（环境工程专业论文）厌氧氨氧化细菌在有机碳源条件下的非氨氧化特性研究.pdf

摘要 厌氧氨氧化细菌在有机碳源条件下的非氨 氧化特性研究 专业：环境工程 硕士：谢志儒 指导教师：贾晓珊教授 摘要 厌氧氨氧化技术是一种新型生物脱氮技术，厌氧氨氧化反应是在厌氧条件 下，以n h 4 + 为电子供体，n 0 2 为电子受体，生成n 2 的一种生化反应。能够发生 厌氧氨氧化反应的细菌被称为厌氧氨氧化细菌。长期以来，人们认为厌氧氨氧化 细菌是一种严格的自养菌，但近三年来有文献报道厌氧氨氧化细菌能够利用有机 物。本文在总结文献资料和课题组前人研究成果的基础上，对厌氧氨氧化细菌在 有机碳源作用下发生的反应进行了系统的研究。本文主要内容如下： 一以c s t r ( 完全混合连续流) 反应器接种硝化污泥为种泥启动厌氧氨氧化反 应，成功培养出具有厌氧氨氧化活性的富集培养物。将培养得到的厌氧氨氧 ，化富集培养物中的优势菌进行了分子生物学鉴定，证明是一种新的厌氧氨氧 化细菌。 二以不同浓度的葡萄糖为碳源，研究有机碳源条件下，厌氧氨氧化富集培养物 的代谢途径。低浓度( o 5 m m ) 的葡萄糖对厌氧氨氧化反应有促进作用，高 浓度( 大于1m m ) 能抑制厌氧氨氧化反应，使富集培养物发生反硝化和硫 酸盐还原反应。添加抑制剂实验的结果证实发生的反硝化反应和硫酸盐还原 反应不是反硝化细菌和硫酸盐还原菌造成的。扫描电镜实验结果证实富集培 养物在发生反硝化和硫酸盐还原反应后，细菌种群没有明显变化。活性恢复 实验证实在发生反硝化反应和硫酸盐还原反应后，厌氧氨氧化富集培养物能 够恢复厌氧氨氧化活性。由此得出结论，本文中厌氧氨氧化细菌在有机碳源 v 摘要 条件下能够发生反硝化反应和硫酸盐还原反应。初步研究显示，厌氧氨氧化 细菌发生反硝化反应的葡萄糖需要量为2 5 7 9 葡萄糖儋亚硝态氮。 三考察其他不同有机碳源对厌氧氨氧化富集培养物的影响，探讨在这些有机碳 源条件下厌氧氨氧化富集培养物的代谢途径。结果如下：甲醇完全抑制了厌 氧氨氧化反应。甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐在低浓度下对厌氧氨氧化反应没有 太大影响，在高浓度下能完全抑制厌氧氨氧化活性，使厌氧氨氧化富集培养 物发生反硝化反应，但未使厌氧氨氧化细菌发生硫酸盐还原反应。低浓度的 乳酸盐对厌氧氨氧化反应没有太大影响，高浓度的乳酸盐能使厌氧氨氧化富 集培养物发生反硝化反应和硫酸盐还原反应。初步推测，硫酸盐还原反应跟 葡萄糖和乳酸的分解代谢相关。 关键词：厌氧氨氧化，有机代谢，反硝化，硫酸盐还原 a b s t r a c t t h e s t u d y o nn o n a n a m m o xo fa n a m m o x 1jj d e c t e r l al np r e s e n t0 lo r g a n i cc o m p o u n d s m 句o r ：e n v i l o 砌e n t a le n g i l l e e r i l l g m a s t e rc a n d i d a t e ：x i cz h i n l s u s p e r v i s o r ：p r o f e s s o r ：j i ax i a o s h a n a b s t r a c t a n a e r o b i ca m m o n i ao x i d a t i o n( a n a m m o x )i s an e wa n d p r o m i s i n g d e n t r i f i c a t i o nb i o t e c h n o l o g y t h i sn e wp r o c e e so x i d i z e sa m m o n i u mu n d e r 卸o x i c c o n d i ti o n sw i t hn i t r i t ea se l e c t r o na c c e p t o ra n dd i n i t m g e ng a sa st h ep r o d u c t f o ra l o n gt i m e ，a n a m m o xb e c t e r i ah a db e e nd e s c r i b e da so b l i g a t ec h e m o i i t h o a u t o t r o p h s b u tr e c e n t l y m a n ys t u d y si n d i c a t e st h a ta n a m m o xb e c t e r i ac a no x i d 泣e so 曙a n i c c o m p o u n d sm a i n l yt oc 0 2 ，w i t hn i t r i t e a se i e c t r o na c c e p t e r i nt h i ss t u d y ，t h e m e t a b ol i cp a t h w a yo fa n a m m o xb e c