（环境工程专业论文）木质纤维素降解菌的筛选及对秸秆降解的研究.pdf

桂林工学院硕士学位论文 摘要 木质纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物，同时它也是地球上数量最大 的再生资源。农作物秸杆中含有大量木质纤维素，如何充分利用这些可再生资源是近几 年世界各国普遍关注的问题。 本课题从提高秸秆降解率的目的出发，进行了纤维素、木质素降解菌的筛选，初步 探讨了其生长特性和产酶特性，并研究了菌株混合培养及对秸秆降解的应用。实验结果 如下： ( 1 ) 一共筛选出一株纤维素降解菌x j - 1 ，一株木质素降解菌z h j - 1 ，经初步鉴定1 为纤维单胞菌属，z h j 1 为原毛平革菌属。 ( 2 ) 对x j - 1 的生长特性试验研究表明：1 生长高峰出现在2 , - - 8 小时，最佳p h 值 为7 o o ，最适温度为3 5 。 ( 3 ) 对z h j 1 木质素降解试验研究表明：z h j 1 接种3 0 d 对稻草木质素降解率为 1 6 6 0 ，综纤维素降解率为30 4 7 ，s f 值为0 7 7 。 ( 4 ) 对z h j - l 产l i p 酶发酵条件优化研究表明：接种孢子浓度、碳源种类、氮源种类、 碳氮比、藜芦醇、t w e e n8 0 等添加物、起始p h 值、温度、装液量都对z h j 1 产l i p 酶 有较大的影响。静置培养下最佳产酶条件为：采用限碳培养基，葡萄糖2 9 l ，酒石酸 铵2 4 m m o l l ，藜芦醇3 0 m m o l l ，t w e e n8 00 5 9 l ，起始p h 值4 5 ，2 5 0 m l 三角瓶中 装液量3 0 m l 每瓶接种量2 x1 0 6 个孢子，培养温度3 5 c ；振荡培养下最佳产酶条件为： 采用限氮培养基，葡萄糖为1 0 9 l ，酒石酸铵2 m m o 儿，藜芦醇3 0 m m o l 几，t w e e n8 0 o 5 9 l 。起始p h 值4 5 ，2 5 0 m l 三角瓶中装液量5 0 m l ，每瓶接种量3 x 1 0 6 个孢子。z h j - i 在最佳发酵条件下静置培养和振荡培养均在第6 d 得到最高l i p 酶活，分别为1 0 2 7 u l 、9 9 8 u l - 1 。 ( 5 ) 实验初步确定了z h j 1 、) ( j 1 之间无拮抗关系。 ( 6 ) 将两株菌通过混合发酵发现比纯发酵效果更好，再由正交实验得到混合菌的最 佳稻草发酵条件为：接种量2 m l ，接种比例2 ：l ( z h j - 1 ：x j - 1 ) ，温度3 5 ( 3 ，含水率8 0 。 最佳条件下稻草发酵3 0 d 后木质素降解率、综纤维素降解率分别达到2 3 0 6 、3 5 2 3 ， l i p 酶活最高为9 5 3u l - 1 ，m n p 酶活为最高7 0 6u - l 一，c m c 酶活最高为2 4 8 7u l l 。 本课题研究的混合菌在优化的发酵条件下与未接种相比能在较短时间内较好的降 解稻草的木质纤维素，对农业废弃物的资源化和解决环境污染的问题都开辟了新途径。 关键词：纤维素降解菌、术质素降解菌、l i p 酶、木质素降解率、综纤维素降解率 桂林工学院硕士学位论文 a b s t r a c t l i g n o c e l l u l o s ei so n eo ft h em o s te x t e n s i v ec a r b o h y d r a t e se x i s t e di nt h en a t u r a lw o d d ， w i t ht h em o s t l a r g e a m o u n to fr e g e n e r a t e dr e s o u r c e s t h es t r a wc o n t a i n sm u c h l i g n o c e l l u l o s e ， a n dh o wt om a k ef u l lu s eo ft h e s er e n e w b l er e s o u e c e si st h ei s s b cw h i c ht h e c o u n t r i e si nt h ew o r l dc o n c e r n e di nr e c e n ty e a r s t h es t u d yi sf r o mt h ep u r p o s eo fi m p r o v i n gt h er a t