（环境工程专业论文）嗜酸氧化亚铁硫杆菌的培养特性和浸磷效果.pdf

武汉理工大学硕士学位论文 摘要 自从硫杆菌被人类发现了以后，出现了很多对相关菌种的描述。对嗜酸氧 化亚铁硫杆菌硫杆菌属中主要用于生物浸矿的细菌之一，也有很多报道。 本文主要是通过实验对从安徽某煤矿的酸性矿坑水中采集的嗜酸氧化亚铁硫杆 菌进行分离纯化以及浸磷的初步研究。 富集培养实验结果表明，在培养温度为3 0 ，初始p h 值为3 0 8 ，接种量 为1 0 ，选用9 k 培养基时，对a t f m 生长培养最为有利；在分离纯化实验中， 采用稀释涂布平板法来分离纯化该菌，通过改变固体培养基的成分，用平板出 现菌落的天数以及菌落数目的稀疏程度评价实验成果。从而得出了影响因素： ( 1 )培养基酸度较高，易导致凝固剂被酸降解，使细菌不能稳定固着生 长，不能形成紧密的菌落，是抑制菌落产生的根本原因。调节培养基成分，可 以很大程度上克服这一状况。当培养基中亚铁离子浓度为4 5 9 l 时嗜酸氧化亚 铁硫杆菌有较好的菌落分离效果。 ( 2 )琼脂经高温灭菌后产生较高浓度的对化能自养菌有毒的水溶性有机 物也可能是影响单层平板检出率的重要原因，而双层平板下层的异养菌因能消 耗上层的水溶性有机物从而可大幅度提高硫杆菌的检出效率。实验证明，采用 双层平板底层为涂布异养菌( 红酵母菌) 的琼脂平板，上层为涂布嗜酸氧化 亚铁硫杆菌的9 k 固体培养基平板，有利于a t ，菌菌落的生成。 经过细菌鉴定实验，可初步判断从矿坑水中直接分离而得的目的菌株为嗜 酸氧化亚铁硫杆菌。 在浸磷实验中，考虑了多种因素对彳t ，菌浸出低品位磷矿的影响，通过对 浸出液的p h 值、菌浓度以及浸磷率评价该效果。得出实验结论为：采用缺磷 9 k 培养基，初始 f e 2 + 】为9g 几，黄铁矿为外加能源物质，经过3 0 天的浸矿反 应，最高浸磷率能达到4 4 1 6 ；加入0 1 m l 的1 吐温8 0 ，可将浸磷率提高到 4 8 0 1 。 最后对a t 厂菌分解磷矿机理进行了初步探讨，认为细菌浸出磷矿的机理是 细菌的直接和间接作用共存的复合作用。浸磷效果的两个重要影响因素为浸出 液的酸度和细菌的生物量。 关键词：嗜酸氧化亚铁硫杆菌分离纯化固体培养基磷矿分解细菌浸出浸磷 室 武汉理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t i th a sb e e nr e p o r t e da b o u tt h ed e s c r i p t i o no ft h eb a c t e r i o l o g ys i n c et h i o b a c i l l u s w a sf o u n d ，a n dr e p o r th a sa l s ob e e nm a d eo n a c i d i t h i o b a c i l l u s 归r ，懈f d n 坶由n e o ft h et h i o b a c i l l u su s e dm a i n l yi nt h el e a c h i n go fo r e s i nt h i sd i s s e r t a t i o n , w e r e s e a r c ha b o u tt h ei s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f a c i d i t h i o b a c i l l u s e r r o o x i d a n sw h i c h w a si s o l a t e df r o ma c i dm i n ed r a i n a g ef r o mac o a lm i n ei na n h u ia n dt h el e a c h i n go f l o wg r a d ep h o s p h a t eo r eb ye x p e r i m e n t s t h er e s u l t so fe n r i c h m e n te x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a tb a c t e r i u mg r e ww e l lu n d e r t h ec o n d i t i o n so f ：c u l t u r et e m p e r a t u r e3 0 ，i n i t i a lp h3 0 8 ，q u a n t i t yo fi n o c u l a t i o n 1 0 a n du s i n g9 kc u l t u r em e d i u m ；i nt h ee x p e r i m e n to fi s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，i t i sa d o p t e dd i l u t i n ga n ds m e a r i n gs l a bt oi s o l a