（环境工程专业论文）微囊藻毒素的光降解研究.pdf

摘要 随着水体污染和富营养化程度的加剧，淡水湖泊发生水华的频率和规模日益严重。 蓝藻水华污染所带来的主要危害之一是产毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不同类 型的藻毒素( m c ) ，在我国常见的主要有m c l r 和m c r r 。本文探讨了微囊藻毒素在 高效液相色谱中的保留特性及分离条件，优化了快速检测微囊藻毒素的分析方法；探索 了初步提取纯化微囊藻毒素的方法，并研究了藻毒素在光照下的光降解作用，考察了不 同色素在光催化降解藻毒素中的作用。研究了色素浓度、温度、光强和p h 等因素对光 降解的影响。得到了如下结果： h p l c 分析测定的条件是：流动相：3 5 乙腈6 5 水( 含有0 0 5 的三氟乙酸) ；流速： o 8m l m i m 紫外检测波长：2 3 9n n l l 进样量l op l 。应用此法对2 0 0 7 年6 月太湖梅梁湾 水域的水质进行监测，结果显示m c l r 浓度为o 3 0m g l 和m c r r 浓度为1 1 6m g l ， 远远超过世界卫生组织和我国卫生部规定的饮用水m c l r1 0 “g l 浓度控制标准。 由于藻毒素纯品的匮乏，以往有关藻毒素的研究多是利用粗提液进行的，本文以太 湖蓝藻水华样品为原料分离、纯化微囊藻毒素，实验中采用5 0 甲醇溶液提取藻细胞中 的m c ，过固相萃取柱( s p e c 1 8 ) 后，再用7 0 甲醇溶液洗脱，可以获得初步提纯的 m c r r 和l r 。 m c 溶液中色素的含量对于光降解有重要影响，色素浓度越高，反应的降解速率越 快。温度3 0 ，4 3 2 0g m o l m 2 s 光照强度下，含有蓝藻胞内色素浓度为o 5m g m l 的 m c l r ( 5m g l ) 溶液，光降解的半衰期为1 个小时。不同的色素溶液对光降解的催化作 用各有不同，混合色素对光降解反应的催化效果显著优于购买的色素。偏碱性的环境有 利于m c l r 的降解，另外，随着温度的升高，光降解反应的速率也有一定的加快。在 p h 值为9 0 ，温度为4 0 。c 的条件下，m c l r 的降解速率达到7 7 3 5 “g l l 。光照强度对光 降解反应也有一定的影响：光照强度越大，光降解反应速率就越快，同等光照时间下的去 除率也越高。 关键词：微囊藻毒素；h p l c ；分离和纯化；光降解；色素 a b s t r a e t a b s t r a c t w i t ht h eg r a v ec o n c e r no fp o l l u t i o na n de u t r o p h i c a t i o nd e g r e eo ff r e s hw a t e r , a l g a l b l o o mh a sb e c o m em o r ea n dm o r es e r i o u s t h ep o t e n tt o x i nm i c r o c y s t i ni sf r e q u e n t l yr e l e a s e d d u r i n gc y a n o b a c t e r i a lb l o o m si ne u t r o p h i cw a t e r sa n dm a yi m p o s ea r i s kt oh u m a nh e a l t ha n d e n v i r o n m e n t t h eu s u a lm i c r o c y s t i n si nc h i n aa r em c r ra n dm c l r t h i st h e s i sd i s c u s s e s m i c r o c y s t i n s r e t e n t i o nc h a r a c t e r i s t i ca n di s o l a t i o nc o n d i t i o n sb yu s i n gh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，a n do p t i m i z e sp a r t so ft h ea n a l y s i ss t e p s t a k i n gw a t e rs a m p l e d u r i n gt h ee u t r o p h i c a t i o np e r i o di nt a i h ul a k e ，i to p t i m i z e st h ec o n d i t i o n so fe x t r a c t i n ga n d i s o l a t i n gm i c r o c y s t i n s i ta l s of o c u s e so nt h ep h o t od e g r a d a t i o no fm i c r o e y s t i n sb