eo fs t r a w , s c r e e n sc e l l u l o s ea n dl i g n i n d e c o m p o s i t i o ns t r a i l 1 s ，p r e l i m i n a r yd i s c u s s i o nt h eg r o w t hc h a r a c t e ra n de n z y m ep r o d u c t i o n p r o p e r t yo ft h e s es t r a i n s ，a n dt os t u d yt h ec u l t u r eo fm i x e ds t r a i n sa n dt h ea p p l i c a t i o no fs t r a w d e g r a d a t i o n 。1 1 地r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) o n ec e l l u l o s e d e c o m p o s i n gs t r a i nx j - 1a n do n el i g n i nd e c o m p o s i t i o nf u n g ia r e s c r e e n e di nt h i s s t u d y ， w h i c ha r ei d e n t i f i e d 觞e e l l u i o m o n a sa n dp c h r y s o s p o r i u r n ， r e s p e c t i v e l y ( 2 ) t h eg r o w t hc h a r a c t e ro fs t r a i nx j 1s h o w st h a tt h eg r o w t hs u m m i ti sf r o m2 8 h ， 、析t ho p t i m u mp ho f7 0 0a n do p t i m u mt e m p e r a t u r eo f3 5 ( 3 ) t h el i g n i nd e c o m p o s i t i o ne x p e r i m e n to fz h j 一1s h o w st h a tt h el i g n i nd e g r a d a t i o nr a t e a n dh o l o c e l l u l o s ed e g r a d a t i o nr a t ea r e1 6 6 0 a n d3 0 4 7 ， r e s p e c t i v e l y ， a f t e r3 0d t r e a t m e n t ，w i t hs fv a l u eo f0 7 7 ( 4 ) t h el i pf e r m e n t a t i o ns t u d yo fz h j 1s h o w st h a ti n o c u l a t i o nc o n c e n t r a t i o n ，t y p eo f c a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e ，c nr a t i o ， v e r a t r y la l c o h o l ，t w e e n8 0 ， i n i t i a lp h ， t e m p e r a t u r ea n dl i q u i dv o l u m ea l la f f e c tt h ep r o d u c t i o no fl i pe n z y m eg r e a t l y i ns t a t i c c u l t u r et h eo p t i m u me n z y m ep r o d u c t i o nc o n d i t i o n sa r ea d o p t i n gc a r b o n - l i m i t e dm e d i u m ， 、析t hg l u c o s e2 9 l ，a m m o n i b mt a r t r a t e2 4 m m o l l ，v e r a t r y la l c o h o l3 0 m r n 0 1 l ，t w e e n8 0 0 5 9 l ，i n i t i a lp ho f4 5 ，i n o c u l a t i o na m o u n t2 