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硕上论文城市粪便高效降解菌的筛选和效果评价 摘要 从城市粪便资源化角度出发，对多种分离源的微生物进行分离、纯化和筛选，得到 堆肥生产有机肥料所需的高效复合菌剂。主要内容如下： 利用多种选择性培养基，从腐熟、半腐熟的人体粪便和经常利用腐熟粪便浇灌农田 的土壤中分离得到4 6 株中温及高温微生物，其中细菌2 0 株，放线菌1 3 株，霉菌8 株， 酵母菌5 株。 经淀粉、蛋白质及纤维素三类大分子有机物水解试验和臭度分析试验，从分离纯化 的各类微生物中筛选出降解能力较强的菌种1 4 株，其中中温细菌( 用b 表示) 4 株，高温 细菌( 用h b 表示) 2 株；中温放线菌( 用a 表示) 2 株，高温放线菌( 用h a 表示) 2 株；中 温霉菌( 用m 表示) 2 株；中温酵母菌2 株。 以气味、c o d e r 的去除率、n h 4 + - n 的变化、种子发芽率等指标为依据，对优化组 合的高效菌剂进行筛选，得到一组能在三个星期左右使新鲜粪便基本熟化的高效复合降 解菌剂，包括5 株细菌、3 株放线菌、2 株霉菌和1 株酵母菌。 为验证所得高效菌剂的腐化效果，与空白对照堆相比较，加入高效菌剂后，在相同 时间内，有机质降解速率快1 0 以上，氨氮含量低1 3 以上，微生物含量可高出一个 数量级，种子发芽率高7 以上。通过对影响粪便好氧堆肥工艺主要参数的实验研究， 结果表明：堆肥碳氮比为3 0 、含水率为6 0 - 6 5 时腐熟速率最大。 采用多种生理生化指标对1 1 株菌株进行初步鉴定：b 1 为微球菌属，b 3 为纤维单 胞菌属，b 5 为芽孢杆菌属：h b i 和h b 5 分别为葡萄球菌属和假单胞菌属；a 2 ，a 4 ， h a 2 分别属于链霉菌属，诺卡氏菌属和小单胞菌属；m 2 和m 3 分别属于青霉属和木霉 属。 关键词：城市粪便，好氧堆肥，腐熟度，菌株鉴定 a b s t r a c t f r o mr e s o u r c e so fu r b a nn i g h t s o i l ，b yi s o l a t i n g ，p u r i f y i n ga n ds c r e e n i n gab a t c ho f m i c r o b e s f r o mv a r i o u ss e p a r a t es o u r c e s ，w eg o th i g he f f e c t u a lc o m p l e xi n c u l a n t sf r o mh u m a n f e c e s ，t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： u s es o m ek i n d so fs e l e c t i v em e d i a , w eh a v eg o tm a n yk i n d so f m e s o p h i l i cm i c r o b e sa n d t h e r m o p h i l i cm i c r o b e sf r o mm a t u r i t y , s e m i - d e c o m p o s i t i o no fh u m a ne x c r e t aa n dt h ei r r i g a t e d f a r m l a n d ，i n c l u d i n g2 0s t r a i n so fb a c t e r i a ；13s t r a i n so fa c t i n o m y c e s ；8s t r a i n so fm o l d ；5s t r a i n s o f y e a s t t h r o u g ht h eo d o rs m e l la n dt h eh y d r o l y t i ct e s t so ft h r e ek i n d so fm a c r o m o l e c u l a ro r g a n i c m a t t e r s ，i n c l u d i n gs t a r c h ，p r o t e i n ，c e l l u l o s e ，1 4s t r a i n so fm i c r o b e sh a v i n gs t r o n gd e g r a d a t i o n a b i l i t yh a v eb e e ns c r e e n e df r o mt h ev a r i o u sm i c r o b e s ，i n c l u d i n g4s t r a i n so fm e s o p h i l i c b a c t e r i a ( b ) ，2s t r a i n so ft h e r m o p h i l i cb a e t e r i a ( h b ) ；2s t r a i n so fm e s o p h i l i ca c t i n o m y c e s ( a ) ，2 s t r a i n so ft h e r m o p h i l i ca