了十四种蒽、醌及黄酮类化合物 与b s a 、h s a 的相互作用，指出葸、醌及黄酮类化合物与b s a 的结合能力随 其极性减少、脂溶性增加而增大，主要是通过疏水作用而与b s a 结合。 1 2 2 金属离子型探针 单一金属离子中以稀土作为探针的研究较多，其中以t b ( i i i ) 、e u ( i i i ) 作为荧光探针最为常见。 杨频2 3 1 等利用t b ( i i i ) 、e u ( i i i ) 与蛋白质生物大分子相互作用的荧光 敏化现象进行计量化学方面的研究，测定了它们的解离常数、竞争离子的解离 常数以及金属离子的结合部位的结构类型。张保林1 2 4 j 研究t b ( h i ) 、e u ( i h ) 与b s a 相互作用的机理表明，参于配位的基团只有谷氨酸、天冬氨酸残基侧 链的b 、y c o o 和肽键中的c = o 基，结合部位分布在b s a 的亲水表面。李 晓晶口5 1 在模拟生理条件下研究了稀土离子与b s a 的相互作用，表明t b ( i i i ) 与b s a 形成1 ：2 配合物；用平衡透析法确定了p r ( i n ) 与b s a 存在两类结合。 杨斌盛【2 6 0 7 谰紫外差谱法研究了t b ( i i i ) 、e u ( i i i ) 能与人血清脱铁蛋白、伴 清蛋白作用；镧系金属离子对伴清蛋白也有结合，并确定了结合部位。此外， 梁宏等渊也有类似的研究。 除稀土金属离子作为蛋白质的探针外，人们还研究了其它的金属离子作 为蛋白质探针。周永洽、梁宏 2 9 - 3 6 】进行了一系列的研究工作，他们指出：n i ( i i ) h s a 和n i ( i i ) 一b s a 的1 ：1 体系内各有两个强偶合的金属中心，其电 荷转移谱带( l m c t ) 是一种新型的减色效应，并符合生色基跃迁偶极矩间的 偶极一偶极相互作用机理：c u 2 + 、n i 2 + 与b s a 的配合物结构随b s a 的浓度增 大以五配位的四方锥构型转变成四配位的四方平面构型；还研究了解c u 2 + 、 n i 2 + 、f e 3 + 、c 0 2 + 、c 0 3 十与人血清蛋白( h s a ) 的相互作用时的配位构型的变化 和结合部位。张朝平1 3 7 1 指出a g + c u 2 + 与b s a 中端基氨基酸残基上的氮和羧基 上的氧均可能存在直接键合作用。黄仲贤3 8 1 认为，根据软硬酸碱理论，z n 2 + 、 c d 2 斗、h g z * 、c u 2 + 、a 矿等易于含有大量的巯基的金属硫蛋白结合，可能是在 生物体重金属解毒方面担承一定的作用。安方 3 9 】在研究钒( i v ) 离子与g 肌 动蛋白作用时，发现在g 肌动蛋白上有一个v 0 2 + 的强结合点和几个弱结合点， 还有v o ”与m g ”相似可能结合在钙的强结合部位上。 7 第1 章绪论 1 2 3 金属配合物型 某些金属配合物借助配体中带负电荷的基团，与蛋白质依靠静电作用力 结合，或者利用配体中的豌水基团以疏水作用力与蛋白质结合，从而产生光学 性质方面的变化，以此来测定蛋白质的浓度以及探讨蛋白质的高级结构。 f u j a t ay 【4 0 】研究了h s a 与邻磺酸基苯基荧光酮u ( v i ) 配合物的相互作 用，依靠热力学参数指出两者的相互作用是疏水反应；还利用3 , 4 ，5 ，6 四氯羧 基苯基荧光酮- m n ( 1 1 ) 配合物与蛋白质相互作用，金属配合物产生可观的红 移并借此测定蛋白质，认为蛋白质与金属配合物的反应能力与蛋白质的等电点 有关f 4 ”。 魏永巨【4 2 1 研究了蛋白质与f e ( i i d 铬天青s 配合物的相互作用，发现 f e ( i i d 铬天青s 的吸收光谱中的最大吸收波长为5 7 0 n m ，而蛋白质与f e ( i i i ) 一铬天青s 三元配合物的最大吸收峰波长为6 6 0 n m ，认为这是因为b s a 侧链上 的质子化氨基与f e ( ) 一铬天青s 配合物的磺酸基、羧基发生了静电作用而 缔合，致使配合物n 电子体系n 一”+ 跃迁的能级间隔显著变小，所以引起了 较大幅度的红移。 