（光学工程专业论文）双光子荧光照明系统的超分辨衍射器件设计方法研究.pdf

ab s tr a c t ab s t r a c t r e s o l u t i o n i s a n i m p o r t a n t p e r f o r ma n c e o f a n i m a g i n g s y s t e m a n d i s d e t e r m i n e d 勿 t h e d i ff r a c t i o n l i mi t i n a n i d e a l i m a g i n g s y s t e m . wi t h t h e t e c h n i q u e s a n d e l e m e n t s o f d i ff r a c ti o n o p t i c s , i t i s f e a s i b l e t o b r e a k t h e d i ff r a c t i o n l i m i t a n d a c h i e v e o p t i c a l s u p e r r e s o l u t i o n . t h e r e i s a n i n t e n s i v e s t u d y o f d i ff r a c t i v e s u p e r r e s o l u t i o n e l e m e n t s ( d s e ) d e s i g n i n g , w h i c h i s i l l u m i n a t e d勿 m o n o c h r o m a t i c l i g h t . b u t t h e re i s l i tt l e s t u d y o f t h e d s e d e s i g n i n g , w h i c h c a n b e a p p l i e d t o t w o - p h o t o n fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y i l l u m i n a t e d b y p u l s e d l a s e r . t w o - p h o t o n fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y i s c o m p o s e d o f i l l u m i n a t i n g l e n s a n d c o l l e c t o r l e n s , a n d t h e s u p e r r e s o l u t i o n o f f o r m e r i s t h e k e y o f t h e w h o l e s y s t e m s u p e rr e s o l u t i o n . s o t h i s t h e s i s i s c o n c e r n e d w i t h p u l s e d l a s e r d s e d e s i g n i n g w h i c h c a n b e a p p l i e d t o t h e i ll u m i n a t i n g l e n s . b as e d o n k i r c h h o ff d i ff r a c t i o n f o r mu l a , t h e p o i n t s p r e a d f u n c ti o n m o d e l o f p u l s e d - l as e r - i l l u m i n a t e d i m a g i n g s y s t e m , w h i c h i s m o d u l a t e d 妙 d s e , i s b u i l t . a n d t h e c h a r a c t e r i s t i c a n d p e r f o r m a n c e o f t h e i m a g i n g s y s t e m a n d d s e , u n d e r v a r i o u s i l lu m i n a ti o n c o n d i t i o n s , i s d i s c u s s e d . r e f e r t o a b o v e d i s c u s s i o n a n d t h e t o l r a d o o p t i mi z a t i o n m e t h o d s , t h i s t h e s i s p r e s e n t s t h