（发酵工程专业论文）生物转化制备l丝氨酸的研究.pdf

摘要 摘要 本文对生物转化生产l 丝氨酸进行了研究。研究的主要内容包括菌种分离鉴定，耐 受性和抗性突变株的选育以及培养基、发酵条件和转化条件的优化。主要研究结果如下： 从甲醇污染土壤中筛选分离得到一株产丝氨酸羟甲基转移酶( s h m t ) 的甲基营养型 菌株m l 2 0 6 ，s h m t 活力达到0 0 3 0 2u m l ，m l 2 0 6 的生长特性稳定，为一株良好的产 s h m t 出发菌。对菌株m l 2 0 6 菌落和细胞形态进行观察，对其生理生化特性进行了研究。 将m l 2 0 6 菌株的1 6 sr d n a 序列和g e n b a n k 数据库中已报道的1 6 sr d n a 序列进行b l a s t 比 对分析，结合形态特征和生理生化特性鉴定结果，确定m l 2 0 6 为嗜胺甲基杆菌。 以甲醇、甘氨酸、磺胺胍( s g ) 三种可提高菌株的l 丝氨酸生产能力的耐受性和抗性 药物作为筛子，通过硫酸二乙酯和亚硝基呱诱变手段最终得到突变株m l 2 1 6 ( m e t h a n o l ， g l y r ，s g 7 ) 。突变株的s h m t 活力由原来的0 0 3 0 2u m l 提高到0 0 4 6 7u m l ，酶活提高了 5 4 6 。 在p l a c k e t t b u m l a n 实验的基础上，通过响应曲面法对培养基和发酵条件中的主要影 响因子进行优化与评价，结合非显著影响因子水平值可知，在各因素分别为：( n h 4 ) 2 h p 0 4 8 6g l 、f e s 0 4 7 h 2 03 8m g l 、甲醇2 2 和转速2 0 5r m i n 时，可获得s h m t 活力的最 大值。在此条件下再进行验证实验，s h m t 活力从0 0 4 6 7u m l 提高到0 0 5 6 2u m l ， 较原来提高了2 0 3 。把培养基中添加甲醇发酵改为发酵过程中流加甲醇发酵，m l 2 1 6 的发酵时间由7 2h 减少到5 0h 。最终，通过优化酶活水平达到0 0 6 1 2u m l ，较原来提 高了3 1 0 ，菌体浓度提高了1 3 3 3 ，发酵时间减少了3 0 6 ，较大的提高了生产效 率。 根据纸层析法原理，调整展开剂成分，成功的改进了纸层析定性定量转化体系中的 l 丝氨酸的方法。利用该研究中确立的展开剂( j 下丁醇：丙酮：水：氨水= 1 0 0 ：4 0 ：3 8 ：2 ) ， 对转化体系中的l 丝氨酸进行很好的分离。纸层析法相对氨基酸分析仪测定结果在一定 范围内标准偏差为0 0 1 5 0 0 2 8 ，变异系数最大值为1 6 5 ，两种方法的相符率达到9 9 6 1 0 0 4 之间。 根据不同p h 条件下s h m t 活力可知，在此转化体系中s h m t 的最适p h 为8 5 。 不同温度条件下s h m t 的活力大小表明s h m t 的最适温度为3 0 。对转化体系中甘氨 酸添加量和甲醇浓度进行了优化，甘氨酸添加量为8 ，甲醇浓度为2 5 时，产酸最高。 在转化体系中添加2 5l m a o l l 的磷酸吡多醛，产l 丝氨酸量提高了1 2 3 ，达到7 4 6g l ， 转化时间缩短了5 8 3 ，效果显著。一定量的菌体在开放的转化体系中进行生物转化， 连续转化了四次，产酸没有明显的变化。 关键词：l 丝氨酸丝氨酸羟甲基转移酶嗜胺甲基杆菌流加发酵生物转化 a b s t r a c t a b s t r a c t l s e r i n ep r o d u c t i o nb yb i o t r a n s f o r m a t i o nm e t h o d , i n c l u d e si s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f ab a c t e r i u m ，b r e e d i n gt h eb a c t e r i u m ，o p t ：j m i z a t i o no fm e d i u mc o m p o s i t i o n , ，f e r m e n t a t i o na n d t r a n s f o r m a t i o nc o n d i t i o n s 。