t e r i ai nt h ep r e s e n c eo fo 唱a n i cc o m p a n d sw a s i n v e s t i g a t e d t h em a i nc o n c l u s i o n s 、v a sf o l l o w e d t h ea n a m m o xc u l t u r e sh a v eb e e ne n r i c h e dw i t hn i t r i 矽i n gs l u d g e t h el6 sr r n a s e q u e n c eo ft h ea n a m m o x b e c t e r i ai nt h ea n a m m o xc u i t u r e sw a sa l i g n e d ，a n dt h e a n a m m o xb e c t e r i aw a si d e n t i n e da san e wa n a m m o xb e c t e r i a ，n a m e da 2 t h ee 行e c t so f g l u c o s eo na n a m m o xc u h u r e sw e r ei n v e s t i g a t e d 1 tw a ss h o w nt h a t t h ea n a m m o xr e a c t i o nw a sa c c e l e r a t e do nl o wg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n ，b u to nh i g h g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n ， t h ea n a m m o xr e a c t i o nw a sc o m p l e t e l yi n b i b t e d ， a n dt h e d e n i t r i f i c a t i o na n ds u l f 乱er e m o v a lw e r ef o u n d e d t h ei n h i b i t o re x p e r i m e n t ss h o w e d t h a tt h ed e n i t r i n c a t i o na n ds u l f a t er e m o v a lw e r en o td o n eb yd e n i t r i f i c a t i o nb e c t e r i a s a n ds u l f a t er e d u c i n gb e c t e r i a ( s r b ) t h es e m so fb a c t e r i a si na n a m m o xc u l t u r e s a b s 订a c t s h o w e dt h a tt h e r ew a sn o td i s t i n c tc h a n g eo fb e c t e r i a si na n a m m o xc u l t u r ea f t e r d e n i t r i f i c a t i o na n ds u l f a t er e m o v a i t h ea n a m n l o xc u l t u r ea f t e rd e n t r i f i c a t i o na n d s u l f a t er e m o v a lc a ns h o wa n a m m o xa c t i v i t ya g a i ni ni n o r g a n i cc o n d i t i o n a l lt h e s e s h o w e dt h a ti nt h ep r e s e n to fg l u c o s e t h ea n a m m o xb e c t e r i ac a no x i d i z eg l u c o s ew i t h n 0 2 。a n ds 0 4 2 。a se l e c t r o na c c e p t e l t h ee 仃色c t so fo t h e ro 唱a n i cc o m p o u n d so na n a m m o xc u l t u r ew e r ei n v e s t i g a t e d i tw a ss h o w nt h a tm e t h a n o li n h i b t e da n a m m o xb e c t e r i ac o m p l e t e l yo nv e r yl o w c o n c e n t r a t i o n f o 咖a t e ，a c e t a t ea n dp r o p i o n a t eh a dn od i s t i n c te f 诧c t so na n a