（环境工程专业论文）微生物絮凝剂的研制与开发.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：盘 到 日期：塑皇：s ：鏊 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留，使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：蚴导师签名：蛊皇立日 山东大学硕士论文 摘要 微生物絮凝剂是一种新型的天然有机高分子化合物。它具有高效、安全、不 产生二次污染等特点，因而受到科学界的高度重视。本论文在全面系统地论述近 年来国内外微生物絮凝剂的研制开发现状与发展的基础上，对微生物絮凝剂产生 菌种筛选、培养条件优化、絮凝剂结构组成与特性、絮凝作用机理以及应用进行 较为系统深入地研究与探讨，主要内容与所得结论如下： 以活性污泥、土壤作为菌源，在特定的培养基中培养增殖，对获得的纯菌株 的絮凝活性进行测定、筛选絮凝剂产生菌。在筛选到的1 7 株菌中，絮凝能力最 强两株都来自土壤，对其进行菌种鉴定，为无花果沙雷氏菌( s e r r a t i af i c a r i a ) 和产气肠杆菌( k l e b s i e l l a m o b i l i s ) 首次发现无花果沙雷氏菌可以生产絮凝 剂。 对无花果沙雷氏菌( s e r r a t i af i c a r i a ) 进行了较为全面的条件优化，该菌 可以在较广泛的培养条件下繁殖并产生高效絮凝剂，具有良好的工业应用前景。 该菌的最佳培养基及最佳培养条件为：乳糖l o g ，k h 2 p o 。2 9 ，k 2 i l p o 5 9 ，n a c l 0 。i g ， 尿素0 5 9 ，酵母膏0 5 9 ，水i l ，p h 6 8 ，温度为3 0 ，摇床培养3 d ，代谢产 物对高岭土悬液的絮凝率超过9 7 。 无花果沙雷氏菌产生的絮凝剂，主要分布于发酵液中，对其进行提取纯化， 通过絮凝过程中高岭土z e t a 电位的变化及絮凝剂的组成对絮凝剂的絮凝特性及 絮凝机理进行探讨。结果表明：该微生物絮凝剂带负电荷，属于阴离子生物高分 子絮凝剂，它凝聚絮凝高岭土悬浊液作用机理是以吸附架桥作用为主。 采用较为廉价的乳品废水作为替代培养基生产微生物絮凝剂。该絮凝剂对各 种废水有较好的处理效果，对c o d c ，、浊度、色度等都有一定的去除率。 关键词：微生物絮凝剂无花果沙雷氏菌絮凝活性 山东大学硕士论文 a b s t r a c t m i c r o b i a lf l o c c u l a n t sa r en e w l yd e v e l o p e dn a t u r a lm a c r o m o l e c u l a ro r g a n i c s u b s t a n c e s f o rt h e i rb i o d e g r a d a b i l i t y , h i g hp e r f o r m a n c ea n dh a r m l e s st oe n v i r o n m e n t , m i c r o b i a lf l o c c u l a n t sh a sd r a wm o r ea n dm o r ea t t e n t i o n s t h i sp a p e rs u m m a r i z e da s e r i e so f r e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to np r e p a r a t i o no f m i c r o b i a lf l o c c u l a n t s s y s t e m a t i c a l l y t h ei s o l a t i o no f f l o e c u l a n t - p r o d u c i n gb a c t e r i u m ，o p t i m i z a t i o no f c u l t u r ec o n d i t i o nf o rf l o c c u l a n t sp r o d u c t i o n ，t h ec o m p o s i t i o n ，c h a r a c t e r i s t i c sa n d f l o c c u l a t i o nm e c h a n i s mo f m i e r o b i a lf l o c c u l a n t sw e r es t u d i e da n dd i s c u s s e d t h e m a i nc o n t e n t so f t h er e s e a r c ha n dt h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： f o rt h es c r e e n i n go fm i c r o b