w a ss t u d i e di nt h i sp a p e r t h es e r i n e h y d r o x y m e t h y l t r a n s f e r a s e ( s h m t i ) w a sp r o d u c e db yan e w l yi s o l a t e d m e t h y l o t r o p h i cb a c t e r i u m s t r a i nm l 2 0 6 ，w h i c hw a si s o l a t l e df r o mm e t h a n o lp o l l u t e ds o i l t l 】t e s h m ta c t i v i t ya t t a i n e dt o0 0 3 0 2u m l b a s e do nt h ea n a l y s i so fm o r p h o l o g y b i o c h e m i c a l a n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，s t r a i nm l 2 0 6w a si d e n t i f i e da sm e t h y l o b a c t e r i u m a m i n o v o r a n sc o m b i n e dw i t ht h eb l a s t e di nt h eg e n b a n ko fi t s16 sr d n ag e n es e q u e n c e al - - s e r i n ep r o d u c i n gm e t h y l o t r o p hm u t a n tm l 216 ( m e t h a n o l ，g l 歹，s g ) w a sd e r i v e d f r o mt h ew i l db a c t e r i u mb yc o m b i n a t i i o nt r e a t m e n tw i t hd i e t h y l s u l f a t ea n dn - m e t h y l - n - n i t r o - n n i t r o s o g u a n i d i n e 1 1 1 es c r e e n i n g sw e r em e t h a n 0 1 g l y c i n ea n ds u l f a g u a n i d i n e ( s g ) w h i c h c o u l di n c r e a s et h el e v e lo fl s e r i n ep r o d u c t i o n t h es h m ta c t i v i t yw h i c ha t t a i n e dt o0 0 4 6 7 u m lf r o m0 0 3 0 2u m lw a si n c r e a s e db y5 4 6 p1a c k e t t - b u r m a nd e s i g nw a su n d e r t a k e nt oe v a l u a t et h ee f f e c t so ft h es i x t e e nf a c t o r s t h er e s p o n s es u r f a c em e t h , o d o l o g yw a su s e dt oo p t i m i z et h ea b o v ec r i t i c a li n t e r n a lf a c t o r s ，t o f i n do u tt h eo p t i m i z a t i o nc o n c e n t r a t i o nl e v e l sa n dt h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h e s ef a c t o r s b y s o l v i n gt h eq u a d r a t i cr e g r e s s i o nm o d e le q u a t i o nu s i n ga p p r o p r i a t es t a t i s t i cm e t h o d s ，t h e o p t f i m a lc o n c e n t r a t i o no ft h ev a r i a b l e sw e r ed e t e r m i n e da s ：( n h 4 ) 2 h p 0 48 6 9 l ，f e s 0 4 。7 h 2 0 3 8m g l 。m e t h a n o l2 2 r o t a t es p e e d2 0 5r m i n t h ea c t i v i t yo fs h m tw a si n c r e a s e df r o m 0 0 4 6 7u m lt o0 0 5 6 2u m l w a si n c r e a s e db y2 0 3 t h r o u g hc h a n g e dt h em o d eo f a d d i n gm e t h a n o lt of e d b a t c hf e r m e n t a t i o n t h ef e r m e n t a t i o nt i m ew a sr e d u c e df r o m7 2ht o 5 0h f i n a l l y t h es h m ta c t i