（环境工程专业论文）优选高性能的好氧反硝化菌株.pdf

北京工商大学硕士学位论文 摘要 本论文在实验室己驯化成熟的好氧反硝化污泥系统基础上，采用n 0 3 - 作为 惟一氮源，进行好氧反硝化菌的筛选，证实好氧反硝化菌的主导地位；研究确定 菌株反硝化性能和脱氮性能的手段；设计正交实验优选环境适应性强的高性能的 好氧反硝化菌株；从微生物学角度达到脱氮产物n 2 0 的控逸，构建低n 2 0 逸出 量高反硝化性能的菌系。 本实验利用b t b 培养基，从实验室两个不同的反应器a 和b 中共分离筛选 得到2 0 株b t b 平板反应阳性菌，除1 株为革兰氏阳性、球菌外，其余1 9 株均 为革兰氏阴性、杆菌。复筛得到1 8 株具有好氧反硝化能力的菌株，其中1 2 株菌 4d 后n 0 3 - - n 的去除率达到5 0 以上，9 株菌4d 后t i n 的去除率达到5 0 以上。 设计正交实验l 9 ( 3 4 ) ，挑选反应器a 筛选的5 株菌和反应器b 筛选的3 株菌 共8 株菌进行反硝化性能的条件优选，优选后w x z 9 ，1 3 ，1 5 ，1 9 四株菌，其 n 0 3 - - n 去除率能达到1 0 0 ；w x z 8 ，9 的t i n 去除率高达7 0 8 0 ；w x z 9 ， 1 5 ，1 9 的n 0 3 - - n 去除速度大于文献m i c r o v i r g u l aa e r o d e n i t r i f i c a n s 的最大n 0 3 - - n 去除速度1 0 8 m g n 0 3 - - n l - i d ，分别为1 5 9 0 ，1 7 2 4 和1 1 4 5 m g n 0 3 - n l - t d 1 。 分别以n 0 3 - - n 去除率和t i n 去除率为指标时，各菌株最主要的影响因素均是 c o d n ，其次才是n 0 3 - - n 浓度、d o 和p h 。 挑选w x z - 9 ，w x z - 1 5 和w x z 1 9 三株菌，均分离自a 反应器，研究测定 其脱氮产物n 2 0 的产生量。三株菌的n 0 3 - - n 比去除速度分别为0 7 6 ，1 2 0 和0 8 9 m g n 0 3 - - n m g 生物量- 1 d ，均大于文献报道值，其中菌株w x z 一1 5 的最大n 0 3 - - n 比去除速度最大，达到m i c r o v i r g u l aa e r o d e n i t r i f i c a n s 文献值的2 4 倍。本实验优 选的三株菌的n 2 0 n 产生量均小于文献值，即使三株菌中n 2 0 n 产生量相对较 大的菌株w x z 1 5 ，其产生的n 2 0 n 总量占n 0 3 - - n 去除总量的比例，也只有文 献报道值相对较小的p s e u d o m o n a ss t u t z e r iz o b e l l 的七分之一。 实验最终优选得到三株脱氮高效且产生低水平量n 2 0 的优质好氧反硝化菌 w x z - 9 ，w x z 一1 5 和w x z 一1 9 。同组其他研究得到w x z - 9 和w x z 1 5 两株菌为 d e l f l i a ，w x z 1 9 为p s e u d o m o n a s 。d e l f l i a 为迄今尚未见报道的具有好氧反硝化 性能的菌属，而本实验中优选得到的d e l p i aw x z 一9 和d e l f l i aw x z 1 5 两株菌， 对环境适应性很强，其在c o d n 为6 1 0 ，n 0 3 - n 初始浓度为5 0 2 0 0 m g l ， 优选高性能的好氧反硝化菌株 p h 6 5 - 7 5 ，d 0 1 8 - 5 6m # l ( 相当于3 0 。c t2 4 7 4 饱和溶解氧) 这些实际工艺 很容易达到的条件下，均能在4d 内甚至更短的时间内，1 0 0 地去除n 0 3 一一n ， 而d e l f t i aw x z 9 和d e l f t i aw x z - 1 5 为两株极具研究潜力的新的优质好氧反硝 化菌。 关键词：好氧反硝化菌；反硝化性能；优选；影响因素；n ：o i i 北京工商大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ef o r m e re x p e r i m e n t sh a v ea c c o m p l i s h e dt h ea c c l i m a t i o no fa e r o t o l e r a n t n i t r o g e nr e m o v a ls l u d g e ，f r o mw h i c hw ei s o l a t e da e r o b i cd e n i t r i f i e r su s i n gn i t r a t ea s s u b s t r a t ct oc o n f i r mt h ed o m i n a n ts t a t u so fa e r o b i cd e n i t r i f i e r s s t u d ym e