t ea n dp u r i f y d u r i n gt h ee x p e r i m e n t s t h r o u g hc h a n g i n gt h ei n g r e d i e n to fp l a t e ，i ti se v a l u a t e db yt h ed a y so fa p p e a r a n c ea n d n u m b e 稻o f c o l o n y i ti sa f f e c t e db yt h ef o l l o w i n gf a c t o r s ： ( 1 ) t h eb a s i cr e a s o nf o rt h ec o l o n yf o r m a t i o ni n h i b i t i o ni st h a tt h ec u l t u r e m e d i u ma c i d i t yi st o oh i g hf o rb a t e r i a lo x i d a t i o nt op r e v e n ta g a rf r o mp e p t o n e da n d k e e pi n v a r i a b l ep hf o rt h ei n o c u l u m ，i nw h i c ht h eb a c t e r i u mc a ns t a b l ya n c h o r a g eo n t h em e d i u mf o r g r o w t h a n d m u l t i p l i c a t i o n r e g u l a t i n g t h ec u l t u r em e d i u m c o m p o s i t i o n ，c a no v e r c o m et h i ss t a t et oag r e a te x t e n t a st h ec o n c e n t r a t i o no ff e 2 + i n 9 ks o l i dc u l t u r em e d i u mw a s4 5 如i th a sab e t t e rc o l o n ys e p a r a t i n gr e s u l to f a t ， ( 2 ) t h eh i g hc o n c e n t r a t i o no fd i s s o l v e do r g a n i cm a t t e r ，w h i c hi st o x i ct o c h e m o a u t o t r o p h i ca c i d i t h o b a c i l l ib a c t e r i a ，r e l e a s e df r o ma g a rw i t ha u t o c l a v ew e r e r e s p o n s i b l ef o rt h el o w e rc o l o n yc o u n te f f i c i e n c yf o rs i n g l e l a y e rp l a t e o nt h e c o n t r a s t t h ey e a s ts t r a i nl i v e di nu n d e r l a y e rc o n s u m e dal o to fd i s s o l v e do r g a n i c m a t t e ri nm e d i u m ，r e s u l t i n gi nah i g h e rc o l o n yc o u n te f f i c i e n c yf o rd o u b l e l a y e rp l a t e t h ee x p e r i m e n t sp r o v e dt h a t a d o p t i n gad o u b l e - l a y e rp l a t e ，w i t hh e t e r o t r o p h i c m i c r o b er h o d o t o r u l a s p s p r e a d o n t ot h eb o t t o ml a y e ra n dc h e m o a u t o t r o p h i c b a c t e r i u m a t f s p r e a d o n t o t h eu p p e r l a y e r i s i n f a v o r o f t h e f o r m a t i o n o f a t f c o l o n y a c c o r d i n gt ot h eb a c t e r i a li d e n t i f i c a t i o ne x p e r i m e n t s ，w ec a np r e l i m i n a r i l yj u d g e t h a tt h es t r a i nw h i c