v i t yw a si n c r e a s e db v31 0 n l ef e r m e n t a t i o nt i m ew a s r e d u c e db y3 0 6 t h eb i o m a s sw a si n c r e a s e db y1 3 3 3 n l em e t h o do fd e t e c t i n gl s e r i n ec o n c e n t r a t i o n 、) l ，i t l lp a p e rc h r o m a t o g r a p h yw a s e s t a b l i s h e d t h en e wd e v e l o p i n ga g e n tw a sn b u t a n o l ：a c e t o n e ：w a t e r ：a m m o n i u r nh y d r o x i d e = 10 0 ：4 0 ：3 8 ：2 c o m p a r e dt ot h ea m i n oa c i da n a l t y z e r t h es t a n d a r dd e v i a t i o nw a sb e t w e e n o o15a n d0 0 2 8 ，t h eb i g g e s tc o e ；陌c i e n to fv a r i a t i o nw a s1 6 5 。t h er a t eo fc o r r e l a t i o nw a s b e t w e e n9 9 6 a n dl0 0 4 1 h eb i o t r a n s f o r m a t i o nc o n d i t i o n so fs h m i tw e r eo p t i m i z e d , t h eo p t i m a lp ha n d t e m p e r a t u r eo fs h m tw e r e8 5a n d3 0 t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no f m e t h ；a n o la n dg l y c i n e w e r e2 5 a n d8 s e p a r a t e l y m e n2 5 1 x m o l lp y r i d o x a lw a sa d d e d t h ep r o d u c t i o na t t a i n e d t o7 4 6g l ，i n c r e a s e db yl2 3 t h et i m eo ft r a n s f o r m a t i o nw a sr e d u c e db y5 8 3 w h l e n f o u rt i m e st r a n s f o r m e dc o n t i n u o u s l yw i t hc e r t a i nb i o m a s s ，t h ep r o d u c t i o nw a sl e s sc h a n g e d k e yw o r d s ：l s e r i n e ，s e r i n eh y d r o x y m e t h y l t r a n s f e r a s e ，m e t h y l o b a c t e r i u ma m i n o v o r a n s ， f e d - b a t c hf e r m e n t a t i o n ，b i o t r a n s f o r m a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 蜀皇! 丑 日 期：) 叩噼日3 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：蜀立同导师签名：讫胞一 日 期迦墨主兰蜀呈望 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 丝氨酸发现较早，1 8 6 5 年c r a m e r 将蛋白质中的丝胶蛋白( s e r i c i n e ) 由硫酸进行水 解，从水解物中分离出一种具有甜味的晶体。1 8 8 0 年e r l e n m e y e r 推定此化合物的化学 结构为伽氨基- p - 羟基丙酸( q a m i n o p - n y d r o x yp r o p i o n i ca c i d ) ，19 0 2 年，f i s c h e 、l e u c h s 等人证明此结构式正确。然后，1 9 0 7 年f i s c h e 发现天然蛋白质中的丝氨酸是一种光学 活性物质【1 1 。由于丝氨酸含有一个手性碳原子，因此存在两种光学异构体【2 】，即d 型和 l 型，自然界中存在的丝氨酸为l 丝氨酸( l s e r i n e ) 。 