i a lf l o c c u l a n t - p r o d u i n gm i c r o o r g a n i s m ，s u s p e n s i o n s f r o ma c t i v a t e ds l u d g e , s o i ls o l u t i o nw 啪c u l t i v a t e di ng i v e nm e d i aw j t l lk a o l i nc l a y s u s p e n s i o na st h et e s ts a m p l ef o rf l o c c u l a t i n ga c t i v i t y i n1 7s c r e e n i n gb a c t e r i a , t h e t w ob e s ts t r a i nw i t l lf l o c c u l a t i n ga c t i v i t yw e r ei s o l a t e df r o ms o i la n di d e n t i f i e da s s e r r a t i a f i c a r i aa n dk l e b s i e l l am o b i l i s i ti sf i r s tt i m et od i s c o v e rs e r r a t i a f i c a r i aa s f l o e c u l a n t - p r o d u c i n gb a c t e r i a t h ee x p e r i m e n tc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e df o rs e r r a t i a f i c a r i a t h es t r a i nc o u l d g r o wi nw i d es i t u a t i o n sa n dp r o d u c eh i g h - e f f e c tf l o c c u l a n t s t h es t u d i e ss h o wt h a tt h e o p t i m u mc a r b o ns o n r c ef o rt h i ss t r a i nt op r o d u c i n gf l o c c u l a n ti sl a c t o s ea n dt h e n i t r o g e ns o u i v 2a r ey e a s tc r e a ma n du r e a ；t h eo p t i m u mp hi s6 o 8 0 ：t h eo p t i m u m i n o e u l a b i l i t yc a p a c i t yi sa b o u t1 0 ；t h es a l t sa r c0 2 k 2 h p 0 4a n d0 5 k h 2 p o , l ； t h eo p t i m u mc u l t u r et i m ei s3d a y s t h ef l o c c u l a t i o nc o u l dr e a c h9 7 0 a f t e r3d a y s c u l t u r e t h em i c r o b i a lf l o c c u l a n t sp r o d u c e db ys e r r a t i a f i c a r i aa r ee x c r e t e do u to f t h e c e l l a n dt h ef l o c c u l a n t s 黜m o s t l yd i s t r i b u t e di nz y m o l y t i cm e d i u m t h ef l o c c u l a t i o n a n dz e t ap o t e n t i a le x p e r i m e n t sw e r em a d e i ti sd e m o n s t r a t e dt h a tt h em i c r o b i a l f l o e e u l a n t sa r eal 【i 1 1 do f a n i o nm a c r o m o l e c u l a ro r g a n i cs u b s t a n c e sa n dt h em a j o r m e c h a n i s ma r ea d s o r p t i o na n db r i d g i n g t h em i c r o b i a lf l o e c u l a n t sa r ep r o d u c e db yu s i n gd a i r yw a s t e w a t e ri n s t e a do f m e d i a t h ef l o c c u l a t i o ne