t h o d so f m e a s u r i n gd e n i t r i f y i n ga b i l i t yo fa e r o b i cd e n i t r i f i e r s o r t h o g o n a le x p e r i m e n t sw e r e a d o p t e dt oo p t i m i z ec o n d i t i o n st os e l e c th i g he f f i c i e n c ya e r o b i cd e n i t r i f i e r s c o n t r o l t h ep r o d u c t i o no fn i t r o u so x i d eo fa e r o b i cd e n i t r i f i e r sb a s e do nm i c r o b i o l o g y s e l e c t l o wl e v e ln i t r o u so x i d ep r o d u c t i o na n dh i g he f f i c i e n ta e r o b i cd e n i t r i f i e r st oc o n d u c t a e r o b i cd e n i t r i f i e r ss y s t e m b yb t bm e d i u m ，t w e n t yb a c t e r i aw e r ep r e l i m i n a r yi s o l a t e df r o mt w od i f f e r e n t r e a c t o r saa n db n i n e t e e no ft h e s et w e n t yb a c t e r i aw e r eg r a m - p o s i t i v eb a c i l l u sa n d o n l yo n ew a sg r a m - n e g a t i v ec o c c u s a m o n gt h e s et w e n t yb a c t e r i a , e i g h t e e nb a c t e r i a w e r ea e r o b i cd e n i t r i f i e r sb y0 e n i t r i f y i n ga c t i v i t yd e t e r m i n a t i o n t h en i t r a t er e m o v a l e f f i c i e n c yo ft w e l v eb a c t e r i ao ft h e mw a s m o r et h a n5 0 ，a n dt i nr e m o v a le f f i c i e n c y o f n i n eb a c t e r i aw a sm o r et h a n5 0 o r t h o g o n a le x p e r i m e n t sb ( 3 4 ) w e r ea d o p t e dt oe v a l u a t et h ed e n i t r i f y i n ga b i l i t y o fe i g h ts e l e c t e da e r o b i cd e n i t r i f i e r s ，f i v es t r a i n sf r o mr e a c t o raa n dt h eo t h e rt h r e e f r o mr e a t o rb t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h en i t r a t er e m o v a le f f i c i e n c yo fw x z - 9 , 1 3 ， 1 5 ，1 9a l lr e a c h e d1 0 0 ，a n dt i nr e m o v le f f i c i e n c yo fw x z - 8 , 9r e a c h e d7 0 - 8 0 t h em a x i m u mn i t r a t er e d u c t i o nr a t eo ft h r e eb a c t e r i a , w x 7 _ 9 , 1 5 ，1 9w e r e1 5 9 o 1 7 2 4 和1 1 4 5m g n 0 3 一- n l q d - 1 。