（生物化学与分子生物学专业论文）酿酒酵母1号染色体基因表达的位置效应.pdf

酿酒酵母1 号染色体基因 表达的位置效应 专业：生物化学与分子生物学 硕士生：刘秋霞 指导教师：贺雄雷教授 摘要 基因表达调控的研究是分子生物学的一个核心课题。目前的研究主要集中在 基因序列本身相关的启动子和y - u t r 上，但基因序列本身并不足以完全解释基 因表达的调控。近年来有研究表明基因的表达与其在染色体上所处的位置有关， 但是尚未有系统的研究。 要系统地开展位置效应的研究，需要在染色体不同位置上插入相同报告基因 的一系列突变体。酵母基因敲除计划( g u dg e ta 1 ，2 0 0 2 ) 所得到的酵母敲除菌株 充分的满足了本论文的研究需求。该计划用一个相同的报告基因k a n m x 4m o d u l e 分别替换了酵母基因组近6 0 0 0 个基因。因此本论文选择该计划产生的5 0 株酿酒 酵母1 号染色体基因敲除的杂合二倍体b y 4 7 4 3 作为实验材料，首次较大规模地 开展了酿酒酵母l 号染色体基因表达的位置效应的研究，初步探讨了基因的表达 与其在染色体上的位置之间的关系。 本文采用多重t a q m a n 探针法r e a l t i m eq p c r 技术作为检测基因表达的手 段，建立了三重t a q m a n 探针法r e a l t i m eq p c r 检测基因表达的实验体系。经过 预实验充分检测了影响三重r e a l t i m eq p c r 准确性的各种因素，结果表明该实验 体系非常好的满足了准确定量的要求。 通过r e a l t i m eq p c r 实验检测报告基因表达量，对表达数据的分析结果如下： 1 ) 利用绝对定量标准曲线分析原基因启动子的表达。结果显示，5 0 个菌株 里面只有3 个菌株检测到了原基因的表达产物。 2 ) 分析k a n m x 4m o d u l e 报告基因的表达。结果显示，在5 0 个基因位置上， k a n m x 4m o d u l e 的表达各不相同，但相对均一。 3 ) 分析比较原始启动子与k a n m x 4 m o d u l e 启动子的强弱。结果表明，只有 在原基因表达比k a n m x 4m o d u l e 表达明显高的位置上，原基因启动子才参与 k a n m x 4m o d u l e 的表达。 4 ) 基因表达位置效应的分析。结果显示，k a n m x 4m o d u l e 的表达大部分高 于原基因的表达水平。将代表位置效应的k a n m x 4m o d u l e 的表达与代表基因受 各种调控因素综合影响的原基因的表达作相关性分析，结果为r 2 = 0 0 3 6 3 。 5 ) 基因的表达与基因之间的距离相关性弱( r 2 = o ) 。 综上所述，我们的研究结果表明，由于k a n m x 4m o d u l e 所带的启动子普遍 强于原基因的启动子，得到的表达结果比原基因要高，但比较均一；可以看到 k a n m x 4m o d u l e 在染色体的不同位置时存在位置效应，但是效应比较弱；位置 效应的分析结果表明，在基因表达的调控因素里面，基因的表达与位置并没有显 著的相关性。 关键词：基因表达位置效应t a q m a n 探针r e a l t i m eq p c r 绝对定量 t h ep o s i t i o ne f f e c to fg e n e e x p r e s s i o na t 6a c c h a r o m v c e se e r e v t s i a el 1 1 r o m 0 s 0 m el 几j1lt m a j o r b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l eb i o l o g y m a s t e rc a n d i d a t e ：q i u x i al i u s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rx i o n g l c ih e a b s t r a ct r e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o ni sam a i nt o p i co fm o l e c u l eb i o l o g y u pt od a t e ， t h er o l e so fp r o m o t e ra n dy - u t rt h a tr e l a t i v et og e n e so w ns e q u e n c ei nr e g u l a t i n g g e n ee x p r e s s i o nh a v eb e e nw e l ld o c u m e n t e d b u tg e n es e q u e n c ei sn o te n o u g ht o e x p l a i nt h em e c h a n i s mo fg e n ee x p r e s s i o nr e