（环境工程专业论文）四氢嘧啶合成工程菌株构建.pdf

中文摘要 摘要 四氢嘧啶( 1 ，4 ，5 ，6 四氢一2 一甲基- 4 嘧啶羧酸；1 ，4 ，5 ，6 t e t r a h y d r o 2 m e t h y l 4 p 州m i d i n e c a r b o x y l i ca c i d ；e c t o i n e ) 是某些微生物应答环境渗透压胁迫所合成的一 种渗透压补偿溶质。四氢嘧啶能在极端环境下对活细胞等大分子起到稳定和保护 的功能以及其平衡渗透压的特性，使其在环境修复等领域有着广阔的前景和开发 价值，提高四氢嘧啶制备效率的研究具有重要意义。 四氢嘧啶特异性转运蛋白( e c t o i n e s p e c i f i c 胁s p o n e r ；t e 啦b c ) 是在 胁z d 川d 月e 幻，郫纽d s m2 5 8 1 t 中首次发现的。he 肠，l g 口幻d s m2 5 8 l t 基于 t e 以b c 对四氢嘧啶的吸收和膨胀压力敏感通道对四氢嘧啶的释放，调节胞内四氢 嘧啶的合成和积累。敲除t e a a b c 编码基因纪叫b c 的he ，o 删纪d s m2 5 8 l1 突变 株，由于只有四氢嘧啶的输出而没有吸收，从而阻断了四氢嘧啶输出回收循环、 解除了四氢嘧啶吸收对其合成的负反馈调节，使四氢嘧啶的合成量增加，超过了 胞内用于平衡渗透胁迫的四氢嘧啶浓度，即he ，d ，郾幻d s m2 5 8 l1 四氢嘧啶吸收 缺陷突变株超量合成四氢嘧啶。 本文利用步移p c r 方法克隆胁f d ，l d ，l s 口胁d s m5 9 2 8 1f 蒯召c 基因，利用 r e d 重组技术敲除该基因、构建h 跚砌口d s m5 9 2 8 。四氢嘧啶合成工程菌。四氢 嘧啶吸收实验考查该菌株的四氢嘧啶吸收效率。l ol 发酵罐进行四氢嘧啶发酵， 四氢嘧啶总浓度9 1 0 ( 士0 0 8 ) l ，合成效率为9 9 3 ( 土0 0 9 ) l d ，并建立了该菌株 的发酵动力学模型。 关键词：四氢嘧啶；纪叫b c ：r e d 重组；四氢嘧啶吸收缺陷型 英文摘要 a b s t r a c t e c t o i n e ( 1 ，4 ，5 ，6 t e t r a h y d r o - 2 m e t h y l 一4 p y r i m i d i n e c a r b o x y l i ca c i d ) i sac o m p a t i b l e s o l u t es y n t i l c s i z e db ys o m em i c r o o 唱锄i s mt 0r e s p o n s et 0t t i es n s so fe n v i 砌衄l e l l “ o s m o t i cp r e s s u r e e c t o i n ep l a y sas t a b i l i z i n ga n dp r o t e c t i o n 凡n c t i o no nl i v i n gc e l l sa n d o t h e rm a c r o m o l e c u l e s ，a n di th a st h ec h a u r a c t e r i s t i ct 0b a l 觚c eo s m o t i cp r e s s u r ei n e x t r e m ee n v i r o 帆e n t s ，s ot h a tt h e r ea r eb r o a dp r o s p e c t sa n dd e v e l o p m e n tv a l u ei nt h e f i e l do fe i l v i r o n m e n t a lr e m e d i a t i o n ，a n dt h er e s e a r c ho fi m p r 0 v i n ge c t o i n es y n t h e s i s e 伍c i e n c yh 嬲a 舀。e a ts i g n i f i c a n c e e c t o i n e - s p e c i f i ct m s p o r tp r o t e i n ( t e a a b c ) i sd i s c 0 v e 北：di n 肠7 肠朋册田e 如，l g 口纽 d s m2 5 8l1 h 幽，郫幻d s m2 5 8 l r e g u l a t e si n 仃a c e l l u l a re c t o i n es ”m e s i s 加d a c c u m u l a t i o nb a s e dt h ea b s o 叩t i o no fe c t o i n eb yt e a a b c 觚dm er e l e a s eo fe c t o i n eb y t h ee x p a n s i o np r c s s u r e s e n s i t i v ec h a r u l e l hp z d g 口胁d s m2 5 81 1 m u t a n t ，w h i c hi s l ( n o c k o u t e dt e a a b cc o d i n gg e n e 泐爿b c c a i lo n i y0 u t p u te c t o i n ew i t h o u ta b s o 叩t i o n ， b l o c k e dt h eb a l a n c eo fe c t o i n eo u t p u t a b s o r p t i o na n dc 0 m p r o m i s e dt h en e g a t i v e f e e d b a c kr e g u l a t i o no fe c t o i n es y n t h e s i s ，t h es ”t h e s i so fe c t o i n ei n c r e a s e dm o r et h a i l i n t r a c e l l u l a rc o n c 肌t r a t i o no fb c t o i n ef o rb a l a n c i n go s m o t i cp r 豁s u r e i tm e a n st h a tt h e k n o c k o u to ft h eo n l ye c t o i n e 缸锄s p o r t e rt e a a b ci e dt 0am u t 柚to fhp ，6 唧细c 锄 o v e 巾r o d u c i n ge c t o i n e i nm i sp a p w ec l o n e d 胁肠肌d 甩粥s 口矗，l 口d s m5 9 2 8 1 f 缎彳曰cg 饥eb yw a l l ( i n g p c r ，a i l dk n o c k o u t e di tt oc o n s t m c te c t o i n es ”t h e s i se n 舀n e 鲥n gs t r a i no f 且s 口砌口 d s m5 9 2 8 b yr e dr e c o m b i n a t i o nt e c h n o l o g y t h ee c t o i n ea b s o 叩t i o ne x p e r i m e n t s i n v e s t i g a t i n gt h ea b s o 巾t i o ne m c i e n c yo ft h es t r a i n t h et o t a lc o n c e n t r a t i o no fe c t o i n e 锄dp r o d u c t i v i t yi nalolf e 肌e n t o rw e r e9 10 ( 士0 0 8 ) l 粕d9 9 3 ( 士0 0 9 ) l d ，a n d b u i l dt h ef e 舯e n t a t i o nk i n e t i cm o d e lo ft h es t r a i n k e y w o r d s ：e c t o i l l e ；纪m 4 b c r e dr e c o m b i n a t i o n ；e c t o i n ea b s o r p t i o n - d e n c i e n t s t r a i n 四氧嘧啶合成i ：科菌株构建 第l 章绪论 四氢嘧啶( 1 ，4 ，5 ，6 一四氢2 甲基4 嘧啶羧酸；1 ，4 ，5 ，6 t e t r a h y d r 0 2 - m e t h y 卜4 p 妒m i d i n e c a r b o x y l i ca c i d ；e c t o i n e ) 是某些微生物应答环境渗透压胁迫所合成的一 种渗透压补偿溶质。它在环境修复、化妆品、酶蛋白稳定剂工业、医药业及等领 域有着广阔的应用，提高四氢嘧啶制备效率的研究具有重要意义。 1 1 中度嗜盐菌 1 1 1中度嗜盐菌简介 嗜盐菌属于极端环境微生物，根据其最适生长盐浓度的不同，可分为轻度嗜 盐菌、中度嗜盐菌、极端嗜盐菌掣，见表1 1 。其中中度嗜盐菌是最适生长盐浓 度为o 5 2 5m o l l 的细菌【2 1 。它们主要分布于海水、盐湖、盐土、盐碱地及盐渍食 品等含盐环境中【3 1 。中度嗜盐菌在环境修复等领域具有重要的研究价值和广阔的应 用前景1 1 4 】。 表1 1 嗜盐菌的分类嘲 t a b l e1 1 c l a s s i f i c a t i 佣o f h a l o p h i l i cb a c t 甜a 中度嗜盐菌是对一个类群微生物的统称。截止1 9 8 0 年只有6 个中度嗜盐菌的 菌种被细菌名录收录，这些中度嗜盐菌包括肋生弧菌( 所6 砌伽砌z c i ) 【6 1 ， 喜盐微球菌( 慨阳c d c 伽j i l 口，d 6 f 淞) 川，盐脱氮副球菌( p 口r 口c d c c 淞j | l 口肠如玎f 聊c 口船) 【趴，喜海水黄杆菌( f f 口y d 6 口c 胞玎甜棚j | l 口如朋o ：砷f f l 删) ，嗜盐海球菌( ，f 口加c d c c l l s 第l 章绪论 j i l 口卸j | l 甜妇) 1 9 】和嗜盐螺旋体菌( 印讹c 砌p 细j l l 口，d 础妇) 【l o 】。