w h i c hw e r ea l lh i g h e rt h a nt h ed a t ao f m i c r o v i r g u l a a e r o d e n i t r i f i c a n s ，1 0 8m g n 0 3 - - n l - l d - 1 c o d nr a t i ow a st h eu p p e r m o s te f f e c t i n g f a c t o r so fa l lb a c t e r i a ，a n dt h e nw e r ed o ，n i t r a t ec o n c e n t r a t i o na n dp h w ed e t e r m i n e dt h ey i e l do fn 2 0o fw x z - 9 , 1 5a n d l 9 t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h em a x i m u ms p e c i f i cn i t r a t er e m o v a lr a t eo ft h e s et h r e eb a c t e r i aw e r c0 7 6 , 1 2 0 和 0 8 9m g n 0 3 - n m g b i o m a s s 1 d 一，r e s p e c t i v e l y , w h i c hw e r ea l lh i g h e rt h a nt h er e p o r t e d d a t a t h ed a t ao fs t r a i nw x z - 1 5w a sh i g h e s tw h i c hw a s2 4t i m e sh i g h e rt h a nt h e r e p o r t e dd a t ao fm i c r o v i r g u l aa e r o d e n i t r i f i c a n s b u tt h ey i e l do fn 2 0 o ft h r e es t r a i n s w e r ea l ll o w e rt h a nt h er e p o r t e dd a t a e v e ni fw x z 一1 5 t h ey i e l do fn 2 0o fw h i c h m 优选高性能的好氧反硝化菌株 s t r a i nw a sc o m p a r a t i v e l yh i g h e r , t h ep r o p o r t i o no ft h ey i e l do fn 2 0t ol o t a ln i t r a t e r e m o v a la m o u n t sw a so n l yo n e s e v e n t ho ft h ec o m p a r a t i v e l yl o w e rr e p o r t e dd a t ao f p s e u d o m o n a ss t u t z e r iz o b e l l f i n a l l y , w es e l e c t e dt h r e eh i g h e f f i c i e n c ya e r o b i cd e n i t r i f i e r sw h i c hp r o d u c e d l o w e rl e v e lm e 0 ，w x 7 _ , - 9 ，w x 7 1 5a n dw x 7 _ , - 1 9 s t u d yo ft h es a m et e a mf o u n dt h a t s t r a i n sw x z - 9a n dw x z - 1 5w e r em e m b e r so fd e l f t i a ，t h eo t h e rw x z - 1 9o f p s e u d o m o n a s t h e r ew e ms t i l ln or e p o r t sa b o u td e l f t i a 勰a e r o b i cd e n i t r i f y i n gg e n e r a h o w e v e r , s e l e c t e ds t r a i n sw x 7 _ ，9a n dw x z - 1 5o ft h i ss t u d ys h o w e ds t r o n g e n v i r o n m e n t a la d a p t a b i l i t y 鹤a e r o b i cd e n i t d f i e r s u n d e rc o n d i t i o n so fc o d n6 1 0 n o f - nc o n c e n t r a t i o n5 0 - 2 0 0m e , a - , p h6 5 0 5a n dd 0 1 8 巧6m g 化w h i c hw e r e g e n e r a lt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n s ，s t r a i n sw x z - 9a n dw x z - 1 5c a nr e m o v en 0 3 - - n c o m p l e t e l yi n4e v e ns h o r t e rd a y s s od 印砌w x z - 9a n dd e l f t i aw x z - 1 5a r et w o n e wh i g hq u a l i t ya e r o b i cd e n i t r i f i e r sw h i c hh a v eg r e a ts t u d yp o t e n t i a l k e y w o r d s ：a e r o b i cd e n i t r i f i e r s ；d e n i t r i f y i n ga c t i v i t y ；o p t i m a l ；e f f e c t i n g f a c t o r s ；n 2 0 i v 北京工商大学学位论文原创性声明 本人郑霪声明：所呈交的学位论文是本入在导筛指导下进行豹研究工作所 取毒孽瓣磅究残暴。