yi r r a d i a t i o n w i t l lv a r i o u sp i g m e n t s ，s u c ha sc h l o r o p h y l l 如f l - c a r r o t e n ea n dm i x e dp i g m e n ti nc y a n o b a c t e r i a c e l l s t h i st h e s i sd i s c u s s e st h ei n f l u e n c e so fp i g m e n tc o n c e n t r a t i o n s ，t e m p e r a t u r e s ，i n t e n s i t i e s a n dp ht ot h ep h o t od e g r a d a t i o n t h ed e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o n so fh p l ca r ea sf o l l o w s ： m o b i l e p h a s e ： a c e t o n i t r i l e w a t e r - t f a ( 3 5 ：6 5 ：0 0 5 ) ；f l o wr a t e ：0 8m l m i n ；u vd e t e c t i o nw a v e l e n g t h ：2 3 9n m ； i n j e c t i o nv o l u m e ：10m i ti sf o u n dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fm c l ra n dm c - r r a r e0 3 0 m g la n d1 16m g li nt h et a i h ul a k ei nj u n e ，2 0 0 7 ，i ti sf a ro v e rt h el i m i t a t i o nr e g u l a t e db y w h o t h ee f f i c i e n c yo fe x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o ni sm u c hb e t t e rw h e ne l u t i n g 、析t 1 17 0 m e t h a n o lf r o ms p e c18a n de x t r a c t i n g 、析廿l5 0 m e t h a n 0 1 a f t e ri r r i t a t i o n 谢廿1f l u o r e s c e n tl a m p ，t h er e s u l t ss h o wa sf o l l o w s ：u n d e rt h et e m p e r a t u r e o f3 0 ，4 3 2 0p m o l m 2 - sl i g h ti n t e n s i t ya n dm c - l rc o n c e n t r a t i o no f5m g l ，诵mp i g m e n t s c o n c e n t r a t i o no f0 5m g m 1 t h eh a l f - l i f eo fm c l ri s1h o u r d i f f e r e n tp i g m e n ts o l u t i o n s h a v ed i f f e r e n tc a t a l y t i ce f f e c t sd u r i n gp h o t od e g r a d a t i o n , r e s u l t ss h o wt h a tt h em i x e d p i g m e n t si nc y a n o b a c t e r i ac e l l sh a v e ab e t t e rc a t a l y t i ce f f e c tt h a nt h eb o u g h tp i g m e n t s m c l rd e g r a d a t i o ni sa l s om o r ef a v o r a b l ei na l k a l i n ee n v i r o n m e n t , w h e nt e m p e r a t u r e i n c r e a s e s ，t h er a t eo fp h o t od e g r a d a t i o nw i l la l s ob e c o m e sf a s t e r u n d e rt h ec o n d i t i o n so fp h 9a n dt e m p e r a t u r eo f4 0 ，t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fm c l rr e a c h e s7 7 3 