2 0 世纪7 0 年代开始， 对各种地理条件下的高盐环境进行了广泛的研究，从中分离并命名了大量的中度 嗜盐菌，对于这一类群的微生物有了更深刻的了解。然而，人们对中度嗜盐菌仍 然没有统一的认识，因此一些中度嗜箍菌被归入不同的科和属，如一些革兰氏阴 性中度嗜盐菌菌株被分到一些包含非嗜盐菌的属。随着分子生物学研究的进展， 1 6 sr d n a 序列的系统发育等先进技术在中度嗜i ；= 菌分类地位的重新确定中起了重 要的作用。研究表明，中度嗜盐菌分布于细菌域的各主要系统的发育分枝上，包 括好氧化能异养菌、厌氧化能异养菌、光能自养菌、光能异养菌、化能无机营养 细菌等多种营养类型的细菌。为了便于描述，本文从需氧或兼性厌氧以及专性厌 氧角度对部分中度嗜盐菌进行分类( 表1 2 ) 。 表1 2 中度嗜盐菌存在的主要类群 t a b l e1 2m a i ng r o u p so f m o d e f a t c l yh a l o p h i l i cb a c t 硎a 类群好氧性革兰氏阴性菌女r 氧性单兰氏刚性菌厌氧菌 p s e u d o m o n n s f l 玳i o b n c t e n u m 菌株盏黧恕勉p h n l o m o n 口s a c t i n o p o l y s p o r q l e n i i b n c i l l u s p n m l i o b n c i l l t 博 m n r i n o c o c c 啦 s h l i n n c d c c t 堪 h n l o q n n e r o b l n c e a e h n l o n n n e r o b i h m h n l o b n c f e r o i d e s s p o r o h q l 曲n c t e r e c t o t h i o r h d d o s p i r n c e 口e 1 1 2 中度嗜盐菌的耐盐机制 嗜盐菌有两种主要的渗透压胁迫应对机制，一是“内盐机制”( 鼢l t i n c y t o p l 鹊m m h a i l i s m ) ，二是“有机物渗透机制”( o r g 鲫i c 0 s m o l ”em e c h 锄i s m ) 。一般认为“内 盐机制”是典型的古细菌渗透应答策略，一些革兰氏阳性厌氧嗜盐细菌也是采取这 一机理来适应高盐环境。“内盐机制”根据环境的渗透性，以调整细胞质内的钾盐浓 度( k c l ) 来应对外部渗透胁迫。但这种机理的适应性窄，细菌的生长会受到限制。 而有机溶质机理在细菌中分布广泛，也存在于产甲烷古细菌中。“有机物渗透机制” 是通过积累不带电荷的、高水溶性的渗透压补偿溶质( 0 0 m p a t i b l e l u t e ) 与环境 介质以保持渗透平衡【i l l 。渗透压补偿溶质并不总是从头合成，微生物也能从环境 四氨嘧啶合成l ：科菌株构建 介质中吸收。由于渗透压补偿溶质能在细胞质中高浓度积累而不影响细胞j 下常的 代谢功能及蛋白质的正确折叠，显然这种机制更利于细菌的生长。中度嗜盐菌主 要通过有机物渗透机制耐受环境渗透压胁迫1 1 2 】。 1 1 3 中度嗜盐菌的应用 特殊的生存环境使中度嗜盐菌具有极为特殊的生理结构和代谢机制，也产生了 许多具有特殊功能的天然活性物质。中度嗜盐菌是一类具有生物技术潜能的资源， 它的开发应用也引起了人们的广泛关注。目前对中度嗜盐菌研究应用主要集中在下 述几个方面。 ( 1 ) 环境污染的治理与修复 化肥厂、造纸厂、制药厂、染料厂等排放大量的高盐或高盐碱废水，而中度 嗜盐菌恰恰可以在这类环境中很好的生存。c e l s os 等研究发现中度嗜盐菌 胁d 朋伽甜c 口删，渤凰能够在高盐废水中降解苯甲酸酯和水杨酸盐，将有害物质降 解成低害或无害的物质，这对高盐碱工业废水的治理将是一个巨大的进步也使利 用生物系统治理高盐废水成为现实【b 】。中度嗜盐菌还可以裂解苯甲酸脂和芳烃的 芳香环。已有实验表明，利用一个含有中度嗜盐菌的生物膜反应器每1 2h 就能降解 盐浓度为1 5 0 l 的高盐污水中9 9 的苯酚【14 1 。在西班牙的一些地理环境下，很多 的中度嗜盐菌都表现出抗重金属镉、铜、汞、铬等的性质，并且大约1 3 的菌株具 有多抗金属性f 1 5 l 。 此外，中度嗜盐菌还能有效地修复环境污染，改良水体、土壤的生态结构。 冯玉杰等人从盐碱地中分离筛选出的固氮菌，将其直接接种在盐碱土中，考察了 该中度嗜盐菌土壤中微生物种群构成和固氮酶活性的影响。研究结果证实了该菌 种确实能够提高盐碱土的固氮酶活性，并且在接种了该菌种后，土壤中微生物生 态结构发生了改变，细菌数量降低了，真菌、放线菌和固氮菌数量却不同程度地 增加了f 1 6 】。 ( 2 ) 食品及酶制剂工业 第l 章绪论 在传统的食品工业中，人们利用中度嗜盐菌进行酱油的发酵等。中度嗜盐菌 的体内含有丰富的胡萝卜素和类胡萝卜素，可用来生产胡萝卜素作为天然的食品 添加剂等【2 1 。 酶制剂生产及其使用行业中，由于工业操作中特殊的理化条件不能总是根据 酶反应所需要的最佳条件而改变，这需要酶制剂能够在不同的盐度和温度下都能 保持良好的活性。