涂了文中麓经注鞠弓| 耀熬瘫容癸，论文孛不包含冀缝个久袋 集体融经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本声明的法律后果完全由本人承担。 学位论文捧者签名：塑量港麓：饷舜年毒胃砑西 北京工商太学学位论文授权使用声明 本人完全了解北京工商大学有关保留和使用学位论文的规定，即。研究搬 在校竣读学戳麓滔论文工作的知识产权单位耩就京工商大学。学校有权保留并 囱国家鸯关部门或极槐送交论文的复印馋秘魄子舨，允诲学像论文被套阕彝綮 阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印戚其它复 制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 学位论文电子敝阕意提交后，可予舀当年岛一年翻二年瑶在学校圈 书镕嬲蛙上发蠢，供校痰疼生测览。 学位论文作者艇名：弛导师签名：芝兰i日期：。7 年，月上孚日 专覆专 北京工商大学硕士学位论文 第一章引言 1 1 好氧反硝化菌株的筛选进展 针对传统脱氮工艺中的不足，人们努力探求新型、效果更好的脱氮微生物。 最近的研究和报道表明生物脱氮过程中出现一些超出人们传统认识的现象，即反 硝化不仅仅在缺氧的条件下进行，某些细菌在好氧条件下也可以进行反硝化，即 好氧反硝化。 最早给出好氧反硝化科学确证的是k r u l ( 1 9 7 6 ) 和m e i b e r g ( 1 9 8 0 ) 。2 0 世 纪8 0 年代，r o b e r t s o n ( r o b c r t s o n ，1 9 8 8 ) 等人在除硫和反硝化处理系统出水中 首次报道分离出好氧反硝化菌泛养硫球菌t h i o s p h a e r a p a n t o t r o p h a ( 现更名为脱 氮副球菌p 缸r a c o c c u sd e n i t r i f i c a t i o n s ) 、假单胞菌属的某一种( p s e u d o m o n a ss p ) 和粪产碱菌( a l c a l i g e n e s f a e c a l i s ) ，并证实在生长过程中，0 2 和n 0 3 一共同存在时， 其生长速度和反硝化率比两者单独存在时都高。此后国内外越来越多的研究证明 好氧反硝化菌的存在，许多不同种属的好氧反硝化菌被筛选出来。 l o n e 等( 1 9 9 7 ) 从间歇厌氧好氧运行的污水处理池中的活性污泥中分离出 1 6 株反硝化菌，它们无论是在好氧条件还是在厌氧条件下都具有反硝化作用。 l u k o w 等( 1 9 9 7 ) 从垃圾渗滤液处理厂的硝化段分离得到一株好氧反硝化菌t l l ， 并研究不同溶解氧条件下的反硝化速度和不同碳源对其生长的影响。g u l l l l a 等 ( 1 9 9 8 ) 为研究活性污泥中高效反硝化菌的多样性，从不同的城市废水处理厂中 分离出1 5 0 0 多株菌，共筛选出2 4 株高效反硝化菌，并对其进行1 6 s r r n a 分析， 结果显示其中5 株菌为r h o d o b a c t e r 属，1 6 株为r u b r i v i v a x 属，1 株为p s e u d o m o n a s 属，2 株未确定，但其与b r u c e l l a 属的一些种表现出高相似性。s h w u i j n g 等( 1 9 9 9 ) 从稻谷沉淀物中分离得到三株好氧反硝化菌，其在好氧或缺氧条件下都能够将硝 态氮转化为氮气获得能量，尤其是分离的d c b - t 6 的反硝化速率，不受氧气的影 响。此外，还将这些菌与完全好氧条件下驯化的综合废水的活性污泥混合，测定 其反硝化能力。s c h o l t e n0 9 9 9 ) 等在垃圾渗滤液处理系统中分离出异养硝化菌 t h a u e r am e c h e r n i c h e n s i s ，可进行好氧反硝化作用。 p a t u r c a u ( 2 0 0 0 ) 等人从天然的生态系统中取四个样品，从活性污泥处理厂 中取一个样品，混合在一起，以硝酸盐为底物，循序渐进地在交替好氧- 厌氧条 件下驯化，以富集好氧反硝化菌。在饱和溶解氧条件下，混合系统和纯菌株均显 优选高性能的好氧反硝化菌株 示出好氧反硝化特性。s e u n g - h u n 等( 2 0 0 1 ) 分离的菌株p 5 也能在有氧条件下以 苯酚为有机碳源进行反硝化作用，同时去除苯酚和硝态氮。