c t i n o m y e e s ( h a ) ；2s t r a i n so fm e s o p h i l i cm o l d ( m ) ；2 s t r a i n so f m e s o p h i l i ey e a s t ( y ) b ys t u d yt h es m e l l ，t h er e m o v a lr a t eo fc o d c r ，n i - 1 4 + nv a l u ea n dg e r m i n a t i o nr a t e ，a g r o u po fc o m p l e xi n o c u l ah a sb e e no b t a i n e d ，w h i c hc a nm a k et h ec o m p o s tm a t u r ei nt h r e e w e e k s ，t h ei n o c u l a i n c l u d e5s t r a i n so fb a c t e r i a , 3s t r a i n so fa c t i n o m y c e s ，2s t r a i n so fm o l d 1 s t r a i no fy e a s t t ov e r i f yt h ep y t h o g e n e s i se f f e c t so fe f f i c i e n ts t r a i n ，i th a sb e e nf o u n dt h a tw i t h i nt h es a m e t i m ep e r i o d ，c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l ，t h er e d u c t i o no ft h eo r g a n i cm a t t e ri s 10 h i g h e r , t h e v a l u eo fn h 4 + - ni s1 3 l o w e r , a n dt h em i c r o b i a lq u a n t i t yi s1 0t i m e sm o r e ，t h eg e r m i n a t i o n r a t ei s7 h i g h e r t h r o u g ht h es t u d yo ff e c e sa e r o b i cc o m p o s t i n gt e c h n o l o g y , w h e nr a t i oo f c a r b o na n dn i t r o g e ni s3 0 ，m o i s t u r ec o n t e n ti s6 0 t o6 5 ，t h ed e g r a d a t i o no f o r g a n i cm a t t e r i sf a s t ，c a ng e tag o o dd e g r e eo f m a t u r i t y p a r t i a lp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a li n d e x e so ft h e11s t r a i n sa r em e a s u r e d ，t h e yb e l o n g t o ：b 1i sg e n u so fm i c r o c o c c u s ，b 3i s g e n u so fc e l l u l o m o n a s ，b 5i sg e n u so fb a c i l l u s ；h b1 a n dh b 5a r eg e n u so fs t a p h y l o c o c c u sa n dp s e u d o m o n a s ；a c t i n o m y c e t e sa 2 ，a 4a n dh a 2 b e l o n gt ot h es t r e p t o m y c e s ，n o c a r d i aa n dm i c r o m o n o s p o r ar e s p e c t i v e l y ；m o l dm 2a n dm 3 r e s p e c t i v e l yb e l o n gt op e n i c i l l i u m a n dt r i c h o d e r m a k e yw o r d s ：u r b a nn i g h t s o i l ，a e r o b i cc o m p o s t ，m a t u r i t y ，s t r a i ni d e n t i f i c a t i o n i i 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学 位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布 过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的 材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明 确的说明。 