hw a si s o l a t e df r o ma c i dm i n ed r a i n a g ef r o mac o a lm i n ew a s i d e n t i f i e da s a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s t h ei n f l u e n t i a lf a c t o r si n c l u d i n gc u l t u r em e d i a ，e n e r g ys o u r c em a t e r i a l sa n dt h e a d d i t i o no fs u r f a c t a n to nt h el e a c h i n go fp h o s p h a t eo r ew i t ht h ec u l t i v a t e da t fw e r e s t u d i e d i ti se s t i m a t e db yp h ，t h eb a c t e r i ad e n s i t ya n dt h er a t eo fl e a c h i n go f p h o s p h a t eo r e i ti sc o n c l u d e dt h a tu pt o4 4 1 6 o fp h o s p h a t ei nt h eo r ew a sl e a c h e d i i 武汉理工大学硕士学位论文 o u tu s i n gt h ei s o l a t e da t fs t r a i na f t e r3 0d a y su n d e rt h ec o n d i t i o n so f 9 kc u l t u r e m e d i u mw i t h o u tk 2 h p 0 4 , t h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no ff e “w a s4 5 叽u s i n gp y r i t e a st h ee n e r g ys o u r c em a t e r i a l w i t ht h ea d d i t i o no f0 1m lo f1 t w e e n 8 0s o l u t i o n , t h er a t eo fl e a c h i n go fp h o s p h a t eo r ec a x ib eu p g r a d e dt o4 8 0 1 a tl a s t , t h em e c h a n i s mo ft h el e a c h i n go fl o wg r a d ep h o s p h a t eo r eb y a t f w a s p r e l i m i n a r i l yd i s c u s s e d t h er e a c t i o nm e c h a n i s mi sc o m p l e xw i t ht h eb a c t e r i u m c o n t r i b u t i n gt ot h ep r o c e s sb yo x i d i z i n gf e n o u si o n st of e r r i ci o n s ，t h es o - c a l l e d ”i n d i r e c tm e c h a n i s m ”o fb a c t e r i a lo x i d a t i o na n db a c t e r i u mo x i d i z i n gt h ec o n c e n t r a t e d i r e c t l y , t h es o - c a l l e d ”d i r e c tm e c h a n i s m ”o fb a c t e r i a lo x i d a t i o n t h ea c i d i t yo f l e a c h i n gs o l u t i o na n db a c t e r i a lb i o m a s sa r et h et w oi m p o r t a n tf a c t o r si nt h i sp r o c e s s k e yw o r d s ：a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；s o l i dc u l t u r e m e d i u m ；p h o s p h a t e o r ed i s s o l u t i o n ；b a c t e r i a ll e a c h i n g ；r a t eo f p h o s p h a t el e a c h e d i u 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权保 留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：埤导师签名：二弛日期：j ! 