（环境工程专业论文）微囊藻毒素的厌氧降解及兼性厌氧降解菌的分离.pdf

摘要 由于微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n ，m c ) 具有强烈的肝毒性，因此m c 在饮用 水中的迁移转化规律已引起日益重视。微生物降解过程被认为是水体中m c 归 趋的主要途径之一，尽管国内外学者对m c 的微生物降解方面进行了大量研究， 但主要集中于m c 的好氧微生物降解方面。由于自然水体中普遍存在着厌氧环 境，那么厌氧降解过程很可能对m c 的迁移转化产生重要影响，但是目前对于 m c 在厌氧条件下的降解过程却未见报道，也没有分离出m c 兼性厌氧降解菌。 因此本文首先考察了m c l r 在厌氧条件下的降解过程，然后从滇池沉积物中分 离出2 株m c l r 兼性厌氧降解菌，并对其中的1 株进行了降解能力研究以及初 步鉴定。具体内容及结果如下： 1 滇池沉积物菌群对微囊藻毒素的厌氧生物降解 通过室内模拟实验，研究了滇池沉积物中混合菌群在厌氧条件下对m c l r 的降解能力，并考察了环境因素和外加营养源对该过程的影响。结果表明，厌 氧条件下m c l r2d 内从5m g l 迅速降解到检测限以下，说明该菌群在厌氧条件 下对m c l r 具有较强的降解能力，并且可以利用m c l r 作为唯一氮源。在实验温 度范围内，m c l r 的降解速率随着温度的升高而增大。酸性条件下m c l r 的厌氧 降解缓慢( p h = 5 o ) 甚至停止( p h = 3 o ) ，而中性( p h = 7 o ) 和碱性( p h 为9 0 、 1 1 0 ) 条件下降解速率没有显著差异。单独添加葡萄糖可以产生酸性物质而使体 系的p h 下降，从而抑制m c l r 的降解，但是同时添加硝酸盐可以消除这一影响。 单独添加硝酸盐对m c l r 的厌氧降解也有显著的抑制作用，说明硝酸根在这一过 程中未被m c l r 厌氧降解菌用作最终电子受体。这些结果表明，厌氧降解可能是 沉积物中m c l r 转化的另一重要途径，该过程在m c l r 污染治理方面具有潜在的 应用价值。 2 m c l r 兼性厌氧降解菌的分离纯化及降解能力研究 通过三层平板分离法，从长期遭受蓝藻水华污染的滇池沉积物中分离得到2 株能够以m c l r 作为氮源生长的兼性厌氧降解菌，其中菌株4 w 2 0 在缺氧条件 下6 d 内对m c l r 的降解率能达到8 0 以上，另外1 株对m c l r 的降解率不到 6 0 ，因此选取降解能力较强的菌株4 w 2 0 进行后续实验。 与缺氧条件相比，好氧条件下菌株4 w 2 0 在6 d 内对m c l r 的降解率达 1 0 0 ，而厌氧条件下6 d 内对m c l r 的降解率为6 6 7 。说明该菌株在不同溶 解氧条件下仍具有很强的降解能力，且溶解氧含量升高，菌株对m c l r 的降解 能力增强。 3 m c l r 兼性厌氧降解菌的初步鉴定和保存 通过考察m c l r 兼性厌氧降解菌的形态特征和生理生化特性对菌株进行初 步鉴定。在好氧条件下菌株4 w 2 0 的菌落形态为圆形，乳白色( 偏淡黄色) ，直 径约1 1 5 m m ，边缘紧缩，表面光滑、湿润，半透明。在缺氧条件下生长的过 程中伴随着菌落形态的变化，生长初期均为圆形，乳白色，直径0 5 o 8 m m ，边 缘紧缩。生长末期为近似圆形，乳白色，直径1 5 m m ，边缘出现小锯齿状。该 降解菌为不运动的革兰氏阴性杆菌，属于兼性厌氧菌，大小为o 5l x m x 2p m ， 无荚膜，无芽孢。通过生理生化鉴定试验可知，该降解菌均能利用葡萄糖和甘 露糖产酸，m r 、v p 反应和尿素酶检测呈阳性，能利用丙二酸盐，具有过氧化 氢酶和半乳糖苷酶，不水解淀粉和纤维素，明胶液化和苯丙氨酸脱氢酶呈阴性， 不产生硫化氢，不能在氰化钾培养基上生长。通过以上形态学和生理生化特性， 初步鉴定m c l r 兼性厌氧降解菌4 w 2 0 属于水拉恩氏菌属( r a h n e l l aa q u a t i l i s ) 。 通过对比液体石蜡保存法、甘油生理盐水保存法、低温甘油保存法、甘油 菌液对半保存法和蒸馏水保存法这5 种方法的优劣发现，甘油菌液对半保存法 既能使菌株保持原始性状，又能保证菌株具有很强的降解活性。所以最终选择 甘油菌液对半保存法作为m c l r 兼性厌氧降解菌的保存方法。 关键词：微囊藻毒素；厌氧生物降解；兼性厌氧降解菌 i i a b s t r a c t b e c a u s eo fm i c r o c y s t i nh a s p o t e n t i a lh e p a t o t o x i c i t y , t h e t r a n s p o r t a n d t r a n s f o r m a t i o no fm i c r o c y s t i ni n d r i n k i n gw a t e rh a v eb e e nc o n c e r n e db yp e o p l e m i c r o b i a ld e g r a d a t i o no fm i c r o c y s t i ni so n