而中度嗜盐菌产生的酶能够在高盐条件下保持较高的活性和稳 定性，因而具有极高的应用潜能，也为生物化学和酶学等基础研究提供了材料f 3 1 。 ( 3 ) 基因工程技术 中度嗜盐菌在高渗环境中能够积累海藻糖、甜菜碱、脯氨酸等多种渗透压补 偿溶质。近年来，渗透压补偿溶质的渗透保护功能越来越受到重视。可以通过基 因工程手段将渗透压补偿溶质的表达基因转入植物基因组中并使其成功的表达， 能够使植物细胞大量积累渗透压补偿溶质，因而，能够不同程度地提高转基因植 物的耐盐性【1 5 l 。 中度嗜盐菌不仅为微生物生理、遗传和分类及生命科学和相关学科许多领域 的研究提供新的课题，也为环境污染治理与修复提供了新的方法，具有广阔的应 用前景。 1 2 渗透压补偿溶质 1 2 i 渗透压补偿溶质概述 中度嗜盐菌主要通过渗透压补偿溶质来调节渗透压，适应环境渗透压的变化。 渗透压补偿溶质是b m 、na d ( 1 9 7 2 ) 等首次提出的，指其是与细胞内体系补偿而 不影响其他生物大分子功能的溶质1 7 1 。当微生物处于高渗环境中时，细胞内水的 溢出引起膨压减小，相应地胞内所有代谢物的浓度均升高而造成胞内水活度下降。 这时微生物通过在胞内积累有限的几种小分子溶质，如糖、多元醇、氨基酸等以 提高细胞内水活度，使细胞的体积和膨压达到正常水平，并避免细胞内所有物质 浓度的升高【1 8 】。由于这种溶质在细胞内的高浓积累度可使细胞内外渗透压达到平 衡，并且不防碍重要的细胞活动如d n a 修复、d n a 。蛋白质相互作用和细胞代谢， 四氡嘧啶合成l ：_ f i i ! 荫株构建 因而被称为“渗透压补偿溶质”。通常，它们是极性的、易溶的、生理p h 范围内不 带电荷的小分子有机物质。由于渗透压补偿溶质机制是一种短期灵活的瞬变反应， 随外界渗透压的变化而变化，在高渗条件下，细胞积累高浓度的渗透压补偿溶质， 执行渗透保护功能；而在低渗条件下，渗透压补偿溶质又能很快泄漏到周围环境 中或者被分解，防止外界水分过多地渗入细胞内造成伤害，它成为了人们研究微 生物调渗机制较好的模型，也是目前微生物渗透压研究的热点。 1 2 2 渗透压补偿溶质分类 s e v 谢n 等人分析研究了大量光合细菌和化能异养细菌在不同培养条件下细胞 内积累的渗透压补偿溶质。他们发现：中度嗜盐菌能够有选择性的积累多种渗透 压补偿溶质，各种渗透压补偿溶质存在的比例随培养基的组分和生长条件的改变 而变化【1 9 郐】。 目前，在中性嗜盐菌中已发现的渗透压补偿溶质主要包括：氨基酸类、双糖 类、甜菜碱类、多元醇类等。其中四氢嘧啶是中度嗜盐菌主要的渗透压补偿溶质 之一，它是一种环形氨基酸衍生物，能在多种中度嗜盐菌细胞中积累，在抵御外 界高渗环境、稳定细胞内酶的活性发挥重要的作用，有着重要的研究价值和应用 前景【1 ，1 2 2 。 氨基酸类：k o u j i m al 等众多研究学者都做过关于游离氨基酸作为渗透压补偿 溶质的报道【2 2 2 3 1 。谷氨酸是大多数革兰氏阴细菌积累的主要渗透压补偿溶质【2 4 1 ， 而其它氨基酸则积累的很少。在低渗透压下，革兰氏阴性菌主要依赖低浓度的谷 氨酸调节，在高盐透压下，革兰氏阴性菌大量合成谷氨酸，同时吸收k + ，中和谷 氨酸携带的负电荷。脯氨酸是某些革兰氏阳性菌主要渗透压补偿溶质【2 5 2 6 】，当外界 的渗透压增加时，革兰氏阳性菌的一系列生理机制将谷氨酸通过相关的代谢途径 转化为脯氨酸或其它渗透压补偿溶质。主要的氨基酸类渗透压补偿溶质主要有： 谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸；常见的氨基酸类衍生物有：谷氨酰胺和乙酰鸟氨酸。 双糖类：目前己发现的有蔗糖、海藻糖和葡萄糖苷。蔗糖是光合作用的主要 产物，是一种容易获得的渗透保护物。海藻糖，由两个葡萄糖通过异头体羟基失 水而形成的非还原性二糖。有3 种不同的异构体：a a 、a p 和p p 。最早是在1 8 3 2 年 第l 章绪论 由w i g g e r s 将其从黑麦的麦角菌中首次提取出来，随后的研究发现海藻糖在细菌、 酵母、真菌、藻类、昆虫和低等动植物中广泛存在【2 7 ，2 引。生物体能在逆环境下合 成并积累高浓度的海藻糖。b 1 u n d 朗g 等的研究表明，海藻糖对于生物体内的生物 大分子如细胞膜等，具有重要的抗逆保护作用，特别是对那些能抗干旱的生物， 更是意义重大【2 9 】。葡萄糖苷是在一些中度嗜盐的蓝细菌中发现的一种渗透压补偿 溶质【3 0 】。由于浓度过高的糖类对某些酶有抑制作用，所以双糖类被认为是一类较 低级的渗透压补偿溶质。 甜菜碱类：甜菜碱不但能作为渗透压补偿溶质，还能作为碳源和能源物质。 早在1 9 世纪8 0 年代初，r a f a e l i e s h l ( o id 等人就在光合紫细菌和蓝细菌中发现了 甜菜碱，它在渗透压调节中起到了重要作用。细胞质内甜菜碱的浓度通常由外 界环境中n a c l 和胆碱的浓度决定，随着外界浓度的增加而增加【3 2 3 3 1 。甜菜碱类主 要包括脯氨酸甜菜碱、甘氨酸甜菜碱等。 多元醇类：主要存在于酵母、藻类和真菌中。