邋 武汉理工大学硕士学位论文 第1 章绪论 随着生产力的发展，人类技术的进步，经济发展与环境保护已经成为人类现 今面临的最大矛盾。现今产生的绿色风暴，对消费者而言有绿色食品，在贸易中 有绿色贸易，而在环境中存在绿色化学。所谓的绿色化学就是用化学的技术和方 法，从根本上减少或消灭那些对人类健康或环境有害的原料、产物、副产物、溶 剂和试剂等的产生，从复杂低品位矿、废堆矿石和尾矿中回收有价金属，实现矿 物资源的高效利用和应用。其本质是从源头上彻底阻止污染的产生。从这个意义 上说，过去发明的许多有关化工“三废”治理的方法均不属于绿色化学之列，因 为这些方法对污染是终端控制而不是始端预防。生物浸出是一种利用微生物把矿 石中不溶性金属化合物变成可溶性化合物，再用湿法冶金从溶液中回收金属的方 法。本文主要是介绍了硫杆菌属的嗜酸氧化亚铁硫杆菌广泛应用在冶金技术 中提取贵金属或是贱金属，探讨其在磷矿石微生物浸出中的应用。 1 1 我国磷矿资源分布及特点 我国磷矿资源比较丰富，已探明资源总量仅次于摩洛哥，居世界第二位。截 止2 0 0 2 年底，我国保有磷资源量1 6 7 8 6 亿t ，其中储量2 1 1 1 亿t ，基础储量4 0 5 4 亿t ，资源量1 2 7 3 2 亿t 。探明资源主要分布在云南、贵州、湖北、湖南、四川5 省。我国磷矿p 2 0 5 平均品位1 6 9 5 ，p 2 0 5 品位 3 0 的富矿仅占总储量的8 1 2 ， 其中云南省占3 5 9 6 、贵州省占4 5 5 2 。从应用看，p 2 0 5 品位 3 0 、可直接 供酸法制肥用的富矿资源主要集中在贵州的开阳磷矿，加上西烽磷矿，合计地质 储量不足3 亿t 。 我国磷矿资源的主要特点1 1 1 ： ( 1 )分布比较集中，地理分布上极不均衡。贵州、云南、湖北、四川和湖 南5 个省份拥有的磷矿资源储量占全国的7 4 。我国北方和东部地区可供利用的 磷矿资源很少，从而形成南磷北运，西磷东运的格局。 ( 2 )低品位磷矿多，富矿资源少。查明资源储量中p 2 0 5 品位3 0 以上的富 矿石储量几乎全都集中在贵州、云南，湖北、四川和湖南5 个省内。尤其是贵州 开阳，3 3 品位以上优质矿的储量占全国优质矿储量的7 8 。全国的磷矿石平均 品位只有1 7 ，可丌采储量平均品位为2 3 ，是世界上磷矿石平均品位较低的国 家。 ( 3 )胶磷矿多，采选难度大。7 0 以上为中低品位的胶磷矿，矿物质颗粒细， 武汉理工大学硕十学位论文 嵌布紧密，有害杂质较多，选矿成本较高。 ( 4 )矿床类型以沉积磷块岩为主沉积型磷矿约占全国资源总量的8 0 。 1 2 微生物浸出磷矿的国内外研究现状 目前利用磷矿制取磷酸盐的生产途径有热法磷酸和湿法磷酸两种【2 】。热法的 产品质量好、浓度高、应用范围广，但湿法的成本低得多。目前几种主要磷肥都 是以湿法来生产的。湿法磷酸是用磷矿石与无机酸反应，经分离杂质后制得，目 前所用无机酸主要是硫酸。对于湿法过程，其硫酸消耗量非常大，如生产1 吨的 磷酸一铵( m a p ) 就约需硫酸3 6 0 吨。这意味着大量的硫酸生产，同时为防腐蚀 而需要巨大的设备投资和可观的生产费用，同时带来了巨大的环境污染。水溶性 磷肥容易被雨水溶解而造成磷的流失，或在碱性土壤中退化，磷的有效利用率仅 为3 0 5 0 。不管是湿法过程还是热法过程，在目前的工艺条件下，两者对使 用的磷矿品位都有较高要求，热法的要求比湿法更高。为此，寻求利用低品位磷 矿的方法，提高磷的利用率，成为了当前磷化工研究的主要方向。 近年来，随着生物技术的发展和绿色化学的新要求，许多研究者致力于微生 物的研究和工业应用。在湿法冶金工业中，低品位金属硫化矿物的细菌浸出得到 了广泛的研究，特别是用于铜、铀、金的浸出，其中铜的生物浸出占到世界铜生 产总量的2 0 1 3 j 。在这种研究微生物工业应用的热潮下，一些研究人员开始研究 利用微生物制生物活性肥的工艺路线，希望不用硫酸置换磷酸的传统生产工艺。 关于磷矿的微生物浸出，国内外已有一些报道1 4 - 9 1 ，根据溶磷微生物的特性可分 为两大类：有机化能异养型微生物( 异养菌) 溶磷和无机化能自养型微生物( 自养 菌) 溶磷。 1 2 1 异养菌溶磷 许多异养菌具有溶磷作用，包括细菌和真菌。报道较多的主要有芽孢杆菌、 假单胞杆菌等细菌，以及曲霉菌和青霉菌等真菌。不同种类的异养菌对不同含磷 原料的溶磷能力有很大的差异【锚l 。例如，g h o s ha n db a n i k 用黑曲霉菌浸出磷酸 盐岩的浸出率最高只有4 5 5 0 。n a r s i o na n dp a t e l 用一种霉菌浸出不同来源的 磷矿粉，发现浸出率最高可达到4 5 ，而p a u la n ds u n d a r a 发现，一些芽孢杆菌 对磷酸三钙的浸出率只有2 0 。中国农业大学林启美等进行的国家重点基础研究 发展规划( 9 7 3 ) 项目系统地研究了各种溶磷微生物( 节卡t 菌、假单胞细菌、青霉菌、 曲霉菌等) 对不同磷矿粉的溶解能力。