g u l a t i o n r e c e n t l yr e p o r t ss h o w e dt h a t g e n ee x p r e s s i o nw a sr e l a t i v et ot h eg e n ep o s i t i o n , b u ts t i l ll e s sw e l lk n o w n a b o u tt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e np o s i t i o ne f f e c ta n dg e n ee x p r e s s i o n t os t u d yt h ep o s i t i o ne f f e c ta tt h el e v e lo fc h r o m o s o m e , i tw a sh a r dt og e tt h e m u t a n t st h a th a v et h es a n l er e p o r t e rg e n ei n s e r t e di n t od i f f e r e n t p o s i t i o no f c h r o m o s o m e , b u tt h ey e a s td e l e t i o np r o j e c tm a d ei tp o s s i b l e ( g u r ig e t a 1 ，2 0 0 2 ) t h i sp r o j e c th a sr e v e a l e dt h ep r e s e n c eo fm o r et h a n6 0 0 0o p e l lr e a d i n gf r a m e s ( o r f s ) i nt h es a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eg e n o m e ，e a c hg e n ed i s r u p t i o nw a sr e p l a c e d 喇la k a n m x 4m o d u l e h e r ew eu s e da b o u t5 0s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ey e a s td e l e t i o n s t r a i n s ( g e n e sd e l e t i o ni nd e f f e n e n tg e n ep o s i t i o no f1s tc h r o m o s o m e ) g e n e r a t e df r o m s a c c h a r o m y c e sg e n o m ed e l e t i o np r o j e c t ( s g d ) ，l l s 证gm u l t i p l e x - p r o b e sr e a l - t i m e m q p c i lf i r s t l yh a v i n g al o o ki n t ot h ep o s i t i o ne f f e c to ft h er e s i d i n gg e n e si n c h r o m o s o m e i nt h i sc h a p t e r , w ee s t a b l i s h e das y s t e mo ft r i p l e xt a q m a np r o b e sr e a l - t i m eq p c r f o rd e t e c t i n gt h eg e n ee x p r e s s i o nl e v e l w eh a dd e t e c t e dt h ep r i m e r ss p e c i f i c i t y , c o l o r c o m p e n s a t i o n , t h ei n t e r f e r e n c eo ft r i p l e xp r o b e sr e a c t i o ni nr e a l t i m eq p c ra n dt h e g e n o m ed n a i nt o t a lr n a t e m p l a t et oe n s u et h er i g h tc o n d i t i o n so f t h er e a l - t i m e q p c r a n a l y s i se x p r e s s i o nd a t ap r o d u c e df r o mr e a l - t i m eq p c r ： 1 ) a n a l y z e de x p r e s s i o nd a t ao fr e s i d i n gg e n eu s i n ga b s o l u t eq u a n t i f i c a t i o n s t a n d a r dc u r v e