（环境工程专业论文）厌氧氨氧化微生物的有机代谢机理及其固定化效应研究.pdf

中山大学博士学位论文 厌氧氨氧化微生物的有机代谢机理及其 固定化效应研究 专业：环境工程 博士生：刘金苓 指导教师：贾晓珊教授 摘要 厌氧氨氧化工艺是目前最简捷和最经济的生物脱氮途径，具有广泛的应用前 景。目前，厌氧氨氧化工艺的应用存在着废水中有机物的干扰和厌氧氨氧化微生 物浓度低的问题，为此在总结前人研究的基础上，本文以长期连续培养的厌氧氨 氧化微生物为对象，研究了特定有机碳源条件下的代谢特性及机理，并探讨了固 定化技术促进其氨氧化活性的效应，结果表明： 1 小分子有机物对厌氧氨氧化影响的研究表明，低浓度( 1m m o l l 1 ) 葡萄糖则抑制了厌氧氨 氧化活性；甲醇在浓度为0 5m m o l l 。1 时完全抑制了厌氧氨氧化反应，乙醇、甲 醛和乙醛在浓度为0 2 5m m o l l - 1 时完全抑制了厌氧氨氧化反应；甲酸和a 酮戊二 酸在低浓度时对厌氧氨氧化反应没有明显影响，高浓度则抑制厌氧氨氧化活性； 乙酸、丙酸、丙酮酸、乳酸、丁酸、丁二酸、苹果酸和柠檬酸在低浓度条件下同 样也能促进厌氧氨氧化反应，在高浓度条件下抑制厌氧氨氧化活性。 2 通过对氨氮、亚硝酸盐氮、硫酸盐和硫化物的测定，以及添加青霉素和 和添加钼酸盐对厌氧氨氧化微生物的影响等一系列实验的验证，揭示了厌氧氨氧 化微生物在有机条件下的反硝化和硫酸盐还原特性，并结合g i b b s 自由能量分 析，阐述了厌氧氨氧化微生物进行氨氧化、反硝化和硫酸盐还原的代谢机理，首 次明确了：低浓度( lm m o l l - 1 ) 葡萄糖条件下，反硝 化代谢为主要反应。硫酸盐还原代谢发生在厌氧氨氧化和反硝化代谢之后。 厌氧氨氧化微生物的有机代谢机理及其固定化效应研究 3 通过s e m 电镜扫描发现厌氧氨氧化微生物群落包括三种形态的微生物： 椭球状菌、杆状菌和丝状菌，4 m m o l l 1 葡萄糖处理1 5d 后群落与无机条件下的 微生物群落相比在数量和结构上没有显著变化。p c r d g g e 和分子克隆测序等 分子生物学技术分析葡萄糖条件下的厌氧氨氧化群落变化可知，0 5 和1m m o l l 。1 葡萄糖处理1 5d 后的s h a n n o n 多样性指数分别为2 8 3 和2 7 0 ，与对照相比 ( 2 8 3 ) 没有发生显著改变，葡萄糖处理对厌氧氨氧化微生物群落多样性没有显 著影响。各处理1 6 sr d n ad g g e 指纹图谱聚类表明，d n a 指纹在相似性8 0 时分为2 类，o 5m m o l l - 1 和1m m o l l 一葡萄糖处理聚为一类，d n a 指纹在相 似性为6 0 时，0 5m m o l l 1 、1m m o | l 1 葡萄糖处理和无机条件处理聚为一类， 说明葡萄糖处理和无机条件下的群落没有明显差异。综上所述，厌氧氨氧化微生 物群落中数量和微生物种类结构稳定，葡萄糖并未对其造成显著影响。 4 各材料固定化脱氮效应的比较表明以p v a 、s a 等材料的包埋吸附仅仅能 维持较高厌氧氨氧化活性，以活性炭、陶瓷生化环、生化棉等材料的表面吸附固 定化方式能较好的提高厌氧氨氧化活性，因此表面吸附固定化方式优于包埋固定 化方式；通过血清瓶实验和反应器的中长期监测，结果表明活性炭固定化能够最 有效地提高厌氧氨氧化脱氮效率，从而找到了一条提高厌氧氨氧化活性的有效途 径。 关键词：厌氧氨氧化；反硝化；硫酸盐还原；p c r d g g e ；固定化 i i 中山大学博士学位论文 t h es t u d yo nm e t a b o l i s mo fa n a m m o xb a c t e r i u m - u n d e ro r g a n i cs u b s t r a t ea n di t si m m o b i l i z a t i o ne f f e c t m a j o r ：e n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g n a m e ：j i n l i n gl i u s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r x i a o s h a nj i a a b s t r a c t a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n ( a n a m m o x ) i st h em o s te c o n o m i ca n dt h e s h o r t e s tb i o l o g i c a ln i t r o g e nr e m o v a lp a t h w a yc u r r e n t l y , w h i c hh a sa ne n o r m o u s p o t e n t i a li nf i e l do fn i t r o g e nr e m o v a l h o w e v e r , a p p l i c a t i o no fa n a m m o x i nf i l e d o fn