（环境工程专业论文）微量铜离子对sbr中除磷菌多样性影响的研究.pdf

摘要 除磷是污水处理中的重要部分，鉴于目前对除磷菌研究较少且不够全面，本 课题以序批式反应器( s b r ) 为实验对象，利用聚合酶链式反应变性梯度凝胶 电泳( p c r 。d g g e ) 技术研究四种不同浓度的铜离子对系统中放线菌 ( a c t i n o b a c t e r i a ) 、伐变形杆菌( a - p r o t e o b a c t e r i a ) 、b 变形杆菌( f l - p r o t e o b a c t e r i a ) 和酸杆菌( a c i d o b a c t e r i u m ) 这四种除磷菌生物多样性的影响。 研究酸杆菌和晓变形杆菌在微量铜离子投加前后的微生物群落结构。在铜离 子投加前后，各系统中酸杆菌群落结构都有较大改变。而0 【变形杆菌群落结构改 变更大。两种除磷菌受环境影响比较大，环境稍有不同，其群落结构也会相应有 比较大的改变；对水质的敏感度较高，随着环境的变化能及时调整其群落结构， 其中0 【变形杆菌表现得更为敏感。多样性指数没有太大变化，表现出了对铜离子 存在环境的适应性。在l 、2 、3 5 m g l 铜离子影响下a 变形杆菌的多样性指数都 是上升态势，低浓度下的铜离子对其生长有微小的促进作用。 研究四种除磷菌在1 i 1 3 g l 铜离子投加之后系统运行过程中的微生物群落结 构演替情况。0 【变形杆菌和放线菌在前期稍加稳定后，才调整其群落结构。c 【- 变 形杆菌的多样性指数比较低，且基本呈现升高态势。四种除磷菌的多样性指数在 整个过程中都没有太大改变，种群结构变动较大，且种群结构相似性处二于二波动状 态。相比较而言，d 变形杆菌和放线菌对铜离子的敏感度较低。四种除磷菌都在 渐渐地适应环境，同时调整群落结构。 关键阐： 序批式反应器；微量铜离子；除磷菌；聚合酶链式反应变性梯度凝 胶电泳；微生物群落结构；生物多样性 a b s t r a c t p h o s p h o r u sr e m o v a li sa ni m p o r t a n tp a r ti ns e w a g et r e a t m e n t a st h e r ei sn o t e n o u g hr e s e a r c ho np h o s p h o r u sr e m o v a lb a c t e r i a ，w ec h o o s et h es e q u e n c i n gb a t c h r e a c t o r ( s b r ) a st h ee x p e r i m e n to b j e c t ，a n dt h ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d e n a t u r i n g g r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( p c r - d g g e ) t e c h n i q u ei su s e dt os t u d yt h ei n f l u e n c e u n d e rf o u rk i n d so fc o n c e n t r a t i o n so fc o p p e ri o n so nm i c r o b i a lb i o d i v e r s i t yo ff o u r p h o s p h o r u sr e m o v a lb a c t e r i a t h e s eb a c t e r i aa r ea c t i n o b a c t e r i a ，a - p r o t e o b a c t e r i a ，p - p r o t e o b a c t e r i aa n da c i d o b a c t e r i u m a tf i r s tt h er e s e a r c hf o c u so nm i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r eo fa c i d o b a c t e r i u m a n da - p r o t e o b a c t e r i ab e f o r ea n da f t e rd o s i n go ft r a c ec o p p e ri o n t h ea c i d o b a c t e r i u m h a sag r e a tc h a n g eo fc o m m u n i t ys t r u c t u r ew h e nt h ea - p r o t e o b a c t e r i ai se v e nm o r e g r e a t e rb e f o r ea n da f t e rd o s i n go ft r a c ec o p p e ri o n t h o s et w ok i n d so fp h o s p h