（环境工程专业论文）微生物絮凝剂产生菌的筛选及其絮凝特性研究.pdf

摘要 目前，絮凝方法已广泛用于水和废水的处理。絮凝剂的开发选择是其关键 技术之。传统的无机絮凝剡和合成有机高分子絮凝剖由于在安全性和污染环 境方面存在问题，限制了它们在食品加工、给水处理及发酵工业等方面的发展。 微生物絮凝剂( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t ，简称m b f ) 具有安全、高效、可生物降 解和对环境无害等 茏点，并且能产絮凝剂的微生物种类多，生长快，易于采取 生物工程手段实现产业化，因而微生物絮凝剂的开发是大有前途的。现在，我 国微生物絮凝剂的开发大多处在菌种筛选阶段，成功的微生物絮凝剂制剂投入 生产的报导尚不多见。从生产实际出发，本试验旨在筛选能够产生高效絮凝剂 的菌种，找出其产絮凝剂的适宜培养条件和适宜的絮凝外部条件，絮凝剂的提 ， 取和保存方式等，从而为微生物絮凝剂产业化生产提供菌种和基础数据。f 主要 试验结果如下： 、 l 、从三个代表性污泥样中分离出1 9 4 株细菌，经过初筛和复筛获得1 4 株 产高效m b f 的菌种，它们所产的m b f 对所选四种废水均有一定的处理效果。 但菌种在保存近半年，传代十次以上时，大部分存在失活问题，仅1 4 1 菌 株保持其高效的絮凝活性。i 一4 l 菌株为小细杆状，革兰氏染色阳性的幕性 厌氧菌。 2 、产m b f 的菌种筛选模式为：样品采集及其预处理一菌株分离纯化一 浅层发酵培养一絮凝剂的提取一絮凝活性检测一菌种取舍( 初筛、复筛) 一镜 检【1 6 1 0 0 倍油镜) 一各菌株絮凝活性的遗传稳定性检验一用实际废水作m b f 的絮凝赦果验证。 3 、i 一4 1 菌株所产m b f 的适宜培养条件为：浅层发酵培养基，起始p h 为7 0 ，3 7 。( _ 恒温培养箱中培养，每天用手充分摇动几次供氧，培养时间为6 0 小时。 4 、i 一4 1 菌株所产m b f 的适宜提取条件为：离心机转速3 0 0 0r m i n 时 离心时间2 0 m i n 。 5 、在测定i 一4 1 荫株所产m b f 对高岭土恳液的浊度去除率时，静置沉 降时间应以1 0 r a i n 为宜：其所产m b f 在介质p h 5 ，尤其是5 时，对高岭 土息液的絮凝效果好：其所产m b f 必须与c a ”协同作用才有絮凝活性。从经 济角度和絮凝效果综合考虑，在本试验的絮凝体系中，适宜的c a 。和m b f 的 加量为：1 c a c l ，溶液5 m l ，m b f0 5 2 0 m l 。 6 、在本实验室条件下，保存i 一4 l 菌株所产m b f 的适宜条件为：将新 、， 提取的m b f 放入清洁小试管中，封口膜封口后，置于4 。c 冰箱保村一。 ， 关键词：微生物絮凝剂菌株絮凝活性 p r e p a r a t i o n o fm i c r o b i a l f l o c c u l a n t p r o d u c i n g b a c t e r i aa n d t h e i rc h a r a c t e r i s z a t i o n a b s t r a c t f i o c c u i a t i o nh a sb e e nw i d e l yu s e di n w a s t e w a t e rt r e a t m e n to n eo ft h ek e y t e c h n o l o g i e s i s t h e d e v e l o p m e n t a n ds e l e c t i o no ff l o c c u l a n t t h et r a d i t i o n a l i n o r g a n i cf l o c c u l a n t sa n ds y n t h e t i cp o l y m e r i sf l o c c u l a n t sh a v e s o m eh a r m f f de f f e c t s o ne n v i r o m e n t a ls a f e t y w h i c hl i m i tt h e i re x t e n s i v ea p p l i c a t i o ni nf o o dp r o c e s s i n g ， w a t e rs u p p l yt r e a t m e n ta n df e r m e n t a t i o ni n d u s t r ye t c o nt h ec o n t r a r y , m i c r o b i a l f l o c c u l a n t ( m b f ) h a s s o m e a d v a n t a g e s ，s u c h a s h i g hs a f e t y a n d e f f i c i e n c y ， b i o d e g r a d a b l i l i t y a n dl e s sp o l l u t