（环境工程专业论文）太湖沉积物中砷对河蚬和苦草的毒性和生物有效性研究.pdf

摘璧 摘要 砷在自然界普遍存在，它可通过新陈代谢作用、以多种形念富集在生物体 中，并通过食物链对人类造成潜在威胁。沉积物砷形态和生物有效性的研究是评 估湖泊环境风险、建立健全沉积物基准的重要依据。本文以江苏太湖沉积物为研 究对象，调查砷在沉积物和底栖动物河蚬体内的分布，并考察d g t ( d i f f u s i v e g r a d i e n ti nt h i nf i l m s ，梯度扩散薄膜) 技术在评价生物有效性方面的可行性，研 究砷污染沉积物在底栖生物河蚬和沉水植物苦草一水环境中的迁移、转化行为和 生物体对砷胁迫的响应，筛选对砷污染沉积物敏感的生物指标，为寻找经济可靠 的预测沉积物砷的生物有效性方法，进一步评价太湖沉积物一水系统的生态风险 提供科学依据。本论文的主要研究结果如下： 1 通过对太湖地区的总砷分布与河蚬不同组织对砷的累积情况比较，表明d g t 法可以作为一种行之有效的预测沉积物生物有效性的方法。太湖湖水中总砷 浓度较低，一般低于o 3 p g l 。太湖1 3 个点的沉积物样品的总砷含量为 5 8 3 - 1 8 8 m g k g 干重，平均值达到1 0 9 m g k g 左右，未发现有极端的高砷污 染区。结果表明，太湖梅梁湾和竺山湾以及西太湖的生物有效态砷含量高于 东太湖、南太湖和湖心地区。砷在河蚬各组织的分布按从d , n 大顺序为斧足 鳃 外套膜 内脏团，推测河蚬是通过摄食行为富集砷元素。 2 将河蚬暴露在砷污染沉积物( 0 、5 、l o 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0m g k g ，以砷计) 1 4 天和2 8 天，研究了砷在河蚬体内的富集和形态变化，以及对抗氧化酶活 性、脂质过氧化和谷胱甘肽含量产生的影响。研究发现，河蚬体内以二甲基 砷酸( d m a ) 和一甲基砷酸( m m a ) 等有机砷形式为主，a s 川仅占总砷的 1 2 。低浓度短期暴露对河蚬的生长产生影响较小，高浓度长时问暴露后河 蚬会受到一定程度的氧化损伤。与其它抗氧化指标相比，g s h g s s g 的比值 对暴露浓度更敏感，可考虑作为检测沉积物中砷对河蚬毒性影响的潜在生物 标志物。 3 苦草在砷污染沉积物静态暴露1 4 天，研究苦草根部和叶部对砷的富集情况， 以及苦草体内s o d 活性、m d a 和叶绿素含量对砷胁迫的响应，并运用电子 顺磁共振自旋技术研究了苦草叶片自由基信号随暴露浓度的变化。研究表 摘璺 明，苦草根部对砷的富集量和暴露浓度之问存在很好的剂量效应关系 ( y = 6 6 6 e o2 6 叙，r 2 = 0 8 9 7 ，y 为富集量，x 为暴露浓度) 。苦草对砷的积累作 用主要体现在根部，根部对砷的富集量最大值可达5 3 6 m g k g ，而叶部对砷 富集量最高值仅为3 8 2 m g k g 。苦草叶部的叶绿素含量和l 自 = l _ i 基信号值对砷 暴露浓度的响应敏感，适合作为苦草对沉积物砷污染的生物检测指标。 4 梯度扩散薄膜( d g t ) 技术可以有效地测定环境中易被生物吸收的砷形态， 认为与化学提取法相比d g t 技术可以更好的反映河蚬对沉积物中有效砷的 富集情况。 关键词：砷氧化应激生物有效性d g t 生物富集 a b s t r a c t a b s t r a c t a r s e n i ci su b i q u i t o u si nt h en a t u r ea n dt h r e a t e n i n gt oh u m a nh e a l t ht h r o u g hf o o d c h a i n ，f o l l o w e db ym e t a b o l i s mt of o r mav a r i e t yo fa r s e n i c a l si no r g a n i s m s t h e s t u d i e so fa ss p e c i e sa n db i o a v a i l a b i l i t yi ns e d i m e n t sw e r es i g n i f i c a n te v i d e n c e sf o r e v a l u a t i n gs e d i m e n te n v i r o n m e n t a lr i s ka n dd e v e l o p i n gs e d i m e n tq u a l i t ys t a n d a r d sf o r a r s e n i c t h i st h e s i s i n v e s t i g a t e d c o n t e n t sa n ds p a c ed i s t r i b u t i o no fa r s e n i ci n s e d i m e n t sa n db i o a c c u m u l a t i o ni na s i a nc l a m s ( c o r b i c u l