i t r o g e nr e m o v a lf r o mw a s t ew a t e re n c o u n t e r e dt h ep r o b l e m so fd i s t u r b a n c ef r o m o r g a n i cm a t t e ra n di t s l o wb i o m a s si nb i o r e a c t o r , w h i c hr e s t r i c t e di t sf u r t h e r a p p l i c a t i o n b a s e do nt h ep r e v i o u sr e s e a r c h ，t h ec h a r a c t e r i s t i c s o fa n a m m o x b a c t e r i u mw h i c hw a sc u l t i v a t e di nac s t rf o rs e v e r a ly e a r sw e r es t u d i e di nas e r i e s o fs e r u me x p e r i m e n t su n d e ro r g a n i cc o n d i t i o n s ，a n dt h e nb a c t e r i ac e l li m m o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yw a su t i l i z e di no r d e rt oi m p r o v et h e i rb i o m a s sa n dn i t r o g e nr e m o v a lr a t i o r e s u l t ss h o w e dt h a tb e l o w 1 t h ee f f e c t so fs i m p l eo r g a n i cm a t t e ro na n a m m o xa c t i v i t yw e r es t u d i e da n d r e s u l t sw e r et h e r eb e l o w w h e ng l u c o s ew a sl o w e rt h a n0 5m m o l l - ，t h er e m o v a l r a t i oo fn 吖- na n dn 0 2 nw a sh i g h e rt h a nc o n t r 0 1 w h e ng l u c o s ec o n c e n t r a t i o n w a s h i g h e rt h a n1m m o l 。l ，a n a m m o xa c t i v i t yw a si n h i b i t e do b v i o u s l y m e t h a n o l ， a l c o h o l ，f o r m a l d e h y d ea n da c e t a l d e h y d ei n h i b i t e da n a m m o xa c t i v i t yc o m p l e t e l y w h e nt h ec o n c e n t r a t i o nw a sa sl e s sa s0 2 5m m o l l 一f o r m a t ea n da - k e t o g l u t a r i ca c i d h a dn oe f f e c to na n a m m o x a c t i v i t yi nl o wc o n c e n t r a t i o n ，b u tt h e yi n h i b i t e di ti n h i g h e rc o n c e n t r a t i o n a c e t a t e ，p r o p i o n a t e ，p y r u v i ca c i d ，l a c t i ca c i d ，b u t y r i ca c i d ， s u c c i n i ca c i d ，m a l a t e o na n dc i t r a t ea l s oi m p r o v e da n a m m o xa c t i v i t yi nl o w i i i 厌氧氨氧化微生物的有机代谢机理及其固定化效应研究 c o n c e n t r a t i o na n di n h i b i t e di ti nh i g h e rc o n c e n t r a t i o n 2 m e t a b o l i s mo fd e n i t r i f i c a t i o na n ds u l f a t er e d u c t i o nu n d e ro r g a n i cm a t t e r c o n d i t i o n sw a sd i s c o v e r e db yd e t e r m i n a t i o no nt h ec h a n g eo fa m m o n i u m ，n i t r i t e ， s u l f a t ea n ds u l f i d ec o n c e n t r a t i o n ，a n dw a ss u p p o r t e db yas e r i e so f e x p e r i m e n t sa d d e d w i t hp e n i c i l l i u ma n dm 0 0 4 。