f f e c to f m i c r o b i a lf l o c c u l a n t so nt h et r e a t m e n to f w a s t e w a t e r i ss t u d i e d p i l o tt e s t ss h o wt h a tc o d c r , s sa n dc h r o m ar e m o v a la r eh i g h k e yw o r d s ：m i c r o b i a lf l o c c u l a n t s ，s e r r a t i a r f i c a r i a ，f l o c c u l a t i n ga c t i v i t y 2 山东大学硕士论文 引言 课题依据： 絮凝沉降是目前国内外普遍采用的一种既经济又简便的水处理技术。絮凝剂 可以分三大类：有机高分子絮凝剂、无机絮凝剂、微生物絮凝剂。随着社会经济 的高速发展，无机和有机合成高分子絮凝剂越来越广泛地被应用于各种给水或废 水处理中。然而在使用过程中给环境造成的二次污染也越来越引起人们的重视。 因此开发安全无毒、絮凝活性高、无二次污染的新型絮凝剂对环境保护和人类的 健康都有重要的现实意义。 微生物絮凝剂是类由微生物本身或代谢产物提纯得到的高分子化合物。絮 凝剂产生菌种类繁多，在细菌、霉菌、酵母菌、放线菌、藻类中部存在，而且分 布广泛。微生物絮凝剂组成也是多种多样，一般由多糖、蛋白质、d n a 、纤维 素、糖蛋白、聚氨基酸等组成。大多数微生物絮凝剂的分子量在1 0 5 道尔顿以上， 一般为链状或分枝状结构，富含多种官能团，如羟基、氨基、羧基等。这些官能 基团能够与水体中相邻的胶体颗粒形成氢键、疏水键或相互络合作用，使胶体迅 速脱稳。由于微生物絮凝剂大多数为生物活性物质，易生物降解，无二次污染， 它克服了无机和有机絮凝剂使用时存在的安全与环境污染方面的问题，同时又具 有高效絮凝特性，因而具有广阔的开发应用前景，已成为近年来国内外研究开发 的热点。 目前，国内外对微生物絮凝剂的研究主要集中在以下几个方面：首先是微生 物絮凝剂产生菌的筛选，以及培养基和培养条件的选择；其次是絮凝剂组成、结 构分析及其絮凝特性。微生物絮凝剂产生菌种类繁多，所以产生的微生物絮凝剂 的种类也各异。即使是同一种微生物絮凝剂，其单体组成也比有机合成高分子絮 凝剂复杂得多，并直接影响其絮凝特性和作用；再者是微生物絮凝剂的应用研究， 己有许多研究者已将微生物絮凝剂应用于活性污泥膨胀治理、污泥脱水、纸浆废 水、染料废水、畜产废水处理以及发酵液菌体去除等众多领域，取得了良好的絮 凝效果。 然而正是由于微生物絮凝剂的种类繁多、组成结构复杂，因此对它的了解和 研究还不足，缺乏系统性。微生物絮凝剂目前采用的葡萄糖、淀粉、酵母膏，牛 山东大学硕士论文 肉膏等高价培养基质，决定了其生产成本过高，与目前常用的无机和有机合成高 分子絮凝剂相比，经济上缺乏市场竞争力。因此，有关微生物絮凝剂的研究，目 前还处于初步研究探索阶段。 本文研究的目的和内容： 本文主要基于目前微生物絮凝剂研究发展趋势及其存在问题，以微生物学、 发酵工程、环境化学和絮凝理论为基础，着重在以下几个方面对微生物絮凝剂进 行研究。 首先以活性污泥、土壤作为微生物絮凝剂菌种来源，在特定培养基中培养增 殖，以高岭土悬液为处理对象，进行分离、筛选絮凝剂菌种并生产微生物絮凝剂。 对培养条件进行优化，研究探讨微生物絮凝荆的组成，絮凝特性及其作用机理。 为了降低生产成本，提高微生物絮凝剂的实用性和经济性，以廉价的食品加工废 水作为替代培养基，用来生产絮凝荆。最后开展微生物絮凝荆对各类模拟水样、 实际废水的除浊、脱色、去除c o d 的实验研究。为微生物絮凝剂的研制开发提 供基础理论依据。 4 山东人学顺1 论文 第一章文献综述 絮凝沉降是目前国内外普遍采用的一种既经济又简便的水处理技术。其处理 效果的好坏很大程度上取决于絮凝剂的性能”1 。絮凝剂可以分三大类：有机高分 子絮凝剂、无机絮凝剂、微生物絮凝剂。随着社会经济的高速发展，无机和有机 合成高分子絮凝剂越来越广泛地被应用于各种给水或废水处理中。然而在使用过 程中给环境造成的二次污染也越来越引起人们的重视。据有关学者研究表明。”， 老年痴呆与现在广泛使用无机絮凝剂聚合氯化铝有关。而使用较多的有机絮凝剂 聚丙烯酰铵，其单体丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，是强的致癌物质。因此开发 安全无毒，絮凝活性高，无二次污染的新型絮凝剂对环境保护和人类的健康都有 重要的现实意义。 微生物絮凝剂是一类由微生物产生的，具有絮凝活性的代谢产物，主要含有 糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和d n a 等。1 。它具有易被微生物降解、无毒无害、 安全性高、适用范围广等特点，因此近年来得到了各国学者的广泛关注并成为新 型絮凝剂研究开发的热点1 。 1 1 微生物絮凝剂的发展史 对微生物絮凝剂的研究，最早见报道的是1 9 3 5 年b u t t e r t i e l d “从活性污泥中 筛选到一抹絮凝剂产生菌。