5 肛g 1 1 i na d d i t i o n ， t h el i g h ti n t e n s i t ya l s oh a sa ne f f e c to np h o t od e g r a d a t i o n ，t h eh i g h e rt h el i g h ti n t e n s i t yi s ，t h e f a s t e rt h ep h o t od e g r a d a t i o nr e a c t i o ng e t s k e y w o r d s ：m i c r o c y s t i n s ；h p l c ；s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；p h o t od e g r a d a t i o n ；p i g m e n t l i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： e l 期： d 吕- v l j 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名o 导师签名： 日 期： l ，苫6 。1v 第一章绪论 第一章绪论 1 1 我国河流湖泊富营养化现状及危害 1 1 1 我国河流湖泊富营养化现状 水体富营养化是指湖泊、水库和河流中接纳过多的氮和磷等营养物质，使水体的生 态结构与功能发生变化，导致藻类过量繁殖生长而出现的水华污染现象，其中蓝藻是引 起藻类水华污染的主要藻类【l 。3 1 。当水华严重时，水面形成厚厚的蓝绿色湖靛，散发出 难闻的气味，不仅破坏了健康、平衡的水生生态系统，而且因藻细胞破裂后释放出了多 种藻毒素而对饮用水的安全构成了严重的威胁。目前，我国除了云南滇池、江苏太湖和 安徽巢湖三大淡水湖泊已发生严重的蓝藻水华污染外，长江、黄河中下游的许多湖泊和 水库中也都相继发生了不同程度的蓝藻水华污染现象并检测到了藻毒素的存在。 面对天然淡水水体富营养化程度日益加剧和蓝藻水华暴发越来越频繁的局势，如何 控制蓝藻的过量繁殖生长和有效去除藻毒素，己成为我国乃至世界环境科学研究领域的 一个难题。 1 1 2 富营养化对环境的危害 蓝藻水华污染所带来的主要危害之一是产毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不 同类型的藻毒素，世界上2 5 7 0 的蓝藻水华可产生藻毒素【4 】。在已发现的各种不同藻 毒素种类中，微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n s ，m c ) 是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产 生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。研究结果显示m c 的主要靶器是肝脏，表现 为使肝脏充血肿大，严重时可导致肝出血和坏死。另据调查发现，饮用水中m c 的存在 与人群中原发性肝癌和大肠癌的发病率有明显的相关性【5 】。自1 8 7 8 年首次报道了动物由 于饮用含蓝藻的水而死亡以来【6 】，国内外因藻毒素引起的水生动物、鸟类、畜类甚至人 类中毒和死亡的事件频繁发生【7 8 】。蓝藻水华已成为我国乃至世界所面临的重大环境污 染问题之一。 微囊藻毒素基本结构是由7 个氨基酸组成的单环多肽，也称7 肽单环肝毒素，相对 分子量在1 0 0 0 左右，由于多肽可变位置上氨基酸种类的变化，导致了微囊藻毒素的多 样性。目前已发现了6 0 多种不同类型的微囊藻毒素们，其中毒性较大的的是m c l r 、 r r 和y r ( l 、r 、y 分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸) ( 图1 1 ) ，其主要差别是在环状 m c 组成中1 个氨基酸的不同。我国重点治理的“三湖”都有着较严重的微囊藻毒素污染， 太湖每年蓝藻爆发时水体中的藻毒素以m c r r 为主。我们在2 0 0 7 年通过采样分析测定 发现，我国太湖蓝藻爆发期间在水源水样中检测到m c l r 浓度为0 3 0m g l 和m c r r 浓度为1 1 6m e l 1 1 j ，远远超过世界卫生组织和我国卫生部规定的饮用水m c l r1 0 p l 浓度控制标准【1 2 j 。 江南大学硕士学位论文 m i c r o m i c r o m i c r o 图1 1 微囊藻毒素( m c ) 的结构 f i g 1 1s t r u c t u r eo fm i c r o e y s t i n s 1 2 微囊藻毒素的测定方法 目前，国内外检测m c 的方法有以下几类： 2 h h 第一章绪论 ( 一) 化学法：包括薄层层析法( t l c ) ，气相色谱法( g c ) ，液相色谱法( l c ) ，液质联 用法( h p l c m s ) ，毛细管电泳法( c e ) 等，不仅能定量精确的检测m c s ，可对不同的m c 作精确定性定量测定，运用恰当可测到各组分的p g l 级的含量。