af l u m i n e a ) f r o ml a k et a i h u t h ef e a s i b i l i t yo fl a b i l ea ss p e c i e sc o n c e n t r a t i o nm e a s u r e db yd g t ( d i f f u s i v e g r a d i e n ti nt h i nf i l m s ) t e c h n i q u ew a sa l s oc o n s i d e r e dt oa s s e s sa v a i l a b l ea si n s e d i m e n t s w eu s e ds p i k i n ga p p r o a c hi ns e d i m e n t sb yt r i v a l e n ta r s e n i ct os t u d yt h e b i o a c c u m u l a t i o na n do x i d a t i v es t r e s si nc o r b i c u l af l u m i n e aa n dv a l l i s n e r i as p i r a l i s i t h em a i na i mo ft h i s s t u d yw a st o r e v e a le a r l y - w a r m i n gb i o m a r k e r sb yb i o l o g i c a l m o d e le x p e r i m e n t su n d e rt h es t r e s so fa si ns e d i m e n t s ，a n dt of i n de c o n o m i c a la n d r e l i a b l et e c h n i q u et op r e d i c tb i o a v a i l a b i l i t yo fa si ns e d i m e n t s ，w h i c ho f f e r ss c i e n t i f i c e v i d e n c e sf o re c o l o g i c a lr i s ka s s e s s m e n to fl a k et a i h u t h em a j o rr e s u l t sw e r e s u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 c o m p a r e dw i t ht o t a la r s e n i ci nl a k et a i h ua n db i o a c c u m u l a t i o ni n d i f f e r e n t t i s s u e so fc l a m s ，d g tw a sc o n s i d e r e dt ob ear e l i a b l ea p p r o a c ht om e a s u r el a b i l e a ss p e c i e si ns e d i m e n ts y s t e m s m o s t l yt o t a la r s e n i ci nw a t e ro fl a k et a i h uw a s u n d e r0 3 “l t h et o t a lc o n t e n t so fa r s e n i ci n13s e d i m e n ts a m p l e sw e r ef r o m 5 8 3t o18 8m 眺gd r yw e i g h t ，w i t ha na v e r a g ec o n c e n t r a t i o no f1 0 9m g k g b i o a v a i l a b i l i t yo fa r s e n i ci nm e i l i a n gb a y , z h u s h a nb a ya n dw e s tl a k ew a s h i g h e rt h a ne a s tl a k e ，s o u t hl a k ea n dc e n t r eo fl a k et a i h u t h eb i o a c c u m u l a t i o n t r e n do fa r s e n i ci nt i s s u e so fc l a mw a sf o o t g i l l 1 0 ) 时，主要以a s 。存在；还原性土壤( e h + p h m m a l l l d m a a s 、 m m a 、 d m a 、 t m a o a s c a s b 8 1 。