i o na n dt h e r eo r ev a r i o u ss t r a i n so ff l o c c u l a n t - p r o d u c i n gm i c r o b a l s ，t h e y h a v ef a s t g r o w t h r a t ea n da r e e a s y t ob e a p p l i e d i n b i o e n g i n e e r i n gi n d u s t l y t h e r e f o r et h ed e v e l o p m e n to fm b fh a v em a n yp r o m i s i n g p r o s p e c t s h o w e v e r , t h ed e v e l o p m e n t so f m b f u pt on o w a r ei nt h es t a g eo fs t r a i n s s c r e e n i n go nt h ew h o l ei no u rc o u n t r ya n d t h er e p o r t so ns u c c e s s f u lp r o d u c t i o no f m b fa r er a r et h i ss t u d ya i m e da ts c r e e n i n ge f f i c i e n ts t r a i n s ，f i n d i n gt h e i rp r o p e r c u h i v a t i o nc o n d i t i o n sa n d i m p r o v i n gt e c h n i q u e s f o r e x t r a c t i o n ，s t o r a g e a n d a p p l i c a t i o no f t h ep r o d u c e dm b et h ea n t h o rh o p e dt of u r n i s hs o m es t r a i n sa n dd a t a f o ri n d u s t r l i z e dp r o d n c t i o no fm b k t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： 1 a m o n gt h e 19 4b a c t e r i a ls t r a i n si s o l a t e df r o mt h r e er e p r e s e n t a t i v e s l u d g e s a m p l e s ，t 4b a c t e r i a ，w h i c hc o u l dp r o d u c ee f f i c i e n tm b f , w e r eo b t a i n e da l t e r s c r e e n i n g a n dr e s c r e e n i n gt h em b fp r o d u c e d b yt h e s e 1 4s t r a i n sh a ds h o w n p o s i t i v ee f f e c t so n t r e a t m e n to f p h a r m a c e u t i cs e w a g e ，d o m e s t i cs e w a g e ，b l u ei n ka n d i n k s e w a g ef o ! ) h o w e v e r ；m o s to ft h es t r a i n sl o s tt h e i ra b i l i t i e si n p r o d u c i n g e f f e c t i v em b f e x c e p tt h e 1 - 4 1s t r a i n sa f t e ro v e r1 0t i m e so f r e g e n e r a t i o ni na b o u t h a l fay e a r1 - 4 1i sab a c i l l u s ，g + a m p h i b a c t e r i a m ，w h i c hc o u l d k e e pa c t i v i t y i n p r o d u c i n ge f f e c t i v em b f , a f t e rr e g e n e r a t i o n s 2 7 l h e s c r e e n i n gp r o c e d u r e o f m b f p r o d u c i n g b a c t e r i ai s ：c o l l e c t i o na n d p r e t r e a t m e n t o fs l u d g e s a m p l e s - s e p a r a t i o n a n dp u r