eo fm a i nw a y sf o rm i c r o c y s t i nr e m o v a li n w a t e re n v i r o n m e n t t h e r ew e r el o t s o fs t u d i e so nm i c r o b i c a l d e g r a d a t i o no f m i c r o c y s t i n ，b u tm a i n l yf o c u s e do na e r o b i ce n v i r o n m e n t i nf a c t a i l a e r o b i c e n v i r o n m e n te x i s t si nn a t u a lw a t e r , s oa n a e r o b i c b i o d e g r a d a t i o nm i g h tp l a ya n i m p o r t a n tr o l ei nt h ef a t eo fm i c r o c y s t i n ，h o w e v e r ，t h e r ew a sl i t t e r r e p o t e r so n b i o d e g r a d a t i o n o fm i c r o c y s t i nu n d e ra n a e r o b i c c o n d i t i o n ， a n dn e v e ri s 0 1 a t e d f a c u l t a t i v ea n a e r o b i cb a c t e r i u m t h i sp a p e rh a ss t u d i e dt h eb i o d e g r a d a t i o np r o c e s s e s o fm i c r o c y s t i nu n d e ra n a e r o b i c c o n d i t i o n ，a n di s o l a t e d2s t r a i n sm i c r o c y s t i n f a c u l t a t i v ea n a e r o b i cb a c t e r i u m m o r e o v e r , o n ed e g r a d a t i o ns t r a i n so ft w ow e r e i n v e s t g a t e da n di d e n t i f i e d t h em a i nc o n c l s i o n so b t a i n e da r el i s t e da sf o l l o w s ： 1 w ea s s e s s e dt h ep o t e n t i a lf o r s e d i m e n tm i c r o b i a l c o m m u n i t yf r o m e n v i r o n m e n t a lf a c t o r sa n da d d i t i o n a l a n a e r o b i cm i c r o c y s t i nl rb i o d e g r a d a t i o nb y d i a n c h il a k ea n de v a l u a t et h ee f f e c t so f n u t r i e n ts o u r c e so nt h er a t e so fa n a e r o b i c b i o d e g r a d a t i o ni nl a b o r a t o r ye x p e r i m e n t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm i c r o c y s t i nl r w a s r a p i d l yd e g r a d e df r o m5m g lt ob e l o wd e t e c t i o nl i m i tw i t h i n2d a y s d e m o n s t r a t i n g t h a tt h e i n d i g e n o u sm i c r o o r g a n i s m sc a n e f f i c i e n t l yd e g r a d e m i c r o c y s t i nl ru n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n sa n dc a nu s em i c r o c y s t i nl ra sas o l e n i t r o g e ns o u r c e t h er a t e so fa n a e r o b i cm i c r o c y s t i nl rb i o d e g r a d a t i o ni n c r e a s e dw i t h i n c r e a s i n g