多元醇类由于含有羟基，具有 良好的亲水性，它不但能够有效的维持细胞内的水活度，并且对酶活性的抑制作 用也很小，是一种良好的渗透压补偿溶质【3 4 1 。多元醇类主要有环多醇、甘露醇、 山梨醇和甘油等。 1 3四氢嘧啶及其合成调节 1 3 1四氢嘧啶 四氢嘧啶是某些微生物应答环境渗透压胁迫所合成的一种渗透压补偿溶质 【1 7 1 引。它是一种坏状氨基酸衍生物，分子量1 4 2 2 咖o l ，分子式为c 6 h l o n 2 0 2 ，结 构式见图1 1 。四氢嘧啶是在1 9 8 5 年由g a l i n s k ie a 等第一次在极端嗜盐外硫红螺 菌属( 艮幻，j | l f d 砌d 却f 厂口) 的光合细菌点c f d 历f d r 而d 蛳胁，d 幽z d r 括中发现的【3 卯。 四氨嘧啶合成l ：w 菌株卡 = i 建 图1 1 四氢嘧啶结构式【3 5 】 f i g 1 1f o m u l ao f e c t o i n e 作为渗透压补偿溶质，四氢嘧啶主要分布在嗜盐微生物中。一部分极端嗜盐 菌、大部分中度嗜盐菌和部分耐盐菌均以四氢嘧啶为主要的渗透压补偿溶质【3 6 1 。 越来越多的实验证明四氢嘧啶不仅是大多数中度嗜盐菌主要的渗透压补偿溶质 7 】，在一些非嗜盐菌( 如飘印幻，1 ) 忧，朋删鼬) 中也可以检测到它的存在【3 7 3 引， 研究发现这种物质主要分布于放线菌门、硬壁菌门和变形细菌门这三个分支中【3 9 】， 见表1 3 。 表1 3 四氢嘧啶主要存在的细菌类群1 3 9 1 t a b l e1 31 n h em a i nb a c t 硎ag r o u p so f e c t o i n e 类群属 放线菌门 硬壁菌门 变形细菌门 放线多胞属( 爿c 砌d p d ，燧p d r 口) 拟诺卡氏菌属( d c 口，讲d 筇括) 短杆菌属( 曰，p v f 6 口c f p ，_ 胁m ) 链霉菌属( 泐f d 肌胱s ) 芽孢杆菌属( 肋舭) 喜盐芽胞杆菌属( 胁，d 施c 池岱) 盐水杆菌属( 勋，彪c 讹j ) 芽胞八番球菌属( 跏瑚口r c 加口) 海球菌属( 胁砌o c 删) 枝芽孢杆蔺( 耽僧z 胁姚，) 盐单胞菌属( 胁z d m d 刀船) 色盐杆莳属( c 垤，d 肌砌口，d 6 口c 盯) 外硫红螺菌属( 屁f d f j i j d 砌d 如印f ，口) 假单胞荫属( a p “如埘d 刀口s ) 甲基细菌属( 朋确眦c 御) 小红卵菌属( 尺 d 如v l | 胁m ) 灰色链霉菌( 勋砌f ，f 6 ，面) 第1 章绪论 1 3 2 四氢嘧啶合成途径 b l u n d e i lg 等人研究了喜盐海球( 胁，觑d c o c c h s 施h 砷i ，螂) 、伸长盐单胞菌 ( 胁，d 朋d ，l 鲫e 肠唧胁) 、巴氏链霉菌( 跏印，d 叼脚印甜f p “耐) 、色盐杆菌 ( 凸r d 朋d i l 口，b 6 口c 胞，础如姆拧s ) 、达坂喜盐芽抱杆菌d 8 ( 胁，d 施c f ，螂如6 口，l 鳓s 西) 等菌的四氢嘧啶合成途径，并在分子水平上进行了比较详细的研究【3 7 柏，4 。 四氢嘧啶的合成属于天冬氨酸合成的分支途径，它由l 天冬氨酸d 半醛 ( a s a ) 开始合成，在四氢嘧啶合成酶编码基因p c 纠b c 的作用下，经过3 步酶促 反应完成。第一步，l 2 ，4 _ 二氨基丁酸转氨酶e c t b ( l d i 锄i n o b u t ”l ca c i d t m s 锄i n 舔e ，d a t ) 催化a s a 生成l 广2 ，4 二氨基丁酸( d a b a ) ；第二步，l 2 ，4 二氨基丁酸乙酰转移酶e c t a ( l - d i 锄i n o b u t 州ca c i dt r 锄s 衙a s e ，d a a ) 将d a b a 乙酰化成n 乙酰l 2 ，4 二氨基丁酸( a d a b a ) ：第三步，l e c t o i n e 合成酶e c t c ( e c t o i ms ”t h a ，e s ) 催化a d a b a 环化成四氢嘧啶【4 2 j ，四氢嘧啶合成途径见 图1 2 。此外，在亚麻类短杆菌( b ，们，f 易口c f p 疗姗l 砌绷s ) 和微小链霉菌中，还存在 一条以谷氨酸为前体的四氢嘧啶合成途径，但是具体步骤目前还不清楚。 汴一。叶洲。亢叩。京 天冬氨酸 l 天冬氨醵p 半醛( a s 砷4 二氨基丁酸( d 岫a ) c o 图1 2he ，d ，l g 口l 口四氢嘧啶合成途径【4 3 1 f i g 1 2b i o s y i l t h 鼹i t i cp a 吐l 、阳yo fe c t o i n ei i lhp ，d 唧胁 1 3 3 四氢嘧啶合成酶及其基因 四氢嘧啶生物合成酶的编码基因已经在5 0 种细菌和一个古菌f f r d 如删m 姚 撇玎f 拥船中被鉴定出来1 4 4 1 。四氢嘧啶合成酶基因p c 纠编码l 一2 ，4 _ 二氨基丁酸乙酰 四氯嘧啶合成i ：科荫株构建 转移酶e c t a ，p c 馏编码l 2 ，4 二氨基丁酸转氨酶e c t b ，日d c 编码l e c t o i n e 合成 酶e c t c 。