1 2l 丝氨酸的理化性质 l 丝氨酸又称l 2 一氨基3 羟基丙酸、l 蚕丝氨酸、l b 羟基丙氨酸( l s e r i n e ， l 2 a m i n o h y d r x y p r o p i o n i ca c i d ，l d h y d r o x y a l a m i n e ) 分子式为c 3 h 7 n 0 3 ，化学结构式为 h o c h 2 c h ( n h 2 ) 一c o o h ，分子量1 0 5 1 0 。l 丝氨酸是一种不带电荷的极性氨基酸，从 水中得到白色结晶或结晶性粉未，呈六角形片或柱状晶，比热容为1 2 0 9j g ，摩尔热 容为1 3 5 6 5j t 0 0 1 ，熔点为2 2 3 - - 2 2 8 ，熔点后分解。l 丝氨酸易溶于水，难溶于 乙醇，在2 5 水溶液中的溶解度为5 ，0 2 ，水溶液中具左旋性( ) ，呈甜味；在2 5 1m o l l h c l 溶液中( 浓度为9 3 4 ) 的比旋度 a i d 2 0 _ + 1 4 5 ；不同基团在2 5 时的解离常数 p k i ( c o o h ) = 2 2 1 ，p k 2 ( n h 3 ) = 9 1 5 ，等电点( p i ) = 5 6 8 p 1 。 1 3l 丝氨酸的应用 虽然l 一丝氨酸属于非必需氨基酸，但其在生物体内具有许多重要的生理功能。利 用它合成嘌呤、胸腺嘧啶、胆碱等前体。作为中间体，它用于合成l 色氨酸、l 多巴、 l 半胱氨酸等【4 】。它在医药、食品、化妆品及化工等工业和科学研究中均有较为广泛的 应用。 1 3 1 在医药方面的应用 ( 1 ) 广泛应用于配制复方氨基酸输液特别是第三代氨基酸输液及营养增补剂【5 j 。适 合一般营养疗法的氨基酸混合液中的l 丝氨酸的含量为1 6 8g l ，适合于肝损伤患者的 氨基酸混合液中的l 丝氨酸的含量为5 0 0g l 。 ( 2 ) 具有稳定滴眼液p h 的作用，且滴眼后无刺激性。 ( 3 ) 用于合成多种l 丝氨酸衍生物如：仪取代丝氨酸、磷脂酰丝氨酸、环丝氨酸、 ( s ) 异丝氨酸和偶氮丝氨酸等。这些衍生物用于抗癌、抗艾滋病新药及基因工程用保护 氨基酸等，在疾病的治疗和生理功能的调节等方面都有重要作用。 1 3 2 在食品方面的应用 食品加热时所产生的香气主要来自氨基酸和糖反应生成的分解产物，此过程涉及到 食品非酶褐变过程的美拉德反应和斯特勒克降解反应。将一份l 丝氨酸和一份葡萄糖所 江南大学硕十学位论文 组成的混合物在1 0 0 下加热，通过斯特克勒降解反应生成2 羟基乙醛，使混合物具有 枫糖浆的香味特征。 1 3 3 在化妆品方面的应用 l 丝氨酸是重要的自然保湿因子之一，与磷脂类化合物可制取质体或与其它物质相 辅具有美肤功能。它可增加表皮细胞活力和保湿，延缓皮肤衰老，是皮肤角质层保持水 分的主要角色。它还具有抗菌、缓冲和表面活性剂的保护作用，以及有利于某些机体的 生理作用。它能改善皮肤弹性、强化营养、维护表层细胞的活力。将l 丝氨酸与谷氨酸、 蛋氨酸等加入洗发剂中，起到防止头屑生成的作用。 因此，它是很多高级化妆品中关键添加剂，只是因其昂贵的价格限制了它在化妆品 中的应用。随着化妆品行业的不断发展和人们对氨基酸生理作用的深人认识，l 丝氨酸 的用量将不断增加。 1 3 4 在其它方面的应用 在化学工业中，l 一丝氨酸是一种良好的手性化合物拆分剂。l 丝氨酸的衍生物在医 药化工等方面用途广泛。 1 3 5l 丝氨酸衍生物的应用 ( 1 ) 0 【一取代丝氨酸 0 【取代丝氨酸( 仅s u b s t i m e ds e r i n e ) 被应用于设计肽，而且是免疫抑制剂和免疫激活 剂，神经鞘真菌素e 等生物活性物质的有效组成部分。 ( 2 ) 磷脂酰丝氨酸 磷脂酰丝氨酸( p h o s p h a t i d y l s e r i n e ，p s ) 是细胞膜磷脂的重要组分之一。它占哺乳类 动物脑中全部磷脂的1 0 2 0 ，对许多细胞代谢过程有重要的调节作用。 p s 能帮助维持大脑的功能平衡，消除神经疲劳的危害，改善运动员在训练比赛中的 心理状况，缓解精神紧张，调节比赛情绪，改善未成年人的情绪【6 1 ；p s 抑制了运动产生 的a c t h 和皮质醇，提高睾酮皮质醇比值，减少肌肉组织中氨基酸的流失；并防止运动 紧张和超负荷训练引起的生理衰退；p s 还保护肌肉膜，避免由于肌肉损伤形成的磷脂酶 损坏；p s 提高葡萄糖向肌肉细胞的传输效率，保护营养物质不从肌肉细胞中流失。 ( 3 ) 环丝氨酸 环丝氨酸( c y c l o s e r i n e ) ，又称氨甲环酸、止血环酸、氧霉素或嗯唑霉素，化学名称 为d 4 氨基3 嗯唑烷酮，是一种纤维蛋白溶酶抑制剂。能竞争性地阻抑纤溶酶原在纤维 蛋白上的吸附。从而防止其激活，保护纤维蛋白不被纤溶酶所降解和溶解，最终达到止 血效果。临床常用于妇产科出血，以及前列腺、肝、胰、肺、卵巢、甲状腺和肾上腺等 手术后出血。近年研究表明，该药在改善脑损伤、疾病所造成的认知功能障碍方面同样 具有良好的疗效 7 1 。 ( 4 ) ( s ) 异丝氨酸 ( s ) - 异丝氨酸( ( s ) 一l s o s e r i n e ) ，即( s ) ( 一) 2 羟基3 氨基丙酸，它是一种重要的具有生 物活性的p 氨基酸，它可以抑制动物体内多种丝氨酸代谢酶的活性，同时影响了发酵过 2 第一章绪论 程中由p - 丙氨酸合成泛酸的反应【8 】，近年来的研究己确切表明。当( s ) 异丝氨酸作为侧链 被引入到蛋白类抗生素或氨基糖苷类抗生素中时，可显著增强它们的抗菌活性，是一种 重要的医药中间体。 ( 5 ) 偶氮丝氨酸 偶氮丝氨酸( a z a s e r i n e ) 是一种抗癌剂，常用于治疗肿瘤：同时，偶氮丝氨酸作为谷 氨酰胺的抗代谢物，可用于治疗急性白血病和柯杰金氏病。 1 4l 丝氨酸的生产方法 由于l 丝氨酸处于代谢途径的中间位置，代谢速度快，生产困难，不易进行大规模 生产。目前，l 丝氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学合成法、发酵法和酶法。 蛋白质水解法生产l 丝氨酸存在很多问题，具体表现在：第一，水解过程中存在消 旋作用，步骤繁琐，l 丝氨酸的损失率高；第二，所得的氨基酸常为混合氨基酸，还需 进一步分离、精制，污染较大；第三，水解设备腐蚀严重；第四，需大量的洗脱液，污 染严重。化学法可采用不同的化学原料，不同的工艺路线，生产规模大，产品易分离 提纯。但化学合成法只能获得d l 丝氨酸，要得到l 丝氨酸还要进行化学拆分【9 】，增加 了成本及其生产复杂性。由于发酵法和酶法克服了上述两种方法的缺点，成为现在l 丝 氨酸生产和研究的主要方向。 1 4 1 发酵法 发酵法合成l 丝氨酸是在培养液中直接添加底物利用菌体生长代谢生成l 丝氨酸。 发酵法生产l 丝氨酸有两种途径：一种是微生物在生长过程中直接利用碳源积累l 丝氨 酸，称之为直接发酵法；另一种是在微生物生长到一段时间后，向培养基中添加特异的， 前体物质，以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用把前体物质转 化为l 丝氨酸，称之为前体发酵法。 ( 1 ) 直接发酵法【1 0 】 由于l 丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置，参与许多生物物质如甘氨酸、蛋氨酸、 半胱氨酸等氨基酸，嘌呤、胸腺嘧啶等核酸碱基，磷脂腺丝氨酸等磷脂的合成，代谢运 转速度极快。因此，与其它氨基酸相比，l 一丝氨酸的直接发酵法生产十分困难。国内外 报道利用直接发酵法生产l 丝氨酸菌株产酸率都不太高，此法在生产中很少采用。 ( 2 ) 前体发酵法 据报道，在l 一丝氨酸生产中作为前体物添加的甘氨酸被认为是最有前景的前体物。 以甘氨酸为原料生产l 丝氨酸的菌株大致分为两类：一类是以葡萄糖等糖类物质为碳源 生长的异养型菌株；另一类是以甲醇为碳源的甲基营养型菌株【1 1 1 。 利用异养型菌株由甘氨酸生产l 丝氨酸 采用异养型菌株由甘氨酸生产l 丝氨酸，所需的c l 供体几乎都是来自甘氨酸的裂 解反应，甘氨酸不仅作为合成l 丝氨酸的前体物质，还要作为c l 供体，降低了甘氨酸 的转化率。理论上2m o l 甘氨酸只能生成1m o ll 丝氨酸。高产l 丝氨酸就要在发酵培 养基中加入大量的甘氨酸。k u b o t a 1 2 1 等人较早发现，向发酵培养基中添加甘氨酸会促进 3 江南大学硕十学位论文 l 丝氨酸的产生，但同时也会抑制菌体的生长。因此，筛选出耐高浓度的甘氨酸菌株是 得到高产l 丝氨酸菌株的关键。 产l 丝氨酸异养型菌株主要有嗜甘氨酸棒杆菌、丁烷诺卡氏菌和白色八叠球菌三 种。k u b o t a 1 3 j 等人从香蕉中分离到嗜甘氨酸棒杆菌，把甘氨酸转化积累为9 4g l 的l 丝氨酸，l 丝氨酸对甘氨酸的摩尔转化率为1 7 。小谷j 等人采用甘氨酸的培养基分 离到丁烷诺卡氏菌。在含有0 5 甘氨酸、2 葡萄糖培养基中产生l 丝氨酸1 7 6g l 。 t a n a k a i l 4 】从丁烷诺卡氏菌诱变筛选l 丝氨酸分解缺陷突变株，进而选育甘氨酸氧肟酸、 乙硫氨酸、蛋氨酸砜、氨基喋吟、二甲氧苄二胺吡啶和6 巯基嘌呤等多重抗性株，获 得了l 丝氨酸高产菌。e m a i l5 j 等选育获得具有高活性s h m a s e 的白色八叠球菌。在含有 甘氨酸0 3 、葡萄糖1 、( n h 4 ) 2 s 0 40 3 、酵母膏1 的培养基中，3 0 培养2 4h 时添加甘氨酸，最适条件( p h7 o ) 发酵6d ，由2 0 甘氨酸可生成2 2g ll 丝氨酸。 利用甲基营养型菌株由甘氨酸生产l 丝氨酸 能够以还原态c 1 化合物作为唯一碳源和能源生长的微生物叫甲基营养型微生物。甲 基营养型微生物同化还原态c l 化合物有三条途径：磷酸己酮糖途径、丝氨酸途径和c a l v i n 循环途径。