m m o x r e a c t i o no nl o wc o n c e n t r a t i o n ，b u to nh i g hc o n c e n t r a t i o n ，a n a m m o xr e a c t i o nw 硒 i n h i b i t e d a n dd e n i t r i f i c a t i o nw a so c c u r 】r e d l a c t a t eh a dn od i s t i n c te f i e c t so n a n a m m o xr e a c t i o no nl o wc o n c e m r a t i o n ，b u to nh i g hc o n c e n t r a t i o n ，a n a m m o x r e a c t i o nw a si 1 1 h i b t e da n dd e n i n t r i 矗c a t i o nw a so c c u n e da n ds u l f - a t er e m o v e lw a s 旬l l o w e d 酗rw o r d s ：a n a m m o x ，0 r g a n i cm e t a b o l i c ，d e n i t r m c a t i o n ，s u l f a t er e m o v e l v 一 论文原创性声明 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 t 作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何他人或者 集体已经发表或撰写过的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作：谗在碍 日期：为嘲年月l 日 学位论文使用授权声明 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：谗在儡 日期：舻3 年月乜日 导师签名： 日期：年月 日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 水体中氮素污染及其危害 水体中的氮的来源是多方面的，主要由城市污水、工厂工业废水、农溉污水 三方面带入。此外自然界的天然固氮也是一个方面，通过雷电同定大气中的氮就 占天然固氮的l5 。大气中的氮通过下雨会降解到水体，水体本身尚有许多能同 氮的微生物，如某些固氮菌和蓝绿藻，在光照充足的情况下能将大气中的氮固定 下来并进入水体【lj 。 随着我国城市人口的增加和人口的进一步集中，以及人民生活水平的提高， 城市排放的垃圾量和污水量在逐步上升。城市生活污水中的氮主要由厨房洗涤、 厕所冲洗、洗衣等带入，城市垃圾的渗滤液含有较高的氨氮。每吨垃圾约产生 o 0 7 2 2 t 渗滤液。例如香港新界的垃级渗滤液就含有高达5 0 0 0 m l 的氨氮【2 】。 许多工业废水( 如制革废水、食品加工废水、炼焦废水、合成氨废水) 含有 氮素污染物，污染物的种类和浓度因行业而异，变化较大。人工合成的含氮化肥 是水体中氨氮营养元素的主要来源。据统计，目前我国的氮肥产量居世界首位【2 1 。 农业污水包括农业灌溉污水和禽畜养殖废水。氮肥进入土壤后，一般认为被 当季植物吸收的量不超过5 0 ，可被后季植物所利用的量约为2 5 3 5 ，而损 失到大气或随水流失的部分可达到总量的2 0 以上。此外，部分农药含有有机 氮。仅有1 0 2 0 的农药吸附在作物上，有8 0 9 0 的农药会流失在土壤 中，随雨水冲淋、农业排水和地表径流进入河道等水体中。因此，由施用农药而 排入水体中的有机氮也相当可观。畜禽养殖废水中也含有大量氮素污染物，据统 计【3 】，19 9 9 年我国排放的畜禽养殖污水超过2 0 0 亿吨，氮素污染负荷高达l5 9 7 万吨。 各种形式的含氮化合物排入水体引起了严重的水体氮素污染，造成的环境危 害日益严重，主要体现在以下几个方面【4 】：( 1 ) 水体中所含的氨氮特别是封闭水 体中所含的氨氮会造成水体富营养化。近年来频频爆发的蓝藻赤潮灾害就是水体 富营养化造成的，给人民生活生产造成了巨大的危害。( 2 ) 引起水体缺氧并对水 生生物产生毒害，氨是硝化细菌的能源，硝化作用会消耗大量的氧气，通常1 m g 第一章绪论 氨氮氧化成硝态氮需要消耗4 6 m g 溶解氧，水体中氨态氮越多，耗去的溶解氧也 越多，会使水体缺氧。( 3 ) 影响人类健康，人体若饮用了n 0 2 n 浓度高于1 0 m g l 或硝态氮浓度高于5 0 m g l 的水，会使人体正常的血红蛋白氧化成高铁血红蛋白， 失去血红蛋白在体内输送氧气的能力，出现缺氧的症状。硝酸盐若长时间作用 于人体可致癌，皿硝酸盐经水煮沸后还可造成浓缩，其危害程度更大。 1 2 脱氮技术的研究现状及发展 随着水体富营养问题的日益突出，世界各国都制订了严格的氮素排放标准， 我国也不断严格了氨氮的出水排放标准【5 】，1 9 9 8 年制订的污水综合排放标准 中氨氮的最高容许排放标准：一级排放标准为1 5 m g l ，二级排放标准为2 5 m g l 。 