o r u s r e m o v a lb a c t e r i aa r ea f f e c t e d l a r g e l yb yt h ee n v i r o n m e n t ，as l i g h tc h a n g e i n e n v i r o n m e n tm a yl e a dal a r g ec h a n g eo nc o m m u n i t ys t r u c t u r e t h e ya r ea l s os e n s i t i v e t ow a t e rq u a l i t 5a n dc a na d j u s tt h e i rc o m m u n i t ys t r u c t u r ew i t ht h ec h a n g ei nt i m e ， a n da - p r o t e o b a c t e r i ai sf a rm o r es e n s i t i v e t h et w ok i n d so fp h o s p h o r usr e m o v a l b a c t e r i as h o wa d a p t a b i l i t yw i t ht h ee x i s t e n c eo f c o p p e ri o na st h e r ei sn ob i gc h a n g e o nd i v e r s i t yi n d e x t h ed i v e r s i t yi n d i c e so f a - p r o t e o b a c t e r i aa p p e a ra nu p w a r dt r e n d a tf o u rk i n d so fc o n c e n t r a t i o no f1 ，2 ，3 5m g lc o p p e ri o n ，a n dal o w e rc o n c e n t r a t i o n o fc o p p e ri o np r o m o t e sb a c t e r i ag r o w t ht i n i l y n e x ti st h er e s e a r c ho nm i c r o b i a lc o m m u n i t ye c o l o g i c a ls u c c e s s i o no ft h ef o u r k i n d so fp h o s p h o r u sr e m o v a lb a c t e r i ai nt h es y s t e ma f t e rd o s i n g1m g lc o p p e ri o n a c t i n o b a c t e r i aa n da - p r o t e o b a c t e r i ab e g i nt oa d j u s tt h e i rc o m m u n i t ys t r u c t u r ea f t e ra s t a b l ep h a s e t h ed i v e r s i t yi n d i c e so fa - p r o t e o b a c t e r i aa r el o w e r , a n ds h o wau p p e r t r e n db a s i c a l l y t h ed i v e r s i t yi n d i c e so f t h ef o u rk i n d so f p h o s p h o r u sr e m o v a lb a c t e r i a h a v en o tc h a n g e dm u c hd u r i n gt h ew h o l ep r o c e s s t h e r ea r el a r g ec h a n g e si n p o p u l a t i o ns t r u c t u r e ，w h o s es i m i l a r i t y i si nf l u c t u a t i o n s i n c o m p a r i s o n ， a c t i n o b a c t e r i aa n dp - p r o t e o b a c t e r i aa r el e s ss e n s i t i v et o c o p p e ri o n t h o s ef o u r k i n d so fp h o s p h o r u sr e m o v a lb a c t e r i aa d a p tt ot h ee n v i r o n m e n ta n da d j u s tt h e i r c o m m u n i t ys t r u c t u r eg r a d u a l l y k e yw o r d s ： s b r ，t r a c ec o p p e ri o n ，p h o s p h o r usr e m o v a lb a c t e r i a ， p c r - d g g e ，m i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e ，b i o d i v e r s i t y 第一章绪论 1 1 课题研究的背景和意义 第一章绪论 生物法在现有的处理城市污水方法中是最为经济有效的。