w i t ht h eg i b b sf r e ee n e r g ya n a l y s i s ，m e c h a n i s mo f a n a m m o x ，d e n i t r i f i c a t i o na n ds u l f a t er e d u c t i o nh a p p e n e di nt h i sp r o c e s sw a s c o n f i r m e df o rt h ef i r s tt i m et h a t1 ) u n d e rl o wc o n c e n t r a t i o ng l u c o s e ( 1m m o l l 。) ， d e n i t r i f i c a t i o nh a p p e n e dq u i c k l y , a n ds u l f a t er e d u c t i o nh a p p e n e da f t e ra n a m m o x a n dd e n i t r i f i c a t i o n 3 s e ms c a no fa n a m m o x p o p u l a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r et h r e ek i n d so f b a c t e r i u mi n c l u d i n gs p h e r i c a lb a l lb a c t e r i a ，s h o r t r o ds h a p e db a c t e r i aa n df i l a m e n t o u s b a c t e r i a ，a n dt h ec o m p o s i t i o no ft h ep o p u l a t i o nd i dn o tc h a n g ea f t e ri n o c u l a t e di n4 m m o l 。l g l u c o s ef o r15d a y s w h i l ea n a m m o x p o p u l a t i o nc h a n g eu n d e rg l u c o s e c o n d i t i o n sw a sa n a l y z e db yp c r - d g g e t e c h n o l o g y r e s u l t ss h o w e dt h a tt h es h a n n o n i n d e xo ft r e a t m e n t so f0 5m m o l l - 1a n d1m m o l l 。1g l u c o s ew i t h2 8 3a n d2 7 0 r e s p e c t i v e l yh a dn os i g n i f i c a n t l yc h a n g ec o m p a r e dw i t hc o n t r o l ( 1 0 m g l 1 或n 0 3 。n 5 0 m g l 。1 的水，使人体正常的血红蛋白氧化成高 铁血红蛋白，从而使得血红蛋白失去在体内输送氧气的能力，出现缺氧的症状， 长期饮用含亚硝酸盐的水体可引致癌症。 1 2 生物脱氮 随着环境污染的日益严重，富营养化的问题突出，世界各国也制定了严格的 水体氮排放标准，1 9 7 4 年意大利规定排入城市污水管网的氨氮为5 6m g l o 以下 【2 】；8 0 年代英国的氮排放标准为低于1 0m g l ；1 9 8 3 年美国e p a 在其颁布的工 业废水污染物最大允许排放浓度中规定，氨氮不得超过10m g l 2 1 ；19 9 8 年荷 兰也将含氮化合物的出水标准从2 0m g l - i 降- 至- 1 0m g l 。【4 1 。我国也不断严格 限制氨氮的排放，1 9 9 8 年制定的污水综合排放标准中氨氮的最高容许排放标 准：一级排放标准为1 5m g l 一，二级排放标准为2 5m g l 一1 【5 1 。 针对水中的氨氮污染，目前常用的控制技术可分为物化处理技术和生物处 理技术。物化处理技术主要包括：空气吹脱法、折点氯化法、选择性离子交换法、 化学沉淀法等【3 1 。采用物化技术脱氮，具有快速高效的优点，但物化法常需要消 2 中山大学博士学位论文 耗化学药品，费用昂贵，而且易产生二次污染。而生物脱氮作为一种经济、节能、 二次污染小的脱氮方法一直被公认为是一种经济、有效和最有发展前途的方法之 一。 截至目前，根据脱氮微生物特性己开发了多种脱氮工艺技术，其中以硝化 反硝化工艺历史最为悠久，但这类工艺流程长、投资大。