废水中氨氮的去除有多种方法。物理方法有反渗透法、电渗析法、蒸馏法等； 化学方法有空气吹脱法、离子交换法、折点氯化法、电化学处理法等；生物方法 有硝化一反硝化法等。其中，生物脱氮法作为一种经济、节能、二次污染小的脱 氮方法一直被公认为是最有发展前途的方法之一。 1 2 1 传统生物脱氮法 传统生物脱氮法其基本原理在于通过硝化反应先将废水中的氨氮氧化为硝 态氮，再通过反硝化反应将硝态氮还原成气态氮从水中逸出。它包括硝化和反硝 化两个过程。 1 2 1 1 硝化反应原理 硝化反虑是由一群自养型好氧微生物完成的，它包含两个步骤【3 】。第一步是 由亚硝酸菌( n t r o s o m o n a s ) 将氨氮转化为亚硝酸盐。这类细菌为专性好氧菌，革 兰阴性，绝大多数为化能无机营养。亚硝酸菌将氨氧化为亚硝酸，从中扶取能量 供合成细胞和同定c 0 2 。第二步则由硝酸菌( n i t r o b a c t e r ) 将亚硝酸盐进一步氧化 为硝酸盐。硝酸菌为专性好氧菌，革兰阴性。 亚硝酸菌和硝酸菌的特性大致相似，但前者的世代期较短，生长率较快，因 此较能适应冲击负荷和不利的环境条件，在硝酸菌受到抑制的时候，有可能出现 第一章绪论 n 0 2 - - n 积累的情况。 亚硝化反应和硝化反应可用下列反应式表示。 2 卜m 4 + + 3 0 2 j 业竺罂竺与2 n 0 2 一+ 2 h 2 0 + 4 h + 2 n 0 2 一+ 0 2 坠马2 n 0 3 一 总反应方程式： n h 4 + + 2 0 2 j 型n 0 3 一+ h 2 0 + 2 h + 1 。2 1 2 反硝化反应原理 ( 1 一1 ) ( 1 - 2 ) ( 1 - 3 ) 反硝化反应是由一群异养型微生物完成的，它的主要作用是将硝酸盐或亚硝 酸盐还原成气态氮或n 2 0 ，反应在无分子态氧的条件下进行。反硝化菌是所有能 以硝酸根为最终电子受体，将硝酸还原为氮气的细菌的总称，在自然界很普遍， 种类很多。反硝化菌多数是兼性的，在溶解氧浓度极低的环境中可利用硝酸盐作 为电子受体，有机物则作为碳源及电子供体提供能量并得到氧化稳定。 在反硝化菌的代谢活动下，硝态氮有两种转化途径【3 1 。一种称为同化反硝化， 最终产物为有机氮化合物，成为细菌细胞的组成部分；另一种则称为异化反硝化， 最终产物为气态氮或者氨。传统上，把异化反硝化生成氮气的反应称为反硝化反 应，而把生成氨的反应称为异化反硝化反应。 公认的反硝化生物化学反应如下： n 0 3 一一n 0 2 一专n o n 2 0 专n 2 ( 1 4 ) 反硝化的生物化学总反应可用下式表示( 以甲醇作为碳源为例) 。 5 c h 3 0 h + 6 n 0 3 一玉型：匕岜3 n 2 + 7 h 2 0 沣5 c 0 2 + 6 0 h ( 1 5 ) 由上列反应式可见，反硝化反应可使有机物得到分解氧化。反硝化过程的结 果是消耗硝酸根和有机物碳源，产生气态氮和碱性物质，使出水p h 值上升。 当环境中缺乏有机物时，微生物还可通过消耗自身的原生质进行所谓的内源 反硝化： c 6 h 7 n 0 2 + 4 n 0 3 一专5 c 0 2 + n h 3 + 2 n 2 + 4 0 h 一 ( 1 6 1 可见，内源反硝化的结果是细胞物质的减少，并会有氨的生成，因此废水处 第一章绪论 理中不希望此种反应占主导地位。 1 2 1 3 硝化一反硝化生物脱氮工艺及其特点 基于硝化一反硝化反应的硝化一反硝化工艺是一项成熟的生物脱氮工艺。其 基本原理是，将废水中的氨氮加氧曝气，经过硝化反应转化成为硝态氮，再由添 加碳源的反硝化反应转化为氮气，从废水中去除。硝化一反硝化法经过一个多世 纪的发展，已经派生出多种生物脱氮工艺，如o 嘲法，a 2 o ( p h o r e d o x ) 法7 ，8 1 ， b a r d e n p h o 氧化沟【9 1 、u c t ( u n i v e r s i t yo fc a p et o w n ) 【10 1 、a a a ( a h e m a t i n g a e r o b i c - a n o x i c ) 1 2 1 等典型的硝化反硝化( 脱磷) 工艺，这些工艺尽管在脱氮处 理方面起到了一定作用，但仍存在以下问题： 将氨氮氧化为硝酸盐氮，曝气量大； 再将硝酸盐氮还原为氮气，有机物不足时需外加碳源； 需投加酸碱中和试剂，处理费用较高； 系统为维持较高生物量以获得良好的脱氮效果，必须同时进行污泥到流 和硝化液回流，增加了动力消耗及运行费用； 主要用于处理低氨氮浓度的市政废水，处理高浓度氨氮废水时效果不佳。 因此对于如消化污泥脱出的富含氨氮的废水，垃圾填埋厂高浓度氨氮渗 滤液等高氨氮有机废水的生物脱氮，硝化一反硝化工艺就难以达到处理 要求。 1 2 2 新型生物脱氮工艺 最近的一些研究表明：生物脱氮过程中出现了一些超出人们传统认识的新现 象，如硝化过程不仅由自养菌完成，异养菌也可以参与硝化作用1 3 1 ：某些微生 物在好氧条件下也可以进行反硝化作用【1 4 】；特别值得一提的是厌氧氨氧化反应 的发现【1 5 】。