微生物通过氧化、 还原、转化和吸附等途径来降解、去除污水中的有机污染物。随着社会发展，单 池好氧生物法己无法满足污水的处理要求。通过研究人员的不断发明改进，逐渐 衍生出厌氧、缺氧、好氧以及他们的组合工艺，如：氧化沟、a 2 o 及s b r 等工 艺1 1 - 3 】，这些工艺的研究和应用现今都比较成熟【4 。 目前国内外对污水生物处理系统中活性污泥混合液性质方面的研究主要集 中在外界因素和运行参数对污泥混合液各种理化性质的动态影响，如对混合液的 可滤性、生物活性、污泥沉降性能、e p s 、s m p 含量以及污泥颗粒粒径分布等方 面 5 - 7 】的影响。在污水生物处理工艺中微生物对污染物的降解起决定性作用。近 些年从微观上对污水处理系统和土壤中微生物的群落结构、种群多样性、生理状 态以及功能等方面的研究逐渐增多1 8 一。环境因素的变化会对生物处理系统中微生 物的新陈代谢产生影响。微生物的群落结构、活性情况和优势微生物的种类都会 发生变化。 人们对污水脱氮除磷的认识随着城市污水脱氮除磷工艺的不断发展正日渐 成熟，但对脱氮除磷微生物的关注点主要在脱氮菌群，而对除磷菌群研究较少且 不够全面。生物除磷通常是指在生物膜法或活性污泥处理废水过程中利用微生物 去除水体中的磷。该项技术主要利用除磷菌能够过量甚至超出其生理需要的从废 水中摄取磷，并且将其以聚合态贮藏在菌体内，形成高磷污泥并排除系统，从而 实现废水除磷 1 0 1 。所谓除磷菌只是从工程的角度对有除磷功能微生物的一种界 定，但现今对有该功能菌群的种群结构等方面研究甚少。在众多有聚磷作用的菌 属中有四种占优势地位的微生物，现今对他们在同一反应器中的相互作用情况及 他们之间的关系也了解甚少。并且传统的培养方法较难对除磷菌进行分离，而在 实验室培养环境下存在的“除磷菌”在实际环境下可能不会出现。而采用1 6 s r d n a 分子生物学技术研究运行良好的生物除磷工艺中除磷菌的种群结构，可以 不必对污泥样品进行纯培养，从而避免了纯培养技术丢失菌群和改变样品菌群特 性的缺点，同时可以选择性的筛选目标条带，针对性高、特异性强。p c r - d g g e 第一章绪论 方法就是其中一种。 近些年来，随着社会发展，建设城市污水处理厂成为了防治城市水污染的重 大战略措施【1 1 】。事实证明，仅仅依靠单项治理虽能使水质在一定程度上得到改善， 但并非是有效解决水污染控制的最根本途径。在水污染发展到一定程度的时候， 单项治理费用大但收效小的问题便会显现出来。而若将工业废水和生活污水在城 市污水厂中集中处理可以节省基建投资2 5 、运行费用5 0 ，还可节省能源和 运行管理费，同时能取得较好的处理效果。城市污水在生物处理过程中能为提供 氮磷等弥补工业废水在此方面的不足，以此促进生物反应的正常运行，从而提高 净化效率；并且均匀水质水量，稀释高浓度废水【12 1 。因此集中处理在经济、技术 及管理上都有优点，能经济有效地解决城市水污染问题。 应用生物法处理污水时，微量重金属能为微生物生命活动提供营养物质，是 酶的活性基或活化剂。但微生物对各类重金属需求量极少，过量会导致毒害作用。 金属离子是城市污水中最常见的污染物，对金属的控制已经成为北美立法的焦点 1 1 3 , 1 4 1 。现有矿山及湿法冶炼企业废水总排放口对于总铜的间接排放浓度限值为 2 0 m g l ，其他企业为1 0 m g l ( g b2 5 4 6 7 - 2 0 1 0 ) 。 故研究微量铜离子冲击下微生物的作用机理很有必要。同时对生物多样性在 不同浓度铜离子冲击下的差异性的研究能进一步了解微生物在处理过程中的变 化，进而了解其应变规律。现今对除磷菌的研究较少，因此利用p c r d g g e 技 术研究微量铜离子冲击下对除磷微生物多样性的影响很有必要，意义深远。 1 2 生物除磷技术的确立及除磷菌简介 1 2 1 生物除磷技术的确立 最先采用化学物质除磷，但是会发生二次污染，进而破坏水体生态系统。 后来一些学者认为底泥疏浚方法是最直接有效的去除磷的方法，但对处于发 展中国家的中国来说经济不可行，并且会引起其他问题。底泥疏浚无法控制由磷 过量导致的富营养化【1 3 】。 国内外自2 0 世纪6 0 至7 0 年代对生物法脱氮除磷进行了大量研究，进而衍 生出多种生物除磷技术。目前已经在活性污泥法基础上发展出多种流程，并显著 提高处理效果，如氧化沟、a 2 o 及s b r 等工艺【1 3 】，这些工艺的研究和应用现今 都比较成熟【4 】。本研究即采用s b r 工艺。 第一章绪论 1 2 2 除磷菌简介 除磷菌是一类生长较为缓慢的细菌，但是由于它能够聚磷、储存和分解p h b ， 从而能更适应厌氧和好氧交替的环境，所以在厌氧和好氧系统中占优势地位而成 为优势菌群。 目前所发现的具有聚磷作用的微生物比较少，研究人员认为还有大量有聚磷 功能的微生物没被发现出来。