i f i c a t i o no fb a c t e r i as t r a i n s - - - s h a l l o w l a y e r f e r m e n t a l i o nc u l t i v a t i o n - - f l o c c u l a n te x t r a c t i o njf l o c c u l a t i o n a c t i v i t y d e t e r m i n a t i o n - - + s e l e c t i o no fb a c t e r i a ls t r a i n s ( s c r e e n i n ga n dr e s c r e e n i n g ) - + m i c r o s c o p yt e s t ( 1 6 x10 0 ) 斗e x a m i n a t i o no fh e r e d i t a r ys t a b i l i t yo fb a c t e r i a s f l o c c u l a t i o n a c t i v i t y - - v e r i f i c a t i o n o ft h ef l o c c u l a t i o n e e f f i c i e n c y o fm b fi n p r a c t i c a lw a s t e w a t e r 3 t h eo p t i m a lc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sf o r1 - 4 1s t r a i nt op r o d u c eh i g h l ye f f i c i e n t m b fw e r et oc u l t i v a t ei tw i t hs h a l l o w l a y e rf e r m e n t a t i o ns u b s t r a t ef p h7 0 ) a t3 7 。c f o r6 0h r s t h es u b s t r a t es h o u l db es h a k e dm a n u a l l yf o rs e v e r a lt i m e se a c hd a y 4 t h e a p p r o p r i a t e e x t r a c t i o nc o n d i t i o n sf o rm b f p r o d u c e db y1 - 4 1 w e r et o c e n t r i f u g et h ec u l t i v a t i o ns u b s t r a t eu n d e r3 0 0 0 r m i nf o rl e s st h a n2 0m i n u t e s 5 t h es u i t a b l es e d i m e n t a t i o nt i m es h o u l db el e s st h a n1 0m i n u t e sd u r i n g d e t e r m i n a t i o no fr e m o v a lr a t eo fk a o l i ns u s p e n s i o n t u r b i d i t yb ym b fp r o d u c e db y i 一 41s t r a i n t h eh i g h e s tf l o c c u l a t i o ne f f i c i e n c yw a sa c h i e v e dw h e nt h ep hv a l u eo ft h e m e d i u mw a s 5 h i g h e rf l o c c u l a t i o na c t i v i t yo f m b f w a ss h o w nw h e nc 矛+ i o n sw e r e a d d e d i nc o n s i d e r a t i o no fb o t he c o n o m ya n df l o c c u l a t i o ne f f i c i e n c y , t h eo p t i m a l a d d i t i o n so fm b fa n dc a “i o nw e r e0 5 - 2 ，0 m la n d5 m l 1 c a c l 2s o l u t i o n ， r e s p e c t i v e l y 6 t h ea p p r o p r i c a t es t o r a g ec o n d i t i o n so fm b f p r o d u c e db y1 - 4 1s t r a i n si nt h i s e x p e r i m e n tw e r et op u tt h el a t e s t e x t r a c t e dm b fi n t oc l e a np r e t t yt e s tt u b ea n d e n c l o s ei tw i t hm e m b r a n e ，t h e ns t o r ei ti nr e f r i g e r a t o ra t4 。