此外，高氨氮有机废水 如污泥浓缩液消化液、垃圾填埋场渗滤液、焦化废水等一直是废水生化处理的 理论与技术难题。对生活污水的处理，目前正在广泛应用二级生化处理技术如氧 化沟、s b r 、u a s b 、a o 、a 2 o 等，但这些工艺对氨氮的去除均建立在硝化一 反硝化原理基础之上，且含较高浓度氨氮的污泥消化液大都直接回流至进水，大 大增加了处理负荷和运行成本，同时还时有出水氨氮超标的危险。因此，更经济 有效的生物脱氮技术的研究与开发仍是国内外废( 污) 水处理研究领域的重要技 术和科学问题。 近十几年来，人们在工程实践的基础上观察到一些新的氮转化现象并以此 为基础开展了深入的研究，结果发现自然界中存在着多种新的氮转化途径，如异 养硝化( h e t 啪仃d p h i cn i t r i f i c a t i o n ) 6 - 9 1 、好氧反硝化( a 咖b i cd e n i t r i f i c a t i o n ) 1 m 1 2 1 、及 厌氧氨氧化( a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n ) 1 3 】等，在生物脱氮理论取得重大突破 的同时，废水生物脱氮技术也取得了快速发展，涌现了一批具有创新性的生物脱 氮工艺，如同时硝化一反硝化s n d ( s i m u l t a n e o u sn i t r i f i c a t i o na n dd e n i t r i f i c a t i o n ) 、 限氧自养硝化反硝化o l a n d ( o x y g e nl i m i t e da u t o t r o p h i c n i t r i f i c a t i o n d e n i t r i f i c a t i o n ) 、基于亚硝酸盐的全程自养型脱氮c a n o n ( c o m p l e t e l ya u t o t r o p h i c n i t r o g e nr e m o v a lo v e rn i t r i t e ) 、短程硝化生物脱氮s h a r o n ( s i n g l er e a c t o rf o r h i g ha c t i v i t ya m m o n i ar e m o v a lo v e rn i t r i t e ) 、厌氧氨氧化a n a m m o x ( a n a e r o b i c a m m o n i u mo x i d a t i o n ) 等工艺，这些新工艺在某种程度上弥补了传统硝化一反硝 化工艺的缺陷，为开发新型高效生物脱氮技术提供了新的思路和理论基础。 在上述这些新的研究方向中，厌氧氨氧化技术因具有工艺简单、节省能耗 及无二次污染等优点，是目前已知最简捷和最经济的生物脱氮途径【1 4 16 1 ，显示出 良好的应用自i 景。 1 3 硝化反硝化生物脱氮原理与工艺 硝化反硝化生物脱氮由两个阶段完成。第一阶段为硝化阶段，在好氧条件 厌氧氨氧化微生物的有机代谢机理及其固定化效应研究 下微生物将氨转化为硝酸盐；第二阶段为反硝化阶段，在厌氧条件下，异养型细 菌将硝酸盐转化为氮气，在该反应过程中硝酸盐作为电子受体，并以有机碳作为 碳源和能源。 1 3 1 硝化作用原理 化能无机自养菌将n h 4 + 氧化成n 0 2 。，再氧化成n 0 3 - 的生物过程，称为硝化 作用( n i t r i f i c a t i o n ) ，通常由自养菌或异养菌完成【1 7 1 。早在1 8 7 7 年，施兴来等【1 8 】 就通过实验证明了这一生物学过程的存在。1 8 9 0 年维诺格拉斯基利用含氨氮的 无机硅胶培养基首次对硝化细菌进行了研究，证明了硝化过程包括两个连续而又 独立的阶段，参与这两个过程的微生物同属于硝化杆菌亚群【1 8 】。其中，由自养菌 引发的硝化作用，称为自养型硝化作用；由异养菌引发的硝化作用，称为异养型 硝化作用。与自养型硝化作用相比较，异养型硝化作用较弱，在废( 污) 水生物 处理中作用不大，可以略去不计。 自养型硝化作用可分为两个阶段，首先在好氧氨氧化菌的作用下，使氨氮 转化为亚硝酸盐氮( 式1 1 ) ；继之，亚硝酸盐氮在亚硝酸盐氧化菌的作用下，进一 步氧化为硝酸盐氮( 式1 2 ) 。自养型硝化作用的总反应表示为式1 3 t 1 9 1 。 2 n h 4 + + 3 0 ，? 2 n o ，+ 2 h ，o + 4 h 十 ( 1 1 ) 2 n 0 2 + 0 2 7 2 n 0 3 ( 1 - 2 ) 总反应方程式( 不考虑硝化菌的生长) n h 4 + + 2 0 2 7n 0 3 + h 2 0 + 2 h + ( 1 - 3 ) 若用c 5 h 7 n 0 2 表示硝化细胞的化学组成，则反应方程式如下： n h 4 + + 1 8 3 0 2 + 1 9 8 h c 0 3 。? o 0 2c s h 7 n 0 2 + 1 0 4 h 2 0 + 0 9 8 n 0 3 + 1 8 8 h 2 c 0 3 ( 1 4 ) 从生物化学的角度看，硝化过程并非仅仅是氨氧化细菌将氨氮氧化成亚硝 酸、亚硝酸氧化细菌将亚硝酸进一步氧化成硝酸的过程，它涉及多种酶和多种中 问产物，并伴随着复杂电子( 能量) 传递，可表示为： 氨单加氧酶羟胺氧化酶羟胺氧化酶 n 臣_ n 乩o i - i _ + q 的) _ n 0 2 。 