随后的研究者在这方面继续进行了研究。7 0 年代 j n a k a m u r a 等人从霉菌、细菌、放线菌、酵母菌等2 1 4 株菌中筛选出1 9 株絮凝 剂产生菌株，包括8 株霉菌、5 株细菌、5 株放线菌和1 株酵母菌。其中a s p e r g i l l u s s o j a e t 5 1 产生的絮凝剂a j 7 0 0 2 效果最好；t a k a g ih 等从土壤中分离到株对多种 微生物细胞和悬浮胶体颗粒具有良好絮凝作用的真菌p a e c i l o m y c e s 印”；8 0 年代末k u r a n e 等人从旱田土壤中分离筛选到一株r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i 一”， 制成了命名为n o c l 的微生物絮凝剂。k u r a n e 等人将n 0 c l 用于畜产废水、膨 胀污泥和砖场生产废水等的处理，均取得了很好的效果，被认为是目前发现的最 好的微生物絮凝剂“1 。 目前，韩国的k w o n g s ，s e o h y u n h y o ，k i m y o u n g j u n 等人，德国的 e r e i n h a r d 以及以色列的n l e v y 等人也对微，l ，j 物絮凝剂进行了较为全面的研究 ”。至今研究者已经获得了多株具有不同r i 能的微生物絮凝剂产g 蔺，这些微生 山东天学硕 论文 物絮凝削在使用过程中具有高效，安全、不污染环境的优点，在食品、化学以及 制药等领域具有巨大的潜在应用价值”。”。 1 2 产絮凝剂的微生物种类 至今发现的具有絮凝特性的微生物种类多种多样，它们分布于细菌、放线 菌和真菌以及藻类之中。4 1 。这些已经鉴定的微生物大量存在于土壤和活性污泥 中，具体种类如表1 所示。”。 表l 产絮凝剂的微生物 t a b l elf l o c c u l a n tp r o d u c i n gm i c r o o r g a n i s m s 絮凝剂产生菌中文名称 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s n o c a r d i af e s r i e 8 n o c a r d i ar h a d n i i n o c a r d i ac a l c a r e a a l c a l i g i l l u sl a t u s a l c a l i g e n e sc u p i c l u s a s p e r g i l l u ss o j a e p a e c i l o m y c e ss p a g r o b a c t e r i u ms p p s e u d o m o n a sf 1 u t p s c e h s p s e u d o m o n a ss p p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a c o r y n e b a c t e r i u r ab r e v i c a l e s t r e p t o m y c e sv i n a c e u s s t r e p t o m y c e sg r i s e u s s o r d a r i af i m i c o l a m o n a s c u sa n k a z o o g o l e as p a s p e r g i l l u sp a r a s i t i c u s b a c i l l u ss p 红平红球菌 椿象虫诺卡氏菌 红色诺卡氏菌 石灰壤诺卡氏菌 广泛产碱菌 协腹产碱杆菌 酱油曲霉 拟青霉菌属 土壤杆菌属 荧光假单胞菌 假单胞菌属 绿脓假单胞菌 铜绿假单胞菌 棒状杆菌 酒红色链霉菌 灰色链霉菌 粪生粪壳菌 赤红曲霉 动胶菌属 寄生曲霉 芽孢杆菌 1 3 微生物絮凝剂的成分 微生物絮凝剂的种类繁多、性质各异。现已知的微生物絮凝剂成分有糖蛋白、 多糖、蛋白质、纤维素和d n a 等。尽管它们性质各异但多为分子量高于1 0 u 的 生物大分子”。”。近年来，国内外的研究者借助各种技术和手段对多种絮凝刺的 组成和结构进行了表征。刘紫鹃等”研究表明絮凝剂b p 2 5 的主要成分是多糖类 物质，胡筱敏等“”。研究表明絮i 疑剂m b f 9 主要分子量超过2 0 0 万，是线 理高分子， 山东大学硕士论文 含1 9 1 糖醛酸、2 7 4 氨基酸和4 7 4 中性糖。而h a r u h i k oy o k o i 等研究发 现絮凝剂p y - 9 0 主要成分为聚合谷胺酸。 1 4 微生物絮凝剂的提取纯化 微生物絮凝剂的提取纯化方法有多种。首先根据菌的情况去菌体。霉菌的发 酵液可以过滤去菌体；细菌、酵母菌则用离心去菌体。提取絮凝剂则视发酵液的 组成成分及絮凝物质的种类和性质而定。常采用的方法有凝胶电泳法、溶剂提取 法和碱提取法。