2 0 1 0 年 j e c f a ( j o i n tf a o w h oe x p e r tc o m m i t t e eo nf o o da d d i t i v e 联合国粮农组织和 世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会) 第7 2 届会议确定了无机砷安全 评价结果，根据食品中有害成分对人体威胁性大小，大部分食品安全标准将采 用无机砷的含量标准，取代了过去以总砷含量评价食品对人类的危害。这也意 味着人们对食品砷标准的安全意识从总量控制上升到以形态区分毒性的阶段。 1 1 3 砷的应用和污染 现代毒理学的研究已然确认砷的致癌性和诱癌性，但是在历史舞台上砷总 是扮演着毒物与良药的双重角色：砒霜因其无色无味，难以在尸体上检验出来 而被选择为杀人工具；但往往也是传统“以毒攻毒”的药物之一，过去人们利 用砷化合物治疗类风湿关节炎、肺结核、皮肤病、梅毒等疾病，常见的一味中 药雄黄的主要成分就是二硫化二砷，现在常用的牛黄解毒片f 9 】中也含有这 种成分，但是用量或用法不当或长期大量服用也会对人体产生急性或慢性的毒 副作用。自从b r a d l e y t l 0 1 发现砷可以诱导细胞凋亡，对治疗急性早幼粒细胞白血 病( a c u t ep r o m y e l o c y t i cl e u c k e m i a ，a p l ) 方面有一定作用后，砷在医药领域的 应用有了进一步发展。 随着工业的发展，砷及砷化合物在农业、畜牧业、电子产品、工业和冶金 等方面得到了更广泛的应用，但同时也造成了环境污染。砷的污染源包括金属 尾矿和采矿废水、金属冶炼废渣、化石燃料燃烧和含砷化学品的使用掣2 ，1 1 1 。长 第一章绪论 期以来含砷化学品( 如除草剂、杀虫剂等) 的使用使大量含砷物质进入环境中， 与此同时到2 0 0 0 年为止，全球砷的累积产量达4 5 3 1 0 4 t ，其中2 0 0 0 年全球砷 的年产量约为5 2 1 0 4 t ，比1 9 0 0 年增加了5 1 倍。 目自仃由砷引起的地下饮用水污染已经成为全球性的环境问题，孟加 旁困、 印度、美国和中国 1 3 】等世界各地都有过饮用水被砷污染的报道，至少2 2 个固家 和地区的人民生活在高砷饮用水造成的阴影下，仅孟加拉国和印度 1 4 ，1 5 两圈就 有近1 亿人口在砷污染地区生活，我国8 个省市区、4 0 个县旗市 i6 都有饮水型 地方性砷中毒的现象存在，其中内蒙和l l i 西是砷中毒重病区，台湾省也有部分 地区的居民受到砷污染的威胁。同时高砷水的灌溉也对大面积的农刚土壤造成 了砷污染威胁，因此世界各国在食品、饮用水、化工产品以及环境等各方而对 砷含量和浓度均有严格的控制。 以往对砷元素的研究多集中在高浓度砷污染对环境和人类造成的危害，但 是低浓度砷对人体和生态环境的长期影响同样不可忽视。2 0 0 4 年美圈e p a 困 家饮用水水质标准 1 7 1 和世界卫生组织( w h o ) 的饮用水水质准则 1 8 】都将 饮用水中砷浓度标准从原来的5 0 1 t g l 降低到1 0 9 9 l ，2 0 0 6 年我困新修订的生 活饮用水卫生标准 1 9 】中也规定饮用水中砷浓度不得高于1 0 9 9 l 。面对低砷环 境的研究r 益迫切，探索低浓度砷对生物和人类可能造成的影响具有重要的研 究意义。 1 1 4 太湖沉积物中砷的污染 太湖是我国五大淡水湖之一，位于长江三角洲南翼的太湖平原，以平均水 位3 0 m ( 吴淞基面) 计算，其水面面积为2 3 8 8 1 k m 2 ，平均水深为1 8 9 m ，最 大水深2 6 m ，是一个典型的浅水湖泊 2 0 1 。太湖具有蓄洪、供水、灌溉、航运、 旅游等功能，其周边主要城市包括苏州市、无锡市、常州市、湖州市等，它为 超过2 0 0 0 万人口提供着用水服务。 在现实生活中，沉积物在人类活动的影响下常常是各种废弃物和污染物的 天然收容和净化处理场所，这样就不可避免地面临着被污染的危险。地球沉积 物中的重金属污染物浓度是长期积累的结果，相对浓度较为稳定。2 0 世纪8 0 年代初无锡市环境保护局和中科院湖泊所【2 1 1 联合对太湖沉积物中重金属的污染 和分布状况进行调查，重点分析了沉积物中汞、砷、铬的含量和富集情况，调 4 硕士学位论文 查结果显示9 9 湖区为清洁和较洼7 f = i j , t 4 i z l 。湖区。最近_ 卜年，众多研究卡；l g j t 2 2 - 2 5 也刈 太湖地区及附近河口表层沉积物的重金属含量进行调查，结果显示太湖北部梅 梁湾、竺l 【j 湾和城市沿岸是重金属的主要污染区，a s 、c d 、c u 、m n 、n i 、f e 、 p b 、z n 等元素逐渐呈现累积上升趋势。 2 0 世纪3 0 年代以i ，j 太湖地区的砷尚低于世界河流沉积物平均砷含量 5 m g k g ，之后便逐渐增加，7 0 年代术期后丌始加剧 2 7 】。随着太湖周边地区化 工企业污染的加剧，太湖沉积物的总砷含量也逐渐增加。2 0 0 2 年3 月向勇等 对全太湖2 0 个点的沉积物监测数据显示太湖沉积物中总砷平均含量已达 1 0 4 8 m g k g ，最高点达到4 0 5 0 m g k g 。2 0 0 4 年3 月太湖全湖2 1 个监测点数据表 明2 9 1 太湖地区沉积物中总砷含量在4 2 3 2 3 o m g k g 之问，均值是1 2 4 3 m g k g 。 