（发酵工程专业论文）纳他霉素高产菌株的诱变育种.pdf

摘要 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 是一种高效、广谱的抗真菌抗生素，能有效地抑制酵母 菌和霉菌的生长，在医疗、食品等方面显示了良好的应用前景。 本论文对纳他霉素生产菌的诱变和选育等方面进行了系统的研究，主要完成了以 下几个方面的工作，并得到了相关结论。 建立了链霉素抗性与纳他霉素产量之间的关系模式，快速筛选纳他霉素高产突变 株。并建立了一套快速、准确的产物分析方法，利用紫外分光光度计法快速测定发酵 液中的纳他霉素含量。 通过对纳他霉素生产菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s a t c c1 3 3 2 6 ) s g s 菌株进行 分离复壮，获得一株遗传性能较为稳定的菌株s g 1 7 ，以s g 1 7 为出发菌株进行紫外 线诱变育种，获得比出发菌株s g 1 7 效价提高5 9 的菌株u v - 1 2 5 ，对u v - 1 2 5 进行 微波诱变，获得比u v - 1 2 5 效价提高3 3 的菌株m 6 3 ，以m 6 3 为出发菌株进行了 6 0 c o 吖射线诱变，得到比m 6 3 效价提高1 6 的菌株1 ，1 8 8 。丫1 8 8 的发酵效价达到 4 5 8 p g m l ，较s g 1 7 提高了1 4 5 倍。 另外，在摇瓶水平进行了纳他霉素发酵培养基优化的研究，探索了不同碳源、不 同氮源、无机盐和前体等各因子对纳他霉素生物合成的影响。结果表明：碳源以葡萄 糖最佳，浓度为3 6 ，氮源以大豆蛋白胨为最佳，最佳浓度为1 8 ，无机盐k 2 h p 0 4 对菌体生长的促进作用可从大豆蛋白胨中得到补充，同时研究了前体物质丙酸钠对于 发酵产量的影响。最终通过正交分析确定了一套发酵培养基的最佳配方。 另外，对纳他霉素发酵的条件也进行了考察，即菌株的发酵温度、初始p h 值、 溶氧量等。发现3 0 0 m l 三角瓶中装料量为2 5 m l 摇床转速为2 2 0 r p m ，p h 值为7 2 时， 在温度2 8 。c 条件下发酵，纳他霉素发酵效价最高，其发酵效价提高了1 2 。 关键词：纳他霉素；诱变；链霉素抗性筛选；紫外分光光度计法 s t u d i e so nm u t a t i o na n ds c r e e n i n go fs t r a i n sp r o d u c i n gn a t a m y c i n a u 廿l o r l i h a i b o s u p e r v i s o r ：c h e n g s h u m e i m a j o r ：f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g a b s t r a c t n a t a m y c i ns e r v e sa sab r o a d - s p e c t r u ma n t i f u n g a l ( f u n g i s t a t i ca n df u n g i c i d ) a g e n t i tc a l l e f f e c t i v e l yi n h i b i tm o l da n dy e a s tg r o w t h ，a n dh a sn ot o x i ce f f e c t se v e na th i g hl e v e l so f i n g e s t i o no nm a m m a l i a ns p e c i e s t h e r e f o r en a t a m y c i ni se f f e c t i v ei nt h et h e r a p yo ff u n g u s i n f e c t i o n so fe y e sa n di np r o t e c t i o no ff o o d sf r o mm o l da n dy e a s tg r o w t h t h ea r t i c l eq u e s t e df o rs o m es t u d i e so nt h es t r a i ni m p r o v e m e n t ，a n df l n i s h i n e dt h e f o l l o w i n gjo b s e s t a b l i s h e dar e l a t i o nb e t w e e ns t r e p t o m y c i nr e s i s t a n c ea n dn a t a m y c i ny i e l d a n d e s t a b l i s h e dam e t h o dt o d e t e r m i n i n gn a t a m y c i n i nf e r m e n t a t i o nb r o t h u s i n gu v s p e c t r o p h o t o m e t e rw h i c h a l ef