c k e yw o r d s ：m i c r o b i a lf l o c c u l a n t ， b a c t e r i as t r a i n ，f l o e c u l a t i o na c t i v i t y 4 文献综述 水是生命的起源，是人类和生物赖以生存不可缺少的物质，是发展工业的 重要条件和农业的命脉。随着经济的高速发展和人i l l 的增长，我国每年的用 水量和污水摊放最也在增力f j ，污水处理问题日益严峻，给水处理问题也不容 忽桃。目前，水和废水的处理方法主要有生化、离子交换、吸附、化学氧化、 电渗析和絮凝沉淀等多种。其中应用最普遍、成本较低的处理方法是絮凝沉 淀法【l i 。在絮凝沉淀法处理废水中，絮凝剂的开发选择是其关键技术之一。 1 、絮凝剂的分类 在液体中，用作聚集粘附并使之生成絮状物的药剂称为絮凝剂。它是絮凝 沉淀法处理水和废水时必不可少的药剂。按生产方式，通常絮凝剂可分三类： 无机絮凝剂，主要有铁系( f e c l 3 、f e s o 。及其多聚物) 和铝系( a 1 c i ，、a 1 2 ( s 0 4 ) 3 及其多聚物) ；合成有机高分子絮凝剂，它分阳离子型、阴离子型及非离子 型。阳离子型主要有聚胺类、几丁质等，阴离子型主要有海藻酸( 钠) 聚丙烯 酸( 钠) 、羟甲基纤维索等，非离子型主要是聚丙烯酰胺类； 天然生物高分 子絮凝剂，它包括微生物絮凝剂和其它生物高分子有机物如甲壳素等。 2 、无机絮凝剂和合成有机絮凝剂的发展和应用现状 无机絮凝剂中的硫酸铝是世界上水和废水处理中使用最早、最多的絮凝 剂。自1 9 世纪末叶美国首先将硫酸铝用于给水处理以来，一直就被广泛采用。 但用于水处理时，存在成本高，腐蚀性大，在某些场合净水效果不理想的不足， 所以市场逐渐被聚铝等无机高分子絮凝剂所占领，聚合氯化铝( 简称聚铝，代 号p a c ) 被称为7 0 年代划时代的絮凝剂。在铁盐与铝盐相似絮凝作用机理的 启迪下，人们设想并开发了铁系无机高分子絮凝剂。7 0 年代中期，聚合硫酸 铁( 简称聚铁，代号p f s ) 问世口j 。p f s 对高浊度废水处理效果显著，而对低 浊度废水，如非洪水期的湘江水处理，反而不及铁系的另一絮凝剂三氯化 铁。在p f s 问世后，无机新型高分子絮凝剂的研制主要向引入其他离子，制 备复合型絮凝剂方向发展。8 0 年代末，汉迪化学公司研制出新型絮凝剂碱式 硅酸硫酸铝( p a s s ) 。p a s s 是一种碱式多核羟基硫酸铝复合物，有较多的反 应性铝，因此，能生成高密度的絮状物，沉降迅速，和其他铝盐絮凝剂相比， 在冷水温度下( 1 0 。c ) 效力不变，和p a c 比较，腐蚀性更小。另外，较早的复合 型絮凝剂如杭州硫酸厂研制的聚硫氯化铝，成品中还弓l 入了铁，使复合絮凝剂 兼具铝盐和铁盐絮凝剂的性质，处理高浊度水时，药剂投放量仅相当于硫酸铝 或p a c 的三分之一左右p 1 。综观无机絮凝荆的发展过程，不难看出，其发展 是由低分子到高分子，单一型到复合型。无机高分子絮凝剂对各种复杂成分的 水处理适用性强，可有效地去除细微悬浮颗粒，但生成的絮体不及有机高分子 生成的絮体大。单独使用无机絮凝剂投药量大，目前已较少采用。并且，铝盐 具有毒性，会影响人体健康如诱发老年痴呆症，可毒害动植物、防碍其生长和 繁殖。还易使材料遭到腐蚀。铁盐会造成处理水中带颜色，高浓度的铁也会对 人类健康和生态环境产生不利影响 与无机絮凝剂相比，合成有机高分子絮凝剂用量少，絮凝速度快，受共存 盐类、介质p h 及环境温度影响小，生成污泥量也少；而且有机高分子絮凝剂 分子可带一c o o 一、一n h 一、s 0 3 、一o h 等亲电基团，可具链状、环状等多 种结构，利于污染物进入絮体，脱色性好口l 。一般有机絮凝剂的色度去除较无 机絮凝剂高2 0 左右。但台成高分子絮凝剂其单体或水解、降解产物常常有 毒，如聚丙烯酰胺( 代号p a m ) 的单体，有神经毒性和致畸、致癌、致突变 的“三致”效应p 。 目前，无机絮凝剂和合成有机高分子絮凝剂大多作为澄清剂用于废水处 理、纺织、冶金、造纸和土木疏竣施工等行业h 1 絮凝剂还广泛用于食品及发 酵工业，可以说絮凝剂的使用已渗透到当今社会生活的各个方面。由于无机絮 凝剂和合成有机高分子絮凝剂虽具自身优点，但在安全性和污染环境方面存在 问题，限制了它们在食品加工，给水处理及发酵工业等方面的发展。 3 、微生物絮凝剂及其优点 相比之下，天然生物高分子絮凝剂对人体无害，可被生物降解，对生态环 境也不存在不利影响，远比前两类絮凝剂安全，而徽生物絮凝荆是天然生物高 分子絮凝剂的重要种类。能产生絮凝剂的微生物种类多，生长快，易于采取生 物工程手段实现产业化，因而微生物絮凝刘在生物絮凝剂中最具发展前途。 