2 0 0 5 年陈守莉等【3 0 】对太湖中相对较清洁、污染程度稍轻的西湖、中湖和东湖的 沉积物进行了分析，发现沉积物中总砷的含量为0 5 2 18 8 m g k g ，均值为 l1 4 m g k g 。这些研究报道均反映太湖沉积物的平均砷含量已超过10 m g k g ，如 果不加以控制，太湖地区的砷污染情况势必会更加严峻。 但是以上研究多局限于砷的总量方面，面对同益加剧的太湖砷污染问题， 仅仅对总砷含量方面的调查，已不能对砷在沉积物中的形态、砷元素在生物体 内的迁移变化、对生物的毒性以及生物有效性等方面的进一步研究提供有效数 据。 1 2 砷的测定 1 2 1 含砷样品的前处理和保存方法 砷在环境和生物中形态复杂多变，其样品前处理和保存方法在砷形态分析 中有直接影响。样品从采集、预处理、分离、提取、保存到测定自订，都需要做 好准备工作。 ( 1 ) 水体和沉积物中的砷含量( 总量测定) 如今大部分现代仪器以液态样品的方式进样分析，所以水质样品一般不需 要特别处理而可以直接测定。自然水样中的砷含量一般不高，以无机砷为主， 微生物的代谢和铁锰化物与砷的共沉淀作用是影响水中砷的稳定的主要因素。 但过滤可以消除微生物的影n 1 6 3 ，而p h 小于2 的酸性环境可以防止水体中的 第一章绪论 铁离子与砷络合沉淀【3 2 1 ，因此水样的i ，j 处理和保存方式通常是将水一f l 杂质、悬 浮胶体和微生物过滤后加酸酸化，可以在o 低温避光保存7 天以卜【3 3 】。若| 1 l j 隔时问较短则可过滤后直接测定。 g a r c i a 等人【3 4 】研究了不同温度下烘二f 对土壤和沉积物样品中砷形态分析的 影响，认为样品在室温( 2 0 风干) 、4 0 。c 和1 0 0 烘干都对样品中的总砷含量 没有显著的影响。 自然环境中砷大多以无机形式存在，在还原念的沉积物水系统中无机砷是 主要赋存形态【5 】土壤中常见的有三氧化二：砷、q 1 7 砷酸盐、j 矗氧化一_ - ( i f t l 、砷酸、 砷酸盐等无机砷和少量的一甲基砷、二甲基砷、三甲基砷等有机砷。从价念米 看，主要以三价和五价形式存在【3 5 】。 国内外多用微波辅助提取法、电热板加热消解法和强酸提取( 混合酸一一1 i 水) 法测定土壤或沉积物样品中的总砷含量。微波辅助提取法每次处理样品数 量有限，不适宜大批量样品测定；电热板加热消解需要在高温下进行，常见于 铜铅锌镉镍等多金属元素共测，但高温易使砷化物伴随溶剂蒸发造成损失；强 酸提取法的适用广泛，操作的危险性低于电热板加热消解法。这= 冲f 一方法都会 使样品中的砷化物发生氧化还原反应改变砷的形态，因此仅适i t jx , ：t i l p f l , j 总量评 估【3 6 】。本研究【3 7 1 选择我国农业部颁布的土壤砷元素测定自订处理方法中规定的l ：l 王水水浴浸提法为沉积物样本中总砷测定的自订处理手段。 ( 2 ) 生物样品中的砷含量( 总砷和形念测定) 生物样品中砷形态测定的前处理主要包括样品收集、预处理、提纯、净化、 浓缩、过滤等，其中关键操作是提纯和净化阶段。在这两个操作中，应当尽可 能减少提取剂的使用量、缩短分离和提取时问、降低外界环境干扰并能有效提 取生物样品中不同砷形态而不相互干扰，得到纯净的样品后引入分离检测系统 进行分析测定。常用的有水浴加热提取、超声提取、溶剂提取、微波辅助提取 等；常见的提取齐1 j 3 8 , 3 9 】有水、弱无机酸、甲醇、乙酸、氯仿以及不同比例的混 合液。 我国国标g b t5 0 0 9 1 1 - 2 0 0 3 1 4 0 】中提供了食品中总砷的自仃处理方法湿 消解法( 硝酸、硫酸、高氯酸) 和干灰化( 5 5 0 ，4 h ) 法，这两种方法各有优 劣：湿消解法操作简便，重复性好，但高温下砷易挥发损失，低温则提取不完 6 硕士学位论文 全；干狄化法是将经硝酸镁溶液浸泡、烘二f i 后的样品，在小火碳化阶段覆盖 m g o ，与样品中的砷化物充分反应生成不挥发的焦砷酸镁( m 9 2 a s 2 0 7 ) 【4 ，避 免样品中砷在高温下的挥发损失。但干灰化法操作步骤复杂，干扰因素较多， 不适宜大批量低砷样品的处理。 1 2 2 砷形态的仪器分析方法进展 元素的形念是指某种元素在样品中的不同物理一化学形态，包括该元素在样 品中的物理状态( 如溶解态、胶体和颗粒态等) 和化学形态( 如元素价念、衍 生物形态、聚合物及其结构等) ，元素形态决定了其在地球环境和生命过程中不 同的行为表现。越来越多的研究发现不同的元素形念对该元素在环境和生物中 的迁移转化、毒性效应、生物利用性等方面至关重要4 2 1 ，传统的元素总量或浓 度分析已远远不能满足科学界在化学、环境化学和生命科学中的研究需要，人 们迫切需要进一步探索元素在实际样品中的赋存形念和结构，以及与生物活性、 毒理效应、环境化学作用等方面的关系4 3 1 。 根据国际纯粹化学和应用化学联合会( i u p a c ) 的定义，元素形态分析是 指定性和定量的测定样品中一个或多个化学形态的过程。现代分析技术利用气 液相色谱和毛细管电泳等高效分离技术与原子光谱、质谱、等高灵敏度检测仪 联用手段为多种元素分析构建了良好的技术平台，可以快速、精确的获得大量 元素形态分析数据，可以单样品多元素形态测定，为现代元素形态分析的发展 和应用提供硬件设施。 