a s ta n de f f e c t i v e as t a b l ea n dh i 曲一y i e l d i n gs t r a i ns g 一17w a so b t a i n e df r o ms g ss t r a i no fn a t a m y c i n p r o d u c e rs t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u sb ys t a b l ee x p e r i m e n t a t i o n s g - 1 7s t r a i nw a s m u t a t e d b yt h r e em e t h o d su v ，m i c r o w a v e ，6 0 c o ) , i r r a d i a t i o n 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h r e e m u t a t i o nm e t h o d sc o u l de n h a n c et h ef e r m e n t a t i o na b i l i t yo ft r a i n s 1 1 1 en a t a m y c i ny i e l do f t h eh i g h y i e l d i n gm u t a n ts t r a i n su v - 1 2 5 、m - 6 3 、y 一1 8 8w e r ei n c r e a s e db y5 9 、3 3 、1 6 r e s p e c t i v e l yc o m p a r e dw i t ht h e i rp a r e n ts t r a i n s t h ey i e l do fy - 18 8s t r a i nw a s4 5 8 9 9 m l ， 1 4 5t a l l e rt h a ns g 17 b e s i d e s ，t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fn a t a m y c i nw e r es t u d i e di ns h a k i n gf l a s k f i r s t ， w ee x p l o r e dt h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e ，i n o r g a n i cs a l ta n d p r e c u r s o ro nn a t a m y c i np r o d u c t i o n o no r t h o g o n a l i t ye x p e r i m e n tb a s i st h r o u g hs t a t i s t i c a l a n a l y s i s ，t h eo p t i m u mm e d i u mw a sd e t e r m i n e d ，a n dt h en a t a m y c i ny i e l di m p r o v e db y12 w h a tw a sm o r e ，w er e s e a r c h e dt h et e m p e r a t u r e ，p hv a l u e ，t h ev o l u m eo fv a c c i n a t i o n ，a n d f o u n dt h a tt h ec o n t a i n e ro f2 5 m l ，p hv a l u eo f7 2 ，t h et e m p e r a t u r eo f2 8 。c ，n a t a m y c i n y i e l dw a st h eh i g h e s t k e yw o r d s ：n a t a m y c i n ；m u t a t i o n ；s t r e p t o m y c i nr e s i s t a n c es c r e e n ；u vs p e c t r o p h o t o m e t e r f a s td e t e r m i n i n g 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逦j 匕壅些太堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：套绚被 签字日期：矽略年多月j j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解通j 匕壅些太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑j 邕壅些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：套为坡 导师签名：希譬影掏 签字日期： 砌易年6 月，) e l 签字日期：钞够年石月，1 