但是由于化学分析方 法需要复杂的前处理过程，并且所需的仪器价格昂贵，限制了它的实际应用。近年来， 随着新的萃取技术的出现，固相微萃取技术( s p m e ) 、基质固相分散萃取技术( m s p d e ) 【1 3 】 和免疫吸附萃取技术( i e ) t 1 4 j 等也应用于m c s 检测的前处理中。这些技术高效、快速、节 省时间，耗费有机溶剂极少甚至不用溶剂，提高了样品中m c s 的提取率，保证了检测 数据的准确性。 ( 二) 生物法：包括生物体法，酶抑制蛋白磷酸酶p p l p p 2 a 法。生物分析法用动物 急性毒性实验间接推算m c 的含量，结果较为直观、快速，但无法用于准确定量测定。 蛋白磷酸酶法利用m c 能够抑制蛋白磷酸酶p p l 和p p 2 a 活性的特点，以磷酸化蛋白为 底物，测定m c s 对蛋白磷酸化酶的抑制程度，即测定m c s 、磷酸化蛋白、蛋白磷酸化 酶反应后释放的磷酸盐的量来检测微囊藻毒素的量。蛋白磷酸酶法可以反映各种毒素的 总量、检测灵敏度高而且测定时间较短，在用于环境监测时具有优势。但蛋白磷酸酶法 的检测限度是p g 级，低于w h o 标准，对于各种m c s 的灵敏度也不同，不能够区分微 囊藻毒素和其他的蛋白磷酸酶抑制剂，测定的是m c s 的总量，如果蓝藻本身具有内源 蛋白磷酸酶活性，则有可能使p p i 的结果偏低。 ( 三) 免疫化学法：包括放射免疫法( r i a ) ，间接竞争酶联免疫法0 d e e l i s a ) ，直接竞 争酶联免疫法( d e e l i s a ) ，夹心免疫法( s a n d w i c h e l i s a ) 。免疫检测方法的原理是利用 微囊藻毒素诱发免疫反应产生抗体，利用抗体对抗原的特异性识别来对各种毒素进行检 测。样品处理简单，便于操作，被国内外同行广泛接受。近年来，免疫检测方法已发展 出多种单克隆抗体和多克隆抗体，用这两种抗体制成的m c s 酶联免疫测试试剂盒已商 品化。但是由于这些试剂盒所用抗体一般是针对m c l r 设计，使得它对于m c s 其他异 构体交叉反应性低，因此试剂盒对于许多天然存在的m c s 灵敏度差异较大，不能检测 所有的毒素。于是，能标记所有的m c s 同分异构体的单克隆抗体的制备技术成为免疫 方法应用发展的关键。 这些方法检测的毒素类型及检测侧重点有所不同，灵敏度差异大，对仪器及操作技 能的要求也各不相同。因此，检测毒素时，要依据样品来源、数量及实验目的，选择适 当的方法，也可将多种方法联合运用，相互验证和补充。 高效液相色谱( h p l c ) 法是目前测定微囊藻毒素最广泛的方法，h p l c 法准确灵敏， 检测下限低，可达5 0n g m l ，结果的重现性好。而且，定量检测的同时，还可分析出不 同的微囊藻毒素异构体。m c 的最大紫外吸收波长在2 3 8 2 4 0n n l 范围【l5 1 。我们的研究 结果也表明，用紫外可见光分光光度计2 0 0 3 0 0r i m 范围进行扫描，标准品m c r r 和 l r 都在2 3 9n m 处有最强的紫外吸收。对于流动相，一般采用乙腈水或甲醇水体系的 不同浓度梯度淋洗，在水相中加入一定比例的三氟乙酸或采用酸性的磷酸盐缓冲溶液以 保持酸性( p h2 5 左右) ，用c 18o d s 柱对m c 进行分离。因为h p l c 对m c 的检测限 为1 0m g l 左右，而天然水体中的m c 含量仅为g l 水平，因此水样一般要通过固相 3 江南大学硕士学位论文 萃取柱进行富集，经洗脱浓缩后才能进行h p l c 测定。 1 3 微囊藻毒素的提取纯化方法 m c 纯品缺少，价格昂贵，成为困扰研究人员对m c 进行深入研究的瓶颈问题之一， 因此迫切需要研究一种有效提取、纯化m c 的方法。 b o t e 等【1 6 】在世界上首先进行了m c 的提取提纯研究，确定出了多种不同的m c 提取提 纯方法。目前m c 提取提纯的过程主要包括三个步骤：1 、从藻细胞中提取m c 。2 、m c 提取液的浓缩。3 、采用不同分离技术对m c 进行提纯。 早期人们利用0 1m 的碳酸氢铵( p h8 4 ) 等溶液对m c 进行提取，并发现在高p h 下的 提取效果好于低p h 【1 7 1 。m ，o n i c a 等【1 8 】报道了辛醇甲醇水( 5 ：2 0 ：7 5 ) 的混合液提取m c 的方 法，提取效率高且操作简便。j a r k k o 等【l9 】发现5 乙酸溶液在提取m c 的过程中可以避免 提取藻细胞中的各种色素杂质，但提取m c 的效率却有所降低。目前普遍采用的提取m c 溶剂主要是不同比例甲醇水溶液，一般5 0 - 8 0 范围的甲醇溶液被认为是m c 的最有效 提取液。对于提取m c 的条件，一般采用搅拌、振荡和超声波振荡以及用沸水或用微波 炉加热等方法，在2 0 - - 4 0 范围内，温度的变化对m c 的提取效果基本没有影响1 2 。 m c 提取液浓缩主要采用蒸发和固相萃取2 种方法进行，蒸发的方法可以采用旋转蒸 发器在4 0 c 时进行负压旋转蒸发，也可通过吹空气或氮气的方法将提取液吹干。