f o rt h ep r o m o t e ro fr e s i d i n gg e n ew a sk e p td u r i n gt h ed e l e t i o n , t h e t r a n s c r i p t i o np r o d u c to ft h i sp r o m o t e rw a sd e t e c t e d ，s h o w e dt h a to n l y3o u to f5 0 s t r a i n sh a dt h ee x p r e s s i o np r o d u c t 2 ) 5 0d i f f e r e n tp o s i t i o n si nc h r o m o s o m ei ，5 0d i f f e r e n te x p r e s s i o n l e v e l so f k a n m x 4m o d u l ew e r ed e t e c t e d b u tu n i f o r mf o rm o s t o ft h e m 3 ) t h ep r o m o t e ro fr e s i d i n gg e n ep a r t i c i p a t e di nt h et r a n s c r i p t i o no f t h er e p o r t g e n ek a n m x 4m o d u l eo n l yw h e nt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fr e s i d i n gg e n ew a sh i g h e r t h a nt h a to fk a n m x 4m o d u l e 4 ) a n a l y z e dt h ep o s i t i o ne f f e c to fr e s i d i n gg e n ei ny e a s tc 栅o m o s o m ei ，t h e c o e f f i c i e n tc o r r e l a t i o nr 2 = 0 0 3 6 3 5 ) t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e ng e n ee x p r e s s i o na n d t h ed i s t a n c ei sw e a k a b o v ea l l ，o u rr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ep r o m o t e ri nk a n m x 4m o d u l ei sah i g h l y e x p r e s s e dp r o m o t e rc o m p a r e dt ot h er e s i d i n gg e n ep r o m o t e r ；, t h e r ew a ss t i l lap o s i t i o n e f f e c tw h e nk a n m _ x 4m o d u l ei nd i f f e r e n tp o s i t i o no fc h r o m o s o m et h o u g hw e a k ；a n d t h e r ew a sn os i g n i f i c a n tc o n t r i b u t i o no f p o s i t i o ne f f e c ti nr e g u l a t i n gg e n ee x p r e s s i o n o u rr e s u l tw i l lb eai m p l i c a t i o na n df o u n d a t i o nf o rt h en e x tw o r k k e y w o r d s ：g e n ee x p r e s s i o n , p o s i t i o ne f f e c t , t a q m a np r o b e , r e a l - t i m eq p c r , a b s o l u t eq u a n t i f i c a t i o n i v 缩写 3 - u t r 5 u t r m r n a q p c r p e v o r f e d t a s d s e b g d n a n or t c p n m d s t d n t c c d n a t r i s o d r p m h m m s e c 英文缩略表 英文名称 t h r e ep r i m eu n t r a n s l a t e dr e g i o n f i v ep r i m et m t m m l a t e dr e g i o n m e s s e n g e rr n a q u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o s i t i o