俞英等1 4 3 研究了在酸性溶液中b s a 与偶氮胂( ) 镱( i i i ) 络合物的 结合反应，发现加入b s a 后偶氮胂( i i i ) 镱( h i ) 的吸收光谱产生减色效应 和红移，并探讨了实验条件对反应的影响。随着b s a 量的增加，6 5 0 n m 吸收 峰线性下降，基于此建立了蛋白质定量分析法，用分光光度法研究b s a 与偶 氮胂( i i i ) 一镱( h i ) 之间的结合模型，发现结合反应符合s c a t c h a r d 模型。进 一步的研究发现b s a 与阳离子表面活性剂、偶氮胂( i i i ) 镱( i i i ) 之间的作 用机理相类似。 1 3 核酸探针的类型及研究进展 核酸探针的研究主要集中在核酸定量分析和作用机理两个方面，下面就 对核酸探针作用机理的研究情况进行介绍。 1 3 1 有机分子型探针 大部分有机分子型核酸探针，有如下特点：带有正电荷，有大的电子共 轭体系，有强的芳香性或疏水性，不能带有负电荷的亲水基团。有机分子核酸 探针根据其用途的不同可分为分析试剂和药物两种类型。 第1 章绪论 ( 1 ) 分析试剂型 分析试剂作为有机分子型核酸探针的研究工作主要体现在如下方面： ( 1 ) 用花青染料作为核酸探针。当溶液的p h 值高于4 时，核酸呈多阴 离子状态，因此具有与某些阳离子染料结合的能力4 钔。y a r m o l u ksm t 4 5 1 合成 了系列单次甲基花青染料，并以此作为探针研究了与具有天然活性的核酸的相 互作用，发现花青3 、花青6 与核酸作用，荧光强度增大到3 5 0 1 5 5 0 倍，而 花青4 与核酸作用，有极大的s t o k e s 位移( 1 5 4 n m ) ，他指出合成含有亚甲基 氧苯并噻唑残基的花青染料有可能成为用于研究与核酸相互作用的新型染料。 ( 2 ) 用酸碱荧光指示剂为核酸探针。s c h yw i l l i a me 1 4 6 研究二氨基苯甲 酸与d n a 的相互作用，指出b i s t r i s 缓冲液会对荧光定量d n a 产生干扰，提 出用二氨基苯甲酸一2 h c l 荧光分析法联合紫外光谱来测定d n a 的纯度。 d a r z y n k i e w i c z z l 朔、g u o x q 4 8 研究了吖啶橙与核酸的相互作用，认为可以用 荧光测定细胞中的核酸。认为其荧光强度增大是因为阴离子表面活性剂溶液中 d n a 使吖啶橙的单聚体与双聚体之间的平衡发生变化，单聚体嵌入d n a 中， 引起二聚体的离解，导致荧光增强。唐宏武f 4 9 】指出吖啶橙与核酸结合方式：一 种是在嵌入核酸双链的碱基对之间，形成a o d n a 复合物，另一种是与d n a 单链核酸的磷酸基团发生静电作用，形成a o r n a 复合物。赵一兵【5 0 1 研究水 杨酸、邻氨基苯甲酸与d n a 的相互作用时，认为d n a 分子中碱基的磷酸基 或戊糖组份均是有形成氢键的基团，与水杨酸、邻氨基苯甲酸分子共存时发生 竞争反应，破坏了水杨酸、邻氨基苯甲酸的二聚体的分子间氢键，致使荧光性 单体增加而荧光强度增强。 ( 3 ) 其它分析试剂。b h a r t a c h a r g a 等剐利用含有葸基的荧光探针研究表 面活性剂与d n a 的相互作用，指出阳离子型表面活性剂和盐可以诱导d n a 构象转变，使得结合在d n a 上的荧光探针被释放出来。z h uqz 【5 2 研究了d h 为3 4 4 0 条件下h y p o c r e l l i na 与核酸的相互作用，发现二者的相互作用会使 体系的荧光强度增强，测定核酸的线性范围o 2 0 0 n p j m l 。 