近年来 固相萃取成为浓缩的主要方法，一般采用c 1 8 为填料的反相柱或者采用o a s i sh l b ，固 相萃取方法使m c 提取液过固相萃取柱并经洗脱后，不仅能够使m c 得到浓缩，而且还能 对m c 进行初步的提纯。应用c 1 8 等不同类型的分离柱在h p l c 上根据m c 紫外吸收出峰 收取对应的流动相，是目前m c 提纯方面应用最普遍的方法 2 2 2 3 1 。p y o 等t 2 4 1 发现用5 的 乙酸提取m c 后，过氰基固相萃取柱，用7 0 乙腈洗脱后可以获得比用o d s 柱更好的m c 回收率和纯度。 1 4 微囊藻毒素去除技术发展和应用现状 1 4 1 吸附去除 吸附是一个简便易行且见效快的去除m c 的方法。目前已有的报道，大都是用各种 活性炭对m c 进行吸附。活性炭吸附m c 的能力与其中中孔( 孔径2 - 5 0n m ) 的体积有关， 而这又取决与制造活性炭的原料。许多研究都表明：不同原料的活性炭中具有微孔加中 孔的木炭是最有效。d o n a t i c 等人比较了8 种活性炭粉末的吸附效果，发现泥炭和椰壳炭 的效果最差，木炭的效果最好【2 5 1 。m o h a m e d 等人研究了不同种类的颗粒和粉末活性炭对 m c 的吸附，发现活性炭粉末的效果比活性炭颗粒的好；而不同种类的活性炭中木炭的 效果最好，非活性炭没有什么吸附效果【2 酬。p e n d l e t o n 等人也得到了同样的结果。他们认 为m c 的分子大小在二级微孔的孔径范围内中，所以活性炭中二级微孔和中孔的体积决 定了吸附m c 的能力1 2 7 。 一些研究表明，臭氧，氯等与活性炭联合作用可以提高m c 的去除效果。m a a t o u k 等研究了臭氧和粉末活性炭去除m c l r 的联合作用，结果表明采用0 0 7m g l 的臭氧和 4 第一章绪论 2 0m g m 的活性炭进行处理后，可将从1 4 至u 7 4n g l f l 勺m c l r 全部去刚硎。刘成等研究了 粉末活性炭与氯同时作用对m c 去除的效果1 2 9 1 ，发现粉末活性炭和氯同时投加可以提高 m c 的去除率2 0 以上，而粉末活性炭和氯在不同投加点投加时，则没有这种强化作用， 相反氯会不同程度地降低粉末活性炭的吸附效果( 降低5 1 0 ) 。他们认为是粉末活性 炭表面的官能团与h c l 0 作用催化了m c 的去除。 其它吸附材料方面，m o r r i s 等研究了天然粘土对m c 的吸附作用【3 0 】，发现在m c l r 初始浓度为4 8m g l 时，含高岭土和蒙脱土的细颗粒粘土材料可以去除8 1 的m c l r 。 m i l l e r 等的研究认为高有机碳含量和高粘土含量的土壤可以最有效地吸附和降解m c ， 并认为降解是去除m c 的一个限制性步骤1 3 。 闫海等对m c 吸附去除的研究表明：m c 的水溶性非常好，不易被吸附，活性炭对 其的吸附去除也并不理想，另外活性炭的使用还会带来过滤上的问题。而碳纳米管有令 人满意的吸附去除m c 的能力，但昂贵的价格使其不可能用于水处理实践【1 5 1 。从理论上 分析，m c l r 的正辛醇水分配系数( 1 0 9 d o w ) 从p h 为1 时的2 1 8 降到p h 为l o 时的 1 7 6 1 3 2 1 ，因此可以推测在爆发水华时的高p h ( 8 ) 条件下，采用吸附去除m c 的方法受 到限制。 1 4 2 生物降解 m c 为多肽结构，但是m c 的环状结构和间隔双键具有相当的稳定性，普通的蛋白 水解酶对它们不起作用，即使加热到3 0 0 c 仍能维持很长时间不分解，只有少数特殊的 微生物菌种才具备降解m c 的能力。 l a m 等用污水处理厂的混合微生物菌群进行了降解m c 的实验1 3 3 l ，发现需要2 5 d 以上才能将初始浓度为o 2 5m g m 的m c l r 全部降解。我国学者吕锡武等采用序批式 生物膜反应器对3 种m c 进行了生物处理【3 4 1 ，虽然发现混合菌种对m c 有生物降解能力， 但3d 内m c 的去除量都低于0 4m g l ，3dm c r r 、l r 和y r 的总去除量低于1 0m g l 。 c o u s i n s 等研究了水库中微生物菌群对m c l r 的可降解性【3 5 】，发现l 周以内m c l r 就 会发生降解，但降解速率很低。c h r i s t o f f e r s e n 等发现湖泊水体中的微生物菌群，大约8d 时间才可将初始0 1m g m 左右的m c l r 全部降解【3 6 】。可见，用混合茵对m c 进行处理 的效果并不理想。 在纯菌种降解m c 研究方面，澳大利亚学者j o n e s 和b o u r n e 等率先筛选出了能够降 解m c 的微生物菌种鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o m o n a s ) t 3 7 】，并对其降解m c 途径和分子机 理进行了研究。