ne f f e c tv a r i e g a t i o n o p e nr e a d i n gf r a m e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d s o d i u md o d c c y ls u l f a t e e t h i d i u mb r o m i d e g e n o l i l i cd n a n or e v 6 t s e t r a n s c r i p t i o n c r o s s i n gp o i n t n o n s e n s e - m e d i a t e dd e c a y s t a n d a r dd e v i a t i o n n ot e m p l a t ec o n t a i n c o m p l e m e n t a r yd n a t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e n t h a n e o p t i c a ld e n s i t y r o t a t i o np e rm i n u t e h o u r m i n u t e s e c o n d 中文名称 3 端非编码区 5 端非编码区 信使l a 定量聚合酶链反应 花斑位置效应 开放阅读框 乙二胺四乙酸 十二烷基磺酸钠 溴化乙啶 基因组d n a 非逆转录 交叉点( 起跳点) 无义降解 标准差 空白对照 互补d n a 三( 羟甲基) 氨基甲烷 光密度 转每分钟 小时 分钟 秒 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：势踌唔 日期：2 0 07 年6 月多日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文迸入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：烈被 聊签名：斟参 日期：一了年毛月厂e t 1 1 引言 第一章前言 生物都必须依赖和适应一定的环境而生存。原核生物及单细胞真核生物都是 直接与环境相接触的，当周围环境的营养、温度、湿度、酸度等条件变化时，只 有根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环境的变化，才 能维持自身的生存和繁衍。高等真核生物虽然对环境的耐受能力比原核生物及单 细胞真核生物强，但是由于它们是多细胞有机体，在个体发育过程中出现细胞分 化，形成各种组织和器官，而不同类型的细胞所合成的蛋白质在质和量上都是不 同的。因此，不论是真核还是原核细胞都有一套准确的调节基因表达和蛋白质合 成的机制。 我们知道，生物体生存、发育、活动和繁殖所需要的全部遗传信息都以基因 的形式存储在d n a ( 或r n a ) 分子中。随着个体的发育，d n a 分子能有序地 将其所承载的遗传信息，通过一系列的步骤，最终以蛋白质的形式区执行各种生 理生化功能，完成生命活动。科学家把这个从d n a 到蛋白质的过程称为基因表 达( g e n ee x p r e s s i o n ) 。典型的基因表达是基因经过转录( t r a n s c r i p t i o n ) 、翻译 ( t r a n s l a t i o n ) ，产生有生物活性的蛋白质的过程。转录是指拷贝出一条与d n a 链 序列完全相同( 除了t _ u 之外) 的r n a 单链的过程，是基因表达的核心步骤； 翻译是指以新生的m r n a 为模版，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、 合成多肽链，最终生成有活性的蛋白质的过程。 对基因表达这个过程的调控称之为表达调控，基因的表达包括转录和翻译， 两个环节中都存在许多调控基因表达的因素。研究基因的表达调控是分子生物学 研究的一个中心课题，对了解生物生长发育的规律、形态结构特征、生物学功能 和疾病的产生有着非常重要的意义。 1 2 基因表达与调控 人们通常用转录水平估计基因表达水平，即m i 洲a 为对象研究基因的表达， m r n a 丰度的调节主要集中在转录环节。事实上，从生物体能量消耗最小化原则 来讲，基因表达调控在转录水平进行是更经济有效的方式( r o b e r tfw ，2 0 0 2 ) 。以 下是转录水平上基因表达调控的几个主要因素： 1 2 1 启动子( p r o m o t e r ) 无论是在原核还是真核细胞中，启动子是起始转录所必需的段d n a 序列 ( l e w i nb ，2 0 0 4 ) 。在原核细胞中，大多数启动子可被r n a 聚合酶直接识别而启动 转录，结构较为简单；对于真核细胞来说，启动子更多的需要借助其他蛋白因子 来辅助r n a 聚合酶的结合从而启动转录，这类启动子的结构相对复杂( b r o w nt ， 1 9 9 9 ) 。一般认为，r n a 聚合酶并不直接识别碱基本身，而是通过氢键互补的方 式加以识别( 朱玉贤，李毅，2 0 0 2 ) 。