属于甲基营养型具有丝氨酸途径的微生物，可在丝氨酸羟甲基转移酶( s e r i n e h y d r o x y m e t h y l t r a n s f e r a s e ，s h m t ，e c 2 1 2 1 ) 的作用下，将由甲醛和四氢叶酸 ( t e t r a h y d r o f o l i ca c i d t h f a ) 反应生成的亚甲基四氢叶酸( m e t h y l e n e t e t r a h y d r o f o l a t e ， m t h f a ) 与甘氨酸结合生成l 一丝氨酸，这种微生物具有高活性的s h m t 。利用含有丝氨 酸途径的甲基营养型菌株生产l 丝氨酸有如下优点：第一，菌体生长利用的碳源是价格 低廉的甲醇，有利于降低葡萄糖等碳源的成本消耗；第二，甘氨酸生产l 丝氨酸所需的 c l 供体来自甲醛同t h f a 反应，大大提高了甘氨酸的转化率，理论上，2m o l 的甘氨酸转 化为2m o l 的l 丝氨酸。 甲基营养型菌株主要有假单胞菌、生丝微菌和球型节杆菌三种。通过丝氨酸途径同 化甲醇的微生物能从甘氨酸高产l 丝氨酸，这一点为k e u n e 1 6 j 等首先采用假单胞菌3 a b 所阐明。假单胞菌3 a b 以甲醇为碳源生长，其后添加甘氨酸即有l 丝氨酸积累，最适条 件下的积累达4 7 l 。m o r i n a g a 【l7 j 等报道了从甲醇利用细菌中分离得到的假单胞菌 m s 3 1 ，当m s 3 1 在甲醇培养基中充分生长后添加甘氨酸和甲醇，该菌株可积累l 丝氨 酸2 5g l 。i z u m i t l 8 j 报道，以甲醇为碳源选育出生丝微菌k m l 4 6 ，采用休止细胞由甲醇 和甘氨酸合成l 丝氨酸。在培养过程中，将f e 2 + 和m 9 2 + 与甲醇一起流加到培养基中， k m l 4 6 的生长显著增加，可获得约7 0e d l 菌体，采用这种菌体在含有甲醇2 4 l 、甘 氨酸10 0g l 、菌体3 0g l 、啊s h c l 缓冲液( p h9 0 ) o 0 5m o l l 的反应液中，经2 4h - - 一2 8 h 振荡生成约2 4g l 的l 一丝氨酸，摩尔转化率为1 7 。y 锄a d a 【l i 】报道由k m1 4 6 选育 l 丝氨酸结构类似物抗性和甘氨酸耐受性突变株g m 2 ，在最优条件下，可积累3 2g l 的l 丝氨酸。t a n i t l 9 j 等报道球型节杆菌s k 2 0 0 对甘氨酸呈较高耐受性，产酸达到6 8g l 。 国外利用甘氨酸作为前体物发酵法生产l 一丝氨酸的研究情况见表1 1 国内利用甘氨 酸作为前体物发酵法生产l 丝氨酸的研究情况见表1 2 。 4 第一章绪论 表1 1 国外利用甘氨酸作为前体物发酵法生产l 丝氨酸的研究情况 t a b l ei - 1a no v e r v i e wo ff o r e i g nl i t e r a t u r e0 1 1t h ef e r m e n t a t i v ep r o d u c t i o no fl s e r i n eb yg l y c i n e 碳源 菌种性质 i 广丝氨酸( g l ) 微黄短杆菌【1 2 1 嗜甘氨酸棒杆菌1 1 3 】 g 1 y r l e u 。，m e t - l e u ，l i e 丁烷诺卡氏菌f l l 】野生型 石蜡诺卡氏刮”1野生型 戊酮二酸短杆菌【1 2 】野生型 丁烷诺卡氏菌【1 5 1 g l y h x r ，e t h r ，m s r 白色八叠球菌【1 5 】 e t h r 甲醇假单胞菌3 a b l l 6 1野生型 球形节杆菌s k 2 0 0 1 9 1g 1 y r ，甲醇r 假单胞菌m s 31 1 7 1g l y r ，m e 产 生丝微菌k m14 6 】g 1 y r 表1 2 国内利用甘氨酸作为前体物发酵法生产l 丝氨酸的研究情况 t a b l el 2a no v e r v i e wo fl i t e r a t u r eo nt h ef e r m e n t a t i v ep r o d u c t i o no fl - s e r i n eb yg l y c i n e 菌株单位菌性质l 丝氨酸 没有工业化 ( g l ) 原因 生物研究所中遇到问题 微球菌属【2 l 】 扭转甲基杆菌【2 2 l c w s 7 i 2 3 】 江南大学 广西大学 中国药科大学 m e t - ，s g r ，d s e r r ， g l y h r ，m t h r 野生型 工程菌 6 2 2 6 2 1 实验室阶段 实验室阶段 实验室阶段 1 4 2 生物酶法 所谓酶法即利用酶催化的立体专一性反应，由化学合成的底物生产光学活性氨基 酸。反应多在溶液中于温和的条件下进行，可高选择性、高收率地获得所需要的光学活 性氨基酸。 酶法与发酵法紧密相连，是发酵工业发展的产物，但又与发酵法有区别。发酵法是 利用微生物的生命活动过程，将简单的碳源、氮源通过复杂的代谢活动生产天然产品， 品种上有其局限性。