微生物絮凝剂( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t ，简称m b f ) 是某些种类的细菌、 放线菌、霉菌、酵母等在特定培养条件下，其生长代谢至一定阶段产生的具有 絮凝活性的代谢产物”7 4 ”。其主要活性成分是具有两性多聚电解质特性的蛋白 质，多糖、核酸类生物高分子化合物；它们通过其电荷性质和高分子特性在液 体介质中起电荷中和、吸附、桥联、网捕等作用，使胶体脱稳、絮凝沉淀、固 液分离1 3 0 - 3 “。 4 、微生物絮凝剂的国内外研究现状 微生物絮凝作用首先是l o u i sp a s t e u r 在酵母中观察到的1 6 i 。这里的“絮凝 作用”是指细胞的聚集现象当时运用该种“絮凝”主要为从培养液中分离出 微生物。后来发现用絮凝化酵母代替非絮凝化酵母，可获得较好质量的啤酒 最早的微生物絮凝剂主要就是用于食品及生物制药。 j n a k a m u r a 等人岬j ，早在1 9 7 6 年就对能产生絮凝效果的微生物进行了研 究。从霉菌、细菌、放线菌、酵母菌等2 1 4 种菌株中，筛选出1 9 种具有絮凝 能力的微生物。其中霉菌g 种，细菌5 种，放线菌5 种，酵母菌1 种，其中对 面包酵母絮凝能力最好的絮凝剂为酱油曲霉a j 7 0 0 2 生产的絮凝剂效果最好 ( a s p e r g i l l u s ，s o j a e ) a j t 0 0 2 1 9 9 5 年h t a k a g i 等人p ”，研究了拟青霉属( p a e c i l o m y c e ss p i 1 ) 微生物生 产的絮凝剂采用乙醇沉淀和凝胶色谱法精制，得到了称为p f l 0 1 的絮凝剂 这种微生物絮凝剂的分子量约为3 0 万，主要成分是半乳糖胺p f l 0 1 对枯草 杆菌，大肠杆菌，啤酒酵母，红血细胞、活性污泥，纤维素粉、羧甲基纤维素、 活性炭、硅藻士、氧化铝等，均有良好的絮凝效果 r k u r , m e 等人研究活性污泥法处理酞酚脂废水时发现，红平红球菌 ( r h o d o o a c ：c u s ，e r y t h r o p o l i s ) ，该茵在日本早田土壤中常见，当废水和活性污泥 中存在红平红球菌时，不但除酞酸酯的效率高，而且处理液透明，污泥沉降性 良好已研制成微生物絮凝剂n o c 1 可用于畜产废水处理，膨胀污泥的沉 降，瓦厂废水处理及纸浆废水( 黑液) 颜料废水等有色废水的脱色，效果显著。 李兆龙等在1 9 9 1 年时认为n o c l 絮凝剂是最好的微生物絮凝剂”1 。1 9 9 4 年 文献报导：n o c l 絮凝剂为唯一用于下水工程的微生物絮凝剂。 美国、日本、英国、法国，德国、前苏联、芬兰、葡萄牙、以色列、韩国 和我国对微生物絮凝剂进行了大量的研究p 】。取得了一些初步的研究成果。国 外微生物絮凝剂的商业化生产始于9 0 年代。9 0 年代以来，国内有关微生物絮 凝剂的报导日渐增多，但大多都在菌种筛选阶段，成功的微生物絮凝剂制剂投 入生产的报导尚不多见。 陆茂林等1 4 所在的江苏微生物研究所在土壤和污泥中筛选出两株絮凝活性 较高，并且絮凝活性稳定的诺卡氏菌。并对其适宜培养基，培养时间和培养液 p h 变化与絮凝活性之间的关系进行r 研究。 李智良p l 等所在的中固科学院成都生物研究所用常规的细菌分离纯化方法 从废水、土壤、活性污泥中分离筛选初步获得6 株微生物絮凝剂产生菌，用其 发酵离心上清液对造纸黑液，皮革废水，偶氮染料废水，硫化染料废水，电镀 废水，彩印制板废水，石油化工废水，造币废水及蓝黑水，碳素墨水等进行的 絮凝试验表明，废水固液分离效果良好，c o d 去除率5 5 9 8 ，悬浮物，色 度、浊度去除率9 0 以上。 庄源益0 1 等所在的南开大学环境科学系，在天津市区和郊区土壤中分离出 的影种荫株中筛选出六株对水中染料有较好的絮凝脱色作用的菌株，利用其培 养淑对代表性的活性、酸性，直接、酸性媒介和直接耐晒等染料水溶液进行了 探索性的絮凝实验。所筛菌种培养液对直接深棕染料，脱色率可达9 0 以上。 对直接黑染料生产废水稀释液的脱色率为6 0 左右，对其它染料脱色效果不 显著。 宫小燕等所在的人连理工大学环境科学与工程系，在污水处理厂活性污 泥中分离筛选获得l 株具有稳定絮凝性状的菌株，经初步鉴定为假单胞菌属， p s c u d o m o n a ss p g x 厂1 。并对影响该菌的絮凝活性条件进行了初步研究。 贾民生等”“所在的上海大学环境科学系在污水处理厂的回流污泥及俞经浦 底泥中分离，筛选出3 株絮凝剂产生菌。该菌株所产培养液可使土壤悬液浊度 去除率达9 9 以上，使碱性染料废水c o d 去除率为7 0 左右，色度去除为9 2 左右。 总之，目前国内对微生物絮凝剂的研究，大多处在菌种筛选和菌株培养液 对废水处理的实验室小试阶段。而当前我国水处理药剂的生产正面i i 盎着挑战， 一是国外絮凝剂的竞争越来越激烈，二是人们对环境质量的客观要求也越来越 严，新型絮凝剂的开发研究己显得十分重要，天然高分子絮凝剂以其优良的絮 凝性、不致病性及安全性、可生物降解性，正引起世人的普遍关注。而微生物 絮凝剂是天然生物高分子絮凝剂的重要种类，能产生絮凝剂的微生物种类多， 生长快，易于采取工程手段实现产业化，因而微生物絮凝剂在生物絮凝剂中最 具发展前途。