各个碱基分子上都分别带有氢键受体，由 于它们分别处在d n a 双螺旋的大沟或小沟内，因此都具有特定的方位，而酶分 子中也有处于特定空间构象的氢键受体与供体，当它们与启动子中对应的分子在 一定距离内相互补时，就形成氢键，相互结合( 朱玉贤，李毅，2 0 0 2 ) 。这种氢 键互补学说较为圆满地解释了启动子功能既受d n a 序列影响，又受其构象影响 这一事实( 朱玉贤，李毅，2 0 0 2 ) 。也就是说启动子的结构会影响它和r n a 聚合 酶结合的亲和力，从而影响基因表达的水平。 1 2 2 3 - u t r ( t h r e ep r i m eu n t r a n s l a t e dr e g i o n ) 几乎所有的m r n a 都可以被分成3 部分：编码区、位于a u g 之前的5 - u t r 以 及位于终止密码子之后的3 - u t r 。有报道指出，在细胞代谢过程中能对外部信号 做出快速反应的基因，其表达主要取决于m r n a 的稳定性( g u h a n i y o g ij ，2 0 0 1 ) 。 涉及这种调节的调控序列大多数集中在转录本的非翻译区( u n r e a n s l a t e dr e g i o n s ， u t r ) i 为，包括5 - u t r 并i a 3 u t r ，其中3 u t r 贝j 更重要。基因的5 - u t r 经常在翻 译环节调控摹因的表达( g e b a l l ee ta 1 ，l9 8 6 ；k a s p a r e ta i ，l9 9 2 ；k e m p ee ta 1 ，j9 9 3 ； s t r i p e c k ee ta 1 ，1 9 9 4 ) 。与5 - u t r 不同，y - u t r 涉及基因转录后水平的调控过程， 是真核生物m r n a 的重要功能元件，在基因表达调控方面起着不可忽视的作用。 主要参与m r n a 在细胞质中的稳定l 生( r o s sj ，1 9 9 5 ；r o d r i g u e z p a s c u a lfe ta i ，2 0 0 0 ； c h r i s t i n em m i s q u i t t ae ta 1 ，2 0 0 1 ；c h r i s t i n eme ta 1 ，2 0 0 6 ) 和m r n a 定位( h e s k e t h ， 1 9 9 6 ；o l e y n i k o va n ds i n g e r ，1 9 9 8 ；h o w a r ddl i p s h i t z ，2 0 0 0 ；j a n s e n ，2 0 0 1 ；h e r v e c h a b a n o ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 等生理进程的调控。 很多不稳定的m r n a 的3 u t r 中都含有促进m r n a 降解的序列，这些序列通 过富含腺嘌呤尿嘧啶元件( a u r i c he l e m e n t ，a r e ) 起作用( c h e nc y e ta 1 ，19 9 5 ) 。 眦引起m r n a 降解的机制可能是：在a r e 上存在a u 去稳定结构域( a u r i c h d e s t a b i l i z i n gm o t i f , a d m ) ，a d m 一方面可以使m r n a 的p o l y ( a ) 尾快速缩短至只含 2 0 - 4 0 个( a ) 的寡聚( a ) 尾，从而加速m r n a 的降解，另一方面，a d m 可以与m r n a 降解因子结合从而促进m r n a 降解( a n amze ta 1 ，1 9 9 5 ) 。与此相反的是，有些基 因的3 u t r 中含有使m r n a 稳定的结构。一个典型的例子就是转铁蛋白受体 m r n a 的3 u t r 内的铁反应元件( i r o n r e s p o n s i v ee l e m e n t , i r e ) ，i r e 中含有一个 茎环结构。铁调蛋i 刍( i r o n - r e g u l a t o r yp r o t e i n s ，i r p s ) 与i r e 茎环结构的结合取决于 细胞内铁的浓度。当细胞内铁浓度高时，i r p 与铁结合形成铁硫簇，与m r n a 的 亲和力降低，暴露了3 - u t r 内潜在的内源性核酸酶的切割位点，使其处于未保 护状态易受核酸酶攻击，降低了m r n a 的稳定性，在铁浓度低的情况下，i r e 可 与i r p 结合保护3 - u t r 内潜在的内源性核酸酶的切割位点而阻止m r n a 降解， 从而可以合成更多的转铁蛋白受体而提高铁离子的利用率( l i l lr a n dm u h l e n h o f f u ，2 0 0 5 ；王海震等，2 0 0 8 ) 。 也就是说3 u t r 能够影响m r n a 的半衰期，在不改变转录水平的情况下，使 m r n a 的丰度大幅度变化，从而影响基因表达水平。 