而酶法是利用微生物中特定的酶作为催化剂，使底物经过酶催化生 成所需的产品，因底物选择的多样性，故而不限于制备天然产品，借助酶的生物催化， 可使许多本来难以用发酵法或合成法制备的光学活性氨基酸有工业生产的可能。 在氨基酸的酶法生产中，可以采用游离酶或固定化酶作为生物催化剂。与游离酶相 比，固定化酶具有以下优点：酶不混入产物，易与产物分离；酶经固定化后，稳定性提 高：可长期反复使用，提高酶的使用效率；根据需要可以制成不同性质、形状的酶；可 乾4 4 筋m d 2 一名5 2 能h m协加如砣”觚弛 江南人学硕+ 学位论文 缩小反应体积；反应条件比较容易控制等。除将酶固定化以外，还可将含酶的微生物直 接固定化，即利用固定化细胞催化反应，一是可降低酶的制备成本，缩短生产周期；二 是可完成较复杂的酶反应。 实际生产中，生物酶法是把发酵液中的菌体收集固定化细胞或者将菌体均匀置于缓 冲体系中后添加底物，利用处于休眠状态菌体中的活性酶在转化体系中进行转化，或者 把酶提出后固定化酶在缓冲体系里面进行转化合成l 丝氨酸。它与发酵法的最大区别在 于在l 丝氨酸合成时菌体所处的状态。上述发酵法中以甲基营养型菌株生成l 丝氨酸 如：k e u n e 1 6 j 等人以甘氨酸和甲醇为底物用p s e u d o m o n a s3 a b 转化l 丝氨酸，i z u m i 1 8 l 用 甲醇为碳源培养生丝微菌k m l 4 6 ，采用其休止细胞加入甲醇和甘氨酸在t r i s 盐酸缓冲液 中振荡培养转化l 丝氨酸，更确切地说应该是酶法转化。 由于酶促反应具有反应过程简单、催化专一性强、反应条件温和转化效率高等优点， 受到国内外的普遍重视。特别是近年来随着固定化酶和固定化细胞技术在氨基酸工业的 应用，使酶法成为l 丝氨酸生产的研究热点。在动物、植物体内和微生物细胞内，普遍 存在着甘氨酸和l 丝氨酸的互相转换。该反应的生理方向是l 丝氨酸断裂成为甘氨酸和 m t h f a ，其中辅酶t h f a 作为c l 基团的载体。生物体内包含甲基基团的化合物、嘌呤 环等的生物合成均利用该步反应提供的c 1 基团。催化该步反应的酶是s h m t t 2 4 ，它属于 胞内酶，该酶以5 一磷酸吡哆醛( 5 p y r i d o x a lp h o s p h a t e ，p l p ) 作为其辅酶。利用动物肝脏匀 浆和微生物所做的研究表明：叶酸及其大多数衍生物如二氢叶酸、t h f a 、m t h f a 等 对甘氨酸与l 丝氨酸的相互转换具有促进作用，其中尤以t h f a 的作用最为明显1 25 ，当 不存在t h f a 等辅因子时，正、逆反应的速度仅是存在合适浓度t h f a 时的千分之一。在 体外条件下，当有一定浓度的t h f a 存在时，s h m t 也可催化甲醛与甘氨酸可逆地合成 l 丝氨酸。 由于甲醛对菌体生长和s h m t 活力的抑制作用很大，因此酶法合成l 丝氨酸实际上 是以甲醇为底物的转化过程。首先，甲醇在甲醇脱氢酶( m e t h a n o ld e h y d r o g e n a s e ，m d h ) 的作用下被氧化为甲醛，甲醛再同t h f a 反应生成m t h f a ，在s h m t 作用下，m t h f a 与甘氨酸反应生产l 丝氨酸【2 6 , 2 7 j 。 s h m t 是酶促法制备l 丝氨酸的关键酶， g l y a 编码，是一种以p l p 为辅酶的吡哆 醛酶，能在t h f a 存在的条件下催化甲醛与甘氨酸缩合生成l 丝氨酸【2 8 , 2 9 。s h m t 主要来 源于两个途径：( 1 ) 从自然界中筛选出的高产菌株，如p s e u d o m o n a ss p ；( 2 ) 利用现代生 物技术构建含g i y a 基因的s h m t 高产的基因工程菌。前者具有筛选盲目性大，酶活力不 高、菌种易退化等缺点。而后者采用现代分子克隆技术，定向改造生物，创造出了具有 高s h m t 活力的新菌种。 目前国际上普遍采用s h m t 来生产l 丝氨酸有两大途径：( 1 ) 提取s h m t ，以固定化 酶用于催化底物反应。( 2 ) 直接固定化高产s h m t 的菌体，以甘氨酸和甲醇为底物生物转 化生产l 丝氨酸。k e u n e 1 6 等人以甘氨酸和甲醇为底物用p s e u d o m o n a s3 a b 转化l 丝氨 酸4 7g l 。l z u m i 1 8 j 用甲醇为碳源培养生丝微菌k m l 4 6 ，采用其休止细胞加入2 4g l 甲 醇、1 0 0g l 甘氨酸和0 0 5m o l lt r i s h c i 缓冲液中振荡培养2d 可得l 一丝氨酸2 4g l 。 6 第一章绪论 t a j r o 【1 8 j 利用m n 4 3 休止细胞，在1 0 4g l 甲醇、5 0r d l 甘氨酸和o 0 5m o l lt r i s h c l 缓冲液 中振荡培养，积累了6 5g ll 丝氨酸。m o r i n a g a l 等人用温度敏感型突变菌株 p s e u d o m o n a sm e 31 积累l 丝氨酸6 8g l 。