其生化反应可表示为： 4 中山大学博士学位论文 氨转化为羟胺：b + q + 驵卜一n i 玉0 i - i + h a o ( 1 - 5 ) 羟胺氧化为亚硝酸：e + n 飓o h 叫e n o + + 3 缸+ + 4 e e n o + + 1 - 1 2 0 一e + n i o f + 刁i + n 地o h + 1 ：5 0 _ n c h 一+ 3 h + + 4 e - ( 1 - 6 ) n h 3 是好氧氨氧化菌的真j 下基质。n h 3 首先在氨单加氧酶( a m o ) 的作用下， 利用氧气将n h 3 氧化成羟氨( n h 2 0 h ) ，这一步是好氧氨氧化的限速步骤【2 0 】；随 后在羟氨氧化还原酶( h a o ) 的作用下，利用水中提供的氧将n h 2 0 h 进一步氧 化成n 0 2 【2 1 】。催化n h 3 转化为n h 2 0 h 的a m o 为膜内酶( 即镶嵌于细胞膜内的酶) ， 而h a o 贝j 位于细胞膜外周质中【2 2 】，除了催化n h 2 0 h 氧化为n 0 2 以外，还能催化 联氨( n 2 出) 氧化【2 3 】。催化亚硝酸盐转化为硝酸盐的酶称为亚硝酸氧化还原酶 ( n o r ) 。n o r 既可催化亚硝酸盐氧化成硝酸盐，也可催化硝酸盐还原成亚硝酸 盐，并由此得名。在n o r 的作用下，n 0 2 结合来自水中的氧形成n 0 3 。 2 4 】。 在亚硝酸氧化为硝酸的过程中，诸多实验表明未检出任何中间产物，因此一 般认为它是一步完成的，结合进硝酸的氧来自水，即： 圣的f + 凰0_ n o f + 签f + 2 e 一 ( 1 - 7 ) 催化氨转化为羟氨的是氨单加氧酶，氨单加氧酶a m o 是膜内酶，关于其结 构、催化活性和作用机理的资料，都是通过间接实验获得的。h y m a n 2 5 】等研究发 现a m o 含铜，对硫脉等金属鳌合剂敏感。他们还发现用1 4 c = 1 4 c 培养n i t r o s o m o n a s p “仰口p 口可使1 4 c 共价结合至一个分子量为2 8 l ( d 的膜内多肽上。这个被标的多肽 可能是a m o 的活性部位，因为它被乙炔共价修饰的程度越高，保留氨氧化活性 越低；反之，当a m o 的氨氧化活性完全丧失时，被1 4 c = 1 4 c 标记的多肽也不再增 多。a m o 能, 催化多种基质。除氨以外，p “仰口叩还可将甲烷氧化成甲醇，乙烯 转化成环氧丙烷，环己烷转化为环己醇，苯转化为苯酚，c o 转化为c 0 2 ，酚转化 为酣2 6 1 。这些基质既可与氨竞争a m o 的活性部位，也可与氨竞争还原剂，因而 对氨的生物氧化有抑制作用。乙炔是一种自杀性基质，可被a m o 转化为不饱和 的环氧化物；这种环氧化物作用于一个或多个与铜结合的氨基酸侧链，可致使 a m o 结构破坏而永久失活。a m o 是由3 个不同亚基组成的三聚体膜结合蛋白【2 7 1 ， 3 个亚基的分子量m r 分别为2 7 x 1 0 3 ( a m o a ) ，3 8 x 1 0 3 ( a m o b ) 和3 1 4 x 1 0 3 ( a m o c ) 。 a m o 只能催化非离子氨( n h 3 ) 氧化，而不能催化离子氨( n h 4 + ) 氧化，而在 环境q b n h 4 + 与n h 3 的动态平衡中，倾向于n h 4 + 的方向，使得n h 3 的浓度很低，这 厌氧氨氧化微生物的有机代谢机理及其同定化效应研究 就是在硝化过程中氨的氧化成为限速步骤的原因。 催化羟氨转化为亚硝酸盐的酶是羟氨氧化还原酶( h a o ) ，h a o 是一种有 相同亚基( m r = 6 4 x 1 0 3 ) 构成的三聚体细胞周质蛋白，它可以氧化羟氨，并释放 出2 对电子，其中一对直接用于n h 3 的氧化过程，另一对用于细胞物质的合成以 及a t p 的产生。 亚硝酸氧化还原酶( n o r ) ，即可催化亚硝酸盐氧化成硝酸盐，也可催化硝 酸盐还原成亚硝酸盐。在n i t r o b a c t e r 菌株中，n o r 是一种诱导酶，只有在以亚硝 酸盐为能源进行的自养生长或以硝酸盐为电子受体进行异氧生长的条件下，n o r 才能合成。n o r 也是由3 个不同亚基组成的三聚体膜结合蛋白复合体【2 8 1 ，3 个亚 基的m r 分别为1 1 6 x 1 0 4 ( n o r a ) ，6 5 x 1 0 4 ( n o r b ) 和3 2 1 0 4 ( n o r x ) ，n o r 复合体还含有铁、钼、硫和铜离子，是一直径为9 5 士3 0 u 的颗粒。 1 3 2 反硝化作用原理 反硝化作用实质上是一个硝酸盐的生物还原过程。硝酸盐还原可区分为同化 性硝酸盐( a s s i m i l a t o r yn i t r a t e r e d u c t i o n ) 和异化性硝酸赫还原( d i s s i m i l a t o r y n i t r a t er e d u c t i o n ) 。