x10 0s p o r ea n da d d s3 0m lo fl i q u i dm e d i u m i n2 5 0m lf l a s k ，t e m p e r a t u r e3 5 i ns h a k ec u l t u r et h eo p t i m u me n z y m ep r o d u e t i o n c o n d i t i o n sa l ea d o p t i n gn i t r o g e n l i m i t e dm e d i u m ，w i mg l u c o s e1 0 l ，a m m o n i u mt a r t r a t e 2 m m o l l ，v e r a t r y la l c o h o l3 0 r e t o o l l ，t w e e n8 00 5 9 l ，i n i t i a lp ho f4 5 ，i n o c u l a t i o n a m o u n t3 x 1 0 0s p o r ea n da d d s5 0m l o f l i q u i dm e d i u mi n2 5 0m lf l a s k ，t e m p e r a t u r e3 5 b o t hs t a t i cc u l t u r ea n ds h a k ec u l t u r es h o w e dt h eh i g h e s tl i pe n z y m ei nt h e6 t nd a y ，w h i c ha r e 10 2 7u l 1a n d9 9 8 u l 。1 ，r e s p e c t i v e l y , f 5 ) 1 1 l er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e s et w os t r a i n si su n a n t a g o n i s t i c ( 6 ) t h es t u d yf o u n d t h a tm i x e df e r m e n t a t i o ns h o w e db e t t e rr e s u l t st h a n h o m o f e r m e n t a t i o n 1 1 1 eo p t i m u mc o n d i t i o n sa r ei n o c u l a t i o na m o u n to f2 m l ，i n o c u l a t i o nr a t e o f2 - l ( z h j 1 ：x j 1 l ，t e m p e r a t u r eo f3 5 a n dw a t e rc u to f8 0 u n d e rt h i so p t i m u m c o n d i t i o n ，t h el i g n i nd e g r a d a t i o nr a t ea n dh o l o c e l l u l o s ed e g r a d a t i o nr a t ea r e2 3 0 6 a n d 3 5 1 2 3 ，r e s p e c t i v e l y ，a f t e r3 0d st r e a t m e n t ，w i t hl i pe n z y m eo f9 5 3u l - 1 ，m n pe n z y m e o f7 0 6u l a n dc m c e n z y m eo f2 4 8 7u l 一 ，n l em i x e ds t r a i n sc a nd e g r a d el i g n o c e l l u l o s ee f f e c t i v e l yi nar e l a t i v e l ys h o r tt i m eu n d e r t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sc o m p a r e dw i t hn o ti n o c u l a t e d ，a n di td e x f e l o p san e w w a yt ot h ec o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no fa g r i c u l t u r a lw a s t e sa n dr e s o l