h u m gy uh s i a o 2 4 j 等人利用工程菌k l e b s i e l l a a e r o g e n e sg x l 7 0 5 以流加甘氨酸和甲醛的方式在生物反应器生成l 丝氨酸的每小时速度 达到5 2g l 。 发酵法为l 丝氨酸工业化生产常用的方法，但此法对设备要求较高，产酸率一般较 低，分离困难，后处理麻烦，提取率低，因而成本高、价格较贵。虽然酶法具有工艺简 单、周期短，耗能低、专一性强、收率高等优点，但要将它们应用于工业化生产，还需 要进一步研究。如何获得廉价的合成底物和酶源是这一方法能否成立的关键。此外，较 高的原料成本以及辅因子需求也是需要考虑的。近年来，随着基因重组技术地迅速发展， 有关酶活力显著提高，加上固定化技术及生物反应器研究成果地配合，使酶法生产氨基 酸的技术取得了重大进展。 1 5 分子生物学在i 广丝氨酸生产中的应用 在前述的l 丝氨酸的发酵法和酶法合成中，是以经传统育种方法得到的高产s h m t 的菌株作为酶源。近年来，由于分子生物学和基因工程技术的发展，使得人们可方便、 大量地获得某一功能蛋白。因此，如能利用基因工程技术构建高表达s h m t 的基因工程 茵，就可利用其所表达的s h m t 作为酶源催化甘氨酸和甲醛，极大的促进酶法转化l 丝 氨酸的发展。 s t u f f e rgv 【3 0 】等人最早运用分子克隆等技术对e c o l ik 1 2 的g l y a 基因进行研究。他们 运用鸟枪克隆法，以e c o l ik 1 2 的染色体d n a 作为g l y a 来源，以p a c y c l 8 4 为质粒载体构 建一系列重组质粒，而后将它们转化到丝氨酸缺陷型e c o l ik 1 2g s 2 4 5 中，并利用抗性 标记和丝氨酸营养缺陷选择压力筛选得到含g l y a 基因的重组质粒p g s i 。随后采用含卡那 霉素抗性的t n 5 转座元进行随机插入实验，把g l y a 基因的具体位置限定在一段2 5 k b 的序 列上( s a i l b c l i 酶切片段) 。随后，他们又对这2 5 k b 的基因片段和其编码的s h m t 进行d n a 序列及氨基酸序列分析，确定t g l y a 结构基因的全序列、氨基酸组成和g l y a 基因中所运 用的密码子，并通过t n 5 插入试验证明s h m t 的分子量为4 6 ，5 0 0k d a 。 c h e nv l 【2 3 】等人分析了白聊0 6 钟胞，- 歹巧“，z f 的9 1 y a 基因及其所编码的s h m t 序列， 并与e c o l i 的g l y a 进行比较，结果表明：两个不同来源的g l y a 具有5 5 6 的同源性，有四 个高度保守的结构域。这些工作为以后利用蛋白质工程等手段改造基因结构、增加表达 水平和提高s h m t 的活力作了一定的理论准备。 ， 中国科学院微生物所沈天翔【3 l 】等人从大肠杆菌k 1 2 中提取染色体d n a ，以e c o r l 酶 切后梯度离心分离，将所获得的9k b - - 1 6k b 的d n a 片段与p b r 3 2 2 连接，用连接产物转 化大肠杆菌j m l 0 9 ，筛选获得重组转化子，提取质粒后转化e c o l ig s 2 4 5 ，在基本培养基 上筛选得到具氨苄青霉素抗性的转化株。然后将重组菌中的质粒以s a li 和p v ui i 酶切， 将2 5k b 的酶切片段分别克隆至l j p u c l 8 8 、p b r 3 2 2 等各质粒载体上，并分别转化大肠杆菌 g s 2 4 5 ，最终获得了能在基本培养基上生长的转化子。 7 江南大学硕十学位论文 用于s h m t 酶法合成l 丝氨酸的基因工程菌具备以下特点：( 1 ) 易于大规模培养；( 2 ) 高水平表达高比活力的s h m t ；( 3 ) m 程菌能稳定遗传。为此，h a m i l t o nb k l 3 2 】等人将含 有g l y a 基因的多拷贝质粒导入到k l e b s i e l l aa e r o g e n e s 中，并且利用营养缺陷作为选择压 力，构建了能表达高活力s h m t 的重组菌。 s h m t 基因工程菌的构建，有着较为广泛的用途。当有辅因子t h f a 存在时，它也 能可逆的催化由甘氨酸和甲醛合成l 丝氨酸。该法合成的l 丝氨酸，可不经分离而直接 作为前体物质，用于合成l 色氨酸、l 酪氨酸和l 半胱氨酸，h s i a oh y t 2 4 】等人利用 h a m i l t o nb k p 2 】等构建的砌p ，d 髟，z p jp g x l 7 0 5 作为s h m t 酶的来源，进行了酶法合成l 丝氨酸的各种工艺条件的优化和工程开发，并在含l 丝氨酸的酶反应液中直接加入色氨 酸酶和吲哚，反应液中色氨酸浓度可达2 0 0g l 。此外，在无t h f a 存在时，s h m t 也可 催化其它羟基氨基酸的裂解，并且这些反应是可逆的。也就是说，s h m t 还可以用于催 化合成多种l 1 3 羟基氨基酸如苏氨酸、同型苏氨