1 2 2 1 氢化物发生原子荧光光谱法( h g a f s ) 氢化物发生原子荧光光谱仪( h g a f s ) 的原理是硼氢化钾与酸反应可以生 成大量新生态氢删，通过新生态氢将样品溶液中的三价砷还原为气念的砷化氢。 砷化氢气体经氩气载气带入石英管，导入原子化器后被氩氢焰原子化，受热分 解为原子态砷。砷空心阴极灯发射光可以激发砷原子外的电子跃迁到较高能量 级，在回到较低能级时辐射原子荧光。在一定浓度范围内，荧光强度与原子浓 度( 即待测溶液中砷浓度) 成f 比。其反应机理见方程式( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) 。 k b h 4 + h + + 3 h 2 0 h 2 8 0 3 + k + + 8 h( 1 ) a s 0 3 + 6 h + 3 h + - + a s h 3 + 3 h 2 0( 2 ) 7 第一章绪论 2a s 0 3 土- - - + 2 a s + 3h 2 ( 3 ) 氢化物发生原子荧光光谱法是我国自主研发的一项技术，可以同时旦j i 分别 测定液体样品中的痕量砷、汞、硒等元素，是一种常用的砷形态分析方法，刈 d m a 、m m a 、a s 、a s 、的检测限最低可以达到p g l 级。氢化物发牛原于荧光 光谱技术具有基体干扰小、线性范围宽、检出限较低、重复性好的优点，在医 药、地质、环境、食品、饮用水检测等方面广泛应用【3 6 】。目自，j 原子荧光仪已成 为实验室常规分析仪器之一，并以此为基础建立了砷检测方法的国家标准及 些部标、行标和地方标准。 1 2 2 2 石墨炉原子吸收光谱法( g f a a s ) 原子吸收光谱分析仪( a t o m i ca b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y , a a s ) 的原理是通过 原子化器将待测元素在高温或化学反应下变成原子蒸汽，由光源灯辐射出待测 元素的特征光，在通过待测元素的原子蒸汽时发生光谱吸收。根据透射光的强 度与待测元素浓度成反比，在仪器光路系统中，透射光的信号经光栅分光并将 待测元素的吸收线与其他谱线分丌。经过光电转换器后，将光信号转换成电信 号f 4 5 1 。经过与原子吸收仪相连的计算仪分析计算后得到待测样品中被测元素的 含量和浓度。 原子吸收光谱分析仪由光源、原子化器、光路系统、电路系统和计算系统 组成【4 4 1 。其中原子化器是决定样品检测的元素种类和精度的关键部件，有火焰 和石墨炉两种。目前使用较广泛的是火焰原子化器，由雾化器和燃烧头组成。 而使用石墨炉原子化器的样品测定要经过干燥狄化原子化净化四个步骤：( 1 ) 干燥是将溶液烘干，去除溶剂；( 2 ) 狄化是去除样品中的有机物，减少基体组 分带来的干扰；( 3 ) 原子化阶段记录被测元素在原子化温度下的吸光度；( 4 ) 净化是在原子化完成后再升温，目的是清除石墨管内的残渣，便于下一个样品 的检测。石墨炉原子化器的原子化效率高，分析样品量少，仪器灵敏精密度高， 在测定痕量a s 、c d 、c u 、f e 、l i 、m n 、p b 、s r 等元素的样品方面有比较成熟 的应用。 近年来，石墨炉原子吸收光谱法在地质、环境、医药等领域有了广阔的发 展。根据文献 4 6 - 4 8 1 报道，石墨炉法已被广泛应用于动物胶、软体动物、鱼类和 硕士学位论文 贝类样品中痕量砷元素的测定，对a s 的检测限最低可以达到6 n g l ，测量准确 而重复性好，认为町以作为动植物样本c - 微量，营, f i t t t 的常规分析。 自然环境和生物样品中的砷浓度一般很低，在0 0 1 1 0 0 u g l 之i h j ，常用的 火焰原子吸收法或分光光度法以及其他常规分析检测仪器，使低浓度的含砷样 品检测变得极为困难，但石墨炉原子吸收法的检出限很低，液体样品在稀释一一 定倍数后便可以直接测定。 1 2 2 3 高效液相色谱法与电感耦合等离子体质谱仪联用技术 ( h p l c i c p m s ) 1 9 8 0 年h i r s c h f e l d 4 9 1 提出联用技术之后，联用技术在医药、生命、环境、 地质、材料化学等各学科得到迅猛发展。砷元素的形态分析也可以通过各种联 用技术实现。 高效液相色谱分离技术与电感耦合等离子体质谱联用技术是根据高效液相 色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) 对元素形态分离时的保 留时问差异反映待测元素的不同形态，用电感耦合等离子体质谱仪( i n d u c t i v e l y c o u p l e dp l a s m am a s ss p e c t r o m e t r y ，i c p - m s ) 为检测手段，跟踪石辟i 元素在分离过 程中的形态变化，并可在标准物质的控制下对样品中砷化合物定性和定量分析。 h p l c i c p - m s 具有灵敏度高、检出限低、检出t i 寸f h j 短、分析线性广、可靠性好 的特点【5 0 5 ，被广泛应用于各种样品中的砷形态分析中。