u t i o no fe n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o n k e y w o r d s ：c e l l u l o s e d e c o m p o s i n gm i c r o o r g a n i s m s ；l i g n i nd e c o m p o s i t i o nf u n g i ；l i p e n z y m e ；l i g n i nd e g r a d a t i o nr a t e ；h o l o c e l l u l o s ed e g r a d a t i o nr a t e i i 桂林工学院硕士学位论文 独创性声明 本人声明：所呈交的论文是我个人在王敦球教授指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得桂林工学院或其它教育机 构的学位或证书而使用过的材料。对论文的完成提供过帮助的有关人员已在论文 中作了明确的说明并致以了谢意。 一 学位论文作者( 签字) ：丑纽。麦塑 签字日期：五坚芏：笸! ： 版权使用授权说明 本人完全了解桂林工学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和 电子版，并提供目录检索与阅览服务：学校可以采用影印、缩印、数字化或其它 复制手段保存论文：在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部 内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 签字日期： 学位论文作者( 签字) 指导教师签字： 桂林工学院硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 木质纤维素特性简介 木质纤维素是纤维素( c e l l u l o s e ) 、木质素( 1 i g n i n ) 、半纤维素( h e m i c e l l u l o s e ) - - - 者的统 称。植物纤维原料中的纤维素、木质素和半纤维素主要存在于细胞形式，其含量比例大 致为4 ：3 ：3 ，其中纤维素是纤维的骨骼物质，而木质素与半纤维素以包容物质的形式 分散在纤维之中及其周围，它们之间主要靠共价键紧密连结，同时也存在一定程度的化 学键连结【。 纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物，同时它也是地球上数量最大的再 生资源。在植物细胞壁中，纤维素分子聚集成纤维丝，包埋在半纤维素和木质素里，形 成网状结构。纤维素分子本身的致密结构以及由木质素和半纤维素形成的保护层造成纤 维素不容易降解而难以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用。纤 维素分子是由葡萄糖分子通过d 1 ，4 糖苷键连接而成的链状高分子聚合物，聚合度很大 ( 通常由4 0 0 0 8 0 0 0 个葡萄糖分子串联起来，分子量达2 0 0 - , 2 0 0 0 k d a ) 。在纤维素的连续 结构中，分子密度大的地方，成平行排列，有较好的定向性，形成纤维素的结晶性区域。 在纤维素分子中邻近的聚合物，有1 ，4 个分子离开原来位置在晶格空间无间隙地配位形 成氢键，使其稳定化。随着分子密度的变小，结合程度变弱，分子间空隙变大，定向性 变差，形成了纤维素的无定形区域。葡萄糖的d 1 ，4 糖苷键连接方式使纤维素的近乎所 有羟基及其它含氧基团，都同其分子内或相邻的分子上含氧基团之间，形成分子内和分 子链之间的氢键。这些氢键使很多纤维素分子共同组成结晶结构，并进而组成复杂的基 元纤维、微纤维、结晶区和无定型区等纤维素聚合物的超分子结构。纤维素的特殊结构 使纤维素酶分子很难靠近纤维素分子内部的糖苷键进行有效的反应。 木质素是仅次于纤维素的一种最丰富可再生的纤维资源，分子量约6 0 0 - 1 0 0 0 k u ， 它与纤维素、半纤维素被称为植物体的“三素”，光合作用所固定的c o z 有很大一部分被 转化为木质素，通过光合作用储存在植物体中的太阳能中，木质素大约占去了4 0 ，在 木本植物中，它的含量约占。2 7 - - 3 2 ，草本植物中占1 4 0 o - 2 5 睇j 。