絮凝剂的纯化是将提取到的絮凝剂粗品溶于水或缓冲溶液中，通 过离子交换、凝胶色谱纯化，透析去小分子物质，真空干燥得到精制品。曲1 1 5 微生物絮凝剂的絮凝条件 对于生物絮凝剂的作用机理先后提出过很多学说。目前较为普遍接受的是 “桥联作用”机理。该学说认为絮凝剂大分子借助离子键、氢键和范德华力，同 时吸附多个胶体颗粒，在颗粒间产生“架桥”现象，从而形成一种网状三维结构而 沉淀下来。1 。l e v y 等“1 以吸附等温线和z e t a 电位测定表明环圈项圈藻p c c 一6 7 2 0 所产絮凝剂对膨润土絮凝过程确以“桥联”机制为基础。用电镜照片显示“”聚合 细菌之间有胞外聚合物搭桥相连，正是这些桥使细胞丧失了胶体的稳定性而紧密 的聚合成凝聚状在液体中沉淀下来。 影响微生物絮凝剂絮凝能力的因素包括絮凝剂投加量、絮凝剂分子量、p h 、 金属离子和其它无机离子、温度等”1 。 1 5 i 微生物絮凝剂投加量t 对于某一絮凝体系来说，微生物絮凝剂的絮凝效率受到其投加量的影响“”， 在较低浓度的范围内，随着絮凝剂投加量的增多，絮凝效果提高，到达某一程度 后，再增加絮凝剂的浓度。絮凝效果反而变差。主要是因为在较高浓度微生物絮 凝剂存在的条件下，微生物絮凝剂高分子吸附在固体悬浮颗粒的表面上，形成一 层高分子保护膜，使整个体系处于稳定状态，降低絮凝活性。”。 1 5 2 微生物絮凝剂的分子量 目前，已分离纯化的微生物絮凝剂多为蛋白质和糖类的生物大分子( 见表 2 ) ，分子量从几十万到几百万不等。絮凝剂的分子量、分子结构及所带基团对絮 凝剂的絮凝活性影响较大“”。据研究报道。“”等研究表明分子量越大，携带电 荷越多，吸附位点越多，絮凝活性越高。此外，如果絮凝剂大分子具有线形结构， 7 山东大学硕士论文 那么它的絮凝效果要好于交联的或支链结构的絮凝剂。 1 5 3p h p h 值是影响絮凝效果的重要因素，它不仅能改变絮凝剂的表面电荷性质、 形态结构，还能影响被絮凝物质的电荷性质，进而影响它们之间的吸附行为嘲。 p s e u d o m o n a n ss p c - 1 2 0 产生的絮凝剂对p h 变化适应性很强0 1 ，在p h2 一1 0 的范 围内均不受影响；a s p e t g i l l u ss o j a ea j 7 0 0 2 产生的絮凝剂在p h 为3 5 时表现 出絮凝活性，但在p h7 - 9 时丧失絮凝能力嘲； a r c u a d e n d r o ns p t s - 4 9 产生的 絮凝剂在p h 低于5 的酸性条件下对酵母菌悬液的絮凝活性最高，随着p h 的升高 絮凝活性降低，这主要是因为p h 改变了被絮凝对象酵母菌的表面电荷引起絮凝 活性的变化1 。 1 5 4 金属离子及其浓度 金属离子种类与离子强度对絮凝剂活性影响很大“”。一般来说，大多数阳离 子如c a 2 + ，m n ”，m g ”，a 1 ”，f e 3 + 等金属阳离子在微生物絮凝剂的絮凝过程中， 有利于絮凝剂的絮凝。其促絮凝作用往往是在絮凝剂与被絮凝物之间起到“架桥” 的作用，“架桥”效果的程度取决于絮凝剂中羧基等官能团暴露数量的多少，暴露 的数量越多。越便于二价金属阳离子的“架桥”，絮凝效果越好。而絮凝剂中羧基 等暴露的数量，又受到由絮凝基因表达的相关酶水平的影响。二价离子如c a + ， m g ”在高浓度时促进效果较好，而a 1 ”，f e ”等三价离子在低浓度时助絮凝能力 强。这与离子所带电荷性质有关，二价离子所带电荷少，电中和能力较弱，所需 的离子浓度较高 1 5 5 温度 温度对于絮凝活性有较大的影响。高温可以使某些絮凝活性物质( 如蛋白质) 改性，导致絮凝活性下降。如r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 产生的絮凝剂在温度 为3 0 c 8 0 c 的条件下活性最大，高于这一温度絮凝活性便迅速下降”1 。但对于 由多聚糖构成的絮凝剂受温度的影响较小，如b a c i l l u ss p 产生的絮凝剂( 主要 成分为聚半乳糖胺) ，在o c 1 0 0 c 之间絮凝效果不随温度改变而变化“”。 1 6 微生物絮凝剂的实际应用 微生物絮凝剂不仅具有絮凝范围广、絮凝活性高、安全无害、可生物降解等 优点。5 - 1 1 ! 而且作用条件粗放，因此可以广泛应用于污水和工业废水处理中 8 山东大学硕士论文 3 t - * 】 在甘草废水处理中，向呈膨胀状态的污泥中加入微生物絮凝剂n o c - 1 。活性 污泥的沉降指数s v i ( 污泥容积指标) 很快从2 9 0 降低到5 0 ，此时污泥的膨胀状 态消失，活性污泥的沉降性能恢复“”。向畜产废水中加入适量的生物絮凝剂 n o c 一1 ，沉降1 0 r a i n 后上清液接近透明，t o c 的去除率达7 0 1 ，浓度由1 4 2 0 m g k g 降至4 2 5 m g k g ；总氮浓度由4 2 0 m g l 降至2 1 5 m g 几：浊度去除率高达9 9 7 “”。 