i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r ew i t h i nt h e e x p e r i m e n t a lr a n g eo f15 3 0o c a n a e r o b i cm i c r o c y s t i nl rb i o d e g r a d a t i o nw a ss l o w e r ( p n = 5 0 ) o r e v e nc e a s e d ( p h 2 3 0 ) a ta c i d i cp h ，b u tt h e r ew a sn od i f f e r e n c ei nt h er a t e sa tn e u t r a l ( p n = 7 0 、a n d a l k a l i n e ( p h9 0 ，11 o ) c o n d i t i o n s t h ea d d i t i o no fg l u c o s ed e c r e a s e dp ho ft h e c u l t u r eb yp r o d u c i n ga c i d i cc o m p o u n d sa n dt h e r e f o r e s i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h e a n a e r o b i cb i o d e g r a d a t i o no fm i c r o c y s t i nl r ，b u tw i t ht h ea d d i t i o no fn 0 3 ，t h i s i n h i b i t i o n d i s a p p e a r e d n 0 3 a m e n d m e n ta l s or e t a r d e dt h e b i o d e g r a d a t i o no f i i i m i c r o c y s t i nl r ，d e m o n s t r a t i n gt h a tn 0 3 。w a sn o tu s e da sat e r m i n a le l e c t r o na c c e p t o r t h e s ef i n d i n g s s u g g e s tt h a t a n a e r o b i cb i o d e g r a d a t i o nm i g h tb ea n o t h e rm a i n a t t e n u a t i o nm e c h a n i s mf o rm i c r o c y s t i nl ri ns e d i m e n t sa n dp r e s e n t sas i g n i f i c a n t b i o r e m e d i a t i o np o t e n t i a l 2 i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ff a c u l t a t i v ea n a e r o b i cb a c t e r i ao nm i c r o c y s t i nl r a n ds t u d yo fd e g r a d a t i o na b i l i t y t w os t r a i n sa n a e r o b i cd e g r a d a t i o nb a c t e r i aw h i c hc a nu s em i c r o c y s t i nl ra s n i t r o g e ns o u r c ew e r ei s o l a t e df r o ms e d i m e n t so fd i a n c h il a k e ，a n dt h ed e g r a d a t i o n r a t i oo fd e g r a d i n gs t r a i n s4 w 2 0o nm i c r o c y s t i nl ru n d e ra n o x i cc o n d i t i o nw a sa b o v e 8 0 ，b u ta n o t h e rw a sl e s s6 0 ，s ot h ed e g r a d i n gs t r a i n s4 w 2 0w a sf u r t h e rs t u d i e da s e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l c o m p a r ew i t ha n o x i cc o n d i t i o n ，t h ed e g r a d i n gr a t i oo f4 w 2 0o nm i c r o c y s t i nl r u n d e ra e r o b i cc o n d i t i o nw a s10 0 d u r i n g6d a y s b u ti tw a s6 3 6 u n d e ra n