研究生签名： 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上 网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权 其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文， 按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：慨g 月确 硕上论文城市粪便高效降解菌的筛选和效果评价 1 绪论 1 1 我国城市粪便的污染现状 粪便是人类生存活动不可避免的产物，人类粪便是由未被消化的食物残渣、肠道内 的细菌和部分新陈代谢物质组成，一般含水量7 5 ，固体物2 5 。新鲜粪便含病菌和寄 生虫卵，是人类某些疾病的传播途径。如果将粪便作肥料使用，必须经过发酵处理，粪便 的处理和处置对保护环境和人们健康有重要的意义【l 】。本课题研究的科学意义在于利用 微生物的方法处理人类粪便，迅速减小其体积，加快分解转化成腐殖质。 在中国，城市粪便用作肥料由来己久，只是长期以来人们更多地关注粪便的资源利 用而很少考虑粪便的污染危害。8 0 年代以来，由于多种原因使城市粪便农用出现了戏剧 性的急剧下降，迫使大量的粪便向城市附近区域倾倒，出现更为严重的卫生和环境污染 问题。许多城市已认识到粪便问题是城市环境保护发展战略必须解决的紧迫问题【2 】。 因缺乏彻底处理粪便的设施，粪便污染是世界各国城市普遍面i 临的“老大难”问题。一 个人每天的排泄物中约含有氮1 8 6 克、磷1 7 4 克，足以污染1 0 吨洁净的水体。据粗略 统计，我国现在仅城市拥有的公厕就有二十万个左右，每年产生的粪便量为3 0 0 0 多万 吨，其中9 0 直接排入河流或近海；如果算上城市居民自用厕所的粪便量，每年产生的 粪便量超过1 亿吨，其“出路”几乎也都是河流和近海。 据1 9 9 7 年统计，我国6 6 8 座设市城市年清运粪便2 9 0 0 万吨，被无害化处置的不到 1 2 ，多数只是经过化粪池的简单处理就被直接排放，粪渣也得不到妥善处置。如北京市 在方庄粪便消纳站建成之前，粪便无害化处置率仅为7 5 ，再建1 1 座同等规模的粪便 消纳站，才能使北京市的粪便全部达到无害化处置。我国城镇粪便的低处置率和污水处 理厂的低普及率直接相关，我国近4 0 的设市城市缺乏完善的下水管网，镇污水处理厂 严重不足，化粪池达不到应有效果，一些现代大都市污水处理率还不足1 0 ，造成了全 国9 0 以上的污水粪便得不到及时、有效的处理就直排江河湖海，致使城市流经河段 8 6 的水质超标【2 1 。 目前世界上主要采用集中处理的方法治理粪便污染，比如在城市郊区兴建污水处理 厂，将包括粪便水在内的污水收集起来集中处理。这种方法投资巨大，技术要求高，尤 其是在集中到处理厂之前，粪便水流经的广大地域已饱受污染。国家应加大对粪便污染 治理技术研究与推广的扶持力度，以尽快解决城市中日趋严重的粪便污染问题p 。5 j 。 1 2 国内外粪便处理的研究现状 如今大都是利用生物方法来处理人体粪便，旨在迅速减少其体积，加快分解转化成 1 绪论硕士论文 腐殖质，利用城市环保型公厕对粪便的处理及处理后粪便的利用。目前，国外一些相关 人员对人粪便的微生物处理已有较深的研究，并在一些发达国家加以应用。尽管有些学 者认为堆肥过程中没有必要接种菌剂，但是多数人认为在人工条件下通过接种可提高堆 肥微生物数量，从而加快堆肥反应进程。早在4 0 年代，美国就通过接种细菌使堆肥时 间缩短1 3 d 。许多研究结果对堆肥过程中接种菌剂的促进作用还是充分肯定的，不少 学者已经致力于研究堆肥不同阶段起关键作用的微生物，并在自然界进行优质高效菌群 的筛选和接种技术的探讨。 近年来，许多研究结果表明，在粪便堆肥过程中添加适当的微生物能显著加速有机 碳的分解、减少氮素损失和缩短堆肥时间，明显减少堆肥过程中臭味的挥发，提高肥效、 保护环境。日本、美国等国家起步较早，进展较大。其中以日本的e m 菌群【6 】为代表， 对粪便、秸秆等有机材料堆制发酵有一定效果，能有效去除粪便的恶臭r 7 1 。美国、马来 西亚等国的研究工作主要集中在产酸微生物方面，利用产酸菌进行发酵，降低粪便的酸 度，减少氨的挥发。同时，近年来，在日本和印度有商业化的堆肥接种菌剂在出售【8 。1 0 1 。 我国在最近几年也开始对粪便堆制发酵进行研究。黄懿梅等j 将粪便与少量锯末混 合，接种两种外源微生物，在自动化高温装置中进行堆肥试验，结果氨态氮的转化和水 溶性有机氮的形成都有明显的促进作用。赵京音等【| 7 】在粪便中添加微生物制剂，结果较 传统堆制法腐熟进程明显加快，能显著提高堆肥中有机质的含量，大大减少氮的气态损 失。 1 2 1 国内外粪便处理工艺方案概述 1 2 1 1 国外粪便处理工艺方案 在欧洲和一些发达国家，粪便的处理是采用特殊处理与污水治理相结合的方法 ( 1 ) 在距污水厂较近的粪便接收站，由抽粪车将粪便从化粪池中抽出，运到接收站， 仅采用粗固液分离和除砂设备，对粪便污水进行初级处理，处理后的过滤液，直接排放 到污水处理厂的污水总进口处，与市政污水混合后进入污水的深度处理，分离出的大块 固体物送填埋场填埋，从而实现对粪便的无害处理。 ( 2 ) 在远离污水厂的粪便接收站，在固液分离装置的作用下，将分离出的液固混合物 经储存调节池，由污泥泵泵入密封的污泥脱水机，经除泥脱水处理后，滤清液排入市政 排水管网，进入污水处理厂进行深度无害化处理。分离出的大块固体物送填埋场填埋， 脱水后的干物质用以制造有机生物肥料。 1 2 1 2 目前国内使用的几种粪便处理工艺方案 ( 1 ) 粗过滤与市政管网排放相结合的工艺 在上海、北京的一些粪便消纳站，是采用粗过滤后，将过滤液排入市政管网，捞出 的滤渣送填埋场做填埋处理。 硕士论文 城市粪便高效降解菌的筛选和效果评价 ( 2 ) 粗过滤、除砂与市政管网排放相结合的工艺 在广州、佛山和上海的一些粪便消纳站，采用了粗过滤与除砂相结合的工艺，即： 粪便经细格栅滤后进入沉砂池( 箱) ，沉淀的砂和大颗粒粪渣由提升螺杆提出与细格栅 滤出的滤渣一起送填埋场填埋，滤清液进入市政管网或通过管道进入污水处理厂。 ( 3 ) 粗过滤、除砂、除泥脱水与市政管网排放相结合的工艺 在北京高碑店粪便处理场、北京四季青粪便处理场、北京酒仙桥粪便处理场、北京 北小河粪便处理场、嘉兴有机肥场等，采用的是粗过滤固液分离捞出大块物质和较大的 砂石等重物后的混合物进入调节池，而后由污泥泵泵入密封的污泥脱水机，再通过脱泥 机进一步去除泥、砂及不溶解的有机物，产生的滤清液排入市政管道，进入污水厂，其 处理过程产生的滤渣和砂石送填埋厂填埋，脱水机排出的干渣，堆肥厂收购制成有机肥， 使资源得到有效利用。 ( 4 ) 粗过滤、除泥脱水与生化处理成独立系统的处理方案 经过粗固液分离，除泥脱水处理后，滤清液进入生物分解、腐化、澄清处理，使其 形成一、二、三级为一体的处理程序，处理后的水质可实现城市下水道排放，而且部分 可用于固液分离部分的稀释水、脱水设备的冲洗用水或浇灌用水等，从而实现对粪便的 有效、资源化处理【1 2 l 。 1 2 2 中国人粪便农业利用的发展途径探讨 我们国家的城市人口有5 亿，每天都产生大量粪便，这些粪便如果都作为有机肥交 给农民，至少可以满足2 亿亩农田的有机肥供应。而如今，这些粪便却被白白的浪费， 被人为引导流入江河，污染人们饮用的河水。为此，建议城市管理部门应禁止粪便沉淀 池通入公共排污管，粪便沉淀池应由使用者雇人定期清理并将清理出的粪便交给农民作 为有机肥( 由于农家肥缺少，现在我们的农民还出钱买粪便) ，这样不仅可解决一部分人 的就业( 变成粪便工人) ，又可满足农民对粪便的需求，更可避免粪便对河流的污染， 一举三得。 解决中国人粪便利用问题是一个系统工程，涉及生态系统物质循环、技术设计、经 济论证、社会接纳性的研究等。然而目前和未来相当长的一段时期内中国人粪便最重要 的消化终端还是在包括农、林、牧、渔在内的农业方面。城镇和农村由于粪便集中的程 度不同处理方式上有很大差异，但都可以从厕所结构、处理方式、运送办法、使用体系 与使用技术等方面进行探讨【3 1 。 1 2 2 1 厕所结构改进 ( 1 ) 使产生的粪便在总量上尽量减少，便于后续的处理与运输；减量的方法有冲洗方 法的改进，如马桶可以通过减量冲水，真空辅助抽吸等方式改进，还可以实行水厕改旱 厕等。 3 l 绪论 硕士论文 ( 2 ) 厕所还应当在卫生方面符合标准，减少气味污染和病原传染。例如在河南洛阳郊 区使用双瓮漏斗厕所，结果比传统厕所对蔬菜的病原污染率少，群众的肠道病发病率减 少2 0 到2 6 。厕所和沼气池结合也是符合卫生改进要求的。 1 2 2 2 远距离运输方式 尽管集约化的家畜饲养企业的粪便运输距离也很远，但是超过5 公里以上的人粪便 运输问题一般只有城镇才会出现。中国城镇人粪便的远距离运送段目前仍然存在人畜力 车辆、机动车辆和管道三种手段。其中，机动车辆数量增长快，9 0 年代中期以来全国粪 便收运机械化达到8 0 以上，其中东部城市高达9 0 以上。管道运送在近年发展比较快， 但是普及率只有7 0 左右，污水处理率只有2 0 左右。在一段时间内，中国城镇的三种 远距离人粪便运送方式将同时存在，但是后两种方式将上升。 随着经济的发展，可以预料管道运送将成为未来的主要人粪便运送手段。未来管道 设计使雨水、生活用水、工厂污水、医院污水与人粪便进行适当的分流，不但可以减少 处理负担，减少重金属和病原污染，而且可能提高水资源和养分的循环利用效率。城市 粪便还可以经过适当处理后，使需要运输的状态不是液体，而是固体。这将有助于减轻 运输压力，是值得鼓励的发展方向。 1 2 2 3 粪便城市集中处理方法 污水处理厂通过物理分离、化学调节和生物曝气等方式处理后，可以把处理过的水 正常排放，或进一步通过人工湿地处理后再利用。曝气处理后的污泥可以进行农业利用 或者焚烧。为了适应不同地方的条件，自8 0 年代以来，我国各地正在积极探索其他低 成本高效益的粪便城市集中处理方法。用于大规模处理的密封存储池正在上海郊区试 验；粪便与垃圾混合的条形高温堆肥在天津河西开展；高温沼气发酵粪便处理厂在青岛 成功建立；烟台用常温沼气发酵处理全市收运的粪便获得成效；用脱水技术处理粪便的 设备在佛山引进试用。 1 2 2 4 粪便农村分散处理方法 ( 1 ) 根据农村分散处理的水分状况，可以把处理方式分为干式和湿式两大类。湿式处 理方法包括常规或改进的化粪池、沼气池和缸储方法等；干式处理方法包括常规堆肥、 高温堆肥、加菌堆肥、通风堆肥等。 ( 2 ) 在农村也形成了各种类型的粪便利用模式，把人畜与作物及土壤紧密结合，形成 良好的物质循环利用系统。目前在南方推广的人畜一沼气一果树模式，在北方推广的人 畜一沼气一蔬菜一大棚模式就属于这类循环利用的农业生态系统。过去在南方的基塘系 统也有人畜鱼一作物模式，由于粪便直接被鱼利用，不符合卫生要求，已经逐步减少 和取消i u j 。 1 2 2 5 粪便处理产物的农业利用 硕上论文 城市粪便高效降解茵的筛选和效果评价 通过沼气、粪池产生的液体状产物，其含的养分量比较高，直接农用可以作基肥和 ，追肥。沼气发酵后产生的液体还可以用于浸种、叶面施肥、养鱼、喂猪，沼气发酵产生 的气体可以用做生活燃料、植物温室加温、动物房舍保温，还可以被利用作为抑制呼吸 的农产品保鲜用气体。沼气渣除了可以直接用作基肥和追肥以外，还可以用于食用菌生 产、蚯蚓生产等。 污水处理厂排放的污水如果符合灌溉标准，可以根据作物对水分和养分的需要直接 进行农田灌溉。污水处理厂生产的污泥，如果重金属没有超标，可以与其他肥料混合， 制成有机无机复合肥，用于农业，特别是非直接食用的材林和花卉生产【悼”】。 1 3 粪便堆肥的基本原理 堆肥化就是在人工控制下，在一定的温度、湿度、c n 和通风条件下，在自然条件 下，利用自然界广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物的发酵作用，人为地促进可生 物降解的有机物向稳定的腐殖质生化转化的微生物学过程【1 6 】。 、 1 3 1 好氧堆肥原理 好氧堆肥是在有氧条件下，依靠好氧微生物的作用来进行的。粪便中可溶性物质可 透过微生物的细胞壁和细胞膜被微生物直接吸收；而不溶的胶体有机物，先被吸附在微 生物体外，依靠微生物分泌的胞外酶分解为可溶性物质，再渗入细胞。微生物通过自身 的生命代谢活动，进行分解代谢( 氧化还原过程) 和合成代谢( 生物合成过程) ，把一 部分被吸收的有机物氧化为简单的无机物，并放出生物生长、活动所需要的能量，把另 一部分有机物转化合成新的细胞物质，使微生物生长繁殖，产生更多的生物【1 7 , 1 9 】。 好氧堆肥过程可大致分为三个阶段： ( 1 ) 中温阶段 中温阶段是指堆肥过程的初期，堆层基本呈1 5 4 5 。c 的中温，嗜温性微生物较为 活跃并利用堆肥中可溶性有机物进行旺盛的生命活动。这些嗜温性微生物包括真菌、细 菌和放线菌，主要以糖类和淀粉类为基质。 ( 2 ) 高温阶段 当堆温升至4 5 时即进入高温阶段，在这一阶段，嗜温微生物受到抑制甚至死亡， 取而代之的是嗜热微生物。堆肥中残留的和新形成的可溶性有机物质继续被氧化分解， 堆肥中复杂的有机物如半纤维素、纤维素和蛋白质也开始被强烈分解。现代化堆肥生产 的最佳温度一般为5 5 。 ( 3 ) 降温阶段 此时微生物的活性下降，发热量减少，温度下降，嗜温性微生物又占优势，对残余 的物质做进一步的分解，腐殖质不断增多且稳定化，堆肥进入腐熟阶段，需氧量大大减 1 绪论 硕士论文 少，含水率也降低。 1 3 2 厌氧堆肥原理 厌氧堆肥过程主要分为两个阶段：第一阶段是产酸阶段，第二阶段是产甲烷阶段。 其最终产物除二氧化碳和水外，还有氨、硫化氢、甲烷和其他有机酸等还原性终产物， 其中氨、硫化氢及其他还原性终产物有异臭。 1 4 影响粪便堆肥的因素 堆肥是一个生物学过程，堆肥化生产有机肥的成败关键在于微生物的正常繁衍。为 了使堆肥顺利进行，必须营造一个有利于微生物生长、繁殖并使其充分发挥作用的环境。 影响堆肥生产的主要环境因子有堆肥成分、水分、温度及通气【1 8 】。 1 4 1 c n 和c p c n 是影响堆肥的重要因素，碳是发酵过程中的动力和热源，而氮主要用于细胞原 生质的合成，因氮含量远超出生物体合成的需氮量，故氮是控制生物合成的决定因素， 也是控制反应速度的决定因素。在堆肥过程中，物料的c n 对分解速度有重要影响。 c n 过低时，可供消耗的碳素少，氮素养料相对过剩，则氮将变成铵态氮而挥发，导致 氮元素大量损失而降低肥效。c n 过高，碳素多，氮素养料相对缺乏，细菌和其他微生 物的生长受到限制，有机物的分解速度就慢、发酵过程就长；堆肥成品的碳氮比过高， 施入土壤后，将夺取土壤中的氮素，使土壤陷入“氮饥饿”状态，会影响作物生长【1 蚰1 1 。 为了保证成品堆肥中一定的碳氮比和在堆肥过程中有理想的分解速度，必须调整好 堆肥原料的碳氮比。一般调整的方法是加入农作物秸秆、落叶等。堆肥c n 应满足微 生物所需最佳值( 2 5 - 3 5 ) ：1 ，最多不能超过4 0 。一般要求堆肥料的c p 在7 5 - 1 5 0 为宜。 1 4 2 含水率 水分是微生物繁殖和活动的重要因素。水分过少，堆内空气流通，好气微生物活动 强，易造成有机质和氮素大量损失，材料不能吸水软化，微生物不易侵入和分解；堆腐 中的各种养料只有溶解在水中才能为微生物吸收利用。水分过多，堆内空气少，通气不 良，腐解同样缓慢，最适宜的含水量是6 0 - - 7 0 ，即加水到手握成团，触之即散的状 态。如发现堆内出现白毛，说明此时含水量过低，对进一步腐解不利，这时应补充加水， 当堆温升至6 0 ，气候又干又热，也应补加水分，水分含量低于4 0 时，不能满足微 生物生长需要，有机物难以分解。 硕上论文 城市粪便高效降解菌的筛选和效果评价 1 4 3 温度 对堆肥而言，温度是堆肥得以顺利进行的重要因素，温度的作用主要是影响微生物 的生长，一般认为高温菌对有机物的降解效率高于中温菌，现在的快速、高温好氧堆肥 正是利用了这一点。