在活性污泥处理过程中，用2 m l 微生物絮凝剂n o c 一1 和5 m l 的浓度为1 的c a + 溶液，处理9 5 m l 浓缩后的污泥，可使污泥体积在2 0 m i n 内浓缩为原体积的9 2 ， 上清液的o d 。小于0 0 5 “。近年来，a n a s t a s i o si 等“4 向垃圾渗滤液中投加适量 的微生物絮凝剂，c o o 的去除率达8 5 。董军芳等“”研究用微生物絮凝剂与硫酸 铝复合，处理自来水原水，处理后的水样完全达到国家饮用水的标准。 同时已有的研究表明。4 “”，微生物絮凝剂可以对包括细菌、真菌、放线菌 以及藻类在内的大多数微生物产生絮凝作用。因此，微生物絮凝剂不仅可以应用 于废水处理，而且可以作为发酵工业和食品工业中安全有效的絮凝剂，为取代传 统工艺中的离心和过滤过程提供了可能。 1 7 微生物絮凝剂的发展趋势 对微生物絮凝剂的初步研究表明，微生物絮凝剂在微生物发酵工业、医药工 业和废水处理中有广阔的应用前景“”1 。但降低生物絮凝剂的生长成本是实际应 用的首要条件。目前微生物絮凝剂的研究还主要停留在实验室研究阶段，要达到 大规模的工业应用还需要继续筛选广谱、高效、粗放的絮凝剂产生菌，对微生物 合成絮凝剂的条件和影响微生物絮凝剂活性的因素进行更深入的研究，以便寻找 廉价的培养基，降低微生物絮凝剂生产成本，实现微生物絮凝剂的工业化生产。 可以预计，通过对微生物絮凝剂的全面深入研究，微生物絮凝剂将为水处理 技术的发展展示一个广阔的前景。 9 山东大学硕士论文 第二章材料与方法 2 1 絮凝；f ! i 产生菌菌种来源 1 山东大学东校区校园内土壤 2 济南市水质净化一厂曝气池活性污泥 3 济南市水质净化一厂脱水污泥 2 2 筛选絮凝剂产生菌所用培养基 1 培养基组成 葡萄糖1 0 9 ，k h 2 p 0 45 9 ，n a c l 0 1 9 ，尿素o 5 9 ，酵母膏o 5 9 ，水1 l ，p h 7 0 7 2 。 2 液体培养基 按上述组成配制好培养基，用n a o h 或h c i 调节p h 至给定值，分装于2 5 0 m l 三角瓶中，装液量为5 0m l 。高压蒸汽灭菌，温度为1 2 0 。灭菌后取出，冷却 后即可接种。该培养基主要用于菌体增殖。 3 平板固体培养基 在按组成配制好的培养基中添加1 5 2 0 琼脂粉，加热使之融解并与培养 基混匀。调节p h 值，高压蒸汽灭菌。灭菌结束，待培养基冷却至5 左右，将 培养基倾倒于灭菌过的空平板上，放平。待冷却凝固即可进行接种。该培养基主 要用于分离、纯化单菌落。 4 斜面培养基 将添加琼脂并调节p h 值的培养基趁热移入试管中，装液量为5m l 。塞上棉 塞，高压蒸汽灭菌。灭菌结束，趁热将试管一端垫高摆放，使培养基形成斜面， 待冷却凝固，即可进行接种。该培养基主要用于纯化菌种的培养和保藏。 2 3 絮凝剂产生菌的筛选 1 土壤作为菌种来源筛选絮凝剂产生菌 取一定量土壤用无菌水配成悬浊液，静置3 0 m i n ，移取上清液5 m l 子5 0 m l 筛选培养基中，于3 0 c ，摇瓶培养2 3 天。再取一定量培养液于同种新鲜培养 基培养2 3 天，将培养液稀释，然后涂布于相应平板固体培养基上，培养2 3 天，待菌落长出后，选择表面光滑且带粘性的单菌落用接种环挑起，转接于相同 的斜面培养基中，于3 0 c 恒温培养箱中培养2 3 天。待菌体大量繁殖，用接种 i o 山东大学硕士论文 环挑取一环接于液体培养基中，摇床培养4 8 小时，2 0 0 r m i n ，3 0 c ，取培养液 冷冻离，l , ( 1 5 0 0 0 x g ) 3 0 m i n ，测定上清液对高岭土悬液浊度的去除效率( 絮凝活 性) ，选取具有较高絮凝活性的菌株作为初筛菌种，采用平行发酵培养，将具有 稳定絮凝性能的菌株作为复筛菌种，反复筛选得到纯菌种。 2 活性污泥作为菌种来源筛选絮凝剂产生菌 将取自污水处理厂的活性污泥静置一段时间，移取上清液5m l 于5 0m l 筛 选培养基中，于3 0 c ，摇瓶培养2 3 天，再取一定量培养液于新鲜培养基培养 2 3 天，将培养液稀释，然后涂布于相应平板固体培养基上，培养2 3 天，待 菌落长出后，选择表面光滑且带粘性的单菌落用接种挑起，转接于相同的斜面培 养基中，于3 0 x 3 恒温培养，其余同上述操作。 2 4 絮凝方法 用蒸馏水将过2 0 0 目筛的高岭土配制成4 9 l 的悬浊液。操作程序为在快速 搅拌( 2 0 0 r m i n ) 的条件下，在l o o m l 高岭土悬液中投加5 m l 浓度为l g l 的c a c l ： 溶液和2 m l 培养液的上清液，3 0 秒钟后，转入慢速搅拌( 1 0 0 r m i n ) 5r a i n ，然 后静置1 0m i n ，取上清液在5 5 0 n m 的波长下，测定吸光度值，以不加絮凝剂的样 品作对照。、 絮凝活性= ( a b ) a x1 0 0 a 为对照上清液吸光度b 为样品上清液吸光度 2 5z e t a 电位测定方法 利用m a l v e m - z e t a s i z e r2 0 0 0 h s 进行z e t a 电位测定，样品测定前先用k o h 或者 h n 0 3 调节p h 值。