h u a n g ( 2 0 0 1 ) 等从 硝化反硝化污泥中分离出好氧反硝化菌c i t r o b a c t e rd i v e r s u s 。s u 等( 2 0 0 2 ) 从猪 圈废水处理系统的活性污泥中分离出p s e u d o m o n a ss t u t z e r is u ，此菌株在含氧量 为9 2 的大气中，硝态氮去除率达到9 9 2 。n a o k i 等( 2 0 0 3 ) 利用反硝化过程为 碱增加过程，通过在培养基中加入p h 指示剂，分离两株好氧反硝化菌 p s e u d o m o n a st r 2 和p s e u d o m o n a sk 5 0 。孔庆鑫( 2 0 0 3 ) 等利用氰化钾( k c n ) 选择性培养基，筛选得到一株可以用柠檬酸钠作为碳源，硝酸钾为氮源，进行好 氧反硝化作用的菌株。e b r u 等( 2 0 0 4 ) 从花房的土壤中筛选出5 株菌，其均能在 好氧条件下进行硝酸盐呼吸。y o s h i f u m i ( 2 0 0 4 ) 分离的好氧反硝化菌d n t - 1 以 甲苯为惟一碳源和能量来源，在有氧和厌氧的情况下均能生长。张光亚等( 2 0 0 4 ) 从土壤中分离出一株好氧反硝化菌，经鉴定为r h o d o c o c c u ss p ，该菌株为革兰氏 染色阳性，球状或杆状，菌落颜色显橙红色。马放( 2 0 0 5 ) 等人筛选得到好氧反 硝化菌株x 3 1 ，经鉴定为p s e u d o m o n a sc h l o r i t i d i s m u t a n s 。当培养液中初始氧化态 氮质量浓度为1 5 0m e ：t , 时，d o 值对x 3 1 菌株的反硝化效果没有显著的影响。于爱 茸( 2 0 0 5 ) 等从鱼塘中分离得到1 株高效的好氧反硝化菌，经初步鉴定为b a c i l l u s 。 由上可见，好氧反硝化作用是常规存在的而不是偶然的，从运河、池塘、土 壤和活性污泥中分离出好氧反硝化菌都是有可能的。这些分离出来的菌种属于 p r o t e o b a c t e r i a 门a ，b ，t 纲的不同菌属( 如p s e u d o m o n a s ，r h o d o c o c c u s ， t h i o b a c i l l u s ，a l c a l i g e n e s ，m i c r o v i r g u l a 等) 。这说明好氧反硝化作用，就像硝化 作用的情况，并不是特殊的某些种属或具体的某种菌具有的性能。它只是一种代 谢途径，目前发现的好氧反硝化菌均不是新的菌种。在好氧条件下，能够还原硝 酸盐或亚硝酸盐，产生n 2 0 或n 2 的细菌就是好氧反硝化菌。因而优选到环境适 应性强的高性能的好氧反硝化菌株，尤其就好氧反硝化作用方面来说，未曾报道 过的新的菌属将具有很重要的研究价值；并且从生物学角度达到脱氮产物n 2 0 的控逸，构建低n 2 0 逸出量高反硝化性能的好氧反硝化菌系，必将成为今后研 究的热点和重点。 2 北京工商大学硕士学位论文 1 2 好氧反硝化菌的作用机制 1 2 1 硝酸盐和氧协同呼吸 0 2 ，h 2 0 的标准电极电势为1 2 2 9v ，n 0 3 - h n 0 2 的标准电极电势为0 9 4v ，电 极电势代数值越大，氧化能力越强，因而早期理论认为，0 2 得到电子的能力要大 于n 0 3 - - n 得到电子的能力，因而0 2 的存在阻止电子传递给n o i - n 或n 0 3 - - n ，从 而抑制有氧条件下反硝化作用的进行。而最近许多研究表明，某些细菌的反硝化 酶系和有氧呼吸系统可以同时存在，也即0 2 与n 0 2 一n 和l 或n o f - n 可以协同呼吸。 缺少n 0 2 - - n 或n 0 3 - n 和0 2 都会降低细菌的生长率和反硝化率( r o b e r t s o n 等， 1 9 8 4 ；d p a t u r e a u 等，2 0 0 0 ) r o e r t s o n ( 1 9 8 3 ，1 9 8 8 ) 等认为t h i o s p h a e r a p a n t o t r o p h a 可以协同呼吸是好氧 反硝化的一个重要机理，协同呼吸意味着氧和硝酸盐同时作为电子受体，有机物 提供的电子流同时传输给反硝化酶系统和氧，因而反硝化可以在好氧情况下作 用。p a t u r e a u 等( 1 9 9 7 ，1 9 9 8 ) 在对m i c r o v i r g u l aa e r o d e n i t r i f i c a n s 和不能进行异养 硝化的菌株c o m a m o n a ss p s g i 2 研究时，也认为好氧反硝化的关键机理是协同 呼吸。w i l s o n 等人( 1 9 9 7 ) 提出细菌反硝化过程中的电子传递模型( 图1 1 ) 。从 图1 1 中可以看出，0 2 与n 0 3 一- n 和或n o - 2 - - n 均可作为最终电子受体。好氧反硝化 菌不仅可将电子从电子供体传递给0 2 ，同时也可通过硝酸盐、亚硝酸盐、n 2 0 等 还原酶将电子传递给n o i n 和或n 0 2 - - n ，实现好氧反硝化作用。 