它由苯基丙烷单元 通过醚键和c c 键连结聚合而成的近似球状的芳香族高聚体，木质素中一般含有松柏 醇、芥子醇和对香豆醇三种不同类型的苯基丙烷单体，它们随植物品种、植物年龄甚至 细胞壁形态部位的不同而存在着不同的比例，如：针叶树的木质素主要由松柏醇的脱氢 聚合物构成愈创木基木质素；阔叶树的木质素由松柏醇和芥子醇的脱氢聚合物构成愈创 木基紫丁香基木质素：而草本植物则是由松柏醇、芥子醇和对香豆醇的脱氢聚合物和 对香豆酸组成。由于这三类醇的共聚化产生了不均匀的、无旋光性的、交叉键合、高度 桂林工学院硕士学位论文 分散性及高度抗生物降解性的芳香高聚物，对绝大多数微生物的攻击均有抗性，因而， 木质素的分解特别慢。而且，在完整的木质组织中，木质素是以一种物理屏障存在的， 它包围纤维素，成为外围基质，保护纤维素免遭微生物袭击和降解酶的进攻，其降解必 须先于纤维素分解，是地球上碳素循环的限速过程，故木质素的降解在碳素循环及植物 纤维素材料有效利用中占有非常重要的地位【l 一4 一】。 与纤维素不同，半纤维素不是单一聚糖，而是一群复合聚糖的总称。组成半纤维素 的糖基主要有：d 木糖基、d 甘露糖基、d 半乳糖基葡萄糖基、l 阿拉伯糖基、4 o 甲基一葡萄糖尾酸基、d 半乳糖醛基、d 葡萄糖糖醛酸基等，这些糖基构成半纤维素时， 一般不是由一种糖基构成一种聚糖，而是由2 4 种糖基构成的复合聚糖( 平均聚合度约 2 0 0 ) 。原料不同，复合糖的组分也不同，就是同一种原料，产地不同，部位不同，它们 的复合聚糖的组成也是不相同的，这就导致了半纤维素结构的复杂性、不确定性，因而 对它的研究利用较少【l 。 木质纤维素的来源非常广泛，主要是植物的根、茎和叶三部分，在我国，主要是未 被充分利用的农作物秸秆。我国作物秸秆和农工下脚料资源十分丰富，品种多( 重要作 物秸秆近2 0 种) 、数量大( 全国年产各类农作物秸秆达5 7 亿吨，相当于北方草原打草总 量的5 0 倍，占全世界秸秆总产量的2 0 3 0 【7 1 。同时我国的作物秸秆总量和粮食作 物秸秆平均每年以1 2 5 1 2 x 1 0 4 吨和1 1 0 0 3 x 1 0 4 吨的速度稳步增长，预计2 0 1 0 年我国作 物秸秆资源将达到8 7 5 0 0 x1 0 4 吨【8 1 ) ，具有丰富的木质纤维素资源。 农作物秸秆的组成一般为：纤维素31 , - - 4 0 ，半纤维素3 5 , - 4 8 ，木质素1 5 - 2 5 9 1 。 另外还含有一些少量的营养物质，如单宁、果胶质、树脂、蜡、配糖物以及不可皂化物 等。 其化学结构( 成分) 含量见表1 1 。 表1 1 秸秆的化学结构含量 1 2 纤维素降解研究进展 1 2 1 降解纤维素的微生物 据研究报道具有降解纤维素能力的微生物分布在细菌域和真核生物域中的许多属 中，在细菌、放线菌和真菌中都有产纤维素酶的菌株，其中真菌被认为是自然界中有机 2 桂林工学院硕士学位论文 质特别是纤维素物质的主要降解者。 1 2 1 1 降解纤维素的细菌 细菌一般是单细胞的，大小0 5 p m q ) 3 p m ，由于体积小，细菌具有较大的比表面 积，能使物质快速进入细胞。因此，细菌往往比真菌多得多。根据纤维素降解细菌对氧 气的需求及对微生物学的其他特征的观察，可以将纤维素降解细菌分为几种不同的生理 类群【1 6 1 。 好氧性细菌：在中性、微碱性土壤的表层，以及河流、湖泊和海洋中，纤维素能 够发生迅速的降解。在自然界中分布的纤维素降解细菌主要包括革兰氏阳性细菌的芽抱 杆菌属( b a c i l l u s ) 、热酸菌属( a c i d o t h e r m u s ) 、热杆菌属( c a l d i b a c i l l u s ) 、纤维单胞菌属 ( c e l l u l o m o n a s ) 。在革兰氏阴性细菌中有假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、纤维弧菌属 ( c e l l v i b r i o ) 、纤维单胞菌属( c e l l u l o m o n a s ) 和欧文菌属( e r w i n i a ) 。这些细菌多数是能活泼 运动的中温好氧菌。它们对天然纤维素的分解能力一般较弱，主要产生内切葡聚糖酶， 分解短链可溶性纤维素，胞外纤维素酶活力也比较低。除此之外，中温好氧细菌中的镶 状纤维菌( c e l l f a c i c u l a ) 分解纤维素能力较强，能使滤纸膨胀黏化。 厌氧发酵细菌：降解纤维素的厌氧发酵细菌包括典型的革兰氏阳性菌和少数的革 兰氏阴性菌，所有这些菌大多数在系统发育树上与梭状芽抱杆菌属( c l o s t r i d i u m ) 有较密 切的相关性。