a e r o b i c c o n d i t i o n t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t4 w 2 0h a ds t r o n gd e g r a d i n ga b i l i t yu n d e r d i f f e r e n td i s s o l v e do x y g e nc o n d i t i o n s ，a n dt h e a b i l i t ye n h a n c e dw i t hd i s s o l v e d o x y g e ni n c r e a s e d 3 i d e n t i f i c a t i o na n d p r e s e r v a t i o n o ff a c u l t a t i v ea n a e r o b i cb a c t e r i ao n m i c r o c y s t i nl r a c c o r d i n gt ot h es t r u c t u r eo fc e l l ，b i o c h e m i s t r ya n dp h y s i o l o g yc h a r a c t e r i s t i c ， t h eb a c t e r i u mi sp r i m a r i l yi d e n t i f i e d 4 w 2 0w a sr o u n d ，t h ec o l o rw a si v o r y w h i t e ，a n d t h ed i a m e t e rw a s1 1 5 m m ，s u r f a c ea n de d g eo fc e l lw e r ed i f f e r e n tu n d e ra e r o b i c c o n d i t i o n h o w e v e r , t h eg r o w t hp r o c e s s e so fb a c t e r i u ma c c o m p a n i e d 、析t ht h ev a r i e t y o fs h a p eu n d e ra n o x i cc o n d i t i o n ，t h es h a p eo fc e l lw a sr o u n da tt h ei n i t i a lp e r i o d ，t h e c o l o rw a si v o r y - w h i t e ，a n dt h ed i a m e t e rw a so 5 0 8 m m a tt h ee n dp e r i o d ，t h es h a p e o fc e l lw a sr o u n d ，t h ec o l o rw a si v o r y w h i t e ，a n dt h ed i a m e t e rw a s1 5 m m t h i s d i d n tf o r ms p o v ea n dg r a m t h r o u g ht h ei d e n t i f i c a t i o ne x p e r i m e n to fb i o c h e m i s t r y a n dp h y s i o l o g y , 4 w 2 0h a dc a t a l a s ea n dg a l a c t o s i d o s e ，c a l lu s eg l u c o s ea n dm a n n o s e w h i c hf o r m sa c i d ，a n dc a n tu s es t a r c ha n dc e l l u l o s e m r 、v pr e a c t i o na n dt h e d e t e c t i o no fu r e a s ew e r e p o s i t i v e ，g e l a t i nl i q u e f a c t i o n a n dp h e n y l a l a n i n e d e h y d r o g e n a s ew e r en e g a t i v e ，i td i d n tp r o d u c e dh y d r o g e ns u l f i d e ，a n dc a n tg r o wi n p o t a s s i u mc y a n i d em e d i u m 4 w 2 0 w a si d e n t i f i e da sr a h n e l l a a q u a t i l i sb y i v b i o c h e m i s t r ya n dp h y s i o l o g yc h a r a c t e r i s t i c a n a e r o b i cd e g r a d i n gb a c t e r i u mw a sp r e s e r v e da c c o r d i n gw i t ht h ep r e s e