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 纳他霉素高产菌株的诱变育种 1 1 纳他霉素的发现 l 引言 1 9 5 5 年，s t r u y k 等人从南非纳他州的土壤中分离到纳塔尔链霉菌s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ，并 从中分离出了一种新的抗真菌物质，称为p i m a r i c i n ( 匹马菌素) 1 1 1 ；1 9 5 9 年，b u r n s 等人在美国 田纳西州的土壤中分离到了一株恰塔努加链霉菌s t r e p t o m y c e sc h a t t a n 0 0 9 e r t s i s ，并从其培养物中分 离到了t e n n e c e t i n ( 田纳西菌素) 。此后的研究证明匹马菌素和田纳西菌素为同一物质，并被世 界卫生组织w h o 统一命名为n a t a m y c i n ( 纳他霉素) 2 1 。 1 2 纳他霉素的理化性质 纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，是一种白色或乳白色，几乎无臭无味的结晶 粉末。分子式为c 3 3 h 4 7 n o l 3 ，分子量为6 6 5 7 5 ，化学结构如图l 所示。 h n 如 图l 纳他霉素的分了结构 f i g im o l e c u l es t r u c t u r eo f n a t a m y c i n ( 咆 纳他霉素是一种四烯大环内酯，四烯系统是全顺式，内酯环上c 9 一c 1 3 部位是半缩醛结构， 含有一个由糖苷键连接的碳水化合物基团，即氨基二脱氧甘露糖( m y c o s a m i n e ) 。纳他霉素是 两性物质，分子当中含有一个碱性基团和一个酸性基团，其电离常数p k a 值为8 3 5 和4 6 ，相应 的等电点为6 5 ，熔点为2 8 0 c 。其结构上存在两种典型构型：烯醇式结构和酮式结构，这就决定 了它在许多溶剂中的低溶解性。纳他霉素在水中或低级醇中的溶解性随着p h 的降低或升高而增 加，在中性p h 下溶解度最低，而在p h 低于3 或高于9 时溶解度增大。 纳他霉素的紫外光谱如图1 2 所显示，在2 9 0 、3 0 3 、3 1 8 n m 处有尖锐的吸收峰，在2 8 0 n m 处有肩，2 2 0 n m 处有宽峰。由于纳他霉素含有四烯环，因此在2 8 0 3 2 0 n m 之间出现吸收峰，而 在2 2 0 n m 的最大吸收是由于纳他霉素含有发色团。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 图2 纳他霉素的紫外光谱 f i g 2u v - s p e c t r u m o f n a t a m y c i n o 纳他霉素的四烯发色团给分子一种高不饱和特性，可与溴和含活性氧的化合物如高锰酸钾、 高硫酸盐及过氧化物相互作用；另一方面，它以环氧族的形式保持弱氧化性，当纳他霉素在冰醋 酸中用热的碘化物处理后会析出碘。纳他霉素通过酸水解作用可以释放出海藻糖氨，内酯可以通 过碱水解作用皂化【1 2 】。 1 3 纳他霉素的活性和稳定性 纳他霉素干粉在避光避潮下是稳定的化合物，室温下保存几年只有很小一部分失去活性。三 水化合物同样稳定，但其无水形态不稳定，在室温封闭的瓶子中保存4 8 h 失去1 5 的活性。中性 的纳他霉素水溶液几乎和干粉一样稳定。纳他霉素的稳定性受p h 值、温度、光照、氧化剂和重 金属等条件的影响而变化1 3 , 5 , 8 1 。 ( 1 ) p h 值：纳他霉素在p h 4 5 9 之间非常稳定，在极端p h 下纳他霉素迅速失活，形成各种各 样的分解产物。在低p h 值时其主要的裂解产物是海藻糖胺；在高p h 值时，如p i l l 2 ，由于内 酯皂化可形成纳他霉酸，用强碱处理导致进一步的分子破裂，产生一系列的后醛醇反应。p h 值 对了：纳他霉素的稳定性有一定的影响，但对纳他霉素的抗真菌活性没有明显的影响。据报道，纳 他霉素于3 0 c 储存三星期，在p h 5 7 的范围内，纳他霉素的活性仍保持1 0 0 ，p h 3 6 时保持大 约8 5 ，p h 9 0 时仅剩大约7 5 ，但在大部分食品的p h 范围内，纳他霉素十分稳定。 ( 2 ) 温度：温度对纳他霉素的活性儿乎没有影响( 在中性水溶液中) 。纳他霉素在室温条件下 是稳定的，5 0 。c 放置几天或1 0 0 。c 短时处理，其活性几乎无损失。1 2 0 c 条件下加热不超过l h 仍 能保持纳他霉素的部分活性。 ( 3 ) 光照：纳他霉素在紫外光下分解，失去四烯结构。1 ，辐射也能使纳他霉素分解。 ( 4 ) 氧化剂：纳他霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触，否则抑菌活性会明显下降。 防止氧化的方法是使用抗氧化剂，如叶绿素、抗坏血酸、丁基羟基茴香醚、丁基甲苯等。 2 纳他霉素高产菌株的诱变育种 ( 5 ) 重金属：一些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活，尤其是铁、镍、铅、汞等重金属。 