革兰氏阳性细菌包括梭状芽抱杆菌属( c l o s t r i d i u m ) ，瘤胃球菌属 ( r u m i o c o c c u s ) 、厌氧纤维菌属( a n a e r o c e l l u m ) 、丁酸弧菌属( b u t y r i v i b r i o ) 、真细菌属 ( e u b a c t e r i u m ) ，少数的螺旋体( s p i r o c h a e t a ) 也有降解纤维素的能力，如嗜热螺旋体 ( s t h e r m o p h i l a ) 。革兰氏阴性菌包括热解纤维素菌属( c a l d i c e l l u l o s i r u p t o r ) 、醋弧菌属 ( a c e t i v i b r i o ) 、闪烁杆菌属( f e r v i d o b a c t e r i u m ) 、丝状杆菌属( f i b r o b a c t e r ) ，嗜盐菌属 ( h a l o c e l l a ) 和栖热袍菌属( t h e r m o t o g a ) 。在瘤胃细菌中主要有白色瘤胃球菌 ( r u m i n o c o c c u sa l b u s ) 、黄色瘤胃球菌( r _ f l a v e f a c i e n s ) 、溶纤丁酸弧菌( b u t y r i v i b r i of r b r i s 0 1 ) 、 产琥珀酸拟杆菌( b a c t e r o i d e ss u c c i n o g e ) 等。 ! 好氧的滑行细菌：滑行细菌分解纤维素的能力强大，其细胞形态特殊，可在固体 表面滑动。包括噬纤维菌属( c y t o p h a g a ) 的红噬纤维菌( c r u b r a ) 、约氏噬纤维菌 ( c j o h n s o n i i ) 、流散噬纤维菌( c d i f f l u e n s ) 、溶解噬纤维菌( c 1 y t i c a ) 、发酵噬纤维菌 ( c f e r m e n t a s ) 、鲑色噬纤维菌( c s a l m o n i c o l o o ，以及生孢噬纤维菌属( s p o r o c y t o p h a g ) 和 多囊菌属( p l o y a n g i u m ) 。 1 2 1 2 降解纤维素的放线菌 放线菌很少利用纤维素，但它们能容易地利用半纤维素，并能在一定程度上改变木 质素的分子结构，继而分解溶解的木质素。尽管由于放线菌繁殖慢且降解纤维素和木质 3 桂林工学院硕士学位论文 =mm 素的能力不及真菌，但因为在不利的条件下，放线菌能形成芽抱，与真菌相比较耐高温 和各种酸碱度，所以在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。 高温放线菌可以从自然界中许多地方分离出来，如：沙子、成熟堆肥、马粪和果园 土中。主要包括：诺卡氏菌属( n o e a r d i a ) 、节杆菌( a r t h r o b u c t e r ) 、小单胞菌属 ( m i e r o m o n s p o r a ) 、链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 、高温放线菌属( t h e r m o a c t i ；o m y c e s ) 等【协1 6 l 。 1 2 1 3 降解纤维素的真菌 丝状真菌：高温真菌对纤维素、半纤维素和木质素有很强的分解作用，它们不仅 能分泌胞外酶，而且其菌丝具有机械穿插作用，共同降解难降解有机物( 如纤维素和木 质素) ，促进生物化学作用。 丝状真菌是纤维素降解微生物中最具有代表性的类群。按照通用的培养方法和酶活 的测定方法，产生胞外滤纸酶活比较高的类群主要为木霉属( t y i c h d e r m a ) 、青霉属 ( p e n i c i l l i u m ) 、漆斑霉属( m y r o t h e c i u m ) 、毛壳霉属( c h a e t o m i u m ) 、和脉抱霉属( n e u r o s p o r a ) 等其中研究较多的是里氏木霉( t r e e s e i ) 、康氏木霉( t k o n i n g i i ) 和绿色木霉( t v i r i d e ) 。曲 霉属( a s p e r b i l l u s ) 和根霉属( r h z i o p u s ) t 扣具有分解纤维素能力的种类大多数是卜葡萄糖 苷酶活力较高的。 