这些现象的发现为水处理工作者设计处理工艺提供了新的思路。 1 2 2 1 短程生物硝化一反硝化脱氮工艺( s h a r o n 工艺) 从氮的微生物转化过程来看，氨被氧化成硝酸是由两类独立的细菌催化完成 第一章绪论 的两个不同反应，应该可以分开。对于反硝化菌，无论是n 0 2 。还是n 0 3 。均可以 作为最终电子受体，因而整个生物脱氮过程也可以经n h 4 + 一h n 0 2 一n 2 这样的 途径完成。并且，在某些特殊条件下，在一些反应器中发现了亚硝酸盐的积累【l 引。 基于这一原理，荷兰荷兰d e l f i 工业大学开发出新型生物脱氮工艺，称作 s h a r o n ( s i n g l er e a c t o r 内rh i g ha c t i v i t ya m m o n i ar e m o v a io v e rn t r i t e ， s h a r o n ) 工艺【1 6 】。此工艺的基本原理是，在较高温度下，硝酸盐细菌的生 长速率大于硝酸盐细菌的生长速率，可以通过控制温度和水力停留时间，将硝酸 盐细菌洗出，使亚硝酸盐细菌在反应器中占绝对优势，从而使大部分n h 4 + n 氧 化成n 0 2 - - n ，而后进行反硝化脱氮。这一工艺采用好氧一缺氧交替运行的操作 方式，在单个反应器内即可实现短程硝化反硝化脱氮。由于无需生成硝酸盐氮， 因而可以节省能量消耗和电子供体。 与硝化反硝化r t 艺相比，s h a r o n 工艺具有以下优点： 硝化和反硝化在同一各反应器中进行，流程短； 皿硝化过程产生的酸要少于完全硝化的产酸量，可以减少投碱量； 缩短反应时间，相应反应器容积减少，节约投资费用； 节省2 5 的氧和4 0 的碳源。 在实验室研究的基础上，v a nk e m p e n 等人【 1 设计出了实际应用规模的 s h a r o n 反应器。1 9 9 7 年在荷兰乌得勒支污水处理厂和鹿特丹污水处理厂分别 建成并成功运行了两个s h a r o n 反应器，容积分别为4 5 0 0 m 3 和1 5 0 0 m 3 。这两 个反应器的运行，有效地提高了污水厂出水水质。 尽管已经成功运行了两个s h a r o n 反应器，如何有效控制和实现亚硝酸盐 的积累、维持，如何降低该工艺的反应温度( 该工艺须在3 0 4 0 的高温下运 行，不利用大量普通废水的利用) ，还需进一步的研究和探索。 1 2 2 2 同步硝化反硝化现象( s n d ) 根据传统生物脱氮理论，硝化与反硝化反应不能同时发生，硝化反应在好氧 条件下进行，反硝化反应在厌氧条件下进行。然而，近几年有不少试验证明，尤 其是有氧条件下，同时硝化一反硝化现象存在丁各种不同的生物处理系统，如生 物转型18 1 、s b r 【19 1 、氧化沟【2 0 】、c a s t 【2 l 】、m b r 【2 2 1 、s m b r 【2 3 1 等。 第一章绪论 此一现象被称为同步硝化反硝化现象( s i m u l t a n e o u sn i t r i f i c a t i o na n d d e n i t r i f i c a t i o n ，s n d ) 。关于这一现象的机理研究还不明确，一般认为三个主要 机理是：混合形态。由于充氧装置的充氧不均匀和反应器的构造原因，造成生 物反应器形态不均，在反应器内形成缺氧厌氧段。此种情况称为生物的大环境， 即宏观环境。菌胶团或生物膜。缺氧厌氧段可在活性污泥菌胶团或生物膜内 形成，即微观环境。生物化学作用。 在过去几年中，许多新的氮生物化学菌群被鉴定出来，其中包括部分菌种以 组团形式对s n d 起作用，包括起硝化作用的自养硝化菌及起反硝化作用的异养 菌。 同步硝化反硝化技术的产生为今后污水处理降低投资并简化生物脱氮过程 提供了可能性。目前，国外对于s n d 的研究已逐渐开始从实验室走向污水厂实 践阶段，国内学者也越来越多的关注s n d 技术的发展，并且进行了一些实验性 的研究。 1 3 厌氧氨氧化工艺的研究现状及发展 1 3 1 厌氧氨氧化现象的发现 早在1 9 7 7 年，b r o d a 【2 4 1 通过热力学计算( 式1 7 和式1 8 ) ，预言自然界可能 存在两种自养菌。这个预言在9 0 年代得到了实验支持。 3 n 0 3 一+ 5 n h 4 + 专4 n 2 + 9 h 2 0 + 2 h + g = 一2 9 7 l j m o l ( 1 7 ) n 0 2 一+ n h 4 + 一n 2 + 2 h 2 0g = 一3 5 8 l ( j m o l f 1 8 ) 1 9 9 4 年，k u e n e n 等发现某些细菌在硝化反硝化反应中能利用n 0 3 。或n 0 2 。 做电子受体将n h 4 + 氧化成n 2 和气态氮化物。l9 9 5 年，m u l d e r 和v h nd e rg r a 一2 5 】 等用流化床反应器研究生物反硝化时，发现了氨氮的厌氧生物氧化现象，从而证 实了b r o d a 的预言。