此外，俞英等1 5 3 在p h i 1 的条件下用丁基罗丹明b 在3 3 5 、3 8 0 、4 2 0 、 和4 4 0 n m 有四个共振散射峰强度大增，其散射光强度与核酸的浓度呈现性关 系，基于此建立了具有较高灵敏度、操作简单的核酸测定方法，将该方法用于 9 第】章绪论 核酸人工合成样品的测定，结果令人满意。 ( 2 ) 药物型 临床上使用的许多抗癌药物，都以d n a 为作用的主要靶点，通过与癌细 胞的d n f i 发生相互作用破坏其结构，进而影响基因调控与表达的功能，表现出 抗癌性。其中探针的研究工作主要有： ( 1 ) 含有蒽醌环的抗菌素。如阿霉素。“、道诺霉素、诺加霉素、阿克拉 霉素a 等，其共同的结构特征是含有一个由三个共平面的六元环所构成的四氢 并四苯醌发色团。w e i n e r 。”和s c h u s t e r ”均认为具有葸醌结构的衍生物均可以 被设计成人工核酸酶，与含有双功能基团的天然核酸内切酶相比，蒽醌结构简 单、合成方便等优点，因此具有很大的研究与应用价值。 ( 2 ) 糖蛋白抗菌素。博来霉素( b l e o m y c i n ，b l m ) 是一种天然存在的糖 肽，临床上常被用来治疗头、颈及鳞状细胞癌。其结构可以分为c 一端( d n a 识 别区) 、n 一端( d n a 断裂区) 和糖残基区三部分“，它对d n a 进行序列特异性剪 切首先取决于c 一端对d n a 的识别。若对b l m 各区进行修饰，可获得对d n a 分子 有更高识别能力的主体分子，且使利用手性识别d n a 成为可能”。近年来从海 洋生物中还发现了一系列高活性的抗癌肽，其结构多为小分子环肽，它们不仅 抗癌活性高，且稳定性好，但有关此类抗癌肽作用机制的研究尚需进一步探索。 ( 3 ) 含有多烯炔( e n e d i y n e ，e d ) 基团的天然抗菌素。这类抗菌素包括 n e e c a r z i n o s t a i n ( n c e ) 、d y n e m i c i n ( d y n ) 、e s p e r a m i c i n s ( e s p ) 等5 。e d 分子 包括d n a 识别区、生物活性区( 多烯炔环) 、活性激发区三个部分，识别区决 定了主体分子对d n a 识别能力的特异性。e d 菌素在激发基团作用下，多烯炔环 发生b e r g m a n 芳环化，产生的双自由基可与d n a 发生反应。主体分子作用点周 围的因素( 空间位阻、自由基的猝灭等) 对e d 药效的影响很大。 ( 4 ) 乙撑亚胺型烷化剂抗生素。如丝裂霉素c ( m i t o n y c i nc ，m c ) 所具 有的抗肿瘤能力及强细胞毒性均是它和d n a 双链共价交联的能力有关，m c 在与 d n a 结合之前，必须先经还原活化过程，活化后的5 i c 先与d n a 结合使之单烷基 化，然后产生双烷基化产物”。进一步表明，m c 在单烷基化d n a 时具有高度的 序列选择性“。 1 3 1 金属离子型 l o 第j 章绪论 对单一金属型核酸探针的研究，将促进人们进一步了解金属离子在核酸分 子中所起的作用以及对核酸的生物功能的影响。目前的研究主要集中在金属离 子与核酸的结合反应上。 金属离子核酸探针中以稀土金属离子较多，其中杨频【6 2 1 指出可以利用稀土 金属离子t b ( i i i ) 作为荧光探针，来分析探测核酸分子中未配对的碱基。慈 云祥【6 3 】研究了铽( 1 1 1 ) 离子与d n a 、r n a 的的相互作用，指出r n a 可直接 与铽( i i i ) 离子发生荧光反应，而d n a 需要变性之后才能与铽( h i ) 离子发 生荧光反应。y a n gjh “】研究了铽( 1 1 1 ) 离子与r n a 的相互作用形成二元络 合物发出t b ( i i i ) 的特征荧光光谱。