因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中，也可以添加e d t a 或聚磷酸盐来防止失 活。 ( 6 ) 鉴别用颜色反应：把纳他霉素晶体加入滴有一滴浓盐酸的点滴板上，颜色马上变蓝；如果 滴加一滴浓磷酸，颜色马上变绿，几分钟后，都会变成浅红色。 1 4 纳他霉素的抗微生物性质 纳他霉素是一种广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类剂的多烯大环内酯类抗生 素。但它没有抗细菌活性。这是由于真菌的细胞膜含有麦角固醇，而细菌细胞膜中不含这种物质， 多烯大环内酯类抗生素能有选择的和阎醇结合，结合的程度与膜的固醇含量成正比，结合后形成 膜一多烯化合物，引起细胞膜结构的改变，导致细胞膜渗透性的改变，造成细胞内物质的泄漏【4 】。 纳他霉素对于抑制正在繁殖的活细胞效果很好，而对于破坏休眠的细胞则需要较高的浓度。纳他 霉素对真菌孢子也有一定的抑制效果。1 9 5 6 年，t r e s n e r t 2 j 曾测试过纳他霉素对5 0 0 种霉菌的抗性， 所有菌种都被1 1 0 p p m 的纳他霉素抑制。1 9 5 9 年，k l i s l 2 比较了纳他霉素、山梨酸、放线菌酮、 制霉菌素、龟裂霉素等的抑菌效果，发现纳他霉素对1 6 种在肉汤和琼脂中培养的霉菌是最有效 的抑制剂，绝大多数霉菌在o 5 - - - 6 p p m 的纳他霉素浓度下被抑制，极个别的种在1 0 - 2 5 p p m 的 纳他霉素浓度下被抑制，多数酵母菌在1 0 5 0 p p m 的纳他霉素浓度下被抑制。表1 和表2 为部 分霉菌和酵母菌的纳他霉素最小抑菌浓度。 3 塑! ! 奎些奎堂堡主兰笪! 兰些2 笙茎 一 一一 表1 纳他霉素对霉菌的最小抑菌浓度 焉t a b l e l m i c o f n a t a m ) , c i n o nm o l d s 丽而丽蕊丽r 一 一 舄爪蜘铂i 浓融fn n m 、 = 育茅1 瓜豸一 棒曲霉( d s p e r g i l l u s c l a v a t u s ) 瓦曲霉( ，4 砌p 似抛一) 4 2 9 8 0 1 , 2 5 构巢曲霉( 爿n i d u l a n s ) 赭曲霉( 爿o r h r a c e u s ) 4 0 6 9 黄曲霉( 爿f l a v u s ) c b s 3 0 0 5 黄曲霉( 彳细) b b 6 7 黄曲霉( 一舯) m a d a g a s c a r 黄曲霉( 一f l a v u s ) p o r t l a m y 黑曲霉( 一n i g e r ) 杂色曲霉( 彳v e r s i c o l o r ) 米曲霉( 爿o r y z a e ) 产黄青霉( p e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u m ) 岛状青霉( 尸i s l a n d i u m ) 指状青霉( pd i g i t a t u m ) 扩展青霉( pe x p a n s u m ) 特异青霉( pn o t a t u m ) 4 6 4 0 黑青霉( pn 延歹f c 口淞) 鲜绿青霉( pv i r i d i c a t u m ) w e s t l i n g 娄地青霉( pr o q u e f o r t iv a r p u n c t a l u m ) 6 0 1 8 疣孢青霉( pv e r r u c o l o s u mv a r c y c l o p i u m ) 芽枝状枝孢霉( ( f 口却d r m 小c l a d o s p o r i o i d e s ) 自色胶孢予菡( g l o e o s p o r i u n ia l b u m ) 果生核盘菌( s c l e r o t i n i a f r u c l i c o l a ) 犁头霉翻b s i d i a 够) 交链孢霉叫l t e r n a r i as p ) 大毛霉( m u c o rm u c e d o ) 犁孢帚霉( s c o p u l a r i o p s i sa s p e r u l a ) 链孢霉( f u s a r i u ms p ) 自地霉( g e o t r i e h u mc a n d i d u m ) 0 1 2 5 o 1 砣5 4 o 8 o 4 o 一8 o 4 0 8 0 4 0 8 0 4 o 8 o 4 o 8 o l o o 1 2 5 0 1 2 5 4 o 8 o 4 o 8 o 4 o 8 0 4 o 8 o 4 0 8 0 1 0 0 1 , 2 5 0 1 - 2 5 o 1 2 5 o 1 2 5 4 o 一8 o 4 o 8 0 4 0 - 8 0 4 o 8 0 1 0 l o 米根g ( r h e 印螂卿p ) 4 7 5 8 l o 灰葡萄孢霉( 曰。