静置4 5 m i n 。待样品p h 稳定后再测定。 2 6 絮凝剂成分分析方法 采用菲林反应和双缩脲法对絮凝剂进行化学成分分析，测定方法见参考文献 1 8 。采用n i e o l e t2 0 s x f t - i r 型红外分光光度计对絮凝剂进行官能团测定。采用 s - 5 2 0 硼陡c | 型扫描电镜对絮凝剂的形貌进行表征。 2 7 絮凝剂的提纯 该实验利用溶剂提取法。培养液离心除去细胞后，于上清液中加入2 倍体积 山东大学硕士论文 乙醇，沉淀物真空干燥，获得微生物絮凝剂的粗制品。取一定量已培养4 8 h 的发 酵液，经蒸馏水稀释到原体积的3 倍，室温下缓慢搅拌2 h ；离o l o m i n ( 5 0 0 0 g ) 去除残留菌体，上清液超滤浓缩到原体积的i 2 ，加入2 倍体积的乙醇，混合均匀 可见到白色棉絮状物结合成团，在温度为4 c 的条件下放置1 2 h ，离心取得沉淀， 在蒸馏水中洗涤，然后对其进行冷冻干燥。重复以上步骤两次可得到纯的微生物 絮凝剂。 2 8 仪器与设备 生物显微镜( x s 一2 0 1 ) ，超净工作台( s v x ) ，空气浴振荡器( h z q - c ) ，隔 水式电热恒温培养箱( p y s d h s 一3 5 * 4 0 ) ，电热手提式压力蒸汽消毒器 ( y x q s g 4 1 2 8 0 ) ，六联搅拌机( i ) ( ；- - 5 0 6 ) ，紫外可见分光光度计( u v - 2 4 5 0 ) ， z e t a 电位分析仪( z e t a s i z e r2 0 0 0 ) ，c 0 1 ) 速测仪，电予天平( b s1 1 0 s ) ，浊度 仪( 2 1 0 0 p ) ，高速离心机，5 l 标准发酵罐( g u c s 一5 ，镇江东方生物工程设备技 术公司) ，p h 屯极( 3 6 3 - - $ 7 1 2 0 ，梅特勒) ，d o 电极( i n p r 0 6 8 0 0 ，梅特勒) ， 灭菌锅( y x 一4 5 0 2 ，上海三申医疗器械有限公司) ，鼓风机( w m - - 4 ，天津医 疗器械二厂) 等。 山东大学硕士论文 第三章絮凝剂产生菌的筛选及絮凝剂产生条件的优化 采集山东大学东校区校园内土壤及济南市水质净化一厂曝气池活性污泥，进 行微生物絮凝剂产生菌的筛选。 为了提高微生物絮凝剂在发酵液中的浓度，必须在培养时提供充足营养、适 宜温度、良好通气状况，菌体才能正常生长并产生大量的絮凝剂，倘若遭遇不良 环境条件，将不产生或很少产生絮凝剂。因此，菌种的培养要尽量提供优越的条 件。在为微生物提供充足营养的同时，还要考虑到营养物的种类和浓度对絮凝剂 产生的影响。因此要对培养基和培养条件进行优化，以获得高浓度絮凝剂。本章 对无花果沙雷氏菌( s e r r a t i af i c a r i a ) 进行了较全面的条件优化。 3 1 微生物絮凝剂产生菌的筛选 经初步筛选，得到1 7 株絮凝活性高于8 0 的菌种，如表3 1 所示 表3 1 筛选菌株的絮凝活性及其来源 f i g l 3 1f l o c c u l a f i o na n dr e s o u r c eo f s c r e e n e db a c t e r i a 对这1 7 株菌继续平板涂布，进行纯化，分离单菌落，传代培养，测定菌株 的液体培养基的絮凝活性。其中絮凝活性最高的是1 3 # 和1 4 # ，且产絮凝剂的性 状稳定。菌1 3 # 菌落呈淡黄色，菌1 4 # 呈乳白色，均表面凸起、光滑、粘稠，菌 体粘连不易挑起，该菌代谢产物对高岭土悬液有良好的絮凝效果，形成絮体大， 沉降迅速，上清液透明澄清，对高岭土悬液的去除率达9 4 1 和9 3 7 。经山东 坐墨查兰婴主堡苎 大学生命学院微生物实验室( 国家重点实验室) b i o l o g 菌种鉴定仪鉴定为无花 果沙雷氏菌( s e r r a t i af i c a r i a ) 和产气肠杆菌( m e b s i e l l a o b i l i s ) ，其中 无花果沙雷氏菌是首次发现可以作为絮凝剂产生菌。鉴定结果见表3 2 。 表3 2 絮凝剂产生菌的鉴定结果 f i 9 3 2i d e n t i f i c a t i o no f f l o c c u l a n t - p r o d u c i n gb a c t e r i a 裹2 ：环1 环2 蕾株的生理生化特征 特征 环i环2特征 环l 环2 利用糖生长：利用有关c 漂： 营茸藉 + + ( 产醵产气)拧攮酸盐+4- 麦芽糖 + 葡糖酸盐 + 蔗糖 + 卜稻石酸盐 一 一 纤维二话4 - 一 膏酸盐4 - + 肌尊 + 丙= 爱盐 一+ 术靖发酵不稳定+蕞朊酸盐 一一 阿东群襞酵不稳定4 - ( 产气)果胶馥盐 一 一 阿拉伯糖 +一 v p 舅定 + 乳糖 + 一 m r 测定： 一一 s 嘲i d s 啊_ c h _ - t ls e 删h o _ 1 帅0 髓s ng 忖e h r 2 ) s o t m l o 蝴00 i 