研究表明，供试细菌溶解来自湖北和贵州 的磷矿粉能力比较强，浸出率最高达到2 7 3 ，而供试真菌溶解云南磷矿粉的能 力最强，浸出率最高达到2 5 4 。碳源、氮源和碳氮比对微生物的溶磷能力有很 2 武汉理工大学硕士学位论文 大的影响，在以n 0 3 为氮源的培养基中曲霉菌表现出强的溶磷能力，而节杆菌 的溶磷能力则降低，青霉菌则只有在以n h 4 + 为氮源时，才具有溶解磷矿粉的能 力。曲霉菌在以n 0 3 。为氮源时浸磷率最高可达到3 7 ，而在以蔗糖为碳源时浸 磷率最高可达4 5 。培养基的碳氮比越高，曲霉菌的溶磷能力越高，而青霉菌则 在碳氮比最低时溶磷能力最强。肖春桥等研究了巨大芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌在 不同磷矿粉用量，培养时间以及不同碳源和氮源质量分数等条件下的磷浸出率。 结果表明：磷的浸出率最高达到3 3 。随着磷矿粉用量增加，磷的浸出率显著 降低，但当用量超过1 0g l 后，培养时间越长，磷的浸出率越高，到培养的1 5 天达到最高值。碳源和氮源质量分数在3 时磷的浸出率最高。 异养菌的溶磷机理比较复杂，不同的菌有不同的溶磷机理，同一菌也可能有 多个溶磷机理。一般认为主要有两种机理：一是由于异养菌在代谢过程中分泌质 子，使培养介质的酸度升高，从而导致磷酸盐溶解。质子来源于呼吸作用和吸收 利用n h 4 + 。二是由于异养菌在代谢过程中分泌有机酸，使培养介质的酸度升高， 同时有机酸与铁、铝、钙、镁络合或螯合，使磷酸盐溶解。范丙全等进行了溶磷 微生物的筛选，获得了具有溶磷作用的草酸青霉菌，在不同条件下测定了其溶磷 能力，并与拜菜青霉菌和巨大芽孢杆菌进行了比较。结果表明草酸青霉菌的溶磷 能力显著高于拜菜青霉菌和巨大芽孢杆菌，磷的浸出率最高可达4 7 5 0 。 1 2 2 自养菌溶磷 一些无机化能自养型微生物( 如爿t ，菌、a t t 菌等) 以氧化某些还原态无机物 ( 如s o 、f e s 2 、f e “等) 获得能量自养生长，产生无机酸( 如h 2 s 0 4 等) ，可使磷酸 盐溶解【2 9 l 。例如，根据c h i 等最近的研究成果，用a t f 菌浸出含黄铁矿磷矿石 的浸磷率仅达到1 1 8 。张永奎等用自养菌臼t 菌和a t ，菌) 氧化硫磺或黄铁矿 产生的细菌酸溶液具有溶解磷矿的能力，磷矿中的某些成分( 如氟) 会抑制细菌的 活性和产酸能力，使磷矿浸出率仅有2 1 4 0 3 0 7 0 。 综上所述，关于异养菌溶磷，国内外已开展了大量的研究。已经取得的结果 表明，异养菌代谢产生的有机酸酸性不强，分解磷矿的速度缓慢，浸出率低，一 般低于4 5 ，而且培养液成分价格昂贵，实现工业化生产十分困难。因此，具有 溶磷作用的异养菌主要被用来生产具有生物活性的磷肥，能够显著地提高土壤难 溶磷的有效性和磷肥的利用效率，增加农作物吸收磷量，提高产量。在这方面， 中国农业大学林启美等进行的国家重点基础研究发展规划( 9 7 3 ) 项目已经耿得了 一些重要的成果。 关于自养菌溶磷，国内外的报道较少。主要是利用硫杆菌臼t ，菌或a t t 菌) 氧化还原态的铁或硫产生硫酸来溶解磷矿。由于硫酸具有较强的溶磷作用，而且 3 武汉理工大学硕士学位论文 自养菌的培养不需要有机物，而以磷矿中伴生的或加入的还原态硫或铁矿物为能 源自养生长，因此具有工业化生产的可能性。存在的主要问题是用硫杆菌浸出磷 矿的浸出率较低( 仅有1 2 3 0 ) 。关于不同自养菌对不同性质磷矿的浸出缺乏系 统的研究。关于自养菌溶解磷矿的基础理论研究也未见报道。 1 3 浸矿细菌硫杆菌属 在生物冶金上，硫杆菌属做出很大的贡献。硫杆菌的广泛运用，不仅可以加 速冶金技术的推广，同时减少金属的污染，对废物的回收利用；从经济上的角度 出发，不仅增加我们的废物利用率，从中获得利润；从环境的角度出发，不仅减 少固体废物的污染，还减少了资源的开发。因此，我们有必要对硫杆菌进行研究， 探讨出对人类有用的方法，推广到工业生产上。 以伯杰氏鉴定细菌学手册( 第八版) 为依据，其对硫杆菌属细菌生理生态 描述如下l ”l ： “小杆状细胞，以单根极生鞭毛运动；两个种不运动。未知有休眠阶段。革 兰氏阴性。 能量获自一种或多种还原态或部分还原的含硫化合物，包括各种硫化物、元 素硫、硫代硫酸盐、连多硫酸盐和亚硫酸盐。最终氧化产物是硫酸盐，但积累硫 和连多硫酸盐，有时在某些条件下暂时积累。嗜酸氧化亚铁硫杆菌 0 c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ) 也利用亚铁化合物作为电子供体。 该属包括严格自养的种，它们从c 0 2 获得其所需碳素；兼性自养菌；起码 有一个种既需要一种部分还原态的硫化合物，也需要有机物质j 能最适生长。 专性好氧菌，脱氮硫杆菌( t h i o b a c i l l u sd e n i t r i f i c a n s ) 例外，它能用硝酸盐作 为电子受体厌氧地生长。 最适温度约2 8 3 0 。p h 范围较宽，有些菌株非常喜欢酸性条件，而另 外一些菌株喜欢适度的碱性条件。 