有一部分微生物同时具有脱氮和除磷功能，即在合 适的环境下能同时大量利用氧化还原氮并且吸收磷，这类微生物也属于除磷菌的 范围。近些年来通过定向培养、分离等手段发现部分有聚磷作用的微生物【1 4 1 ，但 是有很多仍不能通过培养分离出来。 有研究表明，在生物除磷系统中，有聚磷作用的菌属很多，比如放线菌 ( a c t i n o b a c t e r i a ) ，产酸细菌( a c i d o b a c t e r i a ) ，变形杆菌( p r o t e o b a c t e r i a ) 中具 有硝化和反硝化作用的细菌，假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) 、脱氯单胞菌 ( d e c h l o r o m o n a s ) 等等 1 5 , 1 6 。其中占优势地位的有放线菌、0 【变形杆菌 ( a - p r o t e o b a c t e r i a ) 、b 变形杆菌( f l - p r o t e o b a c t e r h 2 ) 以及产酸细菌。近些年来研 究发现，有一类专性反硝化除磷菌有可能属于d 变形杆菌( f l - p r o t e o b a c t e r i a ) 类。 有聚磷作用菌属中的放线菌( a c t i n o b a c t e r i a ) 、值变形杆菌( a - p r o t e o b a c t e r i a ) 、 b 变形杆菌( f l - p r o t e o b a c t e r i a ) 以及酸杆菌属( a c i d o b a c t e r i u m ) 为本研究涉及 到的微生物种群。 广义的细菌是指一大类原始单细胞生物，其细胞核没有核膜包裹，只存在含 有裸露d n a 的拟核区。 放线菌在自然界中分布广泛，主要以孢子或者菌丝的状态存在于土壤、水以 及空气中，尤其在含水量低、有机物丰富、呈中性或者微碱性的土壤中存在数量 最多。近代分子生物学技术研究结果表明，放线菌是一类有分支状菌丝体且有较 高同源性的革兰氏阳性菌。放线菌存在于城市污水处理系统中的大量好氧处理阶 段，一般情况为好氧异养菌。放线菌能够产生多种抗生素，目前广泛应用的抗生 素中约有7 0 是从各种放线菌产生。污水处理中一旦放线菌大量繁殖，会引发污 泥膨胀，产生过多的有害代谢产物从而抑制其他细菌生长，此时应采取措施来抑 制放线菌大量生长。近些年来的研究表明，某些放线菌属种的聚磷作用能在污水 生物除磷处理中发挥重要作用 1 7 - 1 9 1 。 酸杆菌是近些年来新发现的一类细菌，他们是嗜酸菌，在土壤中存：i 笙较多， 目前对其研究很少，很多种类未被发现或者培养出来。研究表明，他 r i t e 污水处 理系统中有聚磷功能，同时对维持系统的酸碱平衡有重要作用。 所有变形菌都是革兰氏阴性菌，茵体外膜主要由脂多糖组成。为数不少的种 第一章绪论 类利用鞭毛运动；一些非运动性种类依靠滑行进行运动；还有一类独特的黏细菌， 能够聚集形成多细胞的子实体。变形菌中大多数细菌营兼性或专性厌氧异养生 活。值一变形菌中某些具固氮作用的菌属以及d 变形菌属某些具硝化作用的菌属也 被发现具有聚磷功能，他们在自然界的氮磷循环以及污水处理系统中的脱氮除磷 中发挥了非常重要的作用。 1 2 3 生物除磷的影响因素 为了达到稳定有效的除磷效果，研究表明主要有以下影响因素： 1 2 3 1 溶解氧 在厌氧条件下d o 必须严格控制于0 2 m g l 以下。一方面d o 妨碍磷释放【1 9 】， 另一方面d o 还会耗尽能快速降解的有机基质从而导致生物除磷效果的变差。好 氧区的d o 一般控制在2 0 m g l 以上 2 0 1 。 1 2 3 2 碳源 生物除磷需要足够的碳源来满足除磷菌在厌氧情况虾释磷需要，在废水中除 磷菌用以降解的有机物不足时，会产生无效释磷，从而不合成胞内聚合物，同时 无效释磷中的磷无法去除。厌氧段碳源的种类、含量和总磷的比值是对除磷效果 产生影响的重要因素。 研究指出，除磷系统进水中的b o d 5 t p 至少在1 5 以上，一般在2 0 - 3 0 ，才 可保证除磷菌有足够的基质从而获得良好的除磷效果 2 1 , 2 2 。但在碳磷比高于 5 0 m g c o d m g p 时会使除磷效率降低，因为此时可为聚糖菌的生长提供充足碳源， 从而使其取得竞争优势淘汰p a o s t 2 2 1 。 1 2 3 3 二次释磷 二次释磷是指在厌氧条件下，在有机物缺乏时释放磷。厌氧段的h r t 过长、 污水中的有机基质不足以及发酵产酸菌的缺乏都会导致磷的二次释放，最终导致 系统运行效果的变型2 3 1 。目前研究认为，引发二次释磷的主要原因有：一是在厌 氧段人为加入某物质使得质子推动力( p m f ) 降低；二是细菌进行内源呼吸时水 解细胞中的多聚磷酸盐【2 4 1 。 二次释磷对生物除磷系统的影响包括两方面：一是二次释磷后的上清液中含 有高浓度磷，从而导致反应器中进水磷浓度的升高；二是二次释磷中的无效释磷 状况最终会造成出水水质的恶化【2 4 】。 