e t r a n s v e r s e a n d a x i a l d s e o p t i m i z a t i o n d e s i g n i n g m e t h o d s , w h i c h c a n b e a p p l i e d t o t h e 州 s e d l as e r i l l u m i n a t i n g s y s t e m , t o r e d u c e t h e s i z e g o f t h e m a i n l o b e , t o i n c re as e t h e c e n t r a l i n t e n s i ty ( o r s t r e h l r a t i o习 ， a n d t o s u p p r e s s t h e h i g h e s t s i d e l o b e i n t e n s ity m t o t h e g r e a t e s t e x t e n t , s o t h a t b e t t e r p e r f o r ma n c e s o f s u p e r r e s o l u ti o n c a n b e o b t a i n e d . t o s i m p l i f y t h e c a l c u l a ti o n , w h o s e c o n d it i o n i s a p p r o x i m a t e l y i d e a l , a s u b s t i t u t e d e s i g n i n g me t h o d i s p res e n t e d . b y c a l c u l a t i n g a b o v e d e s i g n i n g m e t h o d s , s o me re s u l t s o f t r a n s v e r s e a n d a x i a l d s e i s l i s t e d a n d d i s c u s s e d b y c o mp a r i s o n , s o t h a t t h e f e asi b i l i ty a n d v a l i d i ty o f t h e p u l s e d l as e r d s e d e s i g n i n g m e t h o d s i s v e r i f i e d k e y w o r d s : s u p e r r e s o l u ti o n , d i ff r a c ti v e e l e m e n t s , p u l s e d l a s e r , o p t i m i z a ti o n d e s i g n i n g m e t h o d 符号说明 符号说明 a d s e 尸whm g i 2 ( u , v ) m p s f s t t ( 7 , a m ) u v o ( r , a w ) v 甄 口 系统的球差因子 超 分 辨 衍 射 器 件( d i ff r a c t i v e s u p e r r e s o l u t i o n e l e m e n t ) 点扩散函数主瓣半高宽度 点扩散函数的主瓣尺寸参数 点扩散函数的 时间平 均强度分布 点扩散函数的最高旁瓣强度参数 点扩散函数 ( p o i n t s p re a d f u n c t i o n ) s t r e h l 比 脉冲有效宽度 超分辨衍射器件的透过率函数 横向坐标 脉冲光场初始分布 轴向坐标 出瞳归一化横向坐标 归一化横向坐标 归一 化径向坐标 超分辨衍射器件厚度突变位置 系统的色散因子 脉冲中心频率 脉冲各单色光分量的频率对中心频率的偏移量 r冲产八r 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了 解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下 各项内 容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电 子版本;学校有权保存学 位论文的印 刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存 论文;学校有权提供目 录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务; 学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版; 在 不以 赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内 容用于学术 活动。 