研究发现，在巴氏芽孢杆菌( 鼢c f f f 嬲朋s f p 材一) 中，四氢嘧啶合成酶基 因e c 翻、p c 培和口c f c 共用一个启动子，构成一个基因簇，这一基因簇在结构上非 常紧凑。四氢嘧啶合成酶基因结构见图1 3 。其中，p c 纠和e c 国基因在核糖体结合 位点处重叠，p 砌终止密码子与倒c 起始密码子也存在重叠【4 3 1 。 g 呵a e c 诅e c 侣e c t co r 譬 ( 互= _ ( 0 仁型；薄匹吨唰：一 图1 3 胁d 6 口c f 跏胁却i | i 眦四氢嘧啶合成酶基因结构 f i g 1 31 k s t n l c t u 陀o fe c t o i n es y l l t l l a g 饥ei n 胁，d 跏讲淞 口却i | i i ，淞 1 3 4 四氢嘧啶合成调节机理 四氢嘧啶的合成主要由环境渗透压调控。在高渗环境下，微生物合成四氢嘧 啶对抗外界渗透压胁迫；在低渗环境下，微生物向介质中释放四氢嘧啶，平衡细 胞内外的渗透压。除此之外，四氢嘧啶的合成还有基于其特异性转运蛋白的微调 模式。 ( 1 ) 四氢嘧啶特异性转运蛋白t e a a b c 四氢嘧啶特异性转运蛋白( e c t o i n e - s p e c i f i c 缸觚s p o r t e r ；t e a a b c ) 是变形菌门 中的盐单胞菌属伸长盐单胞菌hp z d ，御细d s m2 5 8 l 。中发现的一种新的、渗透压补 偿溶质的二级转运系统。f p 州曰c 基因序列比较确认t e 扒b c 属于独立的a t p 转运蛋 白家族( t h et r i p a n i t ea t p i n d 印e n d tp 舐p l 弱m i ct l 锄s p o r t 觚i l y ，t r a p t ) ，它 由三个亚蛋白组成，一个大跨膜蛋白( t e a c ) 、一个小的跨膜蛋白( t e a b ) 和一 个周质底物结合蛋白( t e a a ) 【4 5 1 。t c a c 催化转运反应负责与质子移动力或钠移动 的能量偶联，t e a b 不直接卷入转运反应可能需要参与周质底物结合蛋白的相互作 用，t e a a 能与四氢嘧啶特异性结合【4 6 1 。 ( 2 ) 四氢嘧啶合成调节机理 h e ，d 唧细以四氢嘧啶为主要的渗透压补偿溶质【4 7 1 ，k u n t eh j 等人研究其四氢 嘧啶的合成调节机理，建立了四氢嘧啶的合成调节的k u n t e 模型。假定四氢嘧啶通 第l 章绪论 过输出通道流出是由比如膜张力信号触发的，如果膨压达到确定的阈值时，四氢 嘧啶就会释放到周质中。由活化的t e a a b c 的体系把输出的四氢嘧啶再返回细胞质 时，就会下调四氧嘧啶的合成。这种调节机制可能使细胞质内的四氢嘧啶水平产 生震荡，这种震荡在接近打开溶质特异性输出通道所需要的阈值的上下波动。结 果，四氢嘧啶在外部( 周质一培养基) 和细胞质之间循环【4 6 1 ，见图1 4 。即任何四氢 嘧啶，都会对四氢嘧啶的合成产生负反馈作用，因此可能起到调节四氢嘧啶合成 的信号作用，从头合成增加四氢嘧啶浓度会引起水的流入从而引起盐胁迫细胞的 膨压增加。为了验证这一模型的可能性，他们敲除了非分泌型菌株hp ，d 刀朋幻的四 氢嘧啶转运蛋白t e a a b c ，使t e a a b c 不能回收介质中的四氢嘧啶，解除了其对四 氢嘧啶合成的负反馈调节，突变体向培养基分泌四氢嘧啶，同时过量i 匕产四氢嘧 啶。渗透调节转运蛋白突变会导致细菌输出补偿性溶质，这个发现已经不仅引起 科学兴趣也引起通过嗜盐菌大规模工业化生产补偿性溶质的兴趣】。 o 吣 ，n 啊 l c 一 ，oi i _ 、一玎 + i 。苫h i k r 丫n h 3 o 一心c 矮k 图1 4 四氢嘧啶等渗透压补偿溶质的吸收转运途径1 4 i 】 f i g 1 4m 0 d e ld e s 谢b i n gt l l e 陀g u l a t i o no ft l l ec e l l sc o m p a t i b l es o l u t ep a t l l w a y b yo s m o r g u l a t 。d 嘞s p o r t 四氧嘧啶合成i ：样葡株构建 1 3 5 四氢嘧啶的应用 四氢嘧啶除了作为渗透压补偿溶质和为细胞生长提供能源物质外，还对逆环 境下的核酸、蛋白质及细胞具有稳定性作用，可作为环境修复的保护剂、蛋白稳 定剂和化妆品保湿剂酶等3 0 4 引，近年来四氢嘧啶在酶应用技术及医药等领域的应 用研究也日益受到关注1 2 2 4 9 1 。 ( 1 ) 在环境修复上的应用 由于四氢嘧啶能在极端环境下对活细胞等大分子起到稳定和保护的功能以及 其平衡渗透压的特性，使其在环境修复领域有着广阔的前景【5 m 5 。四氢嘧啶可以 用于提高植物耐盐碱性，如何建等人发现添加四氢嘧啶能够明显改善r p “如所d ，l 伽 刚比如k t 2 “o 对盐份渗透胁迫的适应性、缩短k t 2 4 4 0 的延滞期，并降低k t 2 4 4 0 细胞的死亡率【5 2 1 。n a l ( a y 啪ah 等研究发现将四氢嘧啶的基因簇克隆到烟草细胞中 可以提高其对盐碱的耐受性【5 3 】。