发现至少有3 种酶参与了m c l r 的代谢过程。第1 种酶是微囊藻毒素 酶( 包含3 3 6 个氨基酸残基的金属酶) ，它首先打开连接a d d a 与精氨酸的肽键，使环状 的m c l r 变成线型的m c l r 。第2 种酶是属于青霉素结合酶家族( 包含4 0 2 氨基酸残 基) ，进一步断裂线型m c l r 肽链上丙氨酸与亮氨酸的肽键，生成四肽化合物。第3 种 酶( 包含5 0 7 氨基酸残基的金属酶) 负责将四肽化合物更进一步降解，产物是更小的多肽 和氨基酸。他们还发现线性m c l r 和四肽化合物抑制5 0 鸡脑蛋白磷酸酶活性的浓度 都远远高于m c l r ，说明中间代谢产物的毒性明显低于m c l r 本身。 日本学者t a k e n a k a 等从湖泊表层水体分离出了对m c 有降解能力的铜绿假单胞菌 江南大学硕士学位论文 ( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 3 8 】，在初始5 0m g lm c l r 浓度下，2 0d 的去除率达9 0 以上， 并发现铜绿假单胞菌所分泌的碱性蛋白酶主要负责降解m c l r 。p a r k 等在蓝藻水华发 生的水样中也分离出了1 株具备对m c r r 、y r 和l r 都有降解能力的鞘氨醇单胞菌1 3 卅， 其对m c r r 和l r 的最大降解速率分别达到每天1 3 0 和5 4m g l 。此外，还发现温度 对生物降解m c 有较大影响，在3 0 时的生物降解速率最大。 闰海等在国内率先分离出了1 株对m c r r 和l r 都有很强降解能力的微生物菌种， 经鉴定为r a l s t o n i as o l a n a e c a m m ( r s 菌) 。该菌在m c r r 和l r 初始浓度分别为5 0 和3 0 m g l 条件下，3d 即可将m c 全部降解，日平均降解速率分别达到了1 6 7 和9 4m g l 【4 u j 。 并指出r s 菌酶催化降解m c r r 和l r 的途径是：首先切断( a d d a ) 与精氨酸的肽键，将 环状m c r r 和l r 转变为线型的m c r r 和l r ，此步骤与b o u r n e 报道的鞘氨醇单胞菌 酶催化降解m c l r 的第1 步骤一致。此后在r s 菌的第2 种降解酶催化下，将线型m c 肽链精氨酸氨基上的氢与肽链羧基上的羟基缩合脱水，进一步生成了具有2 个肽环的线 型m c r r 和1 个肽环的线型m c l r ，分别作为r s 茵酶催化降解m c r r 和l r 的最 终产物。 尽管还有其它学者在m c 的微生物降解方面进行了研究，但在如何采用基因工程技 术提高微生物降解m c 活性研究领域还有待于进一步加强。生物降解可以有效地去除 m c ，但是微生物作用缓慢，通常需要几天的时间。 1 4 3 氧化降解 氧化剂( 氯，臭氧等) 可以高效的降解m c 。最初人们认为氯化处理是无法去除m c 的， 但后来n i c h o l s o n 等人的研究指出氯化处理可以去除m c l r 4 ，条件是余氯浓度为o 5 m g l ，p h 低于8 ，处理时间3 0m i l l ，余氯浓度太低、p h 太高对去除m c 有负面影响。他 人的研究也指出在足够的氯剂量条件下，氯化处理可有效的去除藻毒素，但藻细胞在处 理中死亡解体会导致胞内的m c 释放。此外，还会产生有害的消毒副产物如三卤甲烷等 4 2 1 o 季颖等研究二氧化氯( c 1 0 2 ) j 6 j m c l r 的去除效果及反应特征1 4 3 】。结果表明， c 1 0 2 能够有效地去除水中的m c l r 。c 1 0 2 对m c l r 的去除率与c 1 0 2 投加量、反应时间成正 相关性，其中c 1 0 2 浓度对去除效果的影响较为明显。他们还发现p h 值对去除率也有重要 影响，当p h 值为1 2 5 或l o 5 6 时，对m c l r 去除率可达9 9 以上。 g a j d e k 等尝试了氧化降解m c l r 4 4 1 ，获得了满意的结果。陈一萍的研究表明， f e n t o n 试剂3 0m i n 内对m c 的去除率可达9 0 以上【4 5 1 。苑宝玲等研究了f e n t o n 试剂降 解饮用水中m c l r 的作用，得到f e n t o n 降解m c 的最佳反应条件：h 2 0 2 浓度为o 2 4 m o l l 、f e 2 + h 2 0 2 摩尔比l 9 、初始p h 值为2 3 5 、反应时间为4 5m i n ；并通过检测f e n t o n 反应中生成的羟基自由基，阐明了f e n t o n 催化氧化降解m c 的作用机制先生成某 种相对稳定的中间产物，然后异构化a d d a 基团的共轭双键，使a d d a 基团的结构发生 变化，从而降低其毒性 4 6 1 。 众多研究表明臭氧氧化能有效地降解m c 。据报道，1 2m g l 的臭氧浓度能去掉大 部分m c ，并且不会引起藻类细胞的裂解。