图1 - 1 细菌反硝化过程中的电子传递模型 3 优选高性能的好氧反硝化菌株 1 2 2 氧对反硝化酶系的调控作用 r o b e r t s o n ( 1 9 8 8 ) 等人报道t h i o s p h a e r a p a n t o t r o p h a 的电子传递蛋白能在有 氧条件下依次还原n o d 、n 0 2 - 、n o 和n 2 0 ，最终生成n 2 。这一报道引起众多 研究者的关注，人们纷纷对反硝化菌的各种反硝化酶进行研究，反硝化作用实际 上是一个硝酸盐的生物还原作用，反硝化作用包括多步反应： n o i n o ；一n o n p n 2 每一步均有相应的酶催化进行作用，依次为硝酸盐还原酶n a t 、亚硝酸盐还 原酶n i r 、n o 还原酶n o r 和n 2 0 还原酶n o s 。其酶系的作用过程如图1 - 2 ( y e 等，1 9 9 4 ) 。反硝化菌种类繁多，基质( 电子供体) 多样，但电子受体的种类相 对有限。以氧为电子受体的好氧呼吸和以硝酸盐为电子受体的硝酸盐呼吸是反硝 化菌的主要代谢方式。完整的反硝化还原酶系由n a r 、n i t 、n o r 和n o s 组成，了 解氧对各种反硝化酶的调控作用后，通过酶系的调控和优选组合，可以得到同时 利用氧和硝酸盐进行协同呼吸的好氧反硝化菌。 图1 - 2 反硝化菌酶系的作用不意图 n a r - 硝酸盐还原酶；n i r - 亚硝酸盐还原酶；n o r - n o 还原酶；n o s - n 2 还原酶 1 2 2 1 氧对n a r 的调控作用 在反硝化过程中，n a r 起着很重要的作用，它是启动有氧条件下硝酸盐进行 还原作用的第一步。由图1 - 3 n a t 作用的电子传递示意图( m a d i g a n 等，2 0 0 2 ) 可见，以下三种情况下n a r 的表达不会受到氧的抑制。 ( 1 ) 电子传递链的直接电子供体是载体n a d h 2 。n a d h 2 把撕和2 h 传给 黄素蛋白f p ；f e s 蛋白从黄素蛋白那获得电子，并将其传递给辅酶q 1 0 ，再传给 细胞色素c y tb ；其中，一部分电子传递给细胞色素c y i o ，使氧得到电子生成水； 将过剩的另一部分电子传给硝酸盐还原酶n a r ，使硝酸盐还原为亚硝酸盐。 ( 2 ) d e n i s ( 1 9 9 0 ) 等人发现，缺失末端氧化酶( c y t o 是末端氧化酶的成分) 4 北京工商大学硕士学位论文 时，e c a r l 突变株可在有氧条件下高速还原硝酸盐。 ( 3 ) 膜外硝酸盐还原酶的催化中心位于细胞膜外侧，其表达与活性对氧分 子不太敏感，即膜外硝酸盐还原酶不会受到氧的抑制。 n a d h , j l f t 咯 | r n o i n t h 图1 - 3n a t 作用的电子传递示意图 f 黄素蛋白；f e s - 铁硫蛋白；q l 。- 辅酶q l o ；c y t g c y tb - 细胞色素 1 ，2 2 2 氧对n i r 、n o r 和n o s 的调控作用 含有c y tc d l 型亚硝酸盐还原酶的反硝化菌，能够在有氧条件下还原亚硝酸 盐( a l e f o u n d e r 等，1 9 8 3 ) 。由于亚硝酸盐还原反应的产物( n o ) 可抑制氧化酶 活性，有氧条件下的亚硝酸盐还原反应，实际上是在无氧化酶活性( 没有电子竞 争) 的情况下进行的。与c y tc d t 型亚硝酸盐还原酶相反，c u 型皿硝酸盐还原酶 可被氧灭活。有氧时，该酶即使位于完整细胞内也没有活性。这是因为c u 型亚 硝酸盐还原酶能把氧转化成过氧化物，后者会破坏酶的结构。在有氧条件下， n o 对氧化酶具有抑制作用，即n o 对电子的竞争能力更强。当添加n o 还原酶 时，n o 对氧化酶的抑制作用被解除，说明此时n o 已被还原，说明n o 还原酶 在有氧条件下具有活性。近来研究证明，p s e u d o m o n a p a n t o t r o p h a 和r h o d o c o c c u 5 c a p s u l a t u s 的n 2 0 还原酶活性并不受氧抑制( b e r k s 等，1 9 9 3 ) 。在有氧条件下， p s e u d o m o n a s p a n t o t r o p h a 能把n 2 0 还原为n 2 ( b e l l 等，1 9 9 1 ) 。 由上可见，如果菌株具有膜外硝酸盐还原酶、c ”。d 1 型亚硝酸盐还原酶、 n o 还原酶和n 2 0 还原酶组成的酶系统，在有氧条件下完全可以实现好氧反硝化 作用。 5 优选高性能的好氧反硝化菌株 1 3 好氧反硝化菌反硝化性能的衡量指标 确定好氧反硝化菌的反硝化性能时，目前国内外主要从反硝化势( d p ， d e n i t r i f i c a t i o np o t e n t i a l ) 和反硝化酶活性( d e n i t r i f y i n ge n z y m e a c t i v i t y ) 两个不 同的方面进行研究，以衡量不同生态环境如土壤、水域、海洋、湖泊底泥中不同 反硝化微生物的反硝化能力。 