发现于海水、海泥、土壤、淡水、各种酸性矿水、污水、含硫矿泉之中和硫 沉积物之内或附近。特别是常发现于产生硫化氢或沉积硫的环境中。 所测定的种的d n a 的g + c 含量范围是5 0 6 8 克分子。” 矿物浸出涉及的硫杆菌种类及其作用是多种多样的，主要有嗜酸氧化亚铁硫 杆菌臼c i d i t h i o b a c i l l u s 正e r r o o x i d a n s ，简称a t ，) 、嗜酸氧化硫硫杆菌 臼c i d i t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ，简称a t t ) 、喜温硫卡t 菌阴c i d i t h i o b a c i l l u sc a l d u s ) ， 氧化铁铁杆菌( f e r r o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ) 等等。其中嗜酸氧化亚铁硫杆菌可以氧 化f c “、元素硫( s o ) 和还原态硫化物；嗜酸氧化硫硫杆菌能氧化元素硫，不能氧 化f c “；氧化亚铁铁杆菌能氧化f c “，但不能氧化元素硫。在矿物浸出过程中， 4 武汉理工大学硕士学位论文 前两种细菌通常与其他菌种混合使用，以提高矿物中有价金属的浸出率。 除以上几种主要浸矿硫杆菌外，目前许多研究发现，在硫化矿堆浸体系、硫 化矿酸性废水以及酸性温泉中存在其它多种硫杆菌，其中有报道的硫杆菌种类及 其主要生物学特性见表1 - l 【1 2 1 。 表1 - 1 浸矿体系中硫杆菌的特性 细菌细胞形态 生理特性 适应p h 适应温度氧化底物电子氧化代谢 ( um ) 范围 范围( ) 电子供体受体产物 铁硫杆菌0 5 x 1 0 专性好气z 舢芝器0 2 邺矽 嗜酸氧化硫 硫杆菌 脱氮硫杆菌 排硫硫杆菌 那不勒斯硫 杆菌 新型硫杆菌 中间硫杆菌 代谢不全硫 杆菌 g ，短杆状， 0 5 x 1 0 - 2 0 g - ，短杆状， 0 5 x 1 0 - 3 0 g ，短杆状， 0 5 x 1 0 g ，短杆状， 0 5 x 1 0 - 1 5 g ，短杆 状0 4 1 0 x o 6 4 0 g ，短杆状， 0 5 x 1 0 - 2 0 g ，短杆状， 0 5 x 1 0 - 2 0 同上 专性自养 兼性厌气 专性自养 专性蚶气 同上 兼性自养 专性好气 同上 专性混合 异养，专性 好气 0 5 - 6 01 0 3 7 h r s ，s ，同上s 0 4 - ， 2 0 - 3 5 2 8 - 3 0 s 2 0 3 +h 2 0 4 0 - 9 51 0 - 3 7 s ，s 2 0 ，同上s 0 4 2 , ， 72 8 3 0 h 2 0 ，n 2 4 5 - 1 01 0 3 7 h 2 s ，s ，同上s 0 4 z , 6 钾22 0s203h20 3 m 8 58 3 7 s 2 0 3 。同上同上 6 2 - 7 0 2 8 5 0 - 9 22 5 - 3 5 s 2 0 3 同上同上 7 8 - 9 03 0 1 9 _ 7 o2 5 3 5 6 0 - 7 03 0 2 8 6 82 5 3 5 3 0 $ 2 0 3 。同上同上 s ，s 2 0 3 2同上同上 1 4 嗜酸氧化亚铁硫杆菌细菌学描述 嗜酸氧化亚铁硫杆菌0 c i d t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ，a t ，) 是生物湿法冶金过 程主要的浸矿菌种。自从1 9 4 7 年，c o l m e r 和h i n k l e l l 3 j 首次从硫化矿酸性矿坑水 中分离得到一种能氧化硫化物的细菌嗜酸氧化亚铁硫杆菌，人们将其用于浸 出各种会属硫化矿，它已经成为生物浸出的主要菌种。爿，菌属于原核生物界， 化能营养原核生物门，细菌纲第十二部分的硫化细菌科，硫杆菌属。爿tr 菌生理 特性为化能自养，好氧嗜酸，革兰氏阴性，菌体1 0 t m 到数* m ，宽约0 5 , m ， 杆状，端生鞭毛，能游动，腺嘌呤( c ) 和鸟嘌呤( g ) 的摩尔百分含量为5 7 6 2 。 它广泛生存于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉积硫内，尤以金属硫化矿和 5 武汉理工大学硕士学位论文 煤矿等矿山的酸性矿坑水中最为常见。其适宜生长p h 为2 o 3 5 ，温度为2 8 3 5 。 一个完整的细菌结构简图如图1 - 1 ，包括细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核 ( 无核膜) 。其中a t ，菌的细胞膜的结构对其功能的作用是比较重要的，主要分为 三个部分：一是细胞质膜，由磷脂和蛋白质组成；二是中心区，包括肽聚糖和周 质区；三是外膜，包括粘膜、荚膜、鞭毛、散毛等，由脂多糖、脂蛋白和磷脂构 成【1 4 1 。 图1 - 1a t ，菌细胞结构简图 在该细菌的作用下，f c 2 + 转换成f c 3 + ，无论元素硫或者s 2 + 、s 2 0 3 二、s 4 0 可溶性和不溶性硫化物均可能被这一细菌分解并转换成s 0 4 z - ，从而获得生命过 程所需的能量，吸收空气中的c 0 2 、0 2 以及其他无机物，如铵、钾、钙盐等合 成自身的细胞组织，进行自养生长繁殖。