学位论文作者签名: 卫 口 叮 年 月f 日 经指导教师同 意， 本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 指导教师签名:学位论文作者签名: 解密时间:年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下: 机密2 0 年 ( 最长2 0 年，可少于2 0 年) 匕 分 赢裁笼 蔽 添钾一_ 一_ 一_ _一， 于_ 一. 浏 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内 容外，本学位论文的 研究成果不包含 任何他人创作的、己 公开发表或者没有公开发表的作品的内 容。对本论文所涉 及的研究工作做出贡献的其他个人和集体， 均己 在文中以明 确方式标明。本学 位论文原创性声明的法律责任由 本人承担。 学位论文作者签名: r, 又 。 刃 年 子 月1日 第一章 绪论 第一章绪论 第一节光学 超分辨 分辨率是成像系统最重要的 性能参数。无像差理想成像系 统中，由衍射 现 象 产 生 的 点 扩 散 函 数 ( p o in t s p r e a d f u n c t io n , p s f ) h 1在 焦 面 上 与 沿 光 轴 的 主 瓣 尺寸分别决定的横向与轴向 分辨率， 称为 “ 衍射受限” 分辨率， 它似乎给成 像 系统的分辨率设定了一个 “ 衍射极限”。 然而，光学的 进一步发展表明，“ 衍射极限”并非真正的 “ 极限”。1 9 5 2 年， t o r a ld o 首 次 将 有 限 视 场 超 分 辨的 概 念 引 入 光 学 12 13 1 。 如图 1 .1 所示 ， t o r a ld o 的研究 表明， 如果利用放置在出瞳的 衍射器件将出瞳光场调制为 某种 特殊的 分 布， 则 成像系统的 p s f可以在 焦面上预先 指定 的位置产生零强度点， 第一个 零 强度点使得主瓣的尺寸低于衍射极限，其余零强度点控制主瓣周围的一个有限 区域 ( 视场)内 只出现较低的旁瓣， 而这个区域之外往往会出 现较高的旁瓣。 在焦面上或沿 光轴的主瓣尺寸低于衍 射极限 的 p s f称为超分辨 p s f ， 产生超分 辨 p s f 的 物理现象称为光学超分 辨， 实现光学超分 辨的 衍射器件称为超分辨 衍 射器件 ( d i ff r a c t i v e s u p e r r e s o l u t i o n e l e m e n t , d s e ) 。 e x i t p u p il f o c a l p l a ne o b j e c t i v e l e n s 图1 . 1 传统成像模式下的超分辨衍射器件 仅限 于缩小 p s f 在焦面上的主瓣 尺寸低于 衍射极限的 超分辨， 称为 横向 超分 辨。 缩小p s f 沿光 轴的 主瓣尺寸低 于衍 射极限 的超分辨， 称为 轴向 超分辨。 若同 第一 章 绪论 时实 现横向 超分 辨与轴向超 分辨， 就称 为三维 超分辨。 光学超分辨性能表述 如图1 . 2 所示，对于单色光连续光照明 下的 传统成像模式，通常 采用 三个指 标 定 量 描 述 横向 超 分辨p s f的 性 能 4)s1 , . 主 瓣 尺 寸 : g = rs i rl ， 其 中 r s 为 超 分 辨 的 p s f 在 焦 面 上 的 主 瓣 零点 半 径 ， ra 为 衍射极限相应的半径. 而对于 脉冲 激光照明 下的 成像 系统， 主瓣零点 往往 不 存在， 因此一 般将超分辨 p s f 的主 瓣半高 宽度与衍射极限 的主瓣半高宽 度的 比 值定 为主瓣 尺寸参数g . . s tre h l 比 : s = i d 几， 其中i s 为 超 分 辨 p s f 的 中 心强 度， 人 为 衍 射 极限 p s f 一的中 心强度。 . 最高 旁 瓣 强 度 : m= 布 / 人， 其中 与为 超 分 辨 p s f 在焦 面 上的 最 高 旁 瓣 强 度。 对于轴向 超分辨的情形，由 于超分辨 p s f沿光轴的主瓣强度往往降不到 零，因此主瓣尺寸g定义为， 超分辨p s f 沿光轴的主瓣强度降为中心强度一半的 两 个位置的 轴向 距离除以 衍射极限 相应的 距离: 最高旁瓣强 度m仍然定义为， 超分辨p s f 沿光轴的最高旁瓣强度除以中心强度。 图1 . 2 横向 超分辨 性能指标示意图 g越小则 分辨率 越高， s 越大则主 瓣能 量利用率越高，m越小则旁瓣噪声 第一章 绪 论 越低。 如何设计d s e 以 最大限 度地缩小g、 提高s 、并且降低m ， 正 是光学 超 分辨研究的中心问题。 