这些现象引起了科学家们的关注，将这种现象称为厌氧氨氧 化( a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n ，a n a m m o x ) ，指的是在厌氧或缺氧条件下， 厌氧氨氧化微生物直接以n h 4 + 为电子供体，以n 0 3 。或n 0 2 。为电子受体，将n h 4 + 、 n 0 3 。或n 0 2 ，一起转成n 2 的生物氧化过程。 第一章绪论 1 3 2 厌氧氨氧化的反应机理 在厌氧氨氧化现象发现初期，m u i d e r 等口5 1 推测厌氧氨氧化的反应为式1 7 ， 随后，g r a a f 等口6 1 义证明了n 0 2 才是最适合的电子受体，推测反应式为式1 8 。 为了进一步研究厌氧氨氧化的代谢途径，g m f 等2 6 1 做了n 标记实验，提 出了如下图所示的厌氧氨氧化反应模型。根据这个模型，厌氧氨氧化菌首先将 n 0 2 转化为n h 2 0 h ，再以n h 2 0 h 为电子受体将n h 4 + 氧化成n 2 h 4 ，n 2 h 4 再进 一步被氧化成为n 2 。实验中有n 0 3 生成，推测为部分n 0 2 一被氧化成n 0 3 可为厌 氧氨氧化菌固定c 0 2 提供电子。 翁j m 毯 潮2 嬲1 一一研 ， 2 【弼， n ： ：n 啦+ 被n h 2 0 h 氧化成n 2 地； ：n 2 h 4 产生n 2 和还原当量，还原当量被用于还原n 0 2 产生更多的n h 2 0 h ； ：n 0 2 被氧化成n 0 3 ，产生还原当量用于细胞生长。 图卜l 厌氧氨氧化化学反应模型j 2 6 l f i g u 代1 - lc h e m i c a i 代a c t i o nm o d e lo f a n a m m o x 1 3 3 厌氧氨氧化细菌的富集及分离鉴定 g r a a f 等人证实了厌氧氨氧化反应是生物反应后，进行了大量实验来摸索厌 氧氨氧化富集培养条件，最终确定了厌氧氨氧化富集培养基的基本成分【2 6 1 。但 由于厌氧氨氧化细菌是一种生长缓慢的自养菌，厌氧氨氧化反应器的启动时间非 常长，通常达l o o 2 0 0 天。如何选取合适的污泥和适合的反应器，是厌氧氨氧 ， j j ， 阻 。 - ，- f l 善髓 第一章绪论 化反应器启动的关键。 最初人们认为厌氧氨氧化菌分布范围较窄，但越来越多的研究表明厌氧氨氧 化现象可能在自然界中广泛存在。 t h a m d 九l p 等人【2 7 1 的研究表明，海洋底泥中 存在较高的厌氧氨氧化现象。 k u y p e r s 等人例在2 0 0 3 年利用分子生物学技术从黑海中分离出能够进行厌 氧氨氧化反应的细菌，1 6 s r r n a 基冈测序结果表明其属于浮游霉菌目。这是首 次在自然界发现的厌氧氨氧化细菌。进一步的研究表明，通过厌氧氨氧化反应产 生的n 2 能占到整个海洋中n 2 产量的3 0 5 0 【2 9 1 。 在土壤地下水体的水处理系统中，也存在厌氧氨氧化现象【3 0 】。 人们据此采用了各种污泥启动厌氧氨氧化反应器，有硝化污泥启动的反应器 【3 l r 3 2 1 ，有反硝化污泥启动的反应器【3 3 】，河底污泥启动的反应器f 3 4 】。大量研究表 明，采用硝化污泥可成功启动厌氧氨氧化反应器且活性较高f 3 2 3 5 _ 6 】。 为了更好的持留和扩增菌种，启动反应器的形态选择也很重要。目前采用较 多的反应器有流化床反应器【2 6 1 ，t o h 等人采用的固定床反应器【3 7 】，s t r o u s 等人采 用的s b r 反应器【3 引，s l i e k e r s 等人采用的气提式反应器【3 9 1 等。 目前为止，用实验室的传统分离方法，如系列稀释，平板划线等，都未能得 到能验证活性的纯种厌氧氨氧化细菌。 s t r o u sm 【4 0 1 等人开发出密度梯度离心分离技术来纯化厌氧氨氧化细菌。采用 这种技术获得的厌氧氨氧化细胞悬浮液可达到很高的纯度，每2 0 0 8 0 0 个细胞 中只含有一个污染细胞。 至目前为止，研究者们借助p c r 、f i s h 、d g g e 等技术已发现并命名七种 厌氧氨氧化菌。其在系统发育树中的相关关系如下图所示： t 再电挚珏菌分趴为；c g n d i d n t 聪s b o c a d i nn n o m m o x d 口n s ，p o j ，c 口n d i d n t u s k m e n e n i d s t u t t g n 心i e n s i s 1 2 8 】 c a i n d i d n t s ，s c n f l n d h ns o m 醢n i ，f 4 2 j c n n d d d t s s c m i n c k nb r o d f 4 2 j ，c n n d d o t “s 毫c a l i n c l ”口 w n g n e r i ，f 4 2 j c n n d i d 口t l l s a n a m m o x o g l o b h sp r o p o n i c m s f 4 3 ja n dc a n d d n t m s b r o c a d i n 加l g i d c i f 4 | j 第一章绪论 图卜2 目前所确定的厌氧氨氧化细菌的系统发育树1 4 i j f i g 1 2p h y l o g e n t i ct r e eo fa n a 咖o xb e c t e r i a 由图可知，各a n a m m o x 菌之间系统发育差别相当大。