嗜酸氧化亚铁硫杆菌氧化溶液中f e “ 离子的能力很强，据称比空气自然氧化快1 0 0 0 倍。其代谢反应为【1 5 l ： f e “+ h + + 1 4 0 2 + f e ”+ 1 2 h 2 0( 1 1 ) 当p h 值在2 5 时，菌体对铁的氧化活性最强，随p h 值的提高，对铁的氧 化活性急剧降低，至p h 值为4 时菌体基本失去了对铁的氧化活性。因此，有人 提出嗜酸氧化亚铁硫杆菌的适宜繁殖温度为3 0 ，适宜p h 值为2 5 3 8 。 李建设提出矿山酸性水的形成是硫和硫化物在水、空气和细菌的作用下氧化 水解，发生了一系列的化学反应及细菌参加的生化反应1 1 6 1 ，其反应式为： 2 f e s 2 + 7 0 2 + 2 h 2 0 - 2 f e s 0 4 + 2 h 2 5 0 4 4 f e s 0 4 + 2 h 2 s 0 4 + 0 2 细菌2 f e 2 ( s 0 4 ) 3 + 2 h 2 0 f e 2 ( $ 0 4 ) 3 - - m s + h 2 0 j r _ 3 2 0 2 细菌m s 0 4 + 2 f e s 0 4 + h 2 s 0 4 f e 2 ( s o n ) 3 + 6 h 2 0 一2 f e ( o h ) 3 + 3 h 2 s 0 4 s + 3 0 2 + 2 h 2 0 细菌2h 2 s 0 4 式中：m s 为金属硫化矿物，m s 0 4 为硫酸盐。 6 ( 1 2 ) ( 1 - 3 ) ( 1 4 ) ( 1 5 ) ( 1 6 ) 武汉理工大学硕士学位论文 由于嗜酸氧化亚铁硫杆菌的这种代谢特点，人们利用它来浸出金属硫化矿， 在硫化矿细菌浸出过程中，金属的溶解速率与细菌的生物量( b i o m a s s ) 有关。 1 5 本课题提出的背景及意义 关于低品位复杂磷矿的自养菌浸出工艺及基础理论的研究是一个新的研究 领域，具有理论意义与工业应用前景。采用自养菌( 如爿l ，菌或a t t 菌) 氧化硫 化矿，产生硫酸用来溶解磷矿，这和硫化矿生物冶金具有一些相似的规律，但也 表现出不同的特点。因此，本课题的设置是“微生物冶金的基础研究”的一个组 成部分，是其在非金属矿加工领域的扩展与应用。 我国磷矿资源的特点是矿石类型多而复杂，多为低品位贫矿，粒度细，选别 困难。采用自养菌( 如a t ，菌或a t t 菌) 氧化硫化矿，产生硫酸用来溶解磷矿， 对于我国低品位磷矿资源的利用具有很重要的意义。该方法不但解决了磷酸生产 工艺所产生的环境问题，也具有能源消耗少、节约成本等特点，有效利用了资源。 此法可处理细粒、复杂、低品位的磷矿或磷矿废石及尾矿，是解决难选磷矿回收 的行之有效的办法，可以有效解决矿山垃圾、废渣等，具有节约能源、降低成本、 保护环境、提高资源利用率等重要意义，对于维护我们周围生态环境具有深远意 义。 1 6 本课题的研究目标及研究内容 1 6 1 研究目标 本课题研究的具体目标是：掌握嗜酸氧化亚铁硫杆菌分离培养的方法，利用 纯化后的菌液浸出低品位磷矿，找出能提高浸磷效果的适合条件，为实际生产中 的应用奠定良好的基础。 ( 1 )符合工艺需要的菌种的培养和筛选。确定优良菌种的分离纯化的适宜 条件。 ( 2 )考察利用纯化后的菌液浸出低品位磷矿的效果。 在上述对浸磷影响因素研究的基础上来优化浸出条件，优选出该工艺能够顺 利进行的最佳条件，为下一步提高浸磷的回收率和速率提供基础数据和改进工艺 的指导性方向，并以此来简捷、有效、低成本的回收磷矿，最终达到充分利用我 国磷矿资源的目的。 7 武汉理工大学硕士学位论文 1 6 2 研究内容 为实现上述研究目标，需要研究以下内容： ( 1 )采集嗜酸氧化亚铁硫杆菌a tf 菌) 水样，进行富集培养和分离纯化， 研究不同培养基成分及培养条件对细菌生长及氧化活性的影响规律； ( 2 ) 考查培养基、外加能源物质、初始p h 、表面活性剂等各种因素对细 菌浸磷过程的影响，探究其变化规律，从而优化浸出过程，以获得最佳细菌浸磷 工艺。 武汉理工大学硕士学位论文 第2 章实验材料、设备和方法 2 1 实验材料和设备 2 1 1 菌种 实验中所用的菌种为嗜酸氧化亚铁硫杆菌口t ，菌) ，采自安徽某煤矿的酸性 矿坑水中，在实验室用9 k 及利森( l c a t h c n ) 液体及固体培养基经反复分离与纯化 后作为实验用菌株。 2 1 2 培养基 嗜酸氧化亚铁硫卡t 菌的培养基可以有多种方式。一般来说，硫酸铵、氧化剂、 磷酸氢钾类物质、二价铁离子f e 2 + 等是必需的。自然影响因素主要有温度、湿度、 海拔高度、矿石中的毒性成分和抑制成分等。此外，矿石粒度、矿浆浓度、搅拌 和充氧条件、细菌菌种的选择及其适应时间等，也影响嗜酸氧化亚铁硫杆菌实验 的成败。而且营养物质的用量也直接关系到细菌氧化浸出的经济成本。嗜酸氧化 亚铁硫杆菌的代表培养基是9 k 培养基和利森( l c a t h c n ) 培养基，其组成见表 2 - i l r 。 