叫瞎c m e 愆d ) l 2 5 一一一 4 纳他霉素高产菌株的诱变育种 表2 纳他霉素对酵母菌的最小抑菌浓度 t a b 2m l co f n a t a m 、，c i no ny e a s t s 酵母菌 最小抑菌浓度( p p m ) 布鲁塞尔酒香酵母( b r e t t a n o m y c e sb r u x e l l e n s i s ) 白假丝酵母菌( c a n d i d aa l b i e a n s l 维尼氏酵母菌( c v i n i ) 白球拟酵母菌( t o r u l o p s i sc a n d i d a ) 吉利蒙氏假丝酵母菌( c a n d i d a g u i l l i e r m o n d i i ) 多形汉逊酵母菌( h a n s e n u l ap o l y m o r p h a ) 拜耳酵母菌( s a c c h a r o m y c e s b a i l l i ) 贝耳酵母菌( s b a y a n u s ) 酿酒酵母( s 。c e r e v i s i a e ) 8 0 21 酿酒酵母椭圆变种( s c e r e v i s i a ev a r e u i p s o i d e u s ) 少孢酵母菌【s e x i g u n s ) 路德酵母菌( s 1 u d w i g i ) 0 3 3 9 鲁氏酵母菌( s r o u x i i ) 0 5 6 2 清酒酵母菌( s s a k e ) 0 3 0 5 炼乳球酵母菌( t o r u l o p s i s 1 a c t i s - e o n d e n s i ) 柠檬形克勒克酵母菌( k l o e c k e r aa p i c u l a t a ) 细小红酵母菌( r h o d o t o r u l ag r a c i l i s ) 罗斯有孢圆酵母菌( t o r u l a s p o r ar o s e ) 伯克力接合酵母菌( z y g o s a c c h a r o m y c e sb a r k e f i i ) 1 5 纳他霉素的安全性及毒性 纳他霉素无毒，并且不致突变、不致癌、不致畸、不致敏。纳他霉素很难被消化道吸收，由 于其难溶于水和油脂，大部分摄入的纳他霉素会随粪便排出。给奶牛饲喂高剂量的纳他霉素，结 果表明，9 0 的纳他霉素及其分解产物经粪便排出p j 。1 9 6 6 年，l e v i n s k a s 等1 5 1 研究纳他霉素的急 性毒性和慢性毒性，证明纳他霉素对人体器官没有明显影响，也不产生伤害。1 9 7 3 年h a m i l t o n m i l l e r 5 j 报道纳他霉素口服毒性最小，静脉注射毒性极大。1 9 7 7 年，d eb o e r 和s t o l kh o r s t h u i s p j 研究了真菌对纳他霉素形成抗性的可能性，他们在连续几年使用纳他霉素的食品仓库中，没有发 现真菌形成抗性的证据，使用大于m i c ( 最低有效抑制浓度) 的纳他霉素量，人为诱导也没有发现 真菌形成抗性的证据。1 9 8 2 年，r a y 和b u l l e r m a n 【5 】报道纳他霉素能减少黄曲霉产生的黄曲毒素、 赭曲霉产生的赭曲毒素、圆弧青霉( p e n i c i l l i u mc y c l o p i u m ) 产生的青霉酸、展开青霉产生的展开 青霉素。因此，纳他霉素能减少真菌毒素给人类造成的危害。 5 5 5 5 5 m 5 5 5 5 5 5 5 d m 国 田 m 国 m 眦 眦 胞 l l l l 王 l l l l l 1 l 互 王 王 王 王 王 卫 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 6 纳他霉素的应用 1 6 1 世界各地法规 w h o 和f a o 规定消费者每天纳他霉素最大摄入量( a d i ) 为0 3 m g k g 体重，奶酪和香肠的 一般消费者每天摄入量为o 0 0 2 m g k g 体重【3 1 。1 9 9 8 年g r a s 专家组1 5 j 认定纳他霉素用于酸奶、奶 油、干酪、酸性稀奶油和农家干酪非常安全。目前，荷兰、比利时、法国、西班牙、意大利、瑞 典等国家都允许纳他霉素用于干酪和硬香肠的防腐，荷兰还批准纳他霉素用于苹果和梨的防腐。 在中国，纳他霉素被批准用于干酪、肉制品、月饼、糕点、果汁原浆以及易发霉食品加工器皿的 表面，一般采用2 0 0 3 0 0 m g k g 悬浮液浸泡或喷洒，残留量不超过1 0 m g k g 。纳他霉素也被批准 添加到发酵酒、酸奶和色拉酱中，限量为1 0 m g k g ( 食品添加剂使用卫生标准：g b 2 7 6 0 9 6 ，1 7 0 ， 防腐剂) 。 1 6 2 纳他霉素在食品工业中的应用 1 9 8 2 年6 月，美国f d a 正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂1 6 j 。1 9 9 0 年1 月9 日，我国卫 生部食品监督厅签发了国内第一个生物食品防腐剂n i s i n ( - 孚l 酸链球菌素或称乳链球菌肽) 的使用 合格证明，到。