蒉口肌 3 ，目曲_ 即- 帅耐 即制r 帕 口 o 舯1 0 薯o h t - e h q ) a _ - _ d 酗m 蛐_ o 帅 哪 对t 孙i - e n t s ) 阳删m - 哺 on 1 寿( g h 4 e n t ) 埘曲_ - 口酗嘲0哪”4 9a + e r r 7 ir 岫_ o 1 2 舶g r - - e r t ，轴r 幽曲h0 舯1 2 研制- e r t ，b r o 蝻晴刖m r d ，嘲0哪t 4 a 叫m i 自曲叫_ b 哪 n l t t g n e t 4 t o _ - s p 喇n 日r 曲- d 町_ 啊- 精o q h m 曲帕和 - ) 1 ，e 嘲帕b - d n 帕口聃忡m o 哺帕 1 0 铺t 端a 雌n 下 2 h m m o m o 盘 3 ) 轴- 呻，m 一即_ 嘲嘲 口叫 i o 钳口旧盯 4 曲h 计瞄0伽 ”1 9a + e 盯 5 m k o m1 1 钢a * l 舶删岫- 岫哪1 1 g 忖洲 7 1 日- 曲r 咖嘲哪l 与g 眦盯 s r r d d 嘲哪! 绷a 件叶 ，r 豳岫_ 融酗棚啪6 缸o ，置翘口“m o 白- m c _ - 0 哪! ，啦雠n t o l p 岫1 m 十二月鲫0 3 1 1 m p b ，一 即口 种薹定结秉 根据形杏特征生理生化反应b l 蝴t 种譬宅仅鐾定结果，多相分类综合定一的原用耳l 于无花果沙t 氏奠s c 啊血石c - 血) ；环2 于产气肠杆( h 舾瞄咖托学薯l c b 鲥i i m o b i n ) 2 0 0 1 2 3 0 1 4 山东大学硕士论文 3 2 絮凝剂产生条件的优化 3 2 1 无机盐对絮凝活性的影响 在上述液体培养基中分别加入o 2 的k c l ，f e c l 。，c a c l ：，a 1 ：( s o ) 。，c u s o , ， m g s o , ，k ：h p o , ，n a z h p o ，b a ( n o 。) ：等无机盐溶液替代k h ：p 0 4 。培养后测定对絮凝 活性的影响，结果如表3 3 所示。 表3 3 无机盐对絮凝活性的影响 t a b 3 3e f r e e to f s a l t s0 1 1f l o c e u l a t i o na c t i v i t y 无机盐( o 2 )絮凝活性( ) k c l f e c l ， c a c l 2 a l ：( s 仉) ， 、 c u s 仉 m g s 0 4 k 2 h p 矾 n a z h p 仉 b a ( n o ，) ： 0 2 k d - i p 0 4 + 0 5 k h ：p o , 7 6 8 3 7 4 6 6 9 8 4 4 8 1 5 4 2 2 2 4 1 5 9 5 3 3 3 5 7 1 4 7 3 3 3 9 6 3 4 由表3 3 可知，k c l ，f e c l ，b a ( n o 。) ：，c a c l ：对絮凝剂的絮凝效果有一定的 促进作用，而各种硫酸盐皆不利于絮凝剂活性的提高。虽然用k 2 h p o 替代k h ：p o , 不能保证絮凝剂有高的絮凝活性，k ：h p 仉和k h ：p o , 联用对絮凝活性的提高却具有 良好的效果，这是因为在菌株的生长过程当中k 。h p o , 和k h ：p o , 不仅能够提供菌株 产絮凝剂所需的必要的无机盐和适宜的渗透压，而且k ：h p 0 4 和k h ：p 0 。组合是一种 常用的缓冲剂，使培养液p h 值保持稳定。 3 2 2 培养液初始p h 值对絮凝活性的影响 如图3 1 所示，该菌可以在较大的p h 范围内生长，发酵液粘稠，产生大量 的菌体，并在p h 为6 o 8 0 的范围内有良好的絮凝活性，p h 为6 时絮凝活性最 高，达9 6 。过酸过碱则不利于菌体的生长繁殖和絮凝剂的产生。因此培养液的 初始p h 值以6 o 8 0 之间为宜。 山东大学硕士论文 图3 1p h 对絮凝活性的影响 f i g 3 1e f f e c to f p hv a l u eo nf l o c c u a t i o na c t i v i t y 3 2 3 接种量对絮凝活性的影响 由图3 2 可见，接种量对絮凝活性也有一定影响，随着接种量的增加，絮凝 剂的絮凝活性有所增加，适宜的接种量为1 o ，此时菌体生长良好且代谢产物 多，培养液的絮凝活性出现一个最大值，为9 4 2 。接种量过大反而不利于絮凝 剂的产生。其原因可能是在接种量过大的情况下带入培养基中菌体过多，引起营 养竞争。 山东大学硕士论文 图3 2 接种量对絮凝活性的影响 f i g 3 2e f f e c to f i n o c u l a b i l i t yc a p a c i t yo nf l o c c u l a t i o na c t i v i t y 3 2 4 碳源对絮凝活性的影响 在培养基( 酵母膏0 0 5 ，k h 2 p 0 4 0 2 ，n a c l 0 0 1 ，尿素0 0 5 ，p h 6 8 ) 中加入各种碳源o