黄承志【6 5 研究了在n a c i 介质中小牛胸腺 d n a 与c e ( i i i ) 离子的相互作用，发现c e ( h i ) 产生的荧光猝灭，认为是由 于c e ( 1 1 1 ) 的各种阳离子型体与小牛胸腺上的磷酸根阴离子发生静电作用。、 s h i o n o y am f 6 6 j 研究t b ( i l i ) 离子与d n a 相互作用，t b ( i i i ) 荧光可增强几倍， 而t b ( 1 1 1 ) 的大环配合物与d n a 中的鸟嘌呤碱基相互作用使体系荧光巨增。 m e n g jx 【6 7 研究在p h 6 0 条件下，c e ( 1 1 1 ) 离子产生的荧光被r n a 猝灭，与 s c a t c h a r d 方程相符合存在两类结合，而且加入精胺可以稍稍降低两者的结合常 数。 其次，还有一些非稀土金属离子作为核酸的探针。l e c o m t es t 6 8 1 研究了 m 9 2 十、吡哌酸与d n a 之间的作用，指出m 9 2 + 通过d n a 的磷酸二酯基和氨基 碱基对与d n a 发生作用。花尔并f 6 9 研究了a 型的均聚双链核糖核酸与c d 2 + 的相互作用，认为c d 2 + 的存在对双股螺旋起到了稳定的作用，可能c d 2 + 与磷 酸根发生了静电作用有关。 1 3 3 金属配合物型 金属配合物作为探针研究得较多的是以邻菲咯啉( p h e n ) 和联吡啶( b p y ) 为 配体形成的金属配合物。1 9 8 2 年b a r t o n ”通过 z n ( p h e n ) 。r 与小牛胸腺d n a 相互作用，证实 z n ( p h e n ) 。 ”是以插入方式与d n a 结合的，被称为是第一具有 立体选择性的d n a 插入试剂。1 9 8 6 年b a r t o n 1 发现由这些配体配位生成的r u ”、 c o ”八面体配合物与d n a 作用具有立体选择性，从而发展了一种能识别b 型和z 型d n a 的手性探针。1 9 9 0 年b a r t o n 等“2 用光谱法、流体力学、荧光光谱、光 物理学和一维n m r 等方法进行研究，认为 r u ( p h e n ) 。 ”的异构体一和八一与d n a 第1 章绪论 相互作用存在插入和静电结合两种方式。插入方式有利于一异构体，发生在 d n a 的大沟处( 1 个邻菲咯啉配体插入到d n a 碱基对之间，另2 个非插入邻菲略 啉配体则位于d n a 外侧，并与d n a 磷酸酯骨架相互作用) 。静电结合则较有利 于八一异构体，发生在d n a 的小沟处( 2 个邻菲咯啉配体沿d n a 骨架排列，第3 配体位于d n a 外侧，这一结合方式的稳定性来自疏水作用和静电作用) 。 宋玉民等”用荧光法将 c o ( p h e n ) 。 3 _ 滴加入e b d n a 中，荧光强度逐渐降 低，说明c o ( p h e n ) 。 3 + 与d n a 作用存在插入结合方式。 靳兰等”用手性金属配合物 n i ( p h e n ) 。 2 + 和 f e ( p h e n ) 。 2 + 与e b d n a 作用， 其$ c a t c h a r d 图均为直线，且k 及n 都改变表现为混合型。可能是部分菲咯啉 配体插入到d n a 双螺旋碱基对中，同时带正电荷的配合物与d n a 的磷酸基团可 能发生静电结合。 张荣丽等”“在p h 为7 0 的磷酸盐缓冲液中用荧光光谱、紫外光谱和电化 学等方法研究了 c u ( p h e n ) 。 ”和 c u ( b p y ) 。 2 与6 一硫基嘌呤( 6 - m p ) 、腺嘌呤 发生了相互作用，依荧光光谱实验数据算出配位比( 均为1 ：1 ) 和配位常数。 从而可知这些生物分子与铜配合物形成新的大分子配合物而产生荧光静态猝 灭，而不是动态碰撞猝灭”。用电化学实验也得到相近的结果，且 c