1 9 9 6 年，中国食品添加剂标准化技术委员会正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂捧j 。 乳链球菌肽对革兰氏阳性腐败细菌有抑制作用，对酵母菌及霉菌等丝状真菌无效；而纳他霉素对 酵母菌及霉菌等丝状真菌有极强的抑制或杀灭作用，这一点正好与乳链球菌肽的抑菌谱互补1 6 j 。 纳他霉素与乳链球菌肽是目前国际上批准使用的仅有的两种生物食品防腐剂。 纳他霉素由于溶解度很低，被用作食品表面防腐剂以延长货架期，主要在奶酪、肉制品、葡 萄酒、茶饮料及果汁中添加，它不会干扰其它食品组分，也不会带来异昧。它在食品中的抗真菌 作用是双效的：既可防止真菌引起的食品腐败，减少经济损失；又可防止真菌毒素给人类造成的 毒素型食物中毒。与传统的抗真菌剂比较，纳他霉素有其独特的性质，它在很低的浓度下仍具有 活性，例如：在奶酪中纳他霉素比山梨酸钾活性高4 0 0 倍。在葡萄酒中，纳他霉素能取代山梨醇 和其它抗真菌剂，它允许减少所使用的s 0 2 量1 4 】。目前，全世界已有三十多个国家采用纳他霉素 作为食品防腐剂。 ( 1 ) 干酪 纳他霉素应用于奶酪生产的：l 艺已很成熟，有关的报道从7 0 年代至今多不胜举。纳他霉素 用于干酪皮防止其表面发霉，它不会渗透到干酪内部，仅仅停留在酪皮外层l m m 处，而这一部 分一般不会被取食，干酪放置5 1 0 周后，纳他霉素基本消失，此时酪皮变硬不易受到霉菌侵染， 纳他霉素对细菌无效，因而不会影响干酪和干酪制品的熟化。使用方法一般有浸泡、喷洒或乳剂 覆膜。2 0 0 1 年6 月，b a s i l i c oj c 等人8 1 报道，o 5 ( w v ) 的纳他霉素用于奶酪就可有效防止 丝状真菌的污染。 ( 2 ) 肉制品 在肉制品中使用2 0 0 0 m g k g 的纳他霉素混悬液对其进行浸泡或喷洒，可达到纳他霉素含量 为8 p g c m 2 安全而有效的防霉水平。对于香肠来说，纳他霉素可在以下数个步骤中添加：发酵前； 肠衣浸泡；已灌料香肠的浸泡；已灌料香肠的表面喷洒。对于硬香肠来说，纳他霉素的推荐用量 6 纳他霉素高产菌株的诱变育种 为肠衣浸渍液质量的0 0 5 0 2 【5 j 。 ( 3 ) 果汁 纳他霉素在果汁中的应用也很广泛。对于葡萄汁，添加2 0 m g k g 纳他霉素就能防止酵母菌发 酵：对于2 5 - - 4 c 下保存的橙汁，自然条件下保存一周就会受到真菌的污染，而仅使用1 2 5 m g k g 低剂量的纳他霉素就能保质8 周；对于苹果汁，3 0 m g k g 的纳他霉素能在6 周内防止发酵变质， 并且使果汁的原有风味基本保持不变”】。 ( 4 ) 茶饮料 1 9 9 9 年，c i r i g l i a n o m c 等人1 7 1 报道，纳他霉素用于茶饮料，可以有效防止真菌腐败，并给予 茶饮料更加可接受的感官特性。 ( 5 ) 水果 1 9 8 1 年，j g o o s t e n d o r p l 3 】报道，纳他霉素用于水果储存中，可有效防止真菌引起的有氧降解。 我国也有关于纳他霉素应用于水果的报道。将整个苹果浸泡在含有5 0 0 p p m 纳他霉素的悬液中 1 2 m i n 后，经过8 个月的存放，能有效降低苹果变质的数目。 ( 6 ) 焙烤食品 已经研究过纳他霉素在各种焙烤产品中的应用。当黑面包和白面包表面洒有1 0 0 5 0 0 m g k g 的纳他霉素混悬液时，防霉效果不错。用纳他霉素对生面团进行表面处理，也收到了理想效果。 此外，j g o o s t e n d o r p l 8 1 还报道纳他霉素用于卷心菜叶的防腐，以及在草、马铃薯种子和水仙 花球茎中的应用，都取得了满意的效果。目前，纳他霉素在我国的应用也越来越广泛。纳他霉素 用于沙拉酱、人造奶油、果冻、酱菜和广式月饼，防霉效果均很好m 。 1 6 3 纳他霉素在医药工业中的应用 纳他霉素除了月j 作食品防腐剂，还可药用。近儿年，报道纳他霉素用于医疗的文献越来越多， 它的临床应用范围也越来越广泛。纳他霉素以几种制剂形式( 悬浮剂、乳剂、软膏和鞘状药片等) 被典型地用于抗皮肤和粘液膜的真菌感染，既可以单独使用又可以与新霉素、氢化可的松及其它 类固醇共同使用。纳他霉素还可用于阴道和肺部真菌感染的治疗1 3 , 8 , 1 2 】。 1 9 9 7 年9 月，k a l i u z h n a i al d ，m u r z i n ae a t 报道，将不同剂量的纳他霉素用于治疗儿童由真 菌引起的皮肤和粘液膜感染非常有效。 最新的文献显示，纳他霉素已成功的用于真菌性角膜炎的治疗中，纳他霉素口服不吸收，限 于局部用药。因其难溶于水，临床上使用5 混悬液滴眼，眼部能耐受且无毒性1 13 4 】。 目前，纳他霉素已被广泛用于食品、医疗、饲料、粮储等领域中，特别是在食品原料保鲜、 成品防腐方面的应用显示了良好的前景。 1 7 纳他霉素的生产概况 1 7 1 纳他霉素生产菌特征 纳他霉素产生菌为链霉菌，基内菌丝体通常发育良好，多分枝，无隔膜而连贯；它的气生菌 丝丰茂，气生菌丝通常较基内菌丝粗，颜色较深，当菌丝逐步成熟时，大部分气生菌丝分化成孢 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 子丝，产生呈长链的孢子，孢子为外鞘所包，鞘表面平滑或带各种装饰物，在电子显微镜下表现 为双短杆镶嵌图，有鳞片或形状和大小不同的突起、刺或毛发等：孢子的分裂方式也有差异，有 的沿横膈中央平切，有的两端浑圆，由残余的鞘相连。 