如【4 4 1 ，在1 6 sr r n a 7 k 平上， c n n d i d a t u sb r o c 以i nn n n m m d x i d a n s 积 c 绷d i d n t h sk t l e n e n n s t u t t g d 以i e n s i s 之间序歹 l 相似性为9 q ，丽c 佣d i 幽t t l s s c q | i n d 欹n 啪髓er i i 和 c a n d i d a t u s b m c n d i nn h q m m o x i d n n s ，c n n d i d n t l l s k l l e n e n i ds t h t t g 口r t i e n s i s 三0 日 系列相似性分别为8 7 6 、8 7 9 。 1 3 4 厌氧氨氧化菌的形态特征和生理特点 典型的厌氧氨氧化菌( 劬玎诫妇f z f j 留加c 以加。玎a m m 似眺栅) 。在浓度为 2 0 m m 、p h 为7 4 的磷酸二氢钾磷酸氢二钾的缓冲溶液中以戊二醛同定时，细 胞壁有火f i f 口状结构，以芽殖方式繁殖，属于革兰氏阴性菌，具有一个非常特殊 的细胞器，被称作厌氧氧化体( a n a m m o x o s o m e ) ，其体积占总体积的3 0 6 0 【4 5 t 4 6 1 。厌氧氨氧化体外具有双层膜，构成这种膜的脂类成分比较特殊，称为厌氧氨 氧化体脂，内含阶梯烷( 1 a d d e r a n e ) ，由多个环丁烷环互相结合而成，状似阶梯， 由阶梯烷形成的膜对物质扩散具有良好的屏蔽作用。细胞内存在羟氨氰化还原酶 ( h y d r o x y l a m i n eo x i d o r e d u c t a s e ，h a o ) ，主要集中于厌氧氨氧化体中。而细菌的 类核和核糖体则存在于细胞质中。 s t r o u sm 等用s b r 工艺对厌氧氨氧化菌进行定量研究，确定的厌氧氨氧化 菌生理学参数如下： 第一章绪论 表1 1 厌氧氨氧化细菌的重要生理学参数l 冽 f i g l li m p o r t a n tp h y s i 0 i o g j c a lp a r a m e t e r sf o ra n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n 参数arulammox结果 最火比厌氧氨转化速率 生物体产率 活化能 对氨的亲和力 对亚硝酸盐的亲和力 亚硝酸盐对氨转化的抑止 亚硝酸盐对自身转化的抑止 温度范围 p h 值范围 生物体蛋白含量 蛋白密度 1 1 ( g d ) o 0 7 眈，蛋白像氮 7 0k j m o l 1 0 。4 l 1 0 4 l k j = o 8 ，a = 0 8 k j = 1 ，旺= o 7 2 0 4 3 6 7 8 3 0 6 g ，蛋白生物体干重 5 0 班，蛋白生物体 1 3 5 厌氧氨氧化工艺的发展现状 a n a m m o x 工艺己经在废水生物脱氮领域得到广泛研究。目前，主要有荷 兰d e l r ，下业大学和生物技术实验室提出的s h a r o i n a n a m m o x 工艺，比利时 g e n t 微生物生态实验室开发的o l a n d ( o x y g e nl i m i t e da u t o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o n d e n i t r i f i c a t i o n ) r t 艺和s t r o u s 等人提出的c a n o n 工艺( c o m p i e t e l ya u t o t r o p h i c a m m o n i u mr e m o v a lo v e rn t r t e ) 。这些工艺在工程应用中还很少见，目前主要处 于探索阶段。 1 3 5 1s h a r o n a n a m m o x 工艺 a n a m m o x 工艺以氨为电子供体，硝酸盐为电子受体，而待处理废( 污 水) 中的氮常以氨氮形式存在，因此使用该i t 艺必须先解决亚硝酸盐的来源问题。 而s h a r o n 丁艺是一种比较理想的亚硝酸盐生成装置。 s h a r o n a n a m m o x 工艺分别在两个反应器中实现部分硝化和厌氧氨氧 第一章绪论 化，能优化两类细菌的生存环境，运行性能稳定。s h a r o n 和a n a m m o x 联 合脱氮时，只需约5 0 的n h 4 + - n 转化成n 0 2 n 。剩余5 0 的n h 4 + n 和n 0 2 n 作用直接转化为氮气。