此外，四氢嘧啶也可以通过对其他具有生物修复 功能的微生物细胞及酶的保护，提高其在逆环境下的存活率，进而提高其对环境 恢复的能力。 ( 2 ) 在酶技术和基因工程中的应用 生物传感器是由生物敏感材料作识别元件( 包括酶、抗体、抗原、微生物、 细胞、组织、核酸等) 与适当的理化换能器( 如光敏管、场效应管、压电晶体等 等) 有机结合的分析工具或系统，物质分子水平的快速、微量的分析方法。酶传 感器作为生物传感器的先驱，在食品和药物分析、微生物和毒素的检验、环境监 测、生物芯片等方面得到了广泛的应用。尽管酶传感器具有灵敏度高，专一性强、 操作简单等优势，却也对盐度、p h 、温度等外界环境条件过于敏感，致使稳定性 差，容易失活。 z h 锄gl h 等报道了四氢嘧啶对植酸酶p h y ai l 热稳定性的影响。p h y a i i 是 来自于彳印p 恻f f 淞触“朋a s 3 3 2 4 的植酸酶基因肼叫i 由幽砌朋s f d 廊g s l1 5 表 达的植酸酶蛋白。在p h y al i 的醋酸缓冲液中添加补偿性溶质四氢嘧啶，9 0 加 热1 5m i n ，保留的残余酶活性超过8 0 。此外，p h y al j 在8 0 条件下水解植酸 第1 章绪论 钠1 5m i n ，添加四氢嘧啶会使植酸钠的水解率提高了1 5 7 。与其它几种补偿性溶 质相比，四氢嘧啶是p h y al i 的最有效的热稳定性保护剂f 州。 l 锄gy j 等报道了四氢嘧啶对劲加肌d 以口s 珊d 6 f 船c i c c l 0 2 3 2 在高葡萄糖浓度 下乙醇发酵的影响。研究结果显示，在葡萄糖浓度为2 5 0 l 的介质环境下，添加 四氢嘧啶能够促进细胞生长，提高乙醇生成体积效率。添加lm m m o l l 的四氢嘧啶 的乙醇发酵终了时细胞干重为1 8 l ，比不添加四氢嘧啶的细胞干重( 1 5 l ) 提高了2 0 0 ；前者乙醇体积效率( 1 1 鲫h ) 比后者( o 7 鲫h ) 提高了5 7 1 ，发 酵周期缩短了2 4h 。在葡萄糖浓度为2 5 0 l 的渗透压胁迫下，添加四氢嘧啶后与没 有添加相比，乃册d m d 刀酗m d 所凰c i c c l 0 2 3 2 细胞抽提液中的葡萄糖激酶( g k ) 、 6 一磷酸葡萄糖脱氢酶( g 6 p d h ) 和乙醇脱氢酶( a d h ) 的相对酶活性分别提高了 2 9 9 ( 四氢嘧啶浓度0 5m m o l 几) 、1 1 6 ( 四氢嘧啶浓度0 5m m o l l ) 和7 7 ( 四氧嘧啶浓度o 2 5m m o l l ) 。四氢嘧啶对乙醇发酵的促进作用可能与其对渗透 压胁迫下，对上述酶活性的保护有关【5 5 】。 ( 3 ) 在医药领域的应用 四氢嘧啶在医药领域的应用主要集中在神经功能衰退类疾病，如阿尔茨海默 氏病和马查多约瑟病的治疗上。阿尔茨海默氏病是以认知障碍和记忆力损伤为主 的原发性退行性脑变性疾病，由于发病人数多，涉及范围广，致死率高等原因， 已成为老年医学中亟需解决棘手的问题之一，引起人们越来越多的重视。这一病 症最明显的特征就是脑部的淀粉状蛋白的堆积，这种淀粉状蛋白的沉淀会对细胞 膜、突触、轴索造成一定的损害，是发病的主要原因之一。因此，阻止淀粉样蛋 白合成和堆积的药物对治疗阿尔茨海默氏病就有着重要的意义。m a 1 u m a ik 等的 研究表明，在体外实验中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶可以通过干扰疏水作用和觚 键的相互作用来影响或阻碍淀粉样蛋白通过自身交联来形成聚合体，并能大大降 低它对人类神经细胞瘤的毒性。由于与羟基四氢嘧啶相比，四氢嘧啶缺少了的争 羟基增强了它的疏水性，所以四氢嘧啶对淀粉状蛋白聚合体的形成具有更强的抑 制作用。而且四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶即使较大浓度下( 如1 0 0m m o 儿) 仍对细 四氢嘧啶合成i ：氍菌株构建 胞无任何毒性，因此它们是治疗阿尔茨海默氏病极有潜力的有效药物【5 6 j 。此外， 四氢嘧啶还可以用于治疗疯牛病、帕会森病、以及朊病毒病等疾病，也可以作为 肿瘤放化疗中健康细胞的保护剂等。 ( 4 ) 在化妆品中的应用 四氢嘧啶可以作为防晒剂和保湿剂等化妆品的添加剂，能够降低u v 对皮肤 的损伤度、防止皮肤失水和干燥、提高皮肤免疫功能、恢复皮肤活力、抗氧化和 预防皮肤老化。如德国墨克公司新近推出一套化妆品，就介绍了四氢嘧啶及羟基 四氢嘧啶对胰岛细胞的免疫作用，它能产生热激蛋白以保护膜的完整性，并减少 皮肤因紫外线而形成的晒斑，是一种天然的无毒副作用的化妆品添加剂。 1 4 四氢嘧啶制备技术 目前四氢嘧啶主要由微生物发酵制备。研究报道的四氢嘧啶发酵工艺主要有 分批发酵罐法、流加发酵罐法、细菌挤奶法和生长细胞和静息细胞两阶段联合制 备法等。 1 4 1 分批和流加发酵 o n r a e d ta e 利用分批发酵技术，优化了碳源、酵母膏浓度和盐浓度等培养条 件对表皮短杆菌( b ，删f 6 口c 矗州姗动池删西d s m2 0 6 5 9 ) 四氢嘧啶发酵的影响，l m o l ln a c l 下分批发酵，最大细胞生长量为1 9 6g 儋，单位质量细胞四氢嘧啶合成 量为o 0 8 g ，四氢嘧啶最大浓度为1 6 l ，合成效率为1 1 l d1 5 7 1 。 