对自然水体、土壤、 动植物、农作物、水产品和食品中的a s 川、a s 、m m a 、d m a 、a s b 、a s c 、 t m a o 、t m a 等砷化合物定性定量检测，成为近几年联用技术中发展应用最广 最完善的技术之一。 1 2 2 4 其他常用分离和检测技术 大量现代分析技术的推陈出新促进了近三十年来砷元素形态分析的飞速发 展，在各个领域取得了令人瞩目的成就。h u a n g 5 2 1 等人对超累积植物大叶井1 ：3 边草中砷含量和形态在植物体内迁移转化实验中，采用同步辐射x 射线吸收精 细结构( s r e x a f s ) 技术对根部和羽叶进行分析，发现根部存在与谷胱甘肽 第一章绪论 结合的砷，在分子结构上取得一定突破。 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 是基于分子质荷比的差异使分 析物分离，是具有高效的分离能力的技术，可以分离a s b 、a s c 、d m a 、m m a 、 a s “、a s 、等。c a m p i l l o 等人【5 3 】采用毛细管气相色谱与原子发射光潜( g c a e s ) 联用技术对海水、酒类和固体婴儿食品中d m a 、m m a 和无机砷进行了测定。 采用环己烷对样品萃取提纯，将含有毓基乙酸甲酯( t g m ) 衍生物的样品溶液 注射进气相色谱仪中进行测定。液体样品中d m a 、m m a 和无机砷的检出限分 别是o 0 5 、o 1 5 和o 8 n g l ：固体婴儿食品中的检出限分别是l 、l o 和2 5 m g k g 。 生物体内大部分痕量余属有机物尚未发现或命名，在没有标准的情况下一 些常规方法往往无法进行，近几年新兴的分子质谱检测技术一一电喷雾质谱 e s m s 5 4 1 可以鉴别和表征一些未知化合物的结构信息。 实际生物样品中的不同形态的砷含量通常很低，其形态测定方面还有很多 问题【5 5 】亟待解决： ( 1 ) 在样品d 仃处理和贮存过程中，无可避免的造成含研l 物质损失； ( 2 ) 样品中砷形态不稳定性，生物的新陈代谢使砷形态始终处于动念变化 的过程，外界环境因子的改变也会影响样品的砷形态： ( 3 ) 样品体内的含砷化合物种类繁多，由于仪器灵敏度和分离提取技术等 的限制，无法完全测出； ( 4 ) 尚有未鉴定的含砷化合物存在，生物代谢砷循环模型还需进一+ 步研究。 除此之外，不同的分离和检测技术对砷形态和化合物的表征影响很大，是否有 标准物质的参与鉴定和未知砷化合物的干扰分析也是关系到测定结果的关键因 素。 1 2 3 沉积物砷的生物有效性研究 重金属的生物有效性指外界重金属进入生物体内并被吸收的剂量，由摄取、 吸附、累积等过程决定。砷是一种原生质毒物类非金属元素，具有广泛的生物 效应。由于砷化合物的种类繁多，有机砷与无机砷之问的迁移转化复杂多变， 对预测砷对环境和生物毒性形成很多障碍。过量砷尤其是高含量高浓度无机砷 对环境的毒性危害很大，因此砷元素的生物有效性研究尤为迫切。 硕士学位论文 1 2 3 1 生物监测法 人类与自然界中的各种，物息息相关，生物与环境相互作用，是密不可分 的的统一1 整体，从古至今利用环境中生物生理变异和f 常活动的改变预测环境 变化并趋吉避凶的事例屡见不鲜。1 9 3 0 年科学家【5 6 叶f 式提出了实验室牛物模拟 町以预测复杂的坏境对人类健康和坏境风险影响，此后各种自然环境或实验室 模拟条件下的生物实验和生物物种研究方兴未艾。 联合国环境规划署( u n i t e dn a t i o n se n v i r o n m e n tp r o g r a m m e ，u n e p ) 将“生 物监测”定义为活体生物对环境压力的灵敏度，环境学中重金属污染研究方面 的生物监测( b i o l o g i c a lm o n i t o r i n g ) 是指利用生物对痕量金属和其他物质在体 内的富集能力，预测在特定坏境中污染物的生物可利用性的大小【57 1 ，具有一般 理化监测分析难以取代的特性。成为生物监测物的必要特点首先是在环境浓度 范围内生物的肉质部可以富集污染物而不会出现死亡，在环境中该生物长期存 在并具有一定代表性。除此之外，生物体还应当便于保存和测定，具有普遍适 用的意义。这些可以用于生物监测的生物被称为“生物监测物”，利用生物监 测物富集、浓缩的生理特性，可以连续、选择的i 吸收所处环境中的一些物质， 便于测定该环境中这些物质的生物可利用浓度。 沉积物水系统虽然是一个不断变化的环境，但也是在一定条件下可以达到 动念平衡的特殊系统。水生生物都在某种程度上积累周围的重金属元素，不同 种类的生物对不同元素有定差别。自从1 9 7 7 年，p h i l l i p s 5 8 】发现一些大型藻 和双壳贝类的软体动物可以用于包括河口和海洋等水生环境中痕量金属的生物 监测之后，各国研究人员对此展丌了大量研究。1 9 9 4 年到2 0 0 1 年问，亚太地 区1 2 个国家的研究机构联合对沿海水域贝类的有机氯( o c s ) 污染情况进行了 调查 5 9 1 ，分析可能的污染源分布以及对人类和水生生物的潜在威胁。