与传统的硝化一反硝化过程相比，s h a r o n a n a m m o x 过程可使运行费用减少9 0 ，c 0 2 排放量减少8 8 ，不产生n 2 0 有害气体，无 需有机物，不产生剩余污泥，节省占地，具有显著的可持续性与经济效益。 n h 4 + 。 o 5 n h 4 + 0 0 5 n 0 3 ( = 2 m l 。硝化细菌的培养分为三 个阶段，第一阶段进水n h 4 + - n 浓度为2 8 m l ，流量为2 6 7 m 胁，水力停留时间 为5 d ，负荷18 m d ；第二阶段进水n h 4 + 一n 浓度为7 0 m l ，流量为2 6 7 m 讹， 水力停留时间为5 d ，负荷4 5 m g d ：第三阶段进水n h 4 + - n 浓度为7 0 m g l ，水力 停留时间为2 5 d ，流速5 3 m 讹，负荷9 0 m d 。后因污泥流失严重，进水浓度改 为2 0 0 m l ，水力停留时间延长为6 d ，反应器负荷不变。第一阶段培养1 5 d ，第 二阶段培养2 0 d ，第三阶段培养2 0 d 。在每一阶段结束时进行活性测定实验。 2 3 4 实验结果分析 好氧段污泥经过三个阶段的硝化培养，在每个阶段结束时进行了s s 、v s s 及硝化活性的测定。实验中三个阶段的活性实验结果及s s 、v s s 的变化见图2 2 和表2 4 。 从图2 2 及表2 4 可以看到，随着培养时间的增加，s s 和v s s 均呈现下降 趋势，但v s s s s 的比值则呈上升趋势，说明反应器内硝化微生物得到富集，单 位体积微生物的硝化活性提高。经过三个阶段的硝化培养，污泥的硝化活性从 1 8 9 m g g - 1 d l ( n h 4 + 一n ，以v s s 计) 提高到1 7 3 6 m g g - 1 d l ( n h 4 + - n ，以v s s 计) 。 第二章厌氧氨氧化细菌的富集培养和鉴定 1 6 0 1 4 0 02468l o1 21 4 时间( d ) 图2 2 三个阶段硝化活性比较图 f g2 - 2a c t i v i t yo fn i t r i 6 c a t i o nc u n u r 器i nd i f f e n n tc u n u 他p e o d s 表2 - 4 硝化培养的不同阶段的t s s 和v s s 1 a b i e2 4t s sa n dv s so fn j t r i n c a t i o nc u l t u 化sj nd i f f b 他n tc u n u 他p e r i o d s t s s ( l ) v s s ( l ) v s s t s s 反应器接种时 第一阶段活性实验 第二阶段活性实验 1 1 1 2 o 7 5 3 0 5 3 2 o 5 3 5 0 ，3 9 2 0 2 9 8 o 4 8 l o 5 2 0 o 5 6 l 第三阶段活性实验 0 3 9 5 o 17 00 5 7 3 2 4 厌氧氨氧化细菌的富集培养 2 4 1 实验装置、废水配制及实验方法 初步驯化完成后，将反应器转为厌氧氨氧化污泥富集培养。反应器停止曝气， 项部用硅胶塞密封，实验用废水由人工配成，其组成成分见表2 - 5 ，分析方法见 表2 3 。 厌氧氨氧化活性的测定采用标准微生物血清瓶方法【7 5 6 1 进行。首先用排水 - 2 7 加 舳 印 钟 加 。 一j暑邑瑙蒜n-z 第二章厌氧氨氧化细菌的富集培养和鉴定 法在1 0 0 m l 血清瓶中充满氩气，瓶口用丁基橡胶塞塞住并加铝盖用封口钳密封待 用。用医用注射器从完全混合连续流反应器中取出4 0 m l 微生物混合液，在厌氧 条件下经过4 0 0 0 r p m 、1o m i n 的离心后移去上清液，然后再加入4 0 m l 的培养液 使微生物处于悬浮状态。悬浮后的4 0 m l 混合液再用医用注射器注入前述经过氩 气置换的血清瓶内，之后置入恒温摇床中在3 5 及15 0 r p m m i n 的条件下进行实 验。在活性实验中该培养液中起始n h 4 + n 和n 0 2 。- n 的浓度均为7 0 m 1 ，p h 为 8 。血清瓶外层同样包裹黑布以达到避光的目的，根据反应进行的程度定期取样 进行测定。 表2 5 厌氧氨氧化模拟废水的化学组成 t h b l e2 - 5c o m p o s i t i o no fs y n l h e t i cw a s t e w a t e rf o ra n a m m o x 成分c o m p o n e n t浓度c o n c e n 打a t i o n ( l ) k h c 0 3 m g s 0 4 7 h 2 0 k h 2 p 0 4 c a c l 2 n a n 0 2 ( n h 4 ) 2 s 0 4 o 5 o 3 4 o 0 2 7 o 1 3 6 a d d e da sn e e d a d d e da sn e e d 注：每l l 模拟废水中各加入微量元素i 和微量元素i ll m l 。 2 4 2 厌氧氨氧化反应器的启动及稳定运行 取自污水处理厂好氧段的活性污泥经过一个多月的硝化培养，氨氮去除率达 9 9 。硝化活性从最初的1 8 9 m g g 1 d l ( n