f n n g s 等报道的讹砌d 删印m 5 2 的羟基四氢嘧啶发酵，1 5l 工作体积发 酵罐的分批补料发酵，合成量达到7g l ( 发酵1 4 2h ) ，产率为1 2 l d 【5 8 】。o n r a e d t a e 报道的分批补料高密度发酵，其四氢嘧啶产量依赖于细胞生长量的提高而提 高，在lm o l ln a c l 下，发酵1 0 0h ，最大细胞生长量为4 9 l ，四氢嘧啶合成浓 度约为8 l ，合成效率约1 9 2g l d ，得率为0 0 5 以，这是截至目前报道的利用 非分泌型嗜盐菌分批补料发酵中四氢嘧啶合成浓度和合成效率最高的。在这个工 艺中，细胞停止生长时，四氢嘧啶浓度也不再增加。另外，整个发酵过程需保持 5 0 以上的氧饱和度【5 7 1 。 第1 章绪论 1 4 2 细菌挤奶 细菌挤奶是通过反复的高渗和低渗来刺激细胞，使四氢嘧啶在细胞内积累而 最终向培养基中排出的工艺。t h o m 勰s a u e r 等利用hp ，d ，卿胁d s m l 4 2o 在高盐浓 度( 2 5m o l ln a c l ) 下进行四氢嚓咤的分批流加发酵，然后收集菌体转入低渗溶 液( 0 5m o l ln a c l ) 中进行低渗冲击，胞内的四氢嘧啶迅速释放( 约释放四氢嘧 啶总合成量的6 4 ) 。之后将释放过胞内四氢嘧啶的细胞重新转移至1 5 n a c l 的高渗培养基中，继续诱导合成四氢嘧啶，然后再次进行低渗冲击释放。如此重 复循环，最终可使四氢嘧啶的合成效率可达到3 3 l d 。此工艺的主要优点是允许 四氢嘧啶反复被抽提，而且细胞也没有显著的损失【5 9 1 。 1 4 3生长细胞和静息细胞两阶段联合制备法 静息细胞，也称作静止细胞或非生长细胞，是指非增殖的、但仍能保持原有 的各种酶的活性，维持代谢活性的细胞群体状态。可以通过限制培养基营养成分 使细胞不增长或以较低的比生长速率生长。静息细胞具有选择性产物转化、转化 率高、耗氧量小和细胞稳定等优点，被广泛用于一些产物的合成或转化【6 0 6 l l 。为 了提高四氢嘧啶的底物转化率，克服高密度培养时的溶解氧的限制，郎亚军【6 2 1 等 人探索了利用分泌型菌株胁，d 朋d 片嬲阳砌口d s m 5 9 2 8 1 。的静息细胞高效制备四氢嘧 啶，构建一种新的四氢嘧啶高效合成系统。这个系统是生长细胞分批发酵和静息 细胞合成制备的联合制备工艺，以此提高四氢嘧啶合成效率。其四氢嘧啶总合成 浓度可达1 4 8 6 l ，合成效率为7 7 5 l d ，四氢嘧啶得率为o 1 4 ( g ) ，显著地 提高了四氢嘧啶分泌浓度及合成浓度。 1 5 四氢嘧啶代谢工程 随着基因工程技术手段的不断发展，人们希望通过基因工程的方法改变细胞的 代谢途径，以满足人类对生物的特定需求，代谢工程应运而生。代谢工程是利用 d n a 重组技术修饰特定的生化反应或引进新的生化反应，直接改善产物的形成 和细胞的性能的学科。关于四氢嘧啶的代谢工程研究也有了一定的进展。 四氰嘧啶合成l ：料蔺株构建 1 5 1转座子构建四氢嘧啶吸收缺陷型菌株制备四氢嘧啶 k a t r i ng 等应用p c r 技术将菌株hp z d 琊7 口缸的p c 纠基因的d n a 区域的上游 和下游连接在一起，将得到的e c 纠片断克隆到穿梭载体p k l 8m d 如口胡，通过结 合法转移到且p ，d ，郾胁中，构建了hp 肠以g 口细菌株纠缺陷型突变体l l 。删 除了编码l 2 ，4 二氨基丁酸乙酰转移酶的纠，阻断了补偿性溶质四氢嘧啶的生物 合成途径，消除了其合成四氢嘧啶的能力，它靠从培养基吸收渗透压补偿溶质生 长【6 3 1 。 用hp f 0 朋g 口胁k b l 进行t n j 刀2 诱变，得到的7 2 0 0 株突变体。在含有甘氨酸 甜菜碱或四氢嘧啶补偿性溶质无机盐培养基中筛选。不再拥有外源提供的四氢嘧 啶保护时，一株突变体hp ，d ，靴纪a f e 3 5 ，不能在高盐培养基中生长( o 8 6m o l l n a c l ) 。然而突变体不影响甘氨酸甜菜碱的积累，在甘氨酸甜菜碱存在时，a f e 3 5 对盐的耐受性与hp f d 以鄹纪k b l 和野生型hp ，d 唧幻一样。 转座子插入hp f d 唧胁a f e 3 5 破坏了四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶渗透调节吸收 作用。为了检验四氢嘧啶吸收受到转座子插入的影响，对h 咖，嘲缸k b l 及其转座 子突变体a f e 3 5 进行渗透增压，分别在四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶存在的条件下， n a c l 浓度从1 7 0n u n o l l 提升到6 8 0m m o l l 。当渗透上行胁迫时，积极诱导鼠 p 肠，唧胁l 嬗1 对四氢嘧啶的吸收。 1 5 2r e d 重组构建四氢嘧啶吸收缺陷型菌株制备四氢嘧啶 四氢嘧啶合成调节有两个关键点，一是与培养基渗透压