初堆肥时，堆体温度一般与环境温度相一致，经过中温菌l 2 d 的 作用，堆肥温度达到高温菌的理想温度5 0 - 6 0 c ，在这样的高温下，一般堆肥只要5 6 d 即可达到无害化。过低的温度将大大延长堆肥达到腐熟的时间，而过高的堆温( 7 0 ) 将对堆肥微生物产生有害的影响。 1 4 4p h 值 p h 值也是影响堆肥中微生物生长的重要因素之一，通常p h 值在3 - 1 2 之间都可 以进行堆肥。但有研究发现，堆肥初期堆体过高或过低的p h 值都会严重抑制堆肥反应 的进行，并认为有机固体废物发酵过程的适宜p h 值为6 5 7 5 ，因为这是微生物尤其 是细菌和放线菌生长最合适的酸碱度。一般情况下，堆体有足够的缓冲作用，使p h 值 稳定在可以保证好氧分解的酸碱度水平、如果原料p h 值过低，为了调节原料的p h 值 达到6 5 ，可向堆料中加入少量的消石灰或碳酸钙，相反如果p h 值过高，可加入新鲜 绿肥、青草，它们分解产生有机酸，可以调节p h 值至合适水平。 1 4 5 通风供氧 通风供氧是堆肥成功的关键因素之一，堆肥时需要保持适当的氧气以利于好氧微生 物的繁殖和活动，促进有机质分解。如果通气量不足将抑制好氧微生物的活动，使堆肥 周期变长，影响堆肥的质量。如果通气太旺，微生物活动旺盛，有机质分解加剧，腐殖 质积累减少，同时通气过于旺盛还会带走大量的热量，影响堆肥温度，因此通气要适当。 堆肥过程中合适的氧浓度为1 8 ，最低为8 ，氧浓度一旦低于8 ，就成为好氧堆肥 中微生物生命活动的限制因素，容易使堆肥厌氧而产生恶臭。 1 4 6 堆肥添加剂 为了促进堆肥腐熟，加快堆肥进程，提高堆肥产品的质量，需要在堆肥物料中加入 一些微生物、有机或无机物质作为堆肥添加剂，包括接种剂、营养调节剂、膨胀剂、调 理剂等。堆料中加入接种剂可以加快堆腐材料的发酵速度。比如可以在堆肥中加入分解 较好的厩肥或加入占原始材料体积1 0 - - - 2 0 的腐熟堆肥，能加快发酵速度，在堆肥堆 制过程中，按自然的方式形成了参与有机废弃物发酵和腐殖化的微生物群落，通过有效 的菌系选择，可以从中分离出具有很大活性的微生物培养物，形成微生物接种剂，能有 效的促进堆肥腐熟，缩短堆制周期，提高堆肥质型2 2 1 。 7 1 绪论 硕士论文 1 4 7 堆肥原始尺寸 因为微生物通常是在粪便的表面活动，所以减少粪堆尺寸，增加表面积，将促进微 生物的活动并加快堆肥速度。但是粪堆的尺寸也不能太小，否则会阻碍堆肥中空气的流 动，减少可利用的氧气量。 1 5 评价堆肥腐熟度的指标 堆肥腐熟度的评价是关系到堆肥的方法能否顺利进行的最为关键的问题之一。未腐 熟的产品施用于土壤后，微生物还会利用土壤间隙中的氧气继续活动降解有机物，从而 造成厌氧的环境，使植物根系缺氧，并产生h 2 s 和n o 等气体。未腐熟的产品中有很高 的碳氮比( 2 5 ：1 或更高) ，造成微生物的氮饥饿而去摄取土壤中的氮，使土壤产生缺氮 现象t 2 3 乏习。 多年来，国内外许多学者为了建立一个合理统一的腐熟度标准，在堆肥化过程中生 物降解和物质转化等机理方面作了大量细致深入的研究。根据堆肥腐熟度参数及指标的 分析手段不同，现阶段国内外有以下的一些堆肥腐熟度指标： 1 5 。1 物理学指标 通常情况下，腐熟堆肥的表观特征为：堆肥后期温度自然降低；不再吸引蚊蝇； 不会有令人讨厌的臭味；由于真菌的生长，堆肥表面有白色或灰白色菌丝附着； 堆肥产品呈现疏松的团粒结构。此外，高品质的堆肥应是深褐色，肉眼看上去均匀，并 发出令人愉快的泥浆气味，这种方法只能从感官上进行初步判断，难以进行定量分析。 ( 1 ) 温度 堆肥腐熟后，堆体温度与环境温度趋于一致，一般不再明显变化。由于堆体为非均 相体系，其各个区域的温度分布不均衡，限制了温度作为腐熟度定量指标的应用，但其 仍是堆肥过程最重要的常规检测指标之一【2 6 2 7 1 。 ( 2 ) 气味 堆肥腐熟后，堆体内无不快气味产生，并检测不到低分子脂肪酸，堆肥产品具有森 林腐殖土和潮湿泥土的气息【2 8 。3 1 1 。 ( 3 ) 色度 堆肥过程中堆料逐渐发黑，腐熟后的堆肥产品呈黑褐色或黑色。但使用该法时要注 意取样的代表性，而且堆肥的色度受其原料成分的影响，所以很难建立统一的色度标准 以判别各种堆肥的腐熟程度【3 2 1 。 总的来说，物理的一些指标虽然简便、直观，但是难以定量表征堆肥过程中堆料成 分的变化，也就不易定量说明堆肥腐熟程度，缺乏可信度和可操作性，但其仍是堆肥过 程中常用的监测指标。 硕十论文城市粪便高效降解菌的筛选和效果评价 1 5 2 化学指标 研究腐熟度的化学指标有：有机质变化指标、氨氮指标、腐殖化指标、碳氮比和有 机酸等。 ( 1 ) 有机质的变化 在堆肥过程中，堆料中的不稳定有机质分解转化为二氧化碳、水、矿物质和稳定化 有机质，堆料的有机质含量变化显著。反映有机质变化的参数有化学需氧量c o d 、生 化需氧量( b o d 5 ) 、挥发性固体( v s ) 。l o s s i n t 3 3 】对动物的排泄物进行堆肥研究，提出当堆 料的c o d 小于7 0 0 m g g 干堆肥时达到腐熟。b o d 5 虽然不代表堆肥中的全部有机物， 但代表了堆肥中的可生化降解部分，k a s p e r 等【3 4 1 认为腐熟的堆肥产品中，b o d 5 值应小 于5 m g g 干堆肥。