目前，报道的纳他霉素产生菌有三种： ( 1 ) 恰塔努加链霉菌( s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o v g e n s i s ) a t c c13 3 5 8 ，孢子丝圈至螺旋形，有时柔 曲；孢子呈球形或椭圆形，表面带细刺。 ( 2 ) 纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ) i s p5 3 5 7 ，孢子丝2 - 5 圈松敞螺旋形；孢子呈球形 或卵圆形，表面带小刺。 ( 3 ) 褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ) a t c c1 3 3 2 6 ，孢子丝螺旋形；孢子呈球形或卵 圆形，孢子表面带刺。 1 7 2 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径可以分解为活化前体的生成( 乙酰辅酶a 和丙二酰辅酶 a ) 、内酯大环的生物合成( 多聚乙酰途径) 和氨基糖的形成。如图3 所示。 厂一一、 ii o ： ，一一 h 肛l 州h o p 蠹摹糖的筹譬麓亿音嚣 誓tu 黼j l 獬 辅曹“ c b ，即葡萄糖 丙酸钠 大豆蛋白胨。发酵：e 艺的最优组合为a 2 8 2 c 3 ，即葡萄糖3 6 ，大豆蛋白胨1 8 ，丙酸钠0 8 。 3 4 6 培养温度的影响 温度是影响微生物存活与生长的最重要的因素之一。温度对微生物的影响主要表现在两个方 面，一方面随着温度的升高，细胞中的生物化学反应速率加快；另一方面微生物的重要组成如蛋 白质、核酸等对温度较敏感，随着温度的增高可能遭受不可逆的破坏。同时温度除了直接影响发 酵过程中各种反应速率外，还影响发酵液的物理性质，如发酵液中的溶氧和气体传递速率等，从 而影响了微生物代谢产物的形成。为探讨温度对纳他霉素生成的影响，在出发菌株的培养温度 2 8 前后设置了几个不同的温度，以期获得y 1 8 8 的最是发酵温度。分别设定发酵温度为2 5 、2 6 、 2 7 、2 8 、2 9 、3 0 ，其它条件固定，进行摇瓶发酵试验，测定纳他霉素产量。 3 2 纳他霉索高产菌株的诱变育种 4 5 纳 4 他3 5 霉 3 素2 5 产 9 且 ， 号1 5 ( g 1 l ) 0 5 0 2 52 62 72 82 93 0 温度( ) 图1 4 温度对发酵产量的影响 f i g 1 4e f f e c to f t e m p e r a t u r eo nf e r m e n t a t i o n 可以看出，纳他霉素产量在2 5 2 8 温度范围内，随着温度的升高而增大，2 8 c 时达到最大 值。当温度高于2 8 c 时，纳他霉素产量随着温度的升高而减小。因此，最适发酵温度为2 8 。c 。 3 4 7 培养基起始p h 值的影晌 由于摇瓶发酵过程中p h 难于控制，因此试验只控制发酵液的初始p h 在不同起始p h 值条件 下培养，2 8 条件下，测定纳他霉素的产量。分别调整发酵培养基起始p h 为5 、5 5 、6 0 、6 5 、 7 0 、7 5 、8 0 ，其它条件固定，进行摇瓶发酵试验，测定纳他霉素产量。 p h 图1 5 初始p h 对发酵产量的影响 f i g 15e f f e c to fp ho nf e r m e n t a t i o n 从图1 5 可知，产物合成的最适p h 值为7 7 5 ，此时纳他霉素产量接近4 1 。故纳他霉素发酵 的最适初始p h 值为7 2 。 3 3 5 4 5 3 5 2 5 l 5 o 4 3 2 1 o 纳他霉素产量gl一 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 3 4 8 溶解氧的影响 微生物在进行物质道谢的同时伴随着能量代谢的进行，氧是微生物体内产生能量的一些列生 化反应的电子受体，因此是耗氧微生物进行能量代谢的重要物质。 摇瓶发酵时，培养基的装液量与摇床的转速基本上可以反映瓶内的溶氧水平。装液量越少， 转速越大，则溶氧越好。本试验通过改变3 0 0 m l 摇瓶中的装液量与摇床转速研究了溶氧浓度对 产物合成的影响。 ( 1 ) 分别调整摇床转速为1 6 0 、1 8 0 、2 0 0 、2 2 0 、2 4 0r p m ，2 8 ，p h 7 0 ，进行摇瓶发酵试 验，测定纳他霉素产量。 纳4 他 霉3 素 主2 里 g 1 l0 1 6 01 8 02 0 02 2 02 4 0 转速( r p m ) 图1 6 转速对产量的影响 f i g 16e f f e c to fr o t a t es p e e do ng r o w t ho fp r o d u c t i o n 如图1 6 所示，随摇床转速的升高，纳他霉素的产量也升高，当转速大于2 2 0 r p m 时产量增高 趋势逐渐平缓。考虑到摇床的承受能力，确定2 2 0r p m 为最适转速。 ( 2 ) 装液量对产量的影响 以3 0 0 m l 三角瓶，装液量1 5 - - 4 0 m l ，摇床转速2 2 0 r p m ，起始p h 7 2 ，2 8 c 发酵。测定纳他 霉素产量。 4 5 纳 4 他3 5 霉 3 素2 5 产 2 量1 5 ( 1 l ) 0 5 0 1 5 2 02 53 03 5 装液曩( m l 3 0 0 m e ) 4 0 图1 7 装液量对产量的影响 f i g 1 7e f f e c to f c a p a b i l i t yo f c o n t a i n e ro ng r o w t ho f p r o d u c t i o n 纳他霉素高产菌株的诱变育种 由图1 7 可以看出，装液量对产物合成影响显著，当装液量由1 5 m l 增大到2 5 m l 时，纳他霉 素产量增加，继续增大装液量，纳他霉素产量开始下降。 综合摇床转速和装液量两方面的结果得出，在发酵产酶过程中极为耗氧，对溶氧量的需求很 大。 3 5 本章小结 本章以菌株1 ，一l1 8 为出发菌株，对其液体发酵培养基和发酵条件进行了优化，结果表明液体 发酵培养基的最佳碳源为葡萄糖，浓度为3 6 9 l ，最佳氮源为大豆蛋白胨，最佳浓度为1 8 ，前 体丙酸钠的浓度为o 6 。另外，对纳他霉素发酵的条件也进行了考察，即菌株的发酵温度、 初始p h 值、装料量等。发现3 0 0 m l 三角瓶中装料量为2 5 m l ，摇床转速为2 2 0 r p m ，p h 值为7 2 时，在温度2 8 。c 条件下发酵，纳他霉素发酵效价最高。 3 5 河北农业大学硕+ 学位( 毕业) 论文 4 1 纳他霉素生产菌种的诱变 4 讨论 在研究抗生素生物合成过程和抗生素形成的遗传机制方面，诱变也是一种非常有效的手段。 在研究抗生素的生物到目前为止，许多微生物代谢产物如氨基酸、核营酸、有机酸、酶制剂等及 一些活性物质的发酵生产都或多或少得益于诱变育种技术。但是某一菌株长期使用诱变剂之后， 除产生诱变剂疲劳效应外，还会引起菌种生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢等，这对发酵工 艺的控制不利，在实际生产中多采用几种诱变剂复合处理、交叉使用的方法进行菌株诱变。 4 2 初筛方法的建立 鉴于诱变导致的菌种突变是随机的，生产需要的正突变频率更低，冈此诱变完成后，如何定 向筛选出正向突变株则是一项更重要的j 二作。链霉菌产抗生素能力与抗生素抗性基因之间的对应 关系是目前抗生素科研领域的一个研究热点。采刚链霉素作为致死标记筛选，大约1 0 左右的链 霉素抗性菌株是纳他霉素产量获得提高的菌株。用该方法初筛，结合传统的诱变方法，工作效率 大大提高。 4 3 发酵液中产物测定方法的建立 已经报道的纳他霉素检测方法有分光光度计法、比色分析法、元素分析法、微生物分析法、 色谱分析法和h p l c 法等，纳他霉素的分析干扰因素很多，各种方法各有优缺点。目前常用的检 测方法主要有三种：生物检测法、h p l c 法和紫外分光光度计法。生物检测法被国际公认，但该 方法操作繁琐，对实验条件及操作水平要求较高? 测定周期较长，不够快捷方便。h p l c 法对样 品处理要求较高，条件要求严格。紫外分光光度计法作为实验室的常规对照方法，标准品选用霉 克即可，因其复合物在纳他霉素吸收波长处无吸收值，故不需要纯品，同时样品处理简单，方便 快捷，准确度较高，是一种比较理想的快速定性定量检测方法。 4 4 培养基与发酵条件的优化研究 培养基的成分大致分为碳源、氮源、无机盐、微量元素、特殊生长冈子、水等几大类。其中 碳源和氮源是培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能源，组成菌体细胞成分的碳架，构成代 谢产物。氮源物质构成菌体细胞结构物质。在为微生物提供营养物质时，必须严格掌握各种营养 物质的浓度和比例，因为营养物质的浓度和比例直接影响菌体的繁殖和产物的积累。除了营养条 件外，微生物发酵生产还需要有适宜的环境条件即培养条件加以配合，才能使其生产能力充分发 挥出来。所以必须研究生产菌种的适宜培养条件，如培养温度、p h 值条件、需氧量等。 3 6 纳他霉索高产菌株的诱变育种 5 1 结论 5 结论与展望 本论文对纳他霉素生产菌的诱变和选育等方面进行了系统的研究，主要完成了以下几个方面 的工作，并得到了相关结论。 建立了链霉素抗性与纳他霉素产量之间的关系模式，快速筛选纳他霉素高产突变株。并建立 了一套快速、准确的分析产物的方法，利用紫外分光光度计法快速测定发酵液中的纳他霉素含量。 通过对纳他霉素生产菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u sa t c c1 3 3 2 6 ) s g s 菌株进行分离复壮， 获得一株遗传性能较为稳定的菌株s g 1 7 ，以s g 1 7 为出发菌株进行紫外线诱变育种，获得比出 发菌株s g 一1 7 效价提高5 9 的菌株u v 1 2 5 ，对u v 1 2 5 进行微波诱变，获得比u v 1 2 5 效价提高 3 3 的菌株m 6 3 ，以m 6 3 为出发菌株进