r v a t i o n o fl i q u i dp a r a f f i n ，g l y c e r o l s a l i n e ，l o wt e m p e r a t u r eo fg l y c e r i n ，d i s t i l l e dw a t e r , h a l f v o l u m eo ff l y c e r o la n db a c i l l i t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el a s tm e t h o dn o to n l yc o u l d m a i n t a i nt h eo r i g i n a lt r a i t so fs t r a i n s ，b u ta l s oe n s u r et h a tt h es t r a i n sh a v eas t r o n g a c t i v i t y s ot h el a s tm e t h o d i sa l li d e a lm e t h o d k e yw o r d s ：m i c r o c y s t i n ；a n a e r o b i cb i o d e g r a d a t i o n ；f a c u l t a t i v ea n a e r o b i cb a c t e r i u m v 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其它教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生( 签名) ： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅。本人授权武汉理工大学可以将本学位论文的全部内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存或汇编本学位论文。同时 授权经武汉理工大学认可的国家有关机构或论文数据库使用或收录本学位论 文，并向社会公众提供信息服务。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生( 签名) 导师( 签名) ：日期 武汉理工大学硕士学位论文 第1 章绪论 水体富营养化现象已经成为水体质量恶化的一种标志。目前，世界各国的 淡水水体都出现了水体富营养化现象，而且发生水华的频率和持续时间呈现迅 猛的增长趋势。据调查显示，欧洲、非洲、北美洲、南美洲和亚太地区已经有 3 0 5 0 的湖泊处于不同程度的富营养化状态【l 】。在我国淡水水域中，有5 0 以上的湖泊、3 0 以上的大型水库都呈现富营养化状态，其中以太湖【2 j 、巢湖1 3 】 和滇池【4 j 尤为严重。水体富营养化导致蓝藻水华的大面积暴发，有毒蓝藻细胞破 裂后向水体中释放藻毒烈引，其中微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n ，简称m c ) 是一种在蓝 藻水华中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素类型【6 7 j ，对水 生态系统和人类造成的危害已成为当今最为严重的水环境问题之一，因此倍受 人们关注。本章对m c 的结构、理化性质及危害进行简要阐述，并对微囊藻毒素 的环境归趋及水环境中m c 的微生物降解作了详细综述。 1 1 微囊藻毒素简介 1 1 1 微囊藻毒素的结构及理化性质 1 9 8 4 年b o t e s 等【8 】从铜绿微囊藻中分离纯化出微囊藻毒素，并通过研究首次 确定了m c 的分子结构。微囊藻毒素是一类具有生物活性的七肽单环肝毒素，是 由7 个氨基酸组成的环状多肽类化合物，相对分子量都在1 0 0 0 左右【9 】。m c 的一般 结构为：环( d 丙氨酸( a l a ) lxd 赤d 甲基天冬氨酸( m a s p ) l y - a d d a d 异谷氨 酸( g l u ) - n 甲基脱氢丙氨酸( m d h a ) ) u 0 1 1 j 。其中n 甲基脱氢丙氨酸( m d h a ) 是一种 特殊氨基酸，含有a 、d 不饱和双键；a d d a 结构是另一种特殊的2 0 个碳原子的氨 基酸，其分子结构为3 氨基9 甲氧基2 ，6 ，8 三甲基1 0 苯基一4 ，6 二烯酸，是 微囊藻毒素生物活性表达的主要基剧1 2 j ，a d d a 氨基酸的共轭立体结构会影响其 毒性，改变其结构或去除a d d a 后毒素的毒性就会大大降低【l3 1 。由于x 、y 的不同 及甲基天冬氨酸( m a s p ) 和a d d a 的甲基化去甲基化产生的差异，可以形成多种不 同的异构体【l4 。目前已从不同微囊藻菌株中分离、鉴定出7 5 种以上的微囊藻毒 武汉理工大学硕士学位论文 素结构【1 5 】，存在较普遍、含量较高、毒性较大的是m c l r 、r r 和y r ，其中l ，r 和y 分别代表l e u ( 亮氨酸) 、a r g ( 精氨酸) 和x y r ( 酪氨酸) 。