第一章绪论 1 2 3 4 金属阳离子 废水中金属阳离子的成分及浓度在生物除磷系统中不可忽视2 5 1 ，比如镁、钾 和钙等，这些离子不仅在微生物合成中不可或缺，同时在除磷过程的生化反应中 发挥作用。镁和钾作为聚磷酸盐的反价离子，是微生物细胞中产生能量的关键因 素口6 2 刀。其中镁离子作为酶促剂其含量随着释磷和吸磷反应而增大和减少。微生 物在其生长代谢过程中也需要有特殊生物学的微量元素，其中有重金属元素。如 c u 为多酚氧化酶的组分并能维持羧化酶；z n 为乙醇脱氢酶、r n a 及d n a 聚合 酶的组分矧。 研究发现，厌氧阶段中，每释放l m o l 的p ，伴随释放0 2 7 - 0 3 6 m o l k 和 0 2 9 0 3 2 m o l m g 2 引。随着进水中镁离子浓度的提高，磷酸盐的去除率随之升高【2 5 。 1 2 3 5p h 值 实验证明，磷的厌氧释放在p h 值为6 5 8 的时比较稳定2 9 1 。硫酸盐还原菌 在厌氧条件下产生h 2 s ，并与废水中金属离子反应生成金属硫化物沉淀从而去除 废水中的z n 2 + ，c d 2 + ，p b ”，c u 2 + 等。 1 2 3 6s r t 的影响 生物除磷系统主要通过排除剩余污泥从而去除磷，故剩余污泥的量l 决 - 定系统 的脱磷效果。以除磷为目的的生物除磷系统的污泥龄一般控制在3 5 7 d e 3 0 1 。 1 3 分子生物学研究进展 传统的微生物分析测定技术有很多。但环境中大多数的微生物无法进行实验 室培养，而且由于实验室培养条件不能具体模拟污水处理过程的实际条件，从而 无法真实反映活性污泥中的微生物种类和数量【3 1 1 。分子生物学技术有很大优越 性。它以微生物核酸( 基因组d n a 或者r n a ) 的序列为依据，分析环境样品中 核酸分子的种类、数量，从而反映微生物群落结构中种群的种类、数量口2 。每种 微生物有独特的核酸分子，序列组成也有各自有独特特征，故直接提取环境样品 中所有微生物的核酸，并根据核酸序列的不同分析其种类、相对数量，即可反映 微生物种类组成、种群数量的比例情况，进而能较全面客观的认识微生物群落结 构。近些年来分子生物学技术的应用主要有 3 3 3 5 ： 克隆文库分析法( c l o n el i b r a r yp r o f i l i n g ) 。分析环境样品中的核酸分子种 类和数量时，能够直接提取的核酸分子量很少不可直接分析，故一般利用p c r 扩增、构建克隆文库的方法来进行研究。 第一章绪论 分子杂交技术( m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n ) 。每种微生物都有与其他微生物 不同的独特核酸片段，利用分离、鉴定这些片段即可制备核酸探针。单链的d n a 片段再与r n a 或d n a 互补，即核酸杂交。利用该项技术可检测靶核酸序列的 存在与否。 基于p c r 扩增的遗传指纹技术( g e n e t i cr i n g e rp r i n t i n g ) 。对代表微生物 种群结构的核酸分子进行凝胶电泳，从而分开代表不同种群的核酸分子广泛应用 于群落分析的有核糖体d n a 扩增片段的限制性内切酶分析( a r d r a ) 、单链构 象多态性分析( s s c p ) 、变性温度梯度凝胶电泳分析( d g g e t g g e ) 以及末端 限制性片段长度多态性分析( t _ i 讧l p ) 等。 1 4p c r - d g g e 技术简介 采用1 6 sr d n a 分子生物学技术研宄环境中微生物群落结构的方法如下：将 污泥样品进行预处理，从样品中提取、纯化出细菌d n a ；对1 6 sr d n a 的基因 进行p c r 扩增，得到大量的目的d n a 分子片段；进行变性梯度凝胶电泳，将 d n a 片段从凝胶中分离出来；对d g g e 图谱中有意义的条带进行切胶回收，并 进行p c r 扩增，从而达到序列测定的水平；测序后进入n c b i 序列基因库进行 对比，确定优势菌种的种属，并且分析菌群结构。 1 4 1 样品d n a 的提取与纯化 分离和纯化是d n a 提取的关键。d n a 分离纯化方法的基本原理可归纳为两 方面【3 6 】：一是利用混合物中几个组分分配系数的差异，从而分配到两个相或者几 个相中，比如盐溶、盐析、有机溶剂沉淀和共沉淀等；二是将混合物置于单一物 相中，利用物理场力的作用将各组分分离至不同区域，比如电泳和离心等。 提取d n a 分子的过程首先是进行细胞的破碎，常用方法有物理和化：学方法。 物理法有玻璃珠击打【3 7 1 、反复冻融【3 8 】、超声波处理和微波炉澍4 0 1 等。化学法 则采取溶菌酶或者表面活性剂掣4 1 1 。d n a 纯化应该达到以下要求 4 2 ：d n a 样品 中不能存在对酶起抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；没有其他核酸分 子( 1 a 分子等) 污染；其他的生物大分子比如多糖、蛋白质和脂类分子的污 染降低到最低。 对d n a 进行提取、纯化的速度和效率在不断发展，但由于样品的差异性大 多数d n a 纯化方法只能针对部分特定样品，所以对复杂样品d n a 的提取纯化 方法还待继续完善。 