在同化性硝酸盐还原中，产物( 氨) 被用于合成细胞物质。异 化性硝酸盐还原有两条途径：( 1 ) 把硝酸盐还原成氨；( 2 ) 把硝酸盐还原成气态 氮化合物( 主要是氮气) 。 在反硝化菌的作用下，n 0 3 - 经n 0 2 、n o 、n 2 0 还原为n 2 的过程称为反硝化 作用。反硝化菌主要为异养菌，也有一部分是自养菌。近年研究表明好氧反硝化 和异养硝化可共存于同一微生物中【2 9 。1 1 ，但将异养硝化和好氧反硝化用于废水处 理的可能性较小，根据r o b e r t s o n 等人 】o 】推算，只有在c o d n 1 0 的情况下，才有 小部分氮通过好氧反硝化作用被去除，废水中的氮大部分被微生物同化。 反硝化过程中所利用的电子供体可以是有机物或还原性无机物质( 如：硫 化氢和氢) ，以有机物为电子供体的反硝化作用可表示为式1 8 和式1 9 t 1 9 , 3 2 】。 n 0 3 + 5 h ? 0 5 n 2 + 2 h 2 0 + o h ( 1 - 8 ) n 0 2 + 3 h ? 0 5 n 2 + h 2 0 + o h ( 1 9 ) 反硝化过程由四种不同的酶催化完成，各种酶的协同作用是确保反硝化过 程顺利进行的重要条件( 图1 1 ) 。 6 中山大学博士学位论文 n 饶胁n o蝻o蚝 图1 - 1 细菌的反硝化过程【3 3 】 f i g1 - 1d e n i t r i f i c a t i o np a t h w a y 因此，一个完整的反硝化脱氮过程，水中硝酸盐氮转化成氮气要经历式1 1 0 所示的步骤：n 0 3 ? n 0 2 - ? n o ? n 2 0 7n 2 ( 1 1 0 ) 硝酸盐还原成亚硝酸盐是反硝化过程的第一步反应，该反应由硝酸盐还原酶 催化。p a y n e 3 4 】系统地回顾了具有反硝化能力的废水中的微生物，指出有些类群 只具有硝酸盐还原酶，故只能将n 0 3 - 还原至n 0 2 。，如无色杆菌属、放线杆菌属、 气单胞菌属、琼脂杆菌属、芽抱杆菌属等；而其他类群由于具有反硝化中的全部 酶系，因此能将n 0 3 还原成n 2 ，如微球菌属、丙酸杆菌属、螺菌属等。 由n 0 2 。? n o 的还原反应由亚硝酸盐还原酶催化。目前已报道的亚硝酸盐还 原酶主要有三种：c y tc d l 型亚硝酸盐还原酶，c u 型亚硝酸盐还原酶和细胞色素c 型亚硝酸盐还原酶。n o 还原为n 2 0 由一氧化氮还原酶催化完成，n 2 0 至n 2 的还原 反应由n 2 0 还原酶催化。 1 3 3 硝化反硝化生物脱氮工艺及其特点 硝化反硝化工艺是一项成熟的废水生物脱氮技术，在生物脱氮理论基础上， 经过一个多世纪的发展，已经派生出多种生物脱氮工艺，如a o 法【3 5 1 、 a 2 o ( p h o r e d o x ) 法【3 6 如、b a r d e n p h o 氧化沟【3 8 】、u c t ( u n i v e r s i t yo f c a p et o w n ) 3 9 1 、 a a a ( a l t e m a t i n ga e r o b i c a n o x i c ) 4 0 4 1 】等典型的硝化反硝化( 脱磷) 工艺，这些工 艺尽管在脱氮处理方面起到了一定作用，但仍存在如下一系列问题： ( 1 ) 将氨氮氧化为硝酸盐氮，曝气量大； ( 2 ) 再将硝酸盐氮还原为氮气，有机物不足时需外加碳源； ( 3 ) 需投加酸碱中和试剂，处理费用较高； ( 4 ) 系统为维持较高生物量以获得良好的脱氮效果，必须同时进行污泥回流 和消化液回流，增加了动力消耗及运行费用； 7 厌氧氨氧化微生物的有机代谢机理及其固定化效应研究 ( 5 ) 主要用于处理低氨氮浓度的市政废水，处理高浓度氨氮废水时效果不佳。 因此对于如消化污泥脱出的富含氨氮的废水和垃圾填埋厂高氨氮渗滤液这 一类高氨氮有机废水的生物脱氮，硝化一反硝化工艺就难以达到处理要求。 1 4 新型生物脱氮技术 1 4 1 同时硝化反硝化 传统的观点认为硝化反应要在好氧条件下进行，反硝化反应则要在厌氧条件 下才能完成，而近十几年来一系列新的发现 4 2 4 5 1 突破了这一传统的认识，使得同 时硝化反硝化成为可能。异养硝化菌、好氧反硝化菌和异养硝化一好氧反硝化菌 的发现以及一些新的研究进展，奠定了同时硝化反硝化生物脱氮的理论基础。 ( 1 ) 异养硝化 异养硝化作用( h e t e r o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o n ) 是指异养微生物在好氧条件下将 氨铵氮或三负价态的有机态氮氧化为羟胺、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的过程。不 同于传统的自养硝化作用，异养硝化作用的底物可以是无机态氮也可以是有机态 氮。目前对异养硝化菌的研究中，真菌被认为是数量最大、效率最高的异养硝化 菌，如青霉菌和香曲霉菌轮枝菌等等。此外，某些放线菌、细菌甚至藻类在自然 界或实验室的纯培养中，也被确定为具有硝化能力的异养微生物。 