2 超分辨衍射器件的设计方法及其发展概况 以 下，本文 将回顾一下已 有的 有代表 性的 d s e 的 设计方法: 1 ) t o r a l d o 方法 ( 或求解方程组方法) t o r a l d o 方法的原始形式由 t o r a l d o于1 9 5 2 年提出 ，所采用的 d s e 的形式由 无 限 窄 的 同 心 环 带 2 1推 广 到 了 有限 宽 的 同 心 环 带 31 。 以 后 者 为 例 ， 设p 为 出 瞳 归 一 化 径向 坐 标 ， 在 环带p e p , ., p 】 内 ， d s e的 复 振 幅 透 过 率 设 为u ( p ) = 矶， k = 1 ,2 ., 二 ，,k , p o 一 0 ， p k = 1 . t o r a ld o 建 议 取 八 一 ( k / k 尹， 此 时 d s e 各 环 带 的 面 积相同。于是p s f 在焦平面上的归一化复振幅分布为: h ( n ) = l r u k j i( x j l7p k ) p k 一 j t( x r l1 p k - a) p k- 1 1 ( x r r/ 1 2 ) ( 1 .1 ) k - l 其中n 为焦面上归一化径向 坐 标，人为一 阶b e s s e l 函 数，x , = 3 . 8 3 1 7 为 一阶 b e s s e l 函数的 第一个零点。 令p s f 复振幅分布 满足如下帐一1 ) 个零点 约束: h ( ?1 1 ) = 0 , i = 1 , 2 , . . . , k- 1 , q t r l e + v 1 7 1 1 ( 1 .2 ) 其中第一 个零点n 1 决定了 主瓣尺寸g， 其余零点 控制 最高旁 瓣强度m 。 另 外补充一 个中 心复振幅的 方程如下: h ( 0 ) = 1 ( 1 3 ) 式 ( 1 . 2 ) 构成以认 ( k = 1 , 2 ， 二 ， k ) 为未知数的 k 个线性方程， 可以 唯一解出 u k ， 显 然 ， 得 到 的u k 必 为 实 数( 可 能 取 负 值) 。 考 虑 到 u k 卜1 的 限 制 ， 设 m m c 为!认 的 最 大 值， 将 解 得的 矶再 除 以 u -便 得 到 了 d s e 的 复 振 幅 透 过 率 。 t o r a l d 。 方法的原始形式 只需求解线性方程组，具有计算量小的 优点， 然而 设计得到的 d s e 一般为 混合型 器件， 即 同时存在振幅 衰减与相位调制， 难以 保证 各 环 带 的 振幅 衰 减系 数的 加 工 精 度 问 ， 并 且 有 能 量 损 失 。 为了克服这些缺点，后来的一些作者发展了 t o r a l d o 提出的方法 用于设计纯 相 位 的d s e 15 117 11e 1 。 以 s a le s 等 人 发 展的 方 法 151 为 例 ， d s e 被 设 为 复 振 幅 透 过 率为 1 或一 1 的纯相 位器件，相位突变位置的归 一化径向 坐标为p x , k = 1 ,2 . , 二 ，k - 1 。 与 t o r a l d o 方法的原始形式不同 的是， 此时需要求解的变量是p r 而 不是各 环带的 复 第一章 绪论 振幅透过率， 相同的 是约束方程仍 取式 ( 1 . 2 )。由 于s a l e s 的 方法需要 求解非线 性方程组， 所以计算 量要大 于t o r a l d o 提出的方法，并且存在解不唯一的问题。 不过， d s e 的设计实例表明， s a l e s 的 方法设计的 d s e 的性能总是 优于 t o r a l d o 的 方法。 m . m a r ti n e z - c o r r a l 等人发 展的 方法1 9 1 与 s a l e s 等人发展的方 法大致相同， 只 不过用于设 计轴向 超分辨 d s e . 以 上方法 在本论 文中统 称为 t o r a l d o 方法，又称为求解方程组方法，其优点 是能够有效 控制主瓣尺寸g 及旁瓣 强度m， 其不足是不能 保证s t r e h l 比s 达到所 设零点约束下的 最大值。 另外，该 方法控制m的 零点设置具有 随意性，不恰当 的设置会降 低所设计的 d s e 的性能。 2 ) f o u r i e r 变换方法 以 一维情况为例，p s f在焦 面上的复 振幅分 布与出瞳函数满足 f o u r i e r 变换 关系 a (x ) = 众 u ( 8 )e xp (i,6 x )d /6 ( 1 .4) 其中x 为焦面坐标， p为出 瞳 平面坐标， - ( x ) 为p s f 在 焦面上的复 振幅 分布， u ( 刀 ) 为出 瞳函数， 由 放置在出 瞳的 衍射器 件决定。 