第一章绪论 1 4 2 聚合酶链式( p c r ) 反应 由于在环境样品中提取出的d n a 分子浓度很低导致无法进行后续分析，故 常用聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np c r ) 技术来进行扩增。p c r 技 术作为无细胞分子克隆的技术，有特异性、忠实性和高效率等显著优点。 1 4 2 1p c r 基本原理 p c r 技术利用d n a 半保留复制机理和d n a 变性与复性原理，能有效用于 两端已知序列间d n a 区段的扩增。 包括一下三个基本步骤。变性：双链d n a ( 模板d n a ) 加热变性为单链。 退火：引物与模板d n a 单链在低温下互补配对。延伸：t a q d n a 聚合酶在适宜 温度下催化引物使其沿模板d n a 进行延伸。 p c r 反应有四个主要参数【4 3 j ： ( 1 ) 变性：第一轮循环前，在9 4 c 下进行5 1 0 m i n 的变性很有必要，它能 使模板d n a 完全解链。由于未变性完全的d n a 双链能很快复性从而降低d n a 扩增产量，故变性不完全会导致p c r 反应的失败。双链d n a 的解链在变形温度 下只需几秒就能完成，其他时间则用来使反应体系达到适当温度。 ( 2 ) 退火：引物的退火温度、需要的时间长短取决于引物的碱基组成、长 度、浓度及其与模板的配对程度。 ( 3 ) 延伸：延伸温度通常情况为7 2 。c ，它接近t a qd n a 聚合酶的最适反 应温度7 5 。c 。在扩增反应完成之后，为获得尽可能完整的产物都需要较长时间 的延伸反应，一般在1 0 - 3 0 m i n 。 ( 4 ) 循环次数：当以上三个参数确定后，循环次数主要取决于d n a 的浓 度。一般情况为2 5 3 5 轮循环。循环次数过多将会导致p c r 产物中非特异性产 物的大量增多。 1 4 2 2p c r 产物的影响因素 ( 1 ) 模板：反应以d n a 为模板来进行扩增。模板在数量和纯度上能够影 响p c r 反应。对于成分复杂的样品，可将提取到的总d n a 在p c r 前进行纯化 或稀释，之后再进行使用。 ( 2 ) 引物：p c r 产物的特异性由上下游引物决定。对于引物的选择是整个 p c r 成功与否的关键。引物与模板的退火温度和退火所需时间取决于引物的碱 基组成、长度以及浓度。 ( 3 ) 脱氧核苷三磷酸( d n t p ) ：d a t p 、d c t p 、d g t p 和d t t p 的总称。在 p c r 扩增体系中每种d n t 的最终浓度在2 0 2 0 0 9 m o l l 。 第一章绪论 ( 4 ) m 孑+ 浓度：游离的m 9 2 + 可激活t a qd n a 聚合酶的活性。 ( 5 ) t a qd n a 聚合酶：由于p c r 反应的解链温度在9 0 。c 以上，所以需要 耐热的d n a 聚合酶。t a q 酶的发现解决了此问题，从而促进了p c r 的发展。 1 4 3 变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 技术 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 源于f i s h e r 和l e r m a n 4 4 1 发明的检测d n a 突变技术。之后在1 9 8 5 年m y e r s 等 4 5 1 在一条引物的末 端加上了富含g c 的序列( g c c l a m p ) ，在此项改进后改变了其解链和电泳性质。 从而保证了链在变性胶内的泳动过程中不会完全解链而成为单链，使该技术得到 了完善。1 9 9 3 匀z m u y z e r t 4 6 】首次将该项技术用于微生物生态学研究，并且证实了 此技术在揭示自然界微生物系的种群差异和遗传多样性方面有独特的优越性。在 十多年的时间里d g g e 己在环境微生物生态研究的各个领域里广泛应用 4 4 - 5 5 】。 d g g e 基本原理如下： d g g e 并非基于核酸分子量大小的不同而将不同大小的d n a 片段分开，而是 将片段大小相同的d n a 序列根据序列的不同而分开。双链d n a 分子由于a 、t 、 g 、c 这四种碱基的组成以及排列上的差异，不同序列的双链d n a 分子有不同的 解链温度。 当双链d n a 分子在含有梯度变性剂( 甲酰胺、尿素) 的聚丙烯酰胺凝胶里 进行电泳时，由于解链的速度和程度与其序列密切相关，故当某一双链d n a 序 列迁移到变性凝胶的一定位置，并且达到其解链温度时，即开始部分解链，部分 解链的d n a 分子的迁移速度随时间的延长而减小，最终具有不同序列的d n a 片 段滞留于凝胶中的不同位置，从而分开。理论上只要选择的电泳条件如变性剂梯 度、电压和电泳时间足够精细，接近9 5 1 拘单碱基替换可通过d g g e 实现分离【4 5 1 。 由d g g e 变性梯度的方向与电泳方向是否一致，可分为两种形式的d g g e ： 垂直d g g e 和平行d g g e 。 