异养微生物可以利用的基质很丰富，可以是无机氮也可以是有机氮，有关硝 化作用的底物及其代谢途径至今还不是很清楚【4 6 ，4 7 1 。n 1 5 同位素示踪实验【4 8 】发现 异养菌对n h 4 + 没有作用，但是能将有机氮直接氧化为硝酸盐氮而跨过有机氮分 解为氨氮再氧化为亚硝酸盐氮两步；而有些实验室研究表明异养硝化产生的n 0 3 来源于氨氮，可能跨过氨氮氧化为亚硝酸盐这一步。 ( 2 ) 好氧反硝化 在好氧情况下总氮( t n ) 降低的现象，称之为好氧反硝化现象。目前对此 现象的解释有两种：微环境理论。微环境理论主要侧重于从物理学角度加以解 释。由于氧扩散作用的限制，在微生物絮体内产广j e d o ( d i s s o l v e do x y g e n ) 梯度， 从而导致大环境为好氧，絮体内部微环境为厌氧的反硝化。微生物絮体外表面 d o 较高，以好氧异养菌、好氧硝化茵为主；深入絮体内部，氧传递受阻，并且 有机物氧化，硝化作用消耗掉大量氧，絮体内部产生缺氧区，反硝化菌占优势。 正是由于微生物絮体内缺氧微环境的存在，从而导致好氧反硝化的发生；生物 中山大学博二t 学位论文 学理论。由于好氧反硝化菌以及好氧反硝化酶系的存在，使得好氧反硝化有了生 物学的解释。有的好氧反硝化菌同时也是异养硝化菌，因此能直接把氨转化为最 终气态产物逸出。 传统理论认为，细菌的反硝化是一个严格的厌氧过程。反硝化菌优先使用 d o 呼吸，阻止了硝酸盐或亚硝酸盐作为最终电子受体。然而，细菌好氧反硝化 的发现，突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路。最早 提出好氧反硝化( a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n ) 的是r o b e r t s o n 和k u e n e n ，他们在实验室 观察到在氧气存在的条件下发生了反硝化现象4 9 1 。目前，越来越多的研究证明细 菌好氧反硝化的存在，并发现了一些在有氧条件下局有较高反硝化率的细菌： t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h a 、p s e d o m o n a s 删、a l c a l i g e n e s f a 口凰【5 l 】、p s e u d o m o n a s ，z 口“打翻一5 2 - 5 4 1 、t h a u r e am e c h e r n i c h e n s i s 、m i c r o v i r g u l aa e r o d e n i t r i f i c a n s 5 5 1 等。 ( 3 ) 异养硝化好氧反硝化 zp a n t o t r o p h a 的好氧反硝化现象发现较早，其好氧反硝化机制研究得比较 详细，同时zp a n t o t r o p h a 也是异养硝化菌。自从r o b e r t s o n 和k u e l l e l l 5 6 】分离出z p a n t o t r o p h a ) 舌，很多研究者对其异养硝化【5 7 - 5 9 】和好氧反硝化【6 0 - 6 3 1 性能的特殊的酶 系统的进行研究。 zp a n t o t r o p h a 能进行异养硝化，其具有特殊的硝化酶系统，目前已发现 t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h a 具有自养硝化过程中出现的氨单加氧酶和羟胺氧化还原 酶。 由于异养硝化一好氧反硝化菌及其反应理论的形成使得硝化和反硝化可以 同时在一个具有好氧条件的反应器内完成，从而开发出了同步硝化好氧反硝化反 应工艺。 1 4 2 短程硝化反硝化 长期以来，一直认为要实现废水生物脱氮就必须使n h 3 n 经历典型的硝化和 反硝化过程才能被去除，但实际上从氮的微生物转化过程来看，n h 3 被氧化成 n 0 3 是由氨氧化细菌和亚硝酸氧化菌两类独立的细菌催化完成的两个不同反应， 应该可以分开。所谓亚硝酸型生物脱氮就是将硝化过程控制在h n 0 2 阶段而终止， 随后进行反硝化。 实现短程硝化反硝化的关键在于将n i - 1 4 + 氧化控制在n o z 。阶段，阻止n 0 2 。 9 厌氧氨氧化微生物的有机代谢机理及其固定化效应研究 的进一步氧化。虽然氨氧化细菌和亚硝酸氧化菌是两类独立的细菌，但在开发体 系中，这两类细菌普遍存在，并生活在一起，很难分开。亚硝酸型硝化反应的控 制一定程度上取决于对两种硝化细菌的控制，氨氧化细菌和硝酸细菌在生理机制 及动力学特征上存在固有的差异，导致某些影响因素对其存在不同程度的抑制作 用，从而影响硝化形式。由此可以看到，实现亚硝酸型生物脱氮的途径就是控制 那些能对氨氧化菌和亚硝酸菌两种不同的硝化细菌产生不同影响作用的微生物 生命活动影响因素，主要因素有温度、p h 、溶解氧( d o ) 、游离氨( f a ) 5 f f l 污泥泥 龄等。 1 4 3 厌氧氨氧化 早在1 9 7 7 年，b r o d a 删就根据化学反应热力学理论预言自然界存在以硝酸盐 或亚硝酸盐为氧化剂的氨氧化反应。但一直未发现这种化能自养型微生物，被称 为“失踪于自然界中，【6 5 】。