1 2 3 位置效应( p o s i t i o ne f f e c t ) 很长一段时间内，人们认为染色体重排过程虽然改变了基因的位置，但是却 无法对基因的功能起到调节作用。直到两个非常重要的发现挑战了这个观点：第 一个发现来自s t u r t e v a n t 对果蝇肋删曼突变的研究。果蝇的b a r 基因是一个突变的性 连锁显性基因，野生型的果蝇复眼为椭圆形，而b a r 基凶使得复眼的刻面减少而 呈棒状。正常的雌性果蝇有2 个拷贝的b a r 基因，分别位于两条x 染色体上( b b ) ， 而雌性果蝇突变体拥有4 个拷贝的b a r 基因，每条x 染色体上各有两个拷贝 ( b b b b ) ，即肋，基因的突变是拷贝数的突变。而s t u r t e v a n t 发现了一种新的b a r 基 因突变形式，称为u l t r a b a r 或d o u b l e b a r ，这种突变是每条x 染色体上含有3 个 拷贝的b a r 基因，则纯合的雌性果蝇拥有6 个拷贝的b a r 基因( b b b b b b ) ，而杂合 的的雌性果蝇只有4 个拷贝的b a r 基因( 引媚纺) ，即一条x 染色体上有3 个胁基因 拷贝，另一条x 染色体上只有1 个跏基因拷贝。这种突变虽然与原来的b a r 基因 突变拥有相同的b a r 基因拷贝数，却能令复眼的刻面减少的更多。因此，s t u r t e v a n t 认为既然突变基因拷贝数相同，那么这种更显著的表型的变化就只能由b a r 基因 拷贝数在染色体上的不同的分布而产生的。他把这种现象称之为“位置效应” ( p o s i t i o ne f f e c t ) ( s t u r t e v a n t ，1 9 2 5 ) 。第二个发现来自于m u l l e r 所进行的x 射线诱导 的一系列影响w h i t e 基因的突变实验。先前的实验表明，w h i t e 基因的突变能够均 一的改变果蝇复眼的颜色，如从均一的红色变成橙色，黄色，甚至白色( m o r g a n ， 1 9 2 5 ) 。而m u l l e r 的研究发现了一种新的突变，这种突变使果蝇的眼睛某些区域是 红色，某些区域是白色的，形成了红白相问的花斑样式的复眼，而且不同果蝇的 眼睛复眼的形状，颜色和大小都是不一样的；这都是因为x 射线诱导的染色体重 排改变了w h i t e 基因在染色体上的位置从而改变了w h i t e 基因的表达，形成了果蝇 眼睛出现花斑的现象( m u l l e r ，1 9 3 0 ) 。m u l l e r 将这种现象定义为花斑位置效应 ( p o s i t i o ne f f e c tv a r i e g a t i o n ，p e v ) 。 关于花斑位置效应的产生机制，直接的证据来自于1 9 3 5 年d u b i n i n 和s i d o r o v 以及p a n s h i n 两个独立的工作( d u b i n i ne ta 1 ，1 9 3 5 ；p a n s h i n ，1 9 3 5 ) 。这两个工作指 出原来位于常染色质上的基因通过染色体畸变等过程移动到与异染色质相近的 区域，或者原来异染色质的一段序列被转移到常染色质区域时，异染色质附近的 常染色质基因m 现花斑效应。也就是说花斑效应出现的条件是常染色质基因被移 动到异染色质的接口处( s p o f f o r d ，1 9 7 6 ；z h i m u l e v ，1 9 9 8 ) 。 通过花斑位置效应的机制，很显然，我们不难得出，染色体结构的不同是位 置效应出现的一个重要原因。 1 2 3 1 异染色质结构( h e t e r o c hr o m a t i n ) h e i t z ( 1 9 2 8 ) 发现染色体的某些部分在整个细胞周期都是保持高度的浓缩和 螺旋化的。他把这些区域称为异染色质。研究发现，在果蝇里，异染色质区域主 要分布在接近着丝粒，端粒的区域，分散在整个四号染色体上，还有整条y 染色 体( z h i m u l e v , 1 9 9 8 ；z h i m u l e va n db e l y a e v a ，2 0 0 3 ) 。在大多数果蝇的体细胞中， 3 0 3 5 的基因组是异染色质区域。异染色质构成了整条y 染色体，4 0 的x 染色 体，2 5 的2 号和3 号染色体，以及过半的四号染色体，而且这些异染色质区域是 由许多重复的d n a 片段构成的，在果蝇种系中高度保守( p i m p i n e l l ie ta 1 1 9 9 5 ； w e i l e ra n dw a k i m o r o ，1 9 9 5 ) 。果蝇在端粒附近含有复杂的重复片段，包含了两种 反转座子h e t - a 和t a r t ( p a r d u ea n dd e b a r y s h e ，1 9 9 9 ；w a l l r a t h ，2 0 0 0 ) 。这些重复 片段在不同的染色体之间长度和序列都是不一样的( w a l t e r e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。