从2 0 0 1 年到2 0 0 7 年，韩国应用m u s s e lw a t c h 项目 6 0 】对沿海海域的有机物污染情况进 行了连续跟踪调查，调查表明韩国沿海海域的污染情况正在逐渐好转。近年来 世界各地【6 1 】通过“贝类预警”技术对海洋和淡水生态环境系统中的污染物追踪监 测，并对评价生态的危害项目取得了一些成效。 双壳类底栖生物( 牡蛎、贻贝、蚌类等) 是研究海洋和河流湖泊沉积物重 金属污染良好实验对象，具有监测生物的基本属性：分布广泛、种群密度大、 第一章绪论 寿命较长、固着少动、底栖生活，对水环境中的重金属积累是净累积型，从体 内排出有一定长时问的生物学半衰期【6 2 】。因此双壳类底栖生物是临测海洋和淡 水环境重金属污染的重要手段。通过测定半致死率、生理! l 化变化( 如闭壳反 应、呼吸、排氨率等) 、个体和器官组织的重金属残留、生化指标( 酶活性变化) 、 d n a 损伤等方法监测污染物对沉积物和水体环境污染情况。 用于水体重会属污染的指示生物还有各种鱼类、两栖动物、水生植物、水 生藻类、浮游动物群落和微生物种群等。 1 2 3 2 化学提取法 不同元素的生物有效性与该元素在环境中的形态密切相关，但是单纯测定 介质中的某一元素或某种物质的总浓度无法说明在此介质中的有害物质对环境 和生物的毒性大小，何况不同矿物形态相结合的砷的生物有效性也不相同 6 3 1 。 对沉积物中砷形态的研究方法有x 射线吸收光谱技术( x a s ) 、x 射线衍射技 术( x r d ) 、砷形态分析仪和化学连续提取法等。其中化学提取法操作简瞥，重 复性好，仪器设备要求低，灵敏度高，适用广泛等优点得到普遍应用。 1 9 7 9 年，t e s s i e r 6 4 1 首先提出了五步化学连续提取法，用于分离不同结合念 的霍金属，便于分析研究土壤中重金属的形态，随后多种研究相继丌展。各国 研究人员针对不同重金属和土壤条件对t e s s i e r 方法有所改进，由于实验条件不 同，而且不同理化性质的土壤或沉积物的性能不同等因素，所得结果差异较大， 难以统一。因此为了规范提取条件和方法，欧共同标准物质局( e u r o p e a n c o m m u n i t i e sb u r e a uo f r e f e r e n c e ) 提出了三步提取法( b c r 法) 【65 1 。该法可提 取的重会属形态包括可交换及碳酸盐结合态( 酸溶态) 、f e m n 氧化物结合态( 可 还原态) 、有机物及硫化物结合态( 可氧化态) 及残渣态。b c r 三步提取法因 简单易行，稳定性及重现性好，提取精度较高，不同研究结果可比性很好得到 广泛应用 6 6 - 6 8 】，目前对土壤和沉积物的重金属形态分析多采用b c r 法。 分步提取法可以将不同结合态的砷分离出来，在一定程度上反映土壤和沉 积物中砷的潜在生物有效性和迁移转化能力f 6 9 。7 1 1 。但砷是一种特殊的类金属， 常用的t e s s i e r 法和b c r 法主要适用于金属阳离子，无法很好的说明砷在土壤 或沉积物中的赋存状态。国内外学者 3 , 7 2 - 7 5 1 通过各种化学提取手段对土壤或沉积 物中的砷形态进行了研究并各自取得一定成果，但目前尚无统一规范的砷形态 硕士学位论文 提取方法。不川的提取剂和提取方式得到的沉积物中不同结合念的砷含量也有 所差异，而且些强提取剂可能会将部分非生物可利用的砷形念提取出来，很 难真实的反映环境中的生物对砷元素的吸收和富集状况。因此分步提取法是将 土壤沉积物系统中某元素与矿物的结合态从化学形态上的分离，对元素形态和 迁移转化有很强的现实意义，但对该元素对环境中的生物有效性方面还难以解 释。 1 2 3 3薄膜梯度扩散技术( d g t ) d g t ( d i f f u s i v eg r a d i e n t si nt h i n f i l m s ) 膜技术是w i l l i a md a v i s o n 和张吴在 1 9 9 4 年共同研发的新技术【7 6 1 ，当时首先用于原位测量水环境中重金属的有效形 态，在后续研究中，该技术广泛应用于实验室条件和自然条件下的土壤、沉积 物和水环境中，对a g 、a 1 、a s 、a u 、c d 、c o 、c r 、c u 、f e 、m n 、n i 、p b 、 z n 、p 等金属和非金属离子在环境中的有效念进行测定。 d g t 装置的核心是滤膜、扩散膜和吸附膜7 们。其中过滤膜主要是保护外界 对凝胶层的机械损伤和生物污染，同时阻隔外界颗粒物进入d g t 装置；扩散膜 使水或孑l 隙水中溶解念( 自由态或小分子络合念) 离子扩散，控制基质中待测 离子到吸附膜的扩散通量：当离子到达起固定作用的凝胶吸附层后迅速被固定， 使扩散膜与吸附膜界面的离子有效浓度降为零。这样就在吸附膜中形成了一个 浓度梯度，在一定的放置时i n j 内可以源源不断的吸附环境中的待测元素。 扩散膜的材料和工艺决定了离子能否在扩散膜中稳定扩散，目前扩散膜主 要由聚丙烯酰胺和琼脂衍生的复合物制成，含水率9 5 左右，对分子量低于1 0 5 的离子阻力很小77 1 。