1 4 4p c r - d g g e 技术在环境微生物生物多样性中的应用 利用p c r - d g g e 技术对环境微生物进行研究，首先直接从环境样品中提取细 菌的d n a ，再将编码有1 6 sr d n a 的目的基因进行扩增，通过d g g e 电泳即可分 离不同种类的微生物，从而了解样品中微生物的分布结构和生物多样性。该技术 首次i 主i m u y z e r 等开辟了利用d g g e 进行微生物生态领域的研究，现己迅速发展成 为分析研究环境微生物群落结构的主要手段之一。 p c r - d g g e 在废水生物处理研究中应用广泛。l a p a r a 等t 5 6 j 研究了温度的升高 对废水好氧生物处理过程中细菌群落结构及功能的影响，得出不同温度下有不同 第一章绪论 细菌群落的结论。刘新春等【5 7 】利用p c r - d g g e 技术，分别用低温菌、常温菌接种 了两套活性污泥系统，并在相同操作条件下追踪其中的微生物群落结构的动态变 化，研究得知二者微生物群落结构相似，且随运行时间的延长相似度越高。苏俊 峰等 5 s l 利用p c r _ d g g e 技术初步分析了生物陶粒反应器中细菌的种群演替情况， 结果表明，群落结构和优势种群的数量随进水c o d 值的逐阶段降低有时序动态 性，微生物多样性与废水的处理效果出现协同变化。h u a n g 等 5 9 禾l j m p c r - d g g e 技术研究- j c d 2 + 、c u 2 + 对2 氯酚降解反应器中微生物特征的影响。曹军伟等f 6 川对 某焦化公司的活性污泥中的降解菌进行了分离鉴定，并获得2 8 株细菌，这些菌株 对降解焦化废水中的主要污染物酚类化合物有重要作用。 在废水处理系统中氨氮去除的硝化作用是关键步骤。氨氧化菌将氨氧化成为 亚硝酸盐从而实现亚硝化作用。由于氨氧化菌生长速率极低、生物量很少，许玫 英等【6 l 】在含高浓度氨氮的废水处理系统中将不同驯化时期的4 个活性污泥样品 d n a 分离提纯后，利用p c r 扩增、随机克隆测序等技术，分析氨氧化菌的种类和 氨单加氧酶活性，并且在国内首次采用p c r d g g e 相结合的技术研究样品中总细 菌类群的差异，结果表明采用此技术更全面了解氨氧化菌的类群、功能。叶磊等 【6 2 】联合利用分子生物学及同位素示踪技术研究活性污泥中厌氧氨氧化菌的存在、 活性及功效。 由于对磷的去除重视度不够，对生物除磷领域的微生物群落的研究较少。 j o h w a na h n 等人【6 3 】利用p c r d g g e 技术研究了在强化生物除磷工艺中采用不同 的电子受体对微生物种群的影响，分析了不同的电子受体对除磷菌种类( 比如反 硝化除磷菌) 的影响，以及对生物除磷起主要作用的优势菌种。刘亚男等m 】利用 p c r - d g g e 技术分析了不同碳源强化生物除磷系统，得知这3 个反应系统的微生 物种群各有异同，其中以生活污水为碳源的反应器优势种群数量最多并且相对生 物量最多，而以葡萄糖、乙酸钠为碳源的反应器生物多样性较少。戴睿 6 = 5 】等研究 了s b r 反应器中在不同电子受体和不同p h 条件下的除磷菌种群结构，讨论了由代 谢链的差异性导致的微生物群落结构发生较明显的规律性变化，得出结论：在 6 5 8 5 的p h 范围内的驯化过程中，除磷菌种群结构均较相近。 随着分子生物学的发展，p c r - d g g e 技术在厌氧反应器中得到应用，如用于 处理酿酒厂【6 6 】、啤酒厂 6 7 1 及造纸厂【6 8 1 废水的u a s b 反应器中颗粒污泥微生物的多 样性分析。魏利等【6 9 】分析研究了不同靶序列对厌氧折流板反应器中微生物多样性 的影响，研究表明采用p b s 洗涤污泥及超声振荡有利于硫酸盐还原污泥总, d n a 的 提取，不同引物的d g g e 图谱其微生物群落多样性存在着显著差异。 生物过滤能有效处理恶臭、挥发性有机废气，由于生物滤池、生物滤塔作为 生物处理恶臭气体中是简单有效的方法，因此得到了迅速发展。殷峻等【7 0 j 应用 第一章绪论 d g g e 技术研究了处理含氨废气的生物滤塔中微生物多样性随时间的变化，在比 较了反应器不同填料及不同时期中微生物的多样性之后得出结论：填料中微生物 的多样性随着反应器运行时间的延长而减少，采用堆肥填料的微生物多样性指数 比采用污泥填料和混合填料的微生物多样性指数高。 污泥稳定化在污泥处理过程中相当重要。微生物的稳定化过程对系统达到稳 定状态有直接指导意义。傅以钢等 7 1 用d g g e 技术研究了污泥堆肥工艺中的细菌 种群动态变化和多样性。结果表明，随反应的持续进行，微生物结构的相似性系 数越来越高，说明微生物种群结构逐渐趋于稳定。从而证实了污泥微生物能迅速 调整其内部细菌种群结构来适应环境，并且在发酵过程中形成的优势菌群可以长 时间保持稳定状态。 1 5 研究目的和内容 工业含铜废水中的铜离子浓度很高，而现今国家对总铜的排放限值很低，通 过物理化学可以降低铜离子浓度，但其他指标未达到国家排放标准，因此需要进 行生物处理，而此时低浓度的铜离子也会对其中的微生物产生影响，进而影响其 种群结构，故研究微量铜离子作用下微生物的多样性很有必要。