异染色质 区域的基因由于这种特殊的染色体结构，在细胞周期过程中基本上是不表达。而 它的扩散性作用使易位到异染色质附近的常染色质基因出现了表达不稳定的情 况，也就是在某些细胞内是表达的，在某些细胞内却不表达，即产生花斑效应。j 越接近异染色质则花斑效应越强，如果转移到异染色质附近的基因不止一个，则 按照距离远近它能使位于异染色质附近的基因出现不同程度的花斑效应 ( d e m e r e c ，l9 4 0 ，l9 41 ；l e w i s ，19 5 0 ) 。 1 2 3 2 核小体结构( n u c l e o s o m e ) 与原核生物不同，真核生物的d n a 并不是完全裸露的。1 9 7 4 年，k o m b e r g 和t h o m a s 发现真核生物的d n a 是以一个个念珠状的称为核小体( n u c l e o s o m e ) 的 结构为基本单位，这些基本结构是以2 0 0 b p 左右的d n a 片段缠绕着组蛋白8 聚体 形成的( h e r v e ce ta i ，2 0 0 4 ) 。d n a 与组蛋白之间有1 4 个互作点( l u g e re ta 1 ， 1 9 9 7 ) ，这使得核小体成为生理状态下最为稳固的蛋白d n a 复合体；然而核小体 并不是简单的一个静止的单位，它受到各种因素的调节而呈现出动态的特征，核 小体的这种结构特征影响着从激活因子的结合到前转录复合体的延伸这一系列 的转录过程( w o r k m a ne ta 1 ，l9 9 2 ) 。同时，蛋白质复合物体可通过a t p 水解作用 影响组蛋白与d n a 的相互作用，使染色质结构重塑，即所谓的 c h r o m a t i n r e m o d e li n gc o m p l e x e s ( f l a u sa n do w e n - h u g h e s ，2 0 0 4 ；s m i t ha n d p e t e r s o n ，2 0 0 5 ；s a h ae ta 1 ，2 0 0 6 ) ，相应的结果包括形成d n al o o p ，使核小体滑动， 从而改变了核小体d n a 对转录因子的亲和力，影响基因表达。 位置效应的研究发展到现在，也常用米表示外源基因转入宿主基因组不同位 置时的表达差异现象( a n t o n i u se ta 1 ，1 9 8 8 ；a d a me ta 1 ，2 0 0 8 ) 。外源基因在转入宿 主基因组时，周围的基因组环境会对其表达产生不同程度的影响，通常认为主要 是一些调节上下游基因的增强因子或抑制因子会对外源基因的表达产生影响 ( j a s w i n d e re ta 1 ，2 0 0 8 ) 。有报道指出通过p 元件将外源基因插入宿主基因组中，利 用一些阻断子元件去屏蔽周围基因组的影响( 如图1 1 ) ，可以使该外源基因达到 最佳的表达( m i c h e l ee ta 1 ，2 0 0 8 ；t a t i a n ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 嗡霍黼心芦 i 基因组 隧：磊锄，幺2 褥巷恩彩茹矗锄篪二溷 基因组 l 。， 刨 j 图1 1 阻断子屏蔽基因周围环境对其表达的影响 f i g 1 一lt h em s u l a t o rp r o t e c tg e n ef r o mt h es u r r o u n d 1 3 本论文研究的技术背景 测定基因表达的手段有很多，如n o r t h e r nb l o t t i n g ，r n a s ep r o t e c t i o na s s a y s 等，但它们或多或少都存在费时，样品量需求大，灵敏度不够高的局限性，这对 一些量少珍贵的或目的基因拷贝数小的样品来说是非常不利的。而r e a l t i m e q p c r 技术的出现基本突破了以上瓶颈，凭着高灵敏度，高质量的基因表达分析 结果开始逐渐取代n o r t h e r nb l o t t i n g ，r n a s ep r o t e c t i o na s s a y s 等成为基因表达分析 的有力工具。冈此本论文采用了现在最常用的，灵敏度非常高的r e a l t i m eq p c r 6 作为测定基因表达的手段。 1 3 1r e a l - t i m eq p c r 技术的出现 1 9 8 3 年，k a r ym u l l i s 和同事发明了p c r ( p l o y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合 酶链反应) 技术，并于1 9 8 5 年首次在s c i e n c e 上发表了相关文章( s a i l de ta 1 ，1 9 8 5 ) 。 p c r 技术几乎让任何核酸片段都能通过一定的温度循环过程获得大量的拷贝数， 使得操作d n a 进行克隆，遗传工程和测序等成为可能。k a r ym u l l i s 更因此获得 了1 9 9 3 年度诺贝尔化学奖。 