p s f 的理想形 式是 无限 窄的s 函数， 根据式 ( 1 .4 ) ，这要求出 瞳具有无限大的孔径， 因而不可能实 现。 那么 考虑如下有限区 域内的 p s f : a ( x ) = 8 (x ) , ix l v ) 的脉冲前沿 的时间延迟 ，其 中 a y a 风 项 由球差导致 ， 1 f u v 2 m a z 4 ; r n k 1 . r , 2 . 。一二 。_ . _ _ . 、 _二 二， ， _ _ . - z=一 一( :十 于 j 1 1 1 足 芳细 班 1 以 卜 芝 过迩说 甲心 阴脉 仰 传 猫刽 仇e 2 z ( u , v )点 的 时 间 ， r r 2 项 的 :参 数 由式 ( 2 . 1 3 a ) 定 义 ， 其 中 的 合 koa b,r2 d a y k ,a 2b ,y 2 由 透 镜 的 一 阶 色 散 弓 !起 ，喜 k oa 2b z a w 2 尸 为 透 镜 材 料 的 群速度色散项; 综上可得，公 式 ( 2 . 1 5 ) 的物理 意义为:将 光脉 冲 看作由 许多 单色光分 量叠 加而成， 单独计算其每一单 色光分量经 过透镜后在某 一参 考面上的光场分布， 再 将所有单色光分量的光 场分布叠加， 就可以 获得光脉 冲 经过透镜 后在参 考面上的 光场分布. 式 ( 2 . 1 5 ) 以 光披复振幅 形式表示。但是，无论 对于 光探测 器， 还是待检测 物中 的荧光激发分子，都 是光的强 度而非复 振幅在 起作用， 因此对 于成像系统， 光强分布i 2 ( u , v . t ) 更具有实际意义。 有: i z (u , v , t ) = i u 2 (u , v , t ) 12 ( 2 .1 7 ) 比 较公式 ( 2 . 1 5 )和 文献 4 4 】 中的公式 ( 8 ) 可知: 在大 菲涅尔数近似条件， 即 n1 并 且z z 儿 成 立的 情 况 下 ， 公 式 ( 2 .1 5 ) 可 以 近 似 为 文 献 中 的 形 式 : l l 一 一 、 _ _ 产 _ ， _ _、 ， ， ._ _ _、 二 ， _ _ _， ， . a ro _ _ _ ，i u 尸， ，e a o h ( v , u , a w ) al e ( r , o o) ) u ( r , 0 co ) j o r v ( 1 + - ) e x p 一 二 - ( 1 + - ) 刀 ” 一 ” 一 一 ”w o 一 一 2 w o - aw, x e x p l - i a y ( i +-) 一i , r l r , ow) j r d r ( 2 . 1 8 ) 其中 1* ,. . _ _、 _a 2 co o (d n l f d o) ); _%， ja 2r 2、 ， 1 d n l . 1 d 2 n , , ， _ _, 2 丁 l r , 13w ) 二 二 代 宾 甲 甲 片.一: 甲 -丈 一 2 。口 一l “ 一二气二 尸一 了尸 ，尸， 二夕 入l -丁 一 十 二 ，尸- ) l c w j i j o l n i l o co) 一i j c c i j o l n l l v w ) 一i 1 w o a m l a o- ( 2 . 1 9 ) 因 此， 相对于文献 4 4 ) ， 本文能 够讨论的范围 要宽 一些。 2 . 2 . 2 受超分辨衍射器件( d s 日调制的点扩散函数表达式 为了改变成像系统点扩散函数的强度分布， 缩小其主瓣尺寸， 从而获得成像 分辨率的改善，需要在透镜后加入超分辨衍射器件( d i f 一 。 。 、 一。 m r (y ,v, z)exp (一 。 一): ，、 ， = 奋 l i: d (a . )i s (u,v,y ,a w )exp - ia w r (),v,z) d yl x l i: d (a w 工 s(u, v, y , a w ) exp !一。 w r(y v z)ly d y 丁 j.: dt exp -i(a 。 一 w )t = 争 l f: d(a . ) s一 、 a w )exp -ia w r (y,v,z) d yl x l d (a w s (u,v,: 一 w ) exp - ia o r (y ,v,z) d y i ( 。 一 。 。 = t i: d (a , )l1 s(u ，一 /，a w ) exp 一 。 ，v， )， 、 zv z)k d y l ( 2 . 2 4 ) 上式表明 ， 脉 冲衍射场的时间 平均光强等于各单色 分量衍射场光强的叠加除 以 脉冲持续时 间， 这是能 量守恒定律的体现。 