现阶段，开发微生物絮凝剂的关键是筛选优良、高效、具有稳定 絮凝性状的菌株，找出其适宜培养条件和相应的絮凝机理，从而为我国的微生 物絮凝剂产业化生产奠定坚实的物质和理论基础。 引言 目前，絮凝方法已广泛用于各种工业废水的处理。用絮凝法处理废水，当 然要用到絮凝剂。按f ! 生产方式，通常可将絮凝剂分为三类：( 1 ) 无机絮凝剂， 主要有铁系( f e c l 、f e s o 。及其多聚物) 和铝系( a 1 c i ，、a 1 ，( s o 。) ，及其多聚 物) 。( 2 ) 合成有机高分子絮凝剂，它分阳离子型、阴离子型及非离子型。阳 离子型主要有聚胺类、几丁质等。阴离子型主要有海藻酸( 钠) 、聚丙烯酸( 钠) 、 羟甲基纤维素等，非离子型主要是聚丙烯酰胺类。( 3 ) 天然生物高分子絮凝剂， 它包括微生物絮凝剂和其它生物高分子有机物，如甲壳素等。 由于铝盐具有毒性，会影响人类健康；铁盐会造成处理水中带有颜色。高 浓度时铁也会对人类健康和生态环境产生不利影响。合成有机高分子絮凝剂有 一定的毒性，如聚丙烯酰胺的单体，有神经毒性和“三致”效应( 致畸、致癌、 致突变) 。因此这些絮凝剂的应用受到很大限制。 相比之下，天然生物絮凝剂对人体无害，义可被生物降解，对生态环境也 不存在不利影响，远比前两类絮凝剂安全，而微生物絮凝剂是天然生物高分子 絮凝剂的重要种类。能产生絮凝剂的微生物种类多，生长快，易于采取生物工 程手段实现产业化，因而微生物絮凝剂在生物絮凝剂中最具发展前途。微生物 絮凝剂的研制成本高，目前尚处在实验研究阶段，但由于微生物絮凝剂的种种 优点，随着研究的深入，用其代替污水处理中所使用的无机盐絮凝剂和合成有 机高分子絮凝剂将为期不远。 本试验研究的目的就是：筛选能够产生高效絮凝剂的菌种，找出其产絮凝 剂的适宜培养条件和适宜的絮凝外部条件，絮凝剂的提取和保存方式等，从而 为微生物絮凝剂产业化生产提供菌种和基础数据。 1 试验材料 11供试污泥 ( i ) 混台污泥：唐家桥污水处理厂消化池污泥； ( i i ) 生活污泥：西南农业大学3 号门污水沟污泥： ( i i i ) 工业污泥：北碚大新制药厂废水排放口污泥。 分三批从上述污泥样品中分离筛选获得产m b f 的菌种 1 2 供试废水 ( 1 ) 4 0 0 0 m g l 高岭土悬液：过6 0 0 目筛的高岭土加水搅拌均匀，镧成 4 0 0 0 m g l 悬液，其0 d 6 6 0 = 1 3 5 5 ( o d 为波长6 6 0 n m 处的光密度值，下同) ( 2 ) m b f 絮凝效果验证时所用污水 ( 1 ) 生活污永：取自西南农业大学教师生活区谗污沟，其o d m = o 1 8 9 。 ( i i ) 制药厂污水：取自北碚大新制药厂废水掉放口，其o d 6 。= 0 2 1 3 ，c o e - = l11 6 5 ( m g l ) 。 ( i n ) 蓝黑水：市售红岩牌蓝黑墨水稀释而成，其o d 6 6 0 = o 1 0 6 ，c o d _ = 1 4 8 4 ( m g l ) 。 ( i v ) 0 2 墨汁永：市售三峡脖黑汁稀释而成，其o d = 0 4 0 4 1 3 供试培养基 ( 1 ) 菌种分离用培养基：i 、i i l 批分离时用牛内膏蛋白胨固体培养基( g l ) ： 牛肉膏5 0 ，蛋白胨1 0 0 ，氮f 七钠5 0 ，水1 0 0 0 m | ，琼脂2 o 左右，p h 7 2 7 4 、 1 2 l 。c ，湿热灭菌3 0 m i n 。1 1 批分离时用葡萄糖牛肉膏蛋白胨固体培养摹( l ) ： 葡萄糖1 0 0 ，牛肉膏5 0 ，蛋白胨5 0 ，氧化钠5 0 ，去离子水1 0 0 0 m l ，营养琼 h l5 2o ，p i t 7 0 - 7 2 ，1 2 1 0 c 温热灭菌3 0 r a i n 。 ( 2 ) 蔺种浅层发酵用培养基：牛肉膏蛋白胨培养基( g l ) ：牛肉膏5 0 ，蛋白 o 胨1 0 0 ，氯化钠5 0 ，水1 0 0 0 m l ，p i t 7 2 4 7 4 ，1 2 i 。c 湿热灭菌3 0 m i n 2 试验方法 2 1 微生物絮凝剂( m b f ) 产生菌的筛选 2l i 蒲种分离 采用常规稀释法和划线纯培养法。将污泥样品逐级稀释制成1 0 ，1 0 ， 1 0 4 各种稀释度的样品溶液，采用平板涂布法，涂布于分离用培养基表面上， 倒置于3 7 ”c 恒温培养箱中培养l 3 天，选择菌落数3 0 - 3 0 0 之间的平皿( 中 = 1 0 c m ) ，将单个优势菌落分别挑取接种于分离用培养基试管斜面上。多次划 线分离，直至获取纯菌种，并对之编号。 2 12 菌种浅层发酵培养 将分离获得的各菌株分别接入装有3 0 m l 培养基的1 5 0 m l 三角瓶中，置于 恒温箱中3 7 c 培养6 0 - 7 2 小时，每天用手克分摇动2 - 4 次。 2 1 _ 3 絮凝剂的提取 菌株发酵培养液以3 0 0 0r m i n 转速离心1 0 分钟后，取其上清液。 2 1 4 m b f 絮凝活性的检测 考虑到检测的快速性及低成本性，检测指标采用o d 。