反硝化势( d p ) 的概念是在外加硝酸盐的情况下，反硝化微生物在一定时 间内产生的反硝化产物的多少，它实际上用来衡量可进行反硝化作用的潜在能力 或样品可能具有的最大的反硝化速度。在培养过程中不添加抑制微生物正常生长 的物质。反硝化酶活性( d e a ) ，是测定样品中反硝化酶活性大小的指标。为防 止微生物的生长，往往采用加入氯霉素的方法来抑制微生物的生长( 氯霉素不抑 制微生物的反硝化酶活性) ，通过测定反硝化产物的生成速度来确定反硝化酶活。 两者在方法上的主要区别在于时间的长短。反硝化势( d p ) 测定时间较长，可 以测定数小时到几十个小时内反硝化产物的生成。测定的结果可以表示该样品中 反硝化为微生物在长时间培养过程中利用氧化态氮化合物呼吸、繁殖的能力。这 就需要添加较多的碳源来维持硝酸盐的还原。而反硝化酶活( d e a ) 的测定仅在 几十分钟至数个小时内进行，测定的主要目的是样品现时状态下的反硝化能力， 文献报道不需要添加太多碳源。 目前国内外研究以反硝化势方面居多。具体来说，主要从反硝化底物( n 0 2 - 、 n 0 3 - ) 的去除速度和去除率、脱氮速度和脱氮率、反硝化产物、d o 及其他抑制 影响因素等不同方面来评定好氧反硝化菌的反硝化性能。但反硝化作用产物如 n 2 0 的控逸同样具有很重要的意义，因为反硝化作用是n 2 0 的重要产生源之一， 据估计污水处理过程中每年排放的n 2 0 量占全球n 2 0 总排放量的2 5 - 2 5 ，所 以本文研究菌株的反硝化性能时，增加反硝化作用产物n ：o 控逸这项指标，并 且必会成为今后研究的重点，从生物学角度达到n 2 0 控逸的目的。 1 3 1 反硝化底物的不同( n 0 2 、n 0 3 - ) 反硝化的底物分为n 0 2 一和n 0 3 一两种，目前分离的大多数好氧反硝化菌，均 可以利用两者作为底物进行反硝化作用。但其反硝化速度是不同的，l o n e ( 1 9 9 7 ) 等人在相同条件下分别以n 0 2 - 和n 0 3 - 为底物进行反硝化性能测定，得到n 0 2 的反硝化速度比n 0 3 - 的反硝化速度高。马放( 2 0 0 5 ) 等人分离的好氧反硝化菌 6 北京工商大学硕士学位论文 株x 3 1 同样发现利用n 0 2 一时比利用n 0 3 一更易进行反硝化作用。 1 3 2 反硝化速度 反硝化速度跟微生物种类、p h 、温度、碳源、氮源、碳氮比( c o d n ) 、d o 等因素都有着密切关系。n a o k i ( 2 0 0 3 ) 等分离两株好氧反硝化菌p s e u d o m o n a s t r 2 和k 5 0 ，在d o 浓度分别为1 2 5m g l 和1 2 2m 醴l 的情况下，2 株菌还原 硝态氮为氮气的速度分别为1 8 1 4m g d - 1 5 4 0 n m l 和o 6 0m g d - 1 5 4 0 n m 1 。孔庆鑫 ( 2 0 0 5 ) 等利用氰化钾( k c n ) 选择培养基筛选得到的好氧反硝化菌，在3 0 下溶解氧( d o ) 为6 0 0 5m g 几的培养基中，该菌5d 内将硝态氮由2 8 2 0m g l 降解至1 4 9 2m g l ，同时n 0 2 - - n 仅有少量的积累。 1 3 3 反硝化气体产物( n 0 2 、n o 、n 2 0 、n 2 ) 反硝化气体产物包括n 0 2 、n o 、n 2 0 和n 2 等。不同的菌株，在不同的条件 下，反硝化的终产物是不同的。k c s t e r ( 1 9 9 7 ) 等人通过实验发现，低于1 的 空气溶解度下，p s e u d o m o n a ss t u t z e r i 和a l c a l i g e n e se u t r o p h u s 开始进行反硝化。 培养基中d o 从1 降到0 后，a l c a l i g e n e se u t r o p h u s 的n o 和n 2 0 产生量逐渐 增大。该实验的结果显示，d o 为1 时，p s e u d o m o n a ss t u t z e r i 包含完整的反硝 化途径，反硝化立即进行，中间产物累积相对短暂。n a o k i ( 2 0 0 3 ) 等分离的两 株好氧反硝化菌t r 2 和k 5 0 ，产生比传统反硝化更低水平量的n 2 0 ，其反硝化 作用的主要产物为氮气。 1 4 生长培养环境对菌株反硝化性能的影响 1 4 1d o 的限制 根据氧对生长及反硝化作用的影响，反硝化微生物可分为三类：( 1 ) 在厌氧 条件下进行反硝化作用且仅能耐受较低浓度的氧；( 2 ) 在厌氧条件下进行反硝化 作用，但可以在好氧条件下通过好氧呼吸生长，这类微生物占绝大多数；( 3 ) 可 以同时利用氧和硝酸盐进行反硝化作用。现在研究的反硝化微生物大多数是第二 类。反硝化作用是缺氧环境下的替代产能途径，在氧分压高时，微生物进行好氧 呼吸获得能量；当含氧浓度很低或完全厌氧时，通过反硝化作用获得能量。普遍 的观点是高d o 会抑制好氧反硝化的活性，无论根据上述三类微生物的任一机 理，d o 提高均有利于碳源的消耗，使得n 0 2 - - n 或者n 0 3 一n 因为碳源的不足而 7 优选高性能的好氧反硝化菌株 难以顺利进行反硝化，但是d o 对各种菌株反硝化活性的抑制程度不同，似乎存 在一个阈值，大于此值时，d o 对反硝化效果影响不大，低于此值时，d o 的影 响明显。