设照明 脉 冲的各单 色分量为正入 射 均匀平面波， 即 u o ( y , d a o ) = u o ( t, w ) ( 2 .2 5 ) 其 中 u o ( o w ) 为 光 脉 冲 的 光 谱 分 布 函 数 ， 将 其 代 入 式( 2 .2 1 ) ， 可 得 点 扩 散函数复振幅的瞬时三维分布为 . f y 2、 f ， 、 _ _ .i k ( 1 + o m l w . l a g u , ( u , v , r l = 一 e xn( z rz z ) e xnu - i i a ( v a ) w,( t , o ) 0- 一 一 - - z斗9 , vz x f t (y ,a w ) e x p (一 “ y 0 ) ex p (一 当 l x j o二 (1 + =) f 0 e x p (- ia ct) r ) ),d y 口, z ( 2 .2 6 ) 则此时点扩散函数时间平均强度的三维分布为: 、 (一 卜 争 。 “ (二 )一、 、一 ) i k ( 1 十 o o) l w ,) a o m ,、 _ ，. j ; 、 l, y , a( o ) e x p k - t- 1 7) z， x e x p ( to 尸、 ， r ， 0 () , _八 ， -yo l y v l i + -) 一 e x p ( - : o r o z i y a y c o o z ( 2 . 2 乃 第三节不放置超分辨衍射器件时点扩散函数的计算实例分析 2 . 3 . 1 理想成像系 统点扩散函致在焦面上的分布 本节假设成像系统的像差得到 良 好的校正( 比如， 可用非球面镜校正球差) ， 成为理想成像系统， 计 算其点扩散函 数在焦面上的 分布。 对于式 ( 2 . 1 5 ) ， 无像 差的条件， 即 是使 球差因 子a 二 0 ， 并设色散 项为 0 ， 即n l ( a 动 = n l ( co o ) ， 则光场 分布式 ( 2 . 1 5 )简化为 二 ( u , v , t) 二 一 、ik oz ) ex p (i f o 共) r d (q w ) ik o( 1 + o u ol w o )a 2 z + ) rl vz 、 c u o( y , o co )j o lr v (1 十 e w )与 e x p (一 答e x p (一 、z )y d y 阅wo z乙 ( 2 . 2 8 ) 其中 : 二 ， + _ 上五 叽 z . y 2 _ k o- z 4 z n仇 ( 2 . 2 9 ) 进一步简化式 ( 2 . 2 8 ) ， 可以令旁轴光线到达( u , v ) 点的时 刻为时间坐标零点， 即 t1* ,. 、 二 1 f , v 2 k o _ _ 。 ， 二。 。 。 * ，肠 ， - 7 1 xtpj一 ，- 吮竺 一 l x ff j v, a j t3 i j y l n , : 呜 z 4 ; r n汽 动30) ，a(2. u 2 (u , v , t) = 一 。二 (ik oz ) ex p (i f 0 共) r d (q w ) iko (1 + a w l m o)a 2 l.u o (y z 斗) r l v万习 t _ ， : ， 。 、 f i _ 一 _ ， i 2u r: _ 、 . j . - -j o fv k l -) - l v ;f k 一一丁一少 入 f 气 一沼 。口 ) 2 “， l肠2 则在旁轴焦平面上，即。 = 0 , z = a，光场分布为 _ _、_ ._ 、_v 2、 i w u 2 ( u = u , v , t ) = 一 e x p ( i k o j , ) e x p ( t .es ) 1 d ( a c o ) 件汀 召 . ik o ( 1 + 4 可w o ) a z f . r1 ( 2 . 3 1 ) / u o ( y , o w ) j o l y v ( 1 + 2 f-0 ) i e x p ( 一 ，o w t ) y d y 即l w o 根据式( 2 . 2 4 ) 的 推导， 点 扩散函 数的时间 平均强 度在焦平面上的分布为( 略 去积分前的系数): 1 2 (u = o , v ) 一 f d t = o , v , t ) = l d (e 叫 ik,(1+ a co1w,)a2 f u o(y,o w )j,fo ， . w, yv 气 i +-) lydy一 扣卜小冲| 队物 ( 2 .3 2 ) 设光谱分 布函 数为 矩窗函 数， 脉冲中心 波长为6 2 0 n m ， 则取不同的 光谱宽度 分别计算得到的点 扩散函数时间平均强度在焦平面上的分布情况如图 2 .3 所示 ( 图中 强度已 归 一化，v , = 3 . 8 3 1 7 ，为一阶 b e s s e l 函 数的 第一个零点) 。 线型 .曰.刁.门.门.叭.口.目. d o称 0 6 . 0 o e 可m , 1 u 2 2 / 5 1 / 1 0 单色连续光 朗勃盯助臼以 卜妇t.吕妇月 一一 一._ 站吐州 0 0 一一d 33， j吞 劫 2v0 v/