m u l d e r 等【1 3 1 1 9 9 5 年在荷兰的g i s t - - b r o c a d e s 公司处理工 业废水的中试流化床中发现，进水中原较高的氨氮在出水中降到一个相当低的浓 度，无法用传统的硝化反硝化理论来解释。由于氨氮的消失与亚硝酸的消失同 时发生，且成一定比例，他们认为在反应器内氨氮与亚硝酸盐发生了反应，产物 为氮气，并将此命名为厌氧氨氧化( a n a e r o b i ca m m o n i ao x i d a t i o n ，a n a m m o x ) 。 现已提出厌氧氨氧化的反应机理，并获得了许多实验证据的支持【1 6 , 6 6 - 6 8 。 1 5 厌氧氨氧化的研究进展 1 5 1 厌氧氨氧化的证明及反应机理 在生物脱氮流化床反应器内发现氨与硝酸盐同时失踪以后，为了印证这个 实验结果，m u l d e r b 1 等人进一步做了分批培养实验。实验证明，氨确实与硝酸盐 同步转化；硝酸盐耗尽时，氨转化也停止，添加硝酸盐后，氨继续转化。伴随着 氨和硝酸盐的转化，累计产气量增加，气体主要成分是n 2 。v a nd eg r a a f 等人【6 9 】 采用1 氐标记实验对厌氧氨氧化的反应产物及代谢途径进行了进一步研究，研究 表明厌氧氨氧化是一个微生物反应，生成的氮气几乎全是1 4 。n 2 形式的氮气， 1 5 j 氐2 形式的氮气仅占1 7 ，生成的氮气中氮的来源与氮标记实验相吻合。并通 过一系列研究证明厌氧氨氧化过程是生物过程，并在随后证明参与厌氧氨氧化反 应的微生物是自养型细菌，富集培养实验进一步证实参与厌氧氨氧化的细菌为格 l o 中山大学博士学位论文 兰氏阴性。 图1 2 厌氧氨氧化反应模型 f i g 1 - 2r e a c t i o nm o d e lo fa n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n v a nd eg r a a f 等人( 1 9 9 7 ) 7 0 1 研究结果表i 韭 n h 2 0 h 最可能是氧化氨的电子 受体，并提出厌氧氨氧化工艺的可能途径( 图1 2 ) ：厌氧氨氧化微生物将n 0 2 转化n h 2 0 h ，再以n h 2 0 h 为电子受体将n h 4 + 氧化形成n 2 h 4 ；n 2 h 4 进一步转化成 n 2 ，并为n 0 2 - 还原成n h 2 0 h 提供电子。试验中有少量n o z 被氧化成n 0 3 ，推测 n 0 2 - 氧化成n 0 3 可能为厌氧氨氧化菌固定c 0 2 提供电子。 在厌氧氨氧化现象发现初期，m u l d e r 等【6 7 】推测厌氧氨氧化的反应为： 5 n h 4 + + 3 n 0 3 。? 4 n 2 + 9 h 2 0 + 2 h + ，g = - - 2 9 7k j t o o l( 1 - 1 1 ) 随后g r a a t 阵t 7 0 1 又证明n 0 2 才是最适合的电子受体，反应式为； n h 4 + + n 0 2 。? n 2 + 2 h 2 0 ，g = - - 3 5 8k j m o l( 1 1 2 ) 其后的研究表明，在厌氧氨氧化过程中存在以下平衡关系：n h 4 + n 消耗量、 n 0 2 - n 的消耗量和n 0 3 - - n 的产生之间的比例为1 ：1 3 2 ：0 2 6 7 0 】，其包括细胞合成在 内的生物反应过程如式( 1 1 3 ) 所示。 n h 4 + + 1 3 2 n 0 2 + 0 0 6 6 h c 0 3 + o 13 h + ? 1 0 2 n 2 + 0 2 6 n 0 3 + 0 0 6 6 c h 2 0 0 5n o 1 5 + 2 0 3 h 2 0 ( 1 - 1 3 ) 1 5 2 厌氧氨氧化菌的分布 最初人们认为厌氧氨氧化菌分布范围较窄，但越来越多的研究表明厌氧氨 氧化现象可能在自然界中广泛存在。 t h a m d r u p 等人f 7 1 】的研究表明，海洋底泥中存在较高的厌氧氨氧化活性，其 在海洋氮素循环中起着不容忽视的作用。在哥斯达黎加的g o l f od u l c e 沿海海湾的 厌氧氨氧化微生物的有机代谢机理及其固定化效应研究 深水缺氧水体中，也明显存在厌氧氨氧化活性，由厌氧氨氧化反应产生的n 2 可占 到总n 2 产量的1 9 3 5 【7 2 1 。k u y p e r s 等) j 7 3 1 利用分子生物学技术首次从黑海中 分离出与进行厌氧氨氧化反应的浮霉细菌相关的1 6 sr r n a 基因序列，表明在该 海域的缺氧水体中存在着厌氧氨氧化菌。据估计，通过厌氧氨氧化反应产生的 n 2 能占到整个海洋中n 2 产且的3 0 - - - - 5 0 t 7 4 1 。另外普通的硝化污泥可成功启动厌 氧氨氧化反应器且活性较高【7 5 _ 7 7 1 。在土壤地下水体的水处理系统中，也存在厌氧 氨氧化现象 7 8 1 。 另外许多研究也表明，在厌氧氨氧化混培物中还存在大量的硝化细菌 7 9 , 8 0 】， 具有较高的氨氧化活性；一些典型的氨氧化茵同样具有厌氧氨氧化能力 8 1 , 8 2 - 8 4 】。 因此，厌氧氨氧化菌能与其他细菌共存于反应器内部或者是污泥体系内，共同构