由于m c l r 存在 较为普遍，产毒量较大，且已分离培养出标准纯毒素市售，故目前藻毒素研究 多以m c l r 为代表性指标，世界卫生组织( w h o ) 以m c l r 含量为基准推荐饮 水藻毒素浓度标准为1 0 g l 1 1 6 j 。m c 的一般分子结构如图1 1 所示。 g i l l m d h a c 0 0 h m e a s p 图1 1m c 的分子结构 f i g 1 - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fm i c r o c y s t i n s o m c 具有环状结构和间隔双键，所以化学性质非常稳定。已有研究发现，m c 在水体中的稳定时间与水体的特征有一定的相关性，m c 在沸水中可以停留数小 时而不失活，干燥的m c 在室温下可保存数年之久【1 7 】。m c 在去离子水中可保持 稳定状态长达2 7d ，在灭菌的河水中可保持稳定1 2d ，而在河水中7d 以内即会发 生生物降解【18 1 。m c 能够被紫外线光解或通过异构化丧失毒性【1 9 2 0 1 。m c 极易溶 解于水，在水中的溶解度达1 l 以上。在自然水体中主要以中性分子或阴离子 的形式存在【2 。m c 不挥发，抗p h 变化，可溶于甲醇或丙酮，常规水处理工艺的 混凝、沉淀、过滤、加氯等均不能有效去除m c 2 2 。 1 1 2 微囊藻毒素的危害 微囊藻毒素与人类健康息息相关，近年来，由微囊藻毒素引起的人类中毒 2 武汉理工大学硕士学位论文 事件频频发生，m c 对人类健康造成的危害已受到全世界的重视。人类饮用或直 接接触藻类污染的水体会引起皮肤反应、结膜炎、鼻炎、呕吐、腹泻、胃肠炎 等病症。1 9 9 6 年巴西一透析中心，因透析液遭微囊藻毒素污染，导致1 3 0 名病 人中有u 6 人出现异常症状，其中至少有5 0 人最终死亡，这是迄今为止世界上 第一例因藻毒素导致人类死亡的报道【2 引。据统计，近3 0 年来约有1 0 0 0 0 人因饮 用或直接接触含微囊藻毒素的水而造成急性中毒，其中死亡人数达1 0 0 人以上 2 4 j 。流行病学研究表明，饮用水原水中m c 的含量与原发性肝癌和大肠癌的发 病率有直接关系1 2 5 1 。经调查发现，我国江苏海门、启东和广西扶绥地区的原发 性肝癌发病率高与当地居民长期饮用含微量微囊藻毒素的浅塘水和河流水有关 2 6 j ，而当地饮用深井水的居民原发肝癌发病率则相当低【27 1 ，由此说明，虽然饮 用水中微囊藻毒素含量一般较低，但是长期饮用也会引起慢性中毒，必须受到 重视。除此之外，人类还可以通过其他途径摄入微囊藻毒素而导致各种病变， 如通过食物链的传递和放大作用，食用受污染水体的水产品等等。 微囊藻毒素对动物也具有一定毒性。家畜及野生动物饮用了含微囊藻毒素 的水后，会出现腹泻、乏力、厌食、呕吐等症状，甚至死亡。1 8 7 8 年，f r a n c i s 【2 8 】 首次发现泡沫节球藻( n o d u l a r i as p u m i g e n a ) 水华能够引起家畜和禽类中毒死亡。 此后，由于水体富营养化现象日益加剧，蓝藻水华的发生频率越来越频繁，世 界各地由蓝藻毒素引发的野生动物、家畜、家禽及宠物中毒、死亡的事件也增 多。我国内蒙古达赉湖由于鱼腥藻、微囊藻水华，每年都造成牛羊等家畜死亡【2 9 】。 微囊藻毒素对水生动、植物也有一定的影响。水体中的微囊藻毒素可以在 鱼类肝脏中富集，且对鱼类胚胎的毒性高于对幼鱼的毒性，当藻毒素的浓度达 到某一浓度时常常致使鱼卵变形，蚤类死亡，泥鳅致畸，鱼类行为及生长繁殖 异制3 0 3 1 】。微囊藻毒素对水生植物的影响也非常显著。水体中高浓度微囊藻毒 素可影响水生植物种群的多样性【3 2 1 。 1 1 3 微囊藻毒素的环境归趋 微囊藻毒素在天然水体中的环境归趋，主要有稀释作用，颗粒物吸附，光 降解和微生物降解。 尽管各大淡水流域、河流中的蓝藻细胞死亡破裂释放的藻毒素可以被大量 水体稀释，但是大面积水华暴发会导致藻毒素达到较高浓度水平，再加上水体 环境容量和自净能力有限，使得稀释作用对水体中藻毒素的浓度变化没有显著 武汉理工大学硕士学位论文 影响，从而对水生态系统和人类健康构成严重威胁。 微囊藻毒素主要以中性或阴离子形式存在于天然水体中。受极性官能团和 非极性官能团的共同影响，在天然水体中，m c 更容易停留在水相，而不是吸附 到沉积物上1 2 1 , 3 3 】。本实验室研究也发现，滇池和太湖沉积物对m c 的吸附率均低 于1 0 。张维吴等1 3 4 j 研究微囊藻毒素的吸附行为时也发现，沉积物吸附柱对m c 的平均吸附量小于1 0 ，而颗粒活性炭则对m c 有较强的吸附性。然而，m o r r i s 等【35 】研究表明，粒径小于2 9 m 的海洋沉积物对m c 的吸附率高达8 1 。出现这种 差异的原因可能是沉积物对m c 的吸附性强弱与沉积物的理化性质有直接关系。 光照充足时，m c 很容易进行缓慢的光化学降解或异构化使其毒性降低l l 引。 但已有研究表明，直接光降解无法消除自然水体中的微囊藻毒素，必须有水溶 性的细胞色素或腐殖质等催化剂存在的条件下，才能有效地进行光降解f 1 9 - 2 0 。 可见光降解速率受到催化剂的多少、光照强度等许多条件的限制。