v s 基本上反应了堆肥原料中有机质的含量，在不同的堆肥过程中变 化的幅度比较大【3 5 】。以污泥为原料的堆肥，v s 的测定可采用5 5 0 c 下灼烧4 小时的重 量损失，但也有研究者提出4 3 0 c 下燃烧2 4 小时能更好的反映有机质含量【3 6 1 。 ( 2 ) 氨氮 对于粪便堆肥而言，去除臭味，降低氨氮是很重要的，堆肥初期铵态氮含量较高， r i f f a l d i 等【3 7 】提出铵态氮的减少及消失和硝态氮的增加可以作为腐熟度的参数，杨毓峰 等p 5 】以稳定堆肥的氨氮含量小于0 4 9 k g 作为堆肥的腐熟指标。但当原料的碳氮l 匕( c n ) 高、堆体温度高且通气条件差时，会造成大量的氮( n ) 以氨氮的形式损失，使这两个 参数的使用受到限制，但可以作为评价堆肥效果好坏的指标之一。 ( 3 ) 碳氮比( c n ) 碳源是微生物利用的能源，氮源是微生物的营养物质。在堆肥过程中，碳源被消耗， 转化成二氧化碳和腐殖质物质，而氮则以氨气的形式散失，或变为硝酸盐和亚硝酸盐、 或是由生物体同化吸收。因此，碳和氮的变化是堆肥的基本特征之一。沈根祥等【3 8 】以 c n 霉菌 酵母菌 放线菌。除臭效果最好的七种 菌株分别是：b 3 、b 1 2 、h b 2 、h b 8 、m 1 、h m l 和y 2 ，它们可使粪便的臭度降到基本 无臭。由上表可以看出：与空白对照相比，细菌的除臭效果最好，可能是由于细菌在粪 便及其所污染的土壤环境中的繁殖能力比真菌和放线菌强，容易形成优势菌群，从而表 现出较好的除臭能力，这也说明细菌是组成优势菌群的主要菌种。从中筛选出脱臭效果 比空白对照好的菌株如表2 5 所示： 表2 5 臭度初筛实验结果 t a b l e 2 5r e s u l to fp r e l i m i n a r ys c r e e n i n go f o d o rd e g r e e 菌种编号微生物类群 b l 、b 3 、b 5 、b 6 、b 9 、b l o 、b 1 2 、h b l 、 h b 2 、h b 6 、h b 8 a 2 、a 4 m l 、m 3 、m 4 、h m l y 1 、y 2 、y 4 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌 2 3 3 大分子水解实验 将所有分离纯化得到的菌株进行了菌落形态观察及镜检，并对其进行大分子有机物 水解能力的测定，反复对比测定多次，将生长相对较快，降解淀粉、蛋白质及纤维素能 力较强的4 6 种菌株列于表2 6 中，其中中温细菌( 用b 表示) 1 2 株，高温细菌( 用h b 表 示) 8 株；中温霉菌( 用m 表示) 6 株，高温霉菌( 用h m 表示) 2 株；中温放线菌( 用a 表示) 8 株，高温放线菌( 用h a 表示) 5 株；中温酵母菌( 用y 表示) 4 株，高温酵母菌 ( 用h y 表示) l 株。表2 6 是各菌株对有机物降解能力的测定结果。 硕士论文城市粪便高效降解菌的筛选和效果评价 中m 11 3 3 61 5 3 8 温m 21 9 5 82 5 6 4 霉 m 32 0 3 62 7 8 5 菌 m 4 l - 3 3 1 7 l 1 8 7 7 2 4 9 5 3 1 0 3 9 1 9 9 67 6 0 2 1 醴 5 1 6 2 2 5 74 7 1 2 l 2 高效降解菌的初步筛选硕士论文 表2 5 ( 续) t a b l e 2 5 ( c o n t i n u e ) 名编 淀粉明胶 纤维素 称 号d ( m m ) d ( m m )u pd ( m m ) d ( m m ) u pd ( m m ) d ( m m ) u p 口了 去 m 51 4 6 91 8 3 61 5 6 一一一 恤 詈m 6 1 5 9 12 0 9 31 7 37 3 61 5 8 54 “ 注：表中空白部分表示未做，- 表示未测出数据 由于菌落本身形态各有不同、划“十”接种不很均匀且线条不很直等原因，有些成熟 的菌落及其周围形成的透明圈不是规则的圆形，为减少误差，本文采用以下公式得到的 值作为d 、d 。 平均直径( m m ) = ( 横向直径+ 纵向直径) 2 根据水解实验结果，按分解能力的强弱对菌株进行进一步分类，分类结果如表2 7 所示： 硕士论文城市粪便高效降解菌的筛选和效果评价 表2 7 分解能力强弱的进一步分类 t a b l e 2 7f u r t h e rc l a s s i f i c a t i o no fd e c o m p o s i t i o na b i l i t y 分别比较各类微生物对有机物的降解能力的大小，可得出： ( 1 ) 分离出的细菌中有许多株对淀粉及蛋白质都有降解能力，而且高温细菌对纤 维素也有降解能力，如h b l 、h b 2 等，它们对纤维素的降解能力处于高温菌的前两位； b 1 、b 3 、b 5 、b 6 对淀粉的降解能力大于平均值：b 1 、b 3 、b 4 、b 5 、b 6 、b 7 对蛋白 质的降解能力较强，均高于平均值；而b 3 、b 6 则对纤维素的降解能力远高于平均值， 表现了较强的纤维素降解能力。 ( 2 ) 分离的放线菌中a 1 、a 4 对纤维素的降解能力高于同类其他菌株，h a 2 、h a 3 降解纤维素的能力高于平均值，a 1 、a 2 、a 3 降解淀粉的能力处于平均值附近。 ( 3 ) 分离的霉菌中大多数都具有分解纤维素的能力。 2 4 小结 通过对淀粉、蛋白质、纤维素3 种有机物的降解试验和臭度分析试验，共筛选出 1 4 株相对生长较快、分解能力较强且除臭效果较好的菌株，所得菌株如表2 8 所示： 表2 8 初步筛选所得菌株 t a b l e 2 8b a c t e r i a ls t r a i n so f p r e l i m i n a r ys c r e e n i n g 菌种类别 菌株编号 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌 b 1 、b 3 、b 5 、b 6 、h b l 、h b 6 a 2 、a 4 、h a l 、h a 2 m 2 、m 3 y 1 、y 2 3 高效菌筛选与效果评价硕士论文 3 高效菌筛选与效果评价 在上一章，通过分离纯化和初步筛选挑选出1 4 株高效菌株，但是哪些菌剂的效果 较好，可以作为高效菌剂，需要通过进一步实验评价来得到答案。 3 1 单个菌株的降解效果评价 希望快速降解菌的筛选能从以下三个方面进行衡量：物理指标、化学指标和生物指 标。其中物理指标利用臭度来衡量；化学指标利用c o d c r 的去除率和n h 4 + - n 值的变化 来衡量；而生物指标利用植物种子的发芽率来测定。 将此1 4 株菌种分别按5 的接种量接种到粪便液体培养基中，把中温菌和高温菌分 别放入3 0 c 和5 0 温控摇床中进行培养，分别从脱臭效果、c o d c ，去除率、n h 4 + - n 降 解率、植物种子发芽率等方面进行测定。 3 1 1 实验设备与仪器 实验所用主要设备与仪器如表3 1 所示： 表3 1 实验仪器及设备 t a b l e3 1i n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t so f e x p e r i m e n t 设备名称生产厂家 s a r t o r j u s 电子天平 y x q 8 0 4 1 - 2 8 0 电热手提高压蒸汽消毒器 s p x 1 5 0 b 型生化培养箱 8 0 2 电动离心机 q h z d a 全温大容量振荡培养箱 v i s 7 2 2 0 型可见分光光度计 d h g 9 2 4 0 a 型电热恒温鼓风干燥箱 常规玻璃仪器 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海医用核子仪器厂 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 金坛市江南仪器厂 太仓市华美生化仪器厂 北京瑞利分析仪器公司 上海精宏实验设备有限公司 3 1 2 主要实验药品 硫酸( p = 1 8 4g m e ) 、硫酸银、七水合硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、重铬酸钾、硫酸铝 钾、钼酸铵、邻菲罗啉、酒石酸钾钠、氢氧化钾、碘化钾、二氯化汞、氯化铵、磷酸二 氢钾、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、氢氧化钠、硝酸铵、硝酸钾、氯化钠、4 氨基安替 比林、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、琼脂粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、绿豆、黄 豆芽。 硕上论文城市粪便高效降解菌的筛选和效果评价 3 1 3 实验原理与方法 3 1 3 1 臭度的测定 材料与方法同2 2 2 2 3 1 3 2c o d c ，降解率的测定 ( 1 ) 方法：密封快速消解法 ( 2 ) 原理：本法是在重铬酸钾硫酸银硫酸消解体系中加入助催化剂硫酸铝钾与钼酸铵， 同时密封消解过程是在加压高温下进行的，因此大大缩短了消解时间。消解后用滴定法 测定并计算它的c o d c r 值。对不同c o d c ，的废水在消解时应选择不同浓度的重铬酸钾 消解液，如表3 2 所示： 表3 2 不同c o d c , 值所对应的重铬酸钾浓度值 t a b l e 3 2c o n c e n t r a t i o no f k 2 c r 2 0 7a c c o r d i n gt od i f f e r e n tc o d c rv a l u e s c o d c ，值( m e l ) 重铬酸钾浓度( m o l l ) 放线菌 霉菌 酵母菌，细菌 对c o d c ，平均去除率为4 1 2 7 ，其中b 6 的去除效果最好，在第十天时达到4 9 1 ；放 线菌对c o d c ，平均去除率为3 9 8 ，其中a 2 的去除效果最好，为4 2 6 ；霉菌和酵母 菌对c o d c r 平均去除率分别为3 8 8 5 和3 6 6 5 ；各菌株对c o d c ，去除率都在3 0 以 上，最低的y 2 为3 2 8 。 在加入菌株后的前四天，各菌株对c o d c ，的去除