随着p c r 技术的应用，人们开始关注样本中基因原始拷贝数的差异，大批 早期的q p c r ( q u a n t i t a t i v ep c r ，定量p c r ，也称为e n dp 0 缸q p c r ) 技术被开 发出来，这些q p c r 技术在p c r 反应结束之后，利用传统的凝胶电泳e b 染色等 去检测p c r 产物，以此作为定量原始模板拷贝数差异的依据( b e c k e t - a n d r ea n di c h a h l b r o c k , 1 9 8 9 ；w a n g , a me ta 1 ，1 9 8 9 ；g i l l i l a n de ta 1 ，1 9 9 0 ) 。p c r 扩增反应曲线显 示p c r 反应一般经历三个阶段：指数期，线性期和平台期。在前两个时期，p c r 的扩增不受酶活性或者底物( 如d n r p s ) 的影响。当反应到一定时期，酶活性开 始下降，参与合成聊峨链的底物变得匮乏，反应进入平台期。在这个时候，理 论上所有的样品都应该得到相同数量的产物( h e a t h e re ta 1 ，2 0 0 8 ) 。事实上，不同 样品的平台期都会因为各种不同的因素而停留在不同的水平上。假设一对扩增目 标基因的引物扩增效率为1 0 0 ，那么经过2 0 个循环之后，初始d n a 样品的量 会达到l ，0 0 0 ，0 0 0 倍以上；但是，如果该扩增引物的扩增效率只达到9 5 的话， 那么最终产物只是初始d n a 的6 0 0 ，0 0 0 左右。在经过更高的循环数之后，反 应过程中细小的差异都会被极剧的放大。即使是各种反应条件基本一致的重复性 实验，也不能保证最后得到的扩增产物拷贝数是相同的，因此通过定量扩增产物 的方法并不能反映初始p c r 模板之间的真实差异。早期q p c r 技术作为定量分 析手段的局限性推动着q p c r 技术的不断发展与成熟。 19 9 2 年，h i g u c h i 等人发明了r e a l - t i m e q p c r ( 实时定量p c r ) ( h i g u c h ie ta 1 。 1 9 9 2 ；h i g u c h ie ta 1 ，1 9 9 3 ) ，该技术是在p c r 反应体系中加入能够发荧光的基团， 通过检测荧光信号的变化实时监测整个p c r 反应，将扩增和定量某一特定核酸 序列同时贯穿于整个p c r 进程中，故称之为实时定量p c r 。 7 1 3 2r e a l - t i m eq p c r 荧光标记方法 r e a l - t i m eq p c r 主要通过两太类荧光标记方法进行定量：1 1 在反应中加入能 与d n a 双链非特异性结台的荧光染料( 如s y b rg r e e n ) ( 如图i - 2 ) ：2 ) 加入 能与目的d n a 互补结合的带有荧光基团的标记探针( 如t a q m a n ，m o l e c u l a r b e a c o n ，f r e t 等) ( 如图l - 3 ) 。通过激发荧光染料或荧光基团的荧光，在每个循 环结束时收集荧光强度数据，建立实时扩增曲线。准确得到c 帕值荧光信 号有统计学意义显著增长时的循环数，计算起始模板拷贝敦，真实的对基因拷贝 散进行定量。 0s 3 - b ro r e e n 染刊 图i - 2 s y b r g r e e m 染料结合双链d n a 示意图。 f 啦i - 2 m e c h a n i s m o f s y b r g r e e n b i n d i n g t o d o u b l es t r a n d d n a i nr e a l - t i m e q p c 享一 i一 一一一 一一一 i 。，d 洲m erp 零t a q m n 口r o b 尹 一一 目1 3 t h q m a n 探针作用原理幽。 f i g i - 3 m e c h a n i s m o f t a q m a np r o b e i nr e a l - t i m eq p c rr e a c t i o n 本论文采用的荧光标记方法足是标记探针里面的一种t a q 探针。 t a q m a n 探针是段1 5 - 3 0 b p 左右的单链d n a ，5 + 端带有荧光基团，3 。端带有淬灭 基| ；| 1 1 ，能与目的基因互补结合。在探针还是完整的时候，由于荧光基刚和淬灭基 团距离很近，荧光基脚不发荧光i 而在p c r 反应过程巾t a q m a n 探针先十引物 与目标片段结合，d n a 聚合酶沿着引物扩增目标片段，当遇到探针时d n a 聚 合酶所具有的5 。- + 3 。外切酶活性会将探针切断，这时5 。端的荧光基凼就会游离出 来，解除了淬灭基团对荧光基团的芡光淬灭作用，开始发出在特定波长范围内的 荧光。每经过一个循环过程都会有更多的探针被切断，荧光基团秘累的荧光就会 越束越强。定量p c r 仪的检测通道通过测定每个循环荧光的变化，能够自动描 绘出定量扩增曲线，然后根据实验需要选择 【i 应的数据分析方法得到基因的表达 量。t a q m 探针的优点在于同一个反应里面，能加入多个标记不同荧光基团的 探引同时对多个爿的艇因进行定量。