w e l k e r 等 3 6 】 发现，在腐殖质存在的条件下通过日光照射含m c 的水体，m c 的浓度显著降低。 t s u j i 掣圳研究发现，在光照强度为4 7g w c m 2 的u v n 射下，m c l r 的半衰期为1 0 m i n ，1 0m i n 后用光强为2 5 5 01 t w c m 2 的u v 照射，m c l r 可被完全降解。陈晓国 等1 3 驯的研究结果表明，在2 5 4n m 紫外光照射下，m c r r 的光降解和异构化作用 同时发生，整个过程不能用准一级反应动力学方程描述。光照强度、温度和p h 是影响反应速率的重要因素。增加光照强度、提高反应温度均能促进m c r r 的降 解，偏酸性条件有利于降解。 天然水体中m c 的微生物降解也是其主要归趋途径之一。大量研究表明，在 湖水1 3 9 4 0 】、沉积物【4 1 】和河水【4 2 】中普遍存在能够降解m c 的土著菌，这些特殊的微 生物通过改变侧链a d d a 的结构或打开环状结构降低其毒性。 1 2 水环境中微囊藻毒素的微生物降解 1 2 1 微囊藻毒素的好氧微生物降解 好氧微生物降解已经被证明是微囊藻毒素自然转化的主要途径。国内外学 者对水环境中m c 的好氧生物降解方面迸行了大量的研究，其中主要从两个方面 展开深入研究。一方面从天然水体或沉积物中分离和纯化可以降解m c 的微生物 菌种，进一步对m c 的降解机理进行研究，以便应用到水处理工艺中；另一方面 4 武汉理工大学硕士学位论文 探讨影响m c 降解速率的因素，进而通过生物降解活性的调节达到高效去除m c 的目的，为生物降解去除m c 方面的应用提供理论参考。 国内外学者在现场以及通过室内模拟实验研究了微囊藻毒素的生物降解过 程，获得了大量资料。t s 蛳等1 4 3 j 在s a g a m i a 和t s a k u i 两湖进行现场实验研究发现， 水体中m c l r 和m c r r 的浓度可以持续稳定1 4d ，之后开始逐渐降解。c o u s i n s 等【3 9 】在室内用水库水对低浓度的藻毒素实验时发现，添加的藻毒素在一周内完 全降解，并推测其毒性降低的主要原因是通过改变藻毒素肽环中a d d a 结构实现 的。c h r i s t o f f e r s e n 掣4 4 】在室内人为创造了含有藻毒素、有毒藻类和天然细菌的生 态系统，研究了细菌对藻毒素的降解过程，结果表明，藻毒素在8d 内被完全降 解。国内方面，徐立红【4 5 j 以池塘水实验时发现，微囊藻毒素在有菌状态下可以 发生生物降解。金立娜等【4 6 j 在有氧条件下，利用从滇池蓝藻水华生物量中提取 的微囊藻毒素试验溶液，接种滇池沉积物，结果发现，滇池水体中的m c 易被生 物降解，完全降解时间为4d 1 0d 。张维吴等【3 4 】以滇池沉积物为基质降解水溶液 中的藻毒素时发现，藻毒素可以半衰期为2 5d 左右的速率降解。由此说明，微 囊藻毒素的微生物降解过程是普遍存在的，水体中混合微生物菌群对m c 有一定 的降解能力，但并不是其中所有的细菌都对m c 有降解能力。h y e n s t r a n d 等h 7 】研 究了从湖水和沉积物中分离得到的大量细菌菌株对m c 的降解，发现仅有1 7 的 菌株具备降解m c 的能力。尽管混合菌群能够降解藻毒素，但降解m c 的能力普 遍较弱，而且要想更全面了解降解菌的降解机理，有必要进一步分离出m c 高效 降解菌。 分离高效降解菌是m c 生物降解研究和应用的基础。目前已经发现多株能够 降解藻毒素的好氧纯菌株。自1 9 9 4 年b o u r n e 和j o n e s 等【4 8 】首次从天然水体中分离 出藻毒素降解菌后，关于藻毒素高效降解菌种和降解机理等方面的研究就受到 国内外学者的关注，经鉴定，菌株m j p v 属于鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o m o n a s ) ， 它能使环状m i c r o c y s t i n 转变为线型m i c r o c y s t i n ，该化合物比前者的毒性小近2 0 0 倍，并发现该菌在降解过程中存在一个滞后期，一般为2 8d ，其原因是在这个 时期正在合成降解m c 的水解酶即微囊藻毒素酶( m i c r o c y s t i n a s e ) 。p a r k 等【4 9 】从 日本富营养化湖泊( s u w a 湖) 中分离出一株具有降解m c l r 、m c r r 、m c y r 能力的细菌，该菌对m c l r 和m c r r 的最高降解速率分别为1 3m g l d a y j 和5 4 m g l 。d a y 一，经鉴定该菌从表型上分类属于鞘氨醇单胞菌属，但其1 6 s r d n a 测序 表明，1 6 s r d n a 序列明显有别于目前己发现的鞘氨醇单胞菌属细菌，它实际上 武汉理工大学硕士学位论文 是一个新种甚至新属。s a i t o 等【5 0 】分别从日本k a s u m i g a u r a 湖和中国贵阳市某一常 发生水华的湖泊中分离出2 株具有降解m c 能力的鞘氨醇单胞菌属 ( s p h i n g o m o n a s ) m d 1 和c 1 ，并发现它们的生长受到p h 的影响。