表2 1l e a t h e n 和9 k 培养基的组成( g ) ( n h 4 h s 0 4 o 1 5 k c l0 0 5 k2hp吼005 m g s 0 4 7 h 2 0 0 5 c a ( n 0 3 h 0 0 1 蒸馏水 1 0 0 0 m l i o ( w n ) f e s 0 4 7 h 2 0 溶液l o m l 1 4 7 8 ( w v ) f e s 0 4 7 h 2 0 溶液 p h = 3 o 9 ， 叭 吖 吣 眦 一 7 3 武汉理工大学硕士学位论文 注：培养基置于高压灭菌锅内在1 2 1 ( 1 0 5k 咖n 2 ) 条件下进行湿热灭菌3 0m i n 。 1 0 幕i1 4 7 8 的亚铁溶液，采用0 2 2 【m 的一次性针头过滤器进行过滤除菌。由 于亚铁溶液易被氧化，所以即用即配，且用时按比例加入培养基。 由表2 - 1 看到，两种培养基完全不含有机物，培养基的p h 通过加入1 0 n 稀 硫酸调节到3 0 。此外，培养时要振动或者通气，做到能和空气充分接触，空气 中的二氧化碳是嗜酸氧化亚铁硫杆菌的碳素源，氧是最终的电子受容体。在两种 培养基的组成中，二价铁离子f c “是嗜酸氧化亚铁硫杆菌的能源。 2 1 3 浸出用磷矿矿石 矿石粒度影响矿物表面的暴露程度及其氧化反应动力学。原则上粒度细小有 利于浸出速度和浸出完全程度的提高，但过细的矿料不仅增大磨矿费用，浸出过 程中还会产生细泥。后者将粘附矿料和细菌，妨碍矿料和细菌直接接触，从而使 浸出速度下降。提高矿浆固体矿物浓度虽可增大装料量，但超过一定限度时，溶 液中某些金属离子的不断积累可能超过微生物的极限耐受浓度，会影响细菌的生 长及活性。此外，在浸出液中细菌浓度一定的条件下，固体矿物浓度增大将导致 吸附在单位矿粒表面上的细菌数目下降；在高固体矿物浓度下进行机械搅拌时， 矿粒问的碰撞及摩擦将加剧，也会使吸附于矿粒表面的细菌损伤或脱落，所有这 些均会降低生物浸出速度。因此生物浸出常控制较低的矿浆浓度【1 2 , 1 8 l 。 实验所用磷矿样品取自湖北钟祥磷矿，原矿经破碎、磨矿至2 0 0 目作为浸出 实验用样，其化学组成如表2 2 所示，属低品位磷矿。矿物组成分析显示原矿中 的磷矿为胶磷矿，伴生有方解石、白云石和石英。物相分析见图2 - 1 。 表2 2 磷矿样品的化学组成 1 0 武汉理工大学硕士学位论文 山 o o o l 3 04 0 2 t h e t a d e g r e e a 一磷灰石；c 一方解石；d 一白云石；q 一石英 图2 - 1 磷矿样品的x r d 衍射图 2 1 4 实验药剂 本实验所采用的药剂均由国内化学药剂厂生产，药剂级别及药剂用途见表 2 3 。 表2 - 3 实验所用主要药剂 武汉理工大学硕十学位论文 武汉理1 = 大学硕士学位论文 2 1 5 实验仪器设备 本实验研究需要的主要仪器设备见表2 - 4 。 表2 _ 4 实验所用主要仪器设备 2 2 实验方法 2 2 1 菌种的采集 浸矿细菌分布很广，土壤、水体及空气都可能存在，但相对比较集中的地方 是金属硫化矿物及煤矿的酸性矿坑水，所以采集这类菌种的最佳取样点是铜矿、 铀矿、金矿、煤矿等有酸性矿坑水的地方。如何从这些地方采集菌种及在实验室 武汉理工大学硕士学位论文 中培养所获得的菌株，是浸矿技术取得成功的先决条件。 对研究者与使用者来说，工业微生物即浸矿菌种的获得一般有两种方法1 1 9 】： ( 1 )从微生物保存单位直接购买。这样可以节省时间，并减少工作量，但 这样获得的菌种常常没有从自然界采集的野生菌适应性强。 ( 2 )直接从自然界中采集野生菌。这种细菌适应性强，故人们常常从自然 界中采集。 a t ，菌广泛存在于金属硫化矿山、煤矿的酸性( p t - i 4 ) 矿坑水中。采集这种细 菌即可从这些矿山采取。掘美国矿山局调查3 0 0 个硫化矿山，仅4 个矿山没有发 现这种细菌，故一般不用担心采集不到这种细菌，只不过不同的矿山，细菌的生 长环境不同，工作性能亦有所不同。 本实验所用菌种是采集于安徽某煤矿的酸性矿坑水中，采集步骤如下： 取1 0 0 2 5 0m l 的锥形瓶，沈净并消毒处理后塞好棉塞，用牛皮纸和橡皮筋包 好瓶口，置于1 2 0 烘箱中灭菌2 0 分钟，冷却后即可作为细菌取样瓶。取样瓶 中装入适当的培养基。如矿坑水的p h 值为1 3 3 5 ，并呈红棕色( 说明有f c 3 + 存 在) ，则可能存在嗜酸氧化亚铁硫杆菌，可对此水样进行采集培养；另外也可以 取矿坑岩壁上已氧化变为棕褐色的潮湿矿块。取样时先取下牛皮纸，用一只手拔 出棉塞，另一只手持瓶接取或舀取矿坑水，水样不能取满，以不超出取样瓶体积 的2 3 为宜，需留出一定空间存空气。取样完毕后立即塞好棉塞，用牛皮纸重新 包好瓶口，贴上标签，标明取样地点及时间，带回实验室备用。 2 2 2 菌种的富集培养 实验所采用的原生菌种液细菌浓度约为1 0 6 个m l 。取洁净的2 5 0 m l 锥形瓶， 加入1 0 0 m l 已灭菌的9 k 或i , e a t h c n 液体培养基，然后向其中接入1 0 m l 的原生 菌种液，置入3 0 、1 2 0r