值分别计算其絮凝 活性及浊度去除率。 2l4l 絮凝活性的检测与计斡 虹吸2 0 m l4 0 0 0 m g l 。高岭上息液入2 5 m l 沉降筒中，加入2 m ll c a c i ，溶 液和2 m l 絮凝剂，l 下振荡，摇匀，静置沉降。初筛时以肉眼观察为主( 看 高岭土是否凝成较大颗粒下沉) 。复筛时，静置沉降2 小时后，取其上清液于 7 2 2 型分光光度i 1 上，测其o d 。觚，同时以不接菌种的发酵培养液作对_ ! f i 。 絮凝活性汁算公式： f a = i o d 删( 科挂址p ；- l 一i o d 6 “ ( 埘蚰)( 1 ) 与培养基对j 的辛f i 对絮凝率： l _ ：丝型霎堡螋唑圳o ( 2 ) 上“一面忑五；一一” 弘7 21 4 2 浊度去除率的检测与计锋 称0 2 9 高岭土于5 0 m l 量筒中，加水4 3 m l 摇匀，加2 m l 絮凝剂和5 m l 1 g a o l ，溶液。上下振荡摇匀，静置沉降1 0 r a i n 、取其卜清液用7 2 2 型分光光度 计测o d 。 浊度去除率公式： 睹堕皆l o 咄 ( 3 ) 2 1 5m b f 对实际废水的絮凝效果验证 在2 5 0 m l 烧杯中加入2 0 0 m l 废水，5 m l1 c a c l 2 溶液和t o m l 絮凝剂，用 玻棒快搅1 0 0 次左右，慢搅8 0 次左右，静置沉降l 小时后，取表层上清液， 用高锰酸钾法 9 l l l 其c o d 。，用7 2 2 型分光光度计测其o d 6 。，并按公式( 3 ) 计算浊度去除率。 2 2 产m b f 的菌株适宜培养条件的确定 2 2 1 培养基用量的确定 为了确定浅层培养基中适宜的培养基用量，特选择i i i 1 7 、i i i 一1 8 、i i i 一 2 6 、i i i 一2 8 、i i i 一4 4 进行试验以研究培养液体积对所产m b f 絮凝活性的影响。 其它条件方法不变，只将培养基体积分别设定为3 0 m l 、4 0 m l 、5 0 m l ，同时以 3 0 m l 不接菌种的发酵培养液作对照。 2 2 2 供氖方式和培养时间的确定 选具有稳定絮凝活性的i 一4 1 菌株，同时以i 一1 3 菌株作对比进行试验， 设计盘l j 下： 供氧条件选a 、b 两种方式：a ：恒温培养箱，每天早晚甩手充分摇动几 次。b ：用摇床( d h z c 型大容量恒温振荡器) 进行i 剪暂振荡培养。具体操 作参数为：静置培养1 2 小时，然后1 5 0r m i n 连续振荡培养1 2 小时。再荤复 上述过程2 次，共培养7 2 小时。 控制温度：均为3 7 c 培养时问分六个阶段研究：当i 1 3 和i 一4 1 两株菌分别被培养1 2 、2 4 、 3 6 、4 8 、6 0 、7 2 小时后，取出进行观察、分析及絮凝活性检测。 2 2 3 培养基起始p h 的确定 浅层发酵用培养基起始p h 分别设定为5 、6 、7 、8 、9 、1 0 、1 1 、1 2 ，用 1 0 n a o h 和1 ：3h c l 调节培养基起始p h 至设定值后，1 2 1 。c 灭荫3 0 m i n ， 接入l 一4 1 号菌株进行浅层液体发酵培养。培养6 0 h 后，提取絮凝剂，以起 始p h 为7 的发酵培养基作对照作絮凝活性检测试验。并计算e 札”茸值，从而 确定i 4 l 菌株的适宜起始p h 。 2 3 m b f 提取条件的确定 i 一4 l 菌株经过适宜培养条件培养后，取其菌体培养液，在离心机转速 为3 0 0 0r m i n 条件下，改变离心时间。分别检洲离心时间为1 0 、2 0 、4 0 、6 0 m i n 时所提取的m b f 对高岭土悬液的浊度去除率( 方法2 1 4 2 ) 。 2 4 m b f 絮凝条件的确定 2 , 4 1 浊度去除率曲线的测定 ( 用方法2 1 4 2 ) 测定h f l a i 一4 l 菌株所产m b f 后，静置沉降时间分别 为5 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 m i n 时m b f 对高岭土悬液的浊度去除率。同 时分别以2 m l 去离子水和2 m l 没接菌种的发酵培养液作对比试验。 2 4 ，2 介质p h 的确定 在烧杯中先加入4 3 m l 水，5 m l1 c a c l 2 ，调p h 分别为3 、5 ，7 、9 、l l 倒入装有o 2 9 高岭土的5 0 m l 量筒中，摇匀。加2 m li 一4 l 菌株所产的m b f ， 转置3 次，摇匀，静置沉降l o m i n 后，用7 2 2 型分光光度计测其上清液o d 。 值，并计算浊度去除率。同时以2 m l 水代替2 m l 絮凝剂作对比试验。 24 3 助凝剂c a c l ，用量的确定 在5 0 m l 量筒中加入0 2 9 高岭土，加4 0 m l 水撂匀，加入2 m li 一4 l 菌株 所产絮凝剂，分别加入1 c a c l 2 溶液0 、l 、3 、5 ，7 m l 后，补加去离子水至 5 0 m l 刻度。