i s h i i t ”j 也从日本 s u w a 湖中分离出一株鞘氨醇单胞菌属细菌7 c y ，4d 内就可将初始浓度为6m e l 的蓝藻毒素完全降解到检测限以下。a m e 等【5 2 j 也分离出一株鞘氨醇单胞菌属细 菌c b 4 ，该菌在3 6h 之内可将初始浓度为2 0 0 “g l 的m c r r 完全降解。k i y o m i 等【5 副 从日本两个湖泊中分离得到1 1 株对m c 有降解能力的纯培养，其中一株的降解能 力较其他菌株强，m c 在1d 内即可降解到检测限以下，经1 6 s r d n a 测序发现该菌 株与鞘氨醇单胞菌属y 2 的同源性达9 9 。t a k e n a k a 等【5 4 j 从日本湖泊中分离出一种 铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) ，在m c l r 初始浓度高达5 0 m g l 的情况 下，2 0d 的去除率为9 0 以上，并推测其中的碱性磷酸酶对藻毒素的降解有重要 作用。国内学者闰海等【5 5 】率先从云南滇池沉积物中分离得到5 株具备m c 降解能 力的纯菌株，其中一株降解能力最强，经鉴定属于青枯菌( r a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m ) ，该菌在初始m c r r 和m c l r 浓度分别为5 0 2m e l 和3 0 1m g l 时 日均降解速率达1 6 7m e l 和9 4m g m 。苑宝玲等1 5 6 j 从受藻毒素污染的水库底泥 中分离出7 株m c 降解菌，其中菌株m 5 、m 6 和m 7 三株菌为高效降解菌，经生 理生化实验进行初步鉴定，结果表明，m 5 和m 6 为假单胞菌，m 7 为气单胞菌。 单一菌株在2 4 h 1 为对m c 的降解率为6 3 , - - - 8 4 ，延长降解时间至4d 降解率达9 0 以上，将3 株菌混合协同降解m c 时发现，3d 内藻毒素完全降解到检测限以下。 周洁等【5 。7 】从云南滇池沉积物中分离出一株食酸戴尔福特菌u s t b 0 4 ( d e l f i i a a c i d o v o r a n s ) ，该菌能在2d 内将初始浓度分别为9 0 2m e l 和3 9 6m g l 的m c r r 和 l r 全部降解，日均降解速率分别达4 5 1m e l 和1 9 8m e t , ，是目前国内外报道的 降解藻毒素速率最高的纯菌种。宦海琳等【5 8 】从多个形成蓝藻水华的水体中分离 获得1 8 株能够降解m c 的纯菌株，其中5 株菌对m c 的降解能力相对较强，经初步 鉴定分别属于不动杆菌属( a c i n e t o b a c t e r ) 、肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) 、微杆菌 ( m i c r o b a c t e r i u m ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 和弗拉特氏菌属( f r at e u r i a ) ，均不同于已 报道的属种，刘海燕等1 5 9 j 进一步采用1 6 sr d n a 序列比对法对前期得出属于肠杆 菌属的菌株的分类地位进行鉴定，发现该菌株与3 株p v a l i d u s l 6 sr d n a 序列均有 很高的一致性，因此，该菌株应为一株p v a l i d u s ，如何评估生理生化特征和分子 遗传特征之间的差异，确立该菌株分类归属，尚需进一步研究确定。综上所述， 不同种类的m c 降解菌广泛存在于各种发生微囊藻水华的自然水体及水库水中， 6 武汉理工大学硕士学位论文 并且都有很强的降解能力，为在不同环境条件下利用微生物降解微囊藻毒素提 供了选择。 通过开展微囊藻毒素降解菌的分离纯化工作，为进一步研究其降解机理提 供了基础材料。目前国内外学者对m c 的好氧降解机理进行了大量的研究，使人 们有了初步的认识。b o u m e 掣叫研究表明，至少有3 种酶参与了鞘氨醇单胞菌属 ( s p h i n g o m o n a s ) m j p v 降解m c 的代谢过程。首先微囊藻毒素酶( m i r a ) 打开连 接a d d a 与精氨酸的肽键，使环状m c l r 变成线性的 m c l r ( n h 2 - a d d a - g l u - m e t h y l d e h y d r o a l - a n i n e - a l a - l e u - 1 3 一m e t h y l a s p a r t a t e - a r g - o h ) ，随后在第二种水解酶( m l r b ) 的催化作用下将线性m c l r 肽链上的丙氨酸与 亮氨酸的肽键断 裂，形成为四肽化合物 烈h 2 a d d a g l u - m e t h y l d e h y d r o a l a n i n e 趟a o h ) ，最后第三种水解酶( m l r c ) 将 四肽化合物降解为小分子的多肽和氨基酸。b r o u m e 等1 6 i