r o s i t a n o 等【4 7 j 报道，m c 浓度为2 0p l 时，只 6 第一章绪论 要接触5m i n 后水中存在残余臭氧，即可将其1 0 0 去除。贾瑞宝等【4 8 j 的实验得出：投加 2 3m g l 的臭氧时，m c 的去除率可达6 7 ，当投量增至4 6m g l 时，m c 可被全部去除。 臭氧氧化技术的不足在于：臭氧不足以使m c 全部有机物矿质化，并可能形成副产物和 较多的可生物同化有机碳( a o c ) ；另外，臭氧氧化过程中存在气液传质和操作难以调控， 臭氧利用率低、投资大和运行成本相对昂贵等问题。这些不足限制了臭氧在处理m c 方 面的应用，开发利用太阳能的臭氧发生装置，是一个降低能耗和运行成本的有效方法。 上述氧化降解m c 的方法适合在较清洁的水中运用，而在水华发生条件下或有机负 荷高的情况下去除效果并不好。 1 4 4 光催化降解 近几年，有关光催化方法降解水中微量藻毒素的研究开始引起国际间关注，被认为 是极有前景的藻毒素处理技术。 许多研究都发现虽然m c 在阳光下或紫外光照射下均很稳定，不发生变化，但用 m 0 2 、腐殪质和蓝藻色素等作为光敏剂和催化剂时可以使m c 发生光降解。 二氧化钛( t i 0 2 ) 是常用的光降解催化剂，研究其光催化降解m c 的报道很多。f e i t z 等人的研究表明，m c 在日光或紫外光照射下均不发生变化，但在加入光催化剂t i 0 2 时才发生显著光解，在m c 初始为8 0p g l 时，其半衰期可降低到1 0m i n 左右【4 9 】。 在天然水体中，m c l r 的光解速率非常低，半衰期要达到9 0 1 2 0d 。如果在日光 照射下以腐殖质作为光敏剂，初始1 0 “g lm c 浓度下的半衰期可减少到1 0 5h i 5 0 l 。 k i y o m i 等人的研究发现，在野外条件下，阳光的照射使含有色素的蓝藻大量降解 毒素转化为无毒性且致突变性比m c 小的多的同分异构体【5 1 1 ，当有5m g m l 的蓝藻色素 存在时，m c l r 的光解半衰期只要5d ，但纯的m c 不易被光降解。他们还研究了紫外 线照射对藻毒素的光降解，藻毒素在其最大吸收波长附近的紫外线的照射下，很容易被 降解，当然降解也与光强有关。m c l r 在1 4 7i - t w c m 2 u v 的光照辐射下，半衰期为1 0 m i r a 在2 5 5 0 x w e m 2 u v 的光照下，1 0m i n 后被完全降解；而在更弱的紫外线照射下还 发现有同分异构体生成。 我国一些研究者通过对滇池蓝藻水华的研究后也发现蓝藻色素对m c 在天然水体 中的光降解有促进作用【5 2 1 ，色素含量决定m c 的降解程度。可见，色素是天然水体中加 速m c 光解的一个重要因素，其和m c 的光降解过程可能是维持水体中m c 浓度水平的 主要原因。 m c 光降解的研究多着眼于采用半导体材料t i 0 2 作为催化剂进行光催化降解，有关 水体中自然存在或产生的物质对光催化降解m c 的作用的研究尚不多见且不够深入，对 于天然水体中具体是什么物质( 如：具体是哪种色素) 是m c 降解的光敏剂，以及m c 在 这些催化剂或光敏剂作用下的降解机理和途径尚未见有报道。 7 江南大学硕士学位论文 1 5 论文的研究意义、研究目标和主要研究内容 1 5 1 研究意义 研究掌握天然水体中微囊藻毒素污染产生和消亡的规律，了解自然条件下微囊藻毒 素降解的机理和主要影响因素，对于开发针对微囊藻毒素去除的水处理技术，保障供水 水质有着重要的指导意义。光催化降解微囊藻毒素，处理条件温和，可以在自然条件下 自发的进行，紫外光和光催化生成的羟自由基o h 还具有强烈的抑止藻类生长和杀菌消 毒的能力。如果在供水处理中采用还可以去除饮用水中预氧化而产生的多种有害的微量 卤代烃，极大地提高了饮用水的安全性。近几年，有关光催化方法降解水中微量藻毒素 的研究开始引起国际间关注，被认为是极有前景的微囊藻毒素处理技术，国内虽然已经 有了大量光催化处理有机废水的研究，也有应用于饮用水处理的尝试，但以m c 作为降 解对象少见报道。目前关于微囊藻毒素光降解的研究多着眼于采用半导体材料t i 0 2 作为 催化剂进行光催化降解藻毒素，少有关于水体中自然存在或产生的物质对光催化降解微 囊藻毒素的作用的研究，对于天然水体中具体是什么物质( 如：具体是哪种色素) 是微囊 藻毒素降解的光敏剂，以及微囊囊藻毒素在这些催化剂或光敏剂作用下的降解分子途径 和机理尚未见有报道。 1 5 2 研究目标 ( 1 ) 研究分析确定微囊藻毒素的测定方法。 ( 2 ) 确定提取纯化天然水体中的藻毒素方法。 ( 3 ) 初步确定影响微囊藻毒素光降解的关键因素。 1 5 3 研究内容 ( 1 ) 微囊藻毒素测定：研究h p l c 测定m c 的操作条件，建立h p l c 定量测定m c - r r 和l r 的方法。 ( 2 ) 研究比较确定m c 的提取纯化方法，优化提取纯化条件。 ( 3 ) 研究确定在微囊藻毒素光降解中起关键作用的光敏物质。考察光照强度、p h 、 温度、色素浓度1 等对光降解反应的影响。 