转置3 次，摇匀，静置沉降1 0 r a i n ，取上清液测其o d “o 值，计算 浊度去除率。同时以2 m l 水代替2 m l 絮凝剂作对比实验。 24 4 絮凝剂用量的确定 在5 0 m l 量筒中加入0 2 9 高岭土，加4 0 m l 水摇匀，先加l c a c l 2 溶液5 m l 后，分g , j h u 入i 一4 l 菌株所产絮凝荆0 、0 5 、l 、2 、4 、6 m l ， 加去离子水 至5 0 m l 刻度，转置3 次，摇匀，静置沉降1 0 m i n ，取其上清液，测o d 6 6 0 值， 计算浊度去除率。 2 5m b f 保存条件的确定 将离心所获新鲜的i 一4 1 菌株所产m b f 分装于清洁小试管中，每管约 8 m l ，试管口用封口膜封好。分别置于4 。c 冰箱保存和室温( 2 1 5 0 c ) 保存。 分别测定保存0 、l 、2 、4 、7 天后m b f 对高岭土悬液浊度去除率( 方法同2 1 4 2 ) 。 3 结果与讨论 3 1 m b f 产生菌的分离与筛选 31 1 菌种的分离、初筛与复筛 采用常规稀释法和划线纯培养法。从三个污泥样中分离出1 9 4 株细菌。第 1 批5 0 株，1 1 批9 0 株，l i i 批5 4 株。经过浅层发酵培养和絮凝活性检测。初 筛时，由肉眼观察高蛉土絮凝情况，可知有3 4 株细菌有产m b f 的潜能。其 中第1 批1 0 株，i i 批1 0 株，i i i 批1 4 株。复筛时将这3 4 椽细菌单株浅层发酵 培养后，提取絮凝剂，检测絮凝活性，所得结果列于表1 。 表l 复筛时各菌株所产m b f 絮凝活性( f a ) 值 菌株号上清液o d w a 喳 f - a 值f a 大小排序 对j ! f 1 4 6 i i3 1 3 i 一4 9 i 1 8 l i i 一5 0 1 i i 一5 4 1 1 1 2 6 i 一3 5 l 一4j i i i 1 7 1 1 i 1 8 i i 一8 5 1 i 一7 i i 一6 0 l i i 一8 1 1 1 2 8 i i 一4 8 i 一9 i 一2 8 1 1 3 0 i i i 一2 i i i l l 2 3 i i i 一4 4 1 1 2 5 i i 一5 川一2 0 1 1 1 6 i i i 一3 7 i i i 一2 4 i i 1 1 1 1 6 l 一3 0 i l 一7 0 02 4 0 0 0 3 0 0 0 3 1 00 3 6 0 0 3 8 0 0 4 2 0 0 4 3 0 0 4 5 00 5 l 0 0 5 1 0 0 5 7 00 5 7 0 0 5 8 0 0 5 9 0 0 6 l 0 0 7 2 00 7 5 0 0 7 6 00 8 4 00 8 6 0 0 8 7 0 1 0 2 01 0 3 0 1 0 3 o1 0 6 01 1 0 o1 3 8 0 1 4 5 0 1 5 0 01 5 3 0l5 8 01 7 0 01 8 8 0 1 9 7 02 0 7 0 2 9 1 6 2 80 9 2 3 6 l 2 2 1 5 1 9 6 4 1 9 0 8 1 80 5 1 5 4 4 1 5 4 4 】3 3 7 1 3 3 7 1 3 0 7 1 2 7 8 1 2 2 2 9 7 2 9 1 6 8 9 9 7 7 3 74 6 7 _ 3 2 5 6 3 55 4 55 4 5 2 6 4 9 2 3 0 8 2 7 3 2 4 5 23 7 2 1 6 1 7 l 11 5 0 9 1 0 6 6 ，2，4；6 7 8 8 9 9 m 眩b m佰博悖加加引舱m巧拍”勰如引 取f - a 1 0 者，为高效絮凝剂产生菌，这样复筛所获菌1 4 株。它们分g q 是：i 一4 6 、i 一1 3 、i 一3 、l 一4 9 、i 一1 8 、l l l 一5 0 、i i i 一5 4 、l l i 一2 6 、 i 一3 5 、i i i 一1 7 、i 一4 1 、i i i 一18 、i i 一8 5 、i l 一7 。 对复筛所得1 4 株细菌进行革兰氏染色后，在1 6 1 0 0 倍汕镜下观察。结 果1 4 株细茁均为革兰氏染色阳性菌。1 1 1 1 8 为纤细轩状，l u 1 7 为杆状，l i l 一2 6 为小杆状，i i i 一5 0 为短粗杆状，l i i 一5 4 为短小杆状，i i 一7 为大杆状( 有 芽胞) ，i i 一8 5 细杆状，i 一4 6 和i 一4 9 为球状且十分相像。i 3 和i 1 3 小球状且相像，i 一3 5 小球状，i 一4 l 小细杆状。 由此可知1 ，除j 一4 6 和l 一4 9 ，i 一3 和i 1 3 可能为同种细菌外，其 它各菌株的形态均不相同，说明了可产m b f 的细菌的多样性。 3 1 2 m b f 对实际废水的絮凝效果验证 各菌株所产m b f 对以上三种废水均具有一定的处理能力见( 表2 ) 。 表2 各菌株所产m b f 对三种废水的处理效果 原水i - 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