由于工业废水中 氮磷等营养物质不足，而城市污水可弥补此不足，故将工业废水和生活污水集中 处理在经济及处理效果上有优势。随着社会发展，研究的不断深入，人们对污水 脱氮除磷的认识随城市污水脱氮除磷工艺的不断发展正日渐成熟，对脱氮除磷微 生物的关注点主要在脱氮菌群，而对除磷茵群研究较少且不够全面。因此，利用 广泛采用的p c r - d g g e 技术研究微量铜离子的冲击对本研究选取的s b r 中除磷 菌多样性的影响能更好的了解除磷菌，使s b r 的运行和反应器中除磷菌动态变 化和功能很好的联系起来。 本课题将在营养物质基本充足即c o d ：n ：p = 1 0 0 ：5 ：l 的情况下将天津大学游 泳馆m b r 工艺中的活性污泥置于s b r 反应器进行人工配水的培养，并进行微量 铜离子的冲击。铜离子浓度选取国家总铜排放限值l m g l 和2 m g l ，为进一步探 究铜离子对污泥微生物中除磷菌的影响，同时选取铜离子浓度3 5 m g l 和5 m g l 进行冲击。 重点研究以下两方面内容： ( 1 ) 在铜离子冲击浓度分别为1 、2 、3 5 、5 n 1 l 时，研究酸杆菌和0 【变形 杆菌在冲击前后微生物种群结构和生物多样性的差异，以了解不同浓度铜离子的 存在下微生物群落的异同。 ( 2 ) 在铜离子冲击浓度分别为l m g l 时，研究酸杆菌、c c 变形杆菌、p 变 第一章绪论 形杆菌和放线菌在整个冲击过程的2 4 天周期内微生物群落结构随时间和环境的 演替情况，并找出处理铜离子的优势菌种，为s b r 的运行提供理论指导。 第二章实验材料与方法 第二章实验材料与方法 2 1 实验装置与技术路线 2 1 1 实验装置 实验中所用的s b r 反应器装置采用有机玻璃制成，截面为1 0 c m x l o c m ，高 为5 0 c m ，有效容积为4 l ，反应器的中间有一个有机玻璃隔板，其上端距水面5 c m ， 下端距底5 c m 。设置隔板是为了减少曝气区域，从而降低水中的溶解氧浓度，并 且在反应器里形成自下而上的环流，进而减少水中快速上升的气泡造成对污泥絮 体的破坏。在隔板的一侧为加热棒，另一侧为曝气装备。加热棒用来迅速提供热 量使反应器中的污水在短时间内达到所需温度，并保持基本恒定的状态。曝气装 备采用微孔曝气头，经空压机将压缩空气通过曝气头扩散到反应器，以此提供微 生物所需溶解氧，同时为泥水的均混和环流提供动力作用。见图2 1 。 图2 - 1s b r 反应器 反应器出水采取滗水管方式。在每个反应器的正面距离底部1 0 c m 、2 0 e m 和 3 0 c m 处设置三个直径为1 c m 的滗水管，底部设一个直径为1 c m 的放空管。 同时运行4 个并联在一起的s b r 反应器。设计流程见图2 2 。污水通过进水 泵提供给每一个反应器，控制进水量使每个反应器的进水量基本相同。空气压缩 机通过空气流量计调节进气量，并对每个反应器提供所需氧气，并使每个反应器 第二章实验材料与方法 的溶解氧维持在2 - 4 m g l 左右，以此来让每个反应器中污水以适宜的速度进行环 流。s b r 每天进行2 个循环，每个循环的运行时间为1 2 h ，其中曝气时间为8 h ， 静置时间为4 h ，运行过程的时间设置由时间控制器进行自动控制。污泥静沉结 束后，采用虹吸作用将上清液排出。 空气 流量计 鎏 流量计 鎏 流量计 阐流量寸 引 进水管 寺寺 进水管 寺 1 r- i l l - r i r o ob oo l r 口 oo。 f r oo 簋 i 。i o 苫 r e 出水 r 出水， r 出水一 r 出水1 r 原水箱 2 1 2 实验方案 图2 - 2s b r 反应器流程图 活性污泥取白天津大学游泳馆污水站的m b r 反应池，采用人工配水的方式 对其进行适应性培养。以葡萄糖为碳源，磷酸二氢钾为磷源，氯化铵为氮源，并 使c o d ：n ：p = - 1 0 0 ：5 ：l ，其中葡萄糖为7 6 8 7 5 m g l ，磷酸二氢钾为3 6 2 5 m g l ，氯 化铵为1 5 6 8 8 m g l ，此为原水。经测定得知原水c o d c ，在8 2 0 m g l 左：右。在培 养过程中对水质进行监测，监测项目主要有c o d c ，、总氮、总磷和氨氮。当系统 中c o d c ，、总氮、氨氮的去除率保持稳定并且连续一周大于8 5 ( 总磷去除率大 于7 0 ) 后，培养过程结束。培养后的污泥分别取2 l 置于4 个s b r 反应器中进 行实验。反应器中的初期污泥浓度在4 0 0 0 m g l 左右。 将s b r 反应器中取得的污泥样品进行预处理，之后提取纯化d n a ，并将 d n a 样品置于冰箱2 0 冷冻保存，需要时进行p c r 扩增、d g g e 电泳分析， 以及回收克隆测序分析。对d g g e 图谱和切胶回收克隆测序后的结果进行分析， 从而研究系统中除磷菌种群结构以及生物多样性的变化。 第二章实验材料与方法 2 2 常规项目分析与测定方法 实验中常规项目分析与测定方法如表2 - 1 所示。 表2 - 1 常规实验项目分析和涓定方法u 3 1 测试项目分析方法 3 0m i n 沉降法 1 0 5 干燥减重法 便携式溶解氧仪法 重铬酸盐法 钼酸铵分光光度法