本论文为国家自然科学基金( 2 0 7 0 7 0 0 7 ) 资助项目 8 第二章高效液相色谱法测定微囊藻毒素 第二章高效液相色谱法测定微囊藻毒素 2 1 前言 高效液相色谱法是目前分离和检测微囊藻毒素最广泛的方法之一。h p l c 法准确灵 敏，检测下限低，可达5 0n g m l ，结果的重现性较好。而且，定量检测的同时，还可以 分析出不同的微囊藻毒素异构体，广泛用于m c 的分离和制备，本课题研究过程中均采 用h p l c 法测定微囊藻毒素。 2 2 材料和方法 2 2 1 实验材料及仪器 甲醇( m s l 9 2 2 0 0 1 ) 色谱纯美国t e d i a 公司 乙腈( a s l l 2 2 0 0 1 ) 色谱纯美国t e d i a 公司 三氟乙酸( t f a ) a r 中国医药上海化学试剂公司 水超纯水无锡华晶飘之霖有限公司 m c y s t - l c 、r r标准品瑞士a l e x i s 公司 h p l 1 0 0 高效液相色谱仪( h p l c ) 美国惠普公司 f i n p i p e t t e 移液：器：( z x 2 0 5 8 7 ) 热电( 上海) 仪器有限公司 2 2 2 样品的收集 水样藻样取自太湖蓝藻爆发期间( 2 0 0 7 年5 月- - , 2 0 0 7 年9 月) ，放于冰箱中在0 c 的 温度下保存，所有样品在4 8h 内完成萃取、净化和浓缩等处理过程。 2 2 3 色谱分析条件 分析色谱柱为美国安捷伦公司的s b c 1 8 ( 4 6 x 1 5 0m m ，z o r b a x5 岬) ；流动相为不 同体积比的乙腈一水一三氟乙酸( t f a ) 溶液，流速：0 8 1 0m l m i n ，进样量：1 0p l ，色谱 柱恒温箱设为2 0 ，紫外检测器。 2 3 结果与讨论 2 3 1 检测波长的选择 文献中对微囊藻毒素的检测波长描述在2 3 8 n m - 2 4 0 n m 1 5 1 略有差别，和各自的仪器 有关。我们在紫外和可见光分光光度计紫外区域2 0 0 3 0 0a m 范围内分别对m c r r 和 l r 标准品的出峰进行紫外吸收扫描，结果见图1 ，无论是m c r r 还是l r 都在2 3 9n m 左右有最大的紫外吸收峰。因此本文选择了2 3 9n m 作为定量测定m c r r 和l r 的检测 波长。在水样的测定中，毒素峰的确定是以出峰物质的紫外吸收扫描图的特征( 如图2 1 ) 和保留时间来确定。 9 江南大学硕士学位论文 图2 1m c - r r l r 的紫外吸收扫描谱图 f i g 2 1s c a n n i n gp r o f i l e so f a b s o r b a n c eo f m c - r r l ri nt h eu l t r a v i o l e tr a n g ef r o m2 0 0t o3 0 0 n l l l 配制了m c r r 浓度为2 0m g l 和m c l r 浓度为8 5m g l 的混合标准样品，根据 图2 1 显示m c r r 和l r 在紫外波长2 3 9n l l l 有最强吸收的依据，在h p l c 上注射混合 标准样品后，流动相：3 5 乙腈6 5 水( 含有0 0 5 的三氟乙酸) ；流速：o 8m l m i m 紫 外检测波长：2 3 9n m ；进样量l o 山条件下，结果显示( 如图2 2 ) ，m c - r r 和l r 的出峰 时间分别在4 6 9 9m i n 和1 0 1 9 5m i n 。 图2 - 2m c r r 和m c - l r 在h p l c 上的出峰图 f i g 2 - 2h p l cr e s u l t so f m c - r ra n dm c - l r 2 3 2 流动相组成的优化 对于肽类化合物的h p l c 分离，多采用甲醇磷酸盐缓冲液【5 3 j 或乙腈水( - - 氟乙酸调 节p h ) 和做流动相【5 4 1 。考虑到甲醇磷酸盐缓冲液体系由于盐浓度较高，分析后仪器管路 不及时冲洗容易出现结晶，堵塞色谱柱，因而对仪器要求高。而采用后者，色谱柱易清 洗，可节约分析时间。本文选用含o 0 5 三氟乙酸的超纯水，与乙腈配比做作为流动相， 三者的比例直接影响和决定着m c 的保留值和选择性，以及各组分之间的分离度。 当流动相中不加酸时，m c 的保留值较长且峰形很差，加入一定量的三氟乙酸( t f a ) 1 0 第二章高效液相色谱法测定微囊藻毒素 后，峰形较好，出峰时间也较合适( 如表2 1 ) 。考察了不同1 r 1 1 a 浓度对m c 保留值的影 响，当t f a 从0 0 5 逐渐增大到0 1 时，m c 的峰形也随酸度增大，愈来愈好。但考虑 到所用色谱柱耐酸能力有一定的限度，酸度越小越有利于色谱柱的保护，本文选定t f a 浓度为o 0 5 。 表2 1 流动相中含酸量对m c r r ，m c - l r 出峰时间的影响 t a b l e 2 1t h ei n f l u e n c eo f a c i dc o n c e n 仃a t i o no nm c r r l r sr e t e n t i o nt i m e