当d o 提高后，由于氧在系统中利用的电子更多，流向n 0 3 的电子更 少，反硝化活性受抑制，存在阈值则说明d o 的变化对电子分配的影响不是无限 的，n 0 3 - 在系统中总能获得电子用以还原。前期研究生实验得到，分别以n 0 3 - n 和n 0 2 - n 为底物时，实验室反应器驯化成熟的耐氧脱氮污泥的d o 阈值分别为 2 6 和2 8 m g l 。 r o b e r t s o n 等( 1 9 8 8 ) 发现d o 为5 6m r d l 时，t h i o s p h a e r a p a n t o t r o p h a 的反 硝化速度仍然能达到缺氧情况下的一半；李丛娜( 2 0 0 1 ) 等进行s b r 脱氮研究 时，发现当d o 高达8m g ，l 时，t n 去除率达到4 5 3 ；于爱茸( 2 0 0 5 ) 等人筛 选的一株高效好氧反硝化菌，在d o 达到2m g ，l 时，硝基氮的去除率为9 7 ； 当d o 达到4 巧m g l 时，硝基氮的去除率仍能达到8 5 。然而，有的报道( j e i i l 等，1 9 9 9 ) 发现d o 的抑制作用十分明显，d o 大约0 0 9m g l 时，反硝化速度 已经下降3 5 ，d o 在5 6m g i , 时，反硝化速度仅仅是厌氧时的4 。 对于反硝化过程中的硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、氧化亚氮还原酶，也 有研究提出相应的d o 阀值，p a t u r e a u ( 2 0 0 0 ) 等人在研究一个好氧反硝化菌群 时发现，d o 为0 3 5 6 3 0m g l 时，该菌群的反硝化速度始终在3 4 1 0 - 4 2 3 0 u m o l n l - h 之间，但是当d o 值小于0 3 5 m g l 时，反硝化率急剧上升。p s e u d o m o n a s d e n i t r i j i c a n sd s m 2 9 4 4 的d o 阀值约为2 2 0m g l 。t h i o s p h a e r a p a n t o t r o p h a 的d o 阀值约为1 7 0m j l 。p s e u d o m o n a ss t u t z e r i 的n 0 2 还原酶、n o 还原酶和n 2 0 还 原酶3 种还原酶的d o 阀值分别是5 1 0 、2 5 0 、3 8 0 m g l 。而p s e u d o m o n a s n a u 聒c a 的以上三种还原酶的d o 阀值分别是4 0 5 、2 1 5 、0 2 5m g i 。研究表明，阀值随 着底物、微生物的种类以及环境条件( 温度、气压、离子强度等) 不同而不同。 d o 阀值的范围一般在0 0 8 - , 7 7 0 m g ，l 。d o 阈值高低可以看作好氧反硝化作用的 主要判断依据，也是好氧反硝化作用研究的重点。 1 4 2 碳氦比( c o d n ) 及碳负荷、氮负荷的限制 好氧反硝化作用中，有机碳源作为电子供体，氧气和硝酸盐共同作为电子受 体。有机物作为反硝化菌的碳源和能源，在有氧的条件下，必然要同时为氧和硝 酸盐或亚硝酸盐提供电子，因而有机物的浓度越高，反硝化的速度越快。r o b e r t s o n 8 北京工商大学硕士学位论文 等( 1 9 8 3 ) 很早对t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h a 的研究中指出，c o d n 与反硝化速度 正相关并处于某一最佳范围内。研究报道( p a t u r e a u 等，2 0 0 0 ) 在一定的氮负荷 下，硝酸盐还原速度与c o d 负荷成正比，将c o d 负荷减少一半，反硝化作用占 总氮损失的比例从3 6 锐减到2 。 1 4 3p h 一般认为中性至偏碱性条件适合反硝化微生物进行反硝化作用。b a u m a n n ( 1 9 9 7 ) 筛选得到的脱氮副球菌( p a r a c o c c u s d e n i t r i f i c a n s ) 在不n p e 值条件下， 测定其酶活的研究发现，当p h 为6 8 时，培养结束产生3 1 4 5 1m m 的n 0 2 - ，1 0 0 9m m 的n 2 0 ；当p h 为7 5 时，两种中间产物的产生量都小的多，分别为1 1 1 0m m 和0 2 0 3m m 。进一步测定得出，p h 并不影响反硝化酶的转录，但在 p h 7 5 时的亚硝酸还原酶的酶活是p h 6 8 时的1 0 - 1 5 倍。李军( 2 0 0 2 ) 认为反硝化 微生物生长的最适宜p h i 7 o 罐5 ，当p h 值大于8 5 或小于6 时，反硝化速度将大 大降低。于爱茸( 2 0 0 5 ) 从鱼塘中分离得到1 株高效的好氧反硝化菌砌c i l l u sw 2 ， 发现p h 为7 0 彳5 时硝酸盐的降解率最大，