吸附膜的材料因实验目的不同而异，可以选择性吸附待测 离子。一般重金属离子常用c l e l e x 一1 0 0 树脂凝胶，而f e o 聚丙烯酰胺凝胶，则 用于测定a s 和p 。 根据f i c k 扩散第一定律，特定时问内穿过一定厚度的扩散膜的某一离子进 行定量化测定，通过计算可以得到该离子的准确浓度。 ，：d 丝( 1 ) “a x 在一段时间内d g t 测得沉积物土壤溶液中待测元素的平均浓度c d g t 可以 通过公式( 2 ) 换算得到： 第一章绪论 c ：(2)oc , , r m ，a g da t 、。 式中：m d g t 吸附膜固定的离子总量，n g ； a d g t 装置的丌口面积，c m 2 ； 卜扩散膜和滤膜的厚度，c m ； t _ d g t 装置的放置时f n ，s ； d 。r 待测离子在扩散膜中的扩散系数，c m 2 s ； 其中d d 与元素种类和实验温度有关。 d g t 装置紧密闭合的塑料外壳和小巧的体积几乎适合于安置在任何条件 下的土壤、河段、河口、湖泊甚至于污染物排放口进行原位测量。经过滤层后 的小分子金属离子通过扩散膜的扩散作用到达吸附膜，在吸附膜达到饱和之自订 不断固定富集金属离子，d g t 对重金属的生物可利用性的预测能力好于以往传 统的化学提取法。d g t 装置在土壤沉积物一水溶液界面形成稳定连续的浓度梯 度，并在一段时问内不断向装置中的富集膜传递并固定相应的元素。这个动力 学过程很好的模拟了动物进食【7 9 , 8 0 】，尤其是植物根部从外界吸收养分的动态过 程。无论实验室还是野外实验，许多研究结果也证实了d g t 技术在研究重会属 在环境中的生物可利用性方面有相当的优势，而且几乎不受土壤基本性质的影 耐8 。p a n t h e r 等人【8 2 1 用d g t 技术对新西兰的天然井水和河水中溶解态总无机 砷( a s 、a s 、) 进行研究，并讨论了水样中p h 值、阴离子、阳离子、铁氧化 物胶体、富罩酸等因子对测定值的影响。结果表明d g t 技术是预测水样中总溶 解态无机砷的可靠手段。 1 2 3 4 其他评价方法 其他的生物有效性测定评价方法还包括模拟肠胃液提取法、植物指示法、 土壤动物与微生物测定法等。这些方法操作复杂，人为误差大，不确定因子多， 因此应用受到一定限制。 长期以来，生物富集因子( b a f s ) 是众多学者常用的评价某种元素对湖泊 和海洋生物的影响模型。瑞典学者l a rh a l ( a n s o n 【8 3 】从元素丰度原则和元素释放 度方面提出了沉积物评价方法对重金属污染的潜在生态危害进行评价。我国研 究学者利用该方法评价了河流和太湖湖泊沉积物中a s 、c d 、c r 、c u 、h g 、p b 1 4 硕士学位论文 等金属的潜在生念j 风险 s 4 , s s 。 沉积物中7 l ! 物有效性的研究方法很多，各有优劣，目i 仃热点问题多集中在 如何建立经济实用的砷形念分析与生物有效性的相关模型，可以便捷全面地反 映砷在实际环境中的毒性和l 生物有效性，为研究污染物对环境的潜在威胁和释 放风险提供理论依扔：。 1 3 砷对生物的毒性效应 1 3 1 砷的致毒和解毒机制 砷及其化合物已被世界卫生组织下属的国际癌症研究机构确认为强致癌 物。多国研究人员发现饮用水中的砷可以诱发包括皮肤癌、膀胱癌、肺癌、肾 癌以及肝癌等多种癌症并引起循环系统和神经系统紊乱，除此之外空气中的砷 和通过食物i 吸收的砷也对人类健康造成很大威胁。目自矿砷的致癌机制理论研究 很多，主要有如下几种：染色体畸形、氧化损伤、改变d n a 自我修复功能、 改变d n a 甲基化进程、影响生长因子、细胞增殖、基因增殖、抑制p 5 3 ( 肿瘤 蛋白) 等，但是对研i 的致癌途径和机理尚未完全明确。 五价砷化合物必须先转化为三价砷，爿能够在生物酶的作用下进行甲基 化。无论体外实验还是利用提纯的砷甲基转移酶进行的实验室实验，都表明三 价砷( i a s 、m a s ) 比五价砷( i a s 、m a s 、) 更容易甲基化。湖泊环境中， 砷的毒性和生物可利用态主要取决与其化学赋存形态。水生植物或微生物可以 将自然界中的砷酸盐甲基化或降解为亚砷酸盐，再将亚砷酸盐转化为生物易排 泄的m m a 和d m a 。这个过程也就是砷在植物中的解毒机制。但最近研究发现 无机砷的甲基化代谢产物，m m a 川和d m a “l 也会对生物活性产生致毒效应。 s t y b l o l 8 7 1 发现三价砷的甲基化中间代谢产物m m a “1 的细胞毒性和基因毒性比原 来的无机砷更强，而d m a “的毒性也不亚于无机砷，这些代谢产物与蛋白质中的 半胱氨酸巯基亲合力更强，会导致某些活性蛋白失澍8 8 】。因此生物体内的甲基 化代谢非但无法保护生物细胞反而会产生毒性，这对传统认为无机砷的甲基化 是砷的主要解毒途径理论产生质疑，推断砷代谢物同样与蛋白质或d n a 相互 影响，产生致毒效应。 许多人体和动物实验已经证实：砷进入生物体后引起染色体畸形和断裂( 包 第一章绪论 括细胞微核和姐妹染色体发生交互) 是砷的致癌g l s 翟。砷可以取代细胞的微