子囊菌中的毛壳菌( c h a e t o m i u m ) 、长嚎壳属( c e m t o c y s t i s ) 、炭角菌( x y l a r i a ) 等菌丝可 以穿透细胞壁进入纤维材料内部，对纤维素分解较彻底，但胞外酶活低，不适于生产纤 维素酶，可作蛋白饲料。 植物病原真菌如瓜果腐霉( a y t h i u ma p h a n i d e r m a t u ) 、瓜枝霉( c l a d o s p o r i u m c u c u m e r i n u m ) 等具有外切纤维素酶活力，也有果胶酶活力。 还有部分嗜热真菌如嗜热毛壳茵( c t h e r m o p i l e ) ，嗜热侧抱霉菌( s p o r o t r i c u m t h e m o p h i l e ) ，嗜热子囊菌( t h e m o a s c u sa u r a n t i a c u s ) ，以及分解木材的软腐真菌类( s o f t - r o t f u n g i ) 的丝葚霉属( p a p u l o s o r a ) ，黏束孢属( g r a p h i u m ) 、梭孢壳属( t h i e l a v i a ) 等也具有纤维 素酶活。 低等厌氧真菌：这类真菌包括单分裂的属，如n e o c a l l i m a s t i x 、p i r o m y c e s 、 a n a e r o m y e e s ；多分裂的属，如o r p i m o m y c e s 和a n a e r o m c e s 。这些真菌产生的纤维素酶 是高分子量的复合体，对微晶纤维素有很高的亲和性，并能够有效降解。 担子菌类：已知能分解木质素材料的微生物大都属于担子菌类。根据分解木材时 纤维素和木质素变化速率的不同，可将它们分为褐腐真菌( b r o w n - r o tf u n g i ) 、白腐真菌 ( w h i t e r o tf u n g i ) 和软腐真菌( s o f t r o tf u n g i ) - - 大类。 褐腐菌类对木质素的分解能力较弱，但能有效、快速分解纤维素。这类菌包括卧孔 菌( p o r i a m o n t i c o l a ) 、拟管革桐菌( l e n z i t e st r a b e a ) 等。 4 桂林工学院硕士学位论文 白腐菌能较快地降解木质素，在多孔菌( p o l y p o r u s ) 、层空菌( f o m e s ) 、侧耳( p l e u r o t u s ) ， 口蘑菌( t r i c h o l o m a ) f ：f l 蘑菇( a g a r i c u s ) 等担子菌中都有很多强烈分解木质素和纤维素能力 的菌株，如黄白卧孔菌( p o r i as u b a c i d a ) ，变色多孔菌( p o l y p o r u sv c r s i c o l o o 等。但生长缓 慢，胞外酶活力低，大规模生产只能沿用传统的固体培养方法。 软腐真菌，如球毛壳属( c h e a t o m i u mg l b o s o m ) ，既可分解纤维素，又可分解木质素， 但其降解速度非常慢【峥1 6 l 。 1 2 2 纤维素酶 1 2 2 1 纤维素酶研究概况 自1 9 0 6 年s e d l i e r e 在蜗牛的消化液中发现纤维素酶后，人们对纤维素的组成性质、 作用方式、培养条件、分离提纯、测定方法、降解机理、固定化和工业应用等方面作了 大量的研究，其中以将纤维素转化成葡萄糖作为主要目标。但纤维素酶及其作用的底物 非常复杂，影响因素繁多，水解速度缓慢，酶的利用率低，所以实际应用还存在许多困 难，酶解效率不高。 目前，对于一般纤维素酶的研究己经非常的深入，进展到利用结构生物学及蛋白质 工程的方法对纤维素酶分子的结构和功能进行研究的阶段，其中包括纤维素酶结构域的 拆分、解析、功能性氨基酸的确定、水解的双置换机制的确立，分子折叠和催化机制关 系的探讨l l7 。 1 1 2 2 2 纤维素酶的来源 纤维素酶的来源非常广泛。真菌、放线菌及细菌等在一定条件下均可产生纤维素酶， 原生动物、软体动物和昆虫等也能产生纤维素酶。细菌产生的纤维素酶的量较低，主要 是内切葡聚糖酶，少数细菌能分泌外切葡聚糖酶，大多数细菌产生的内切葡聚糖酶对结 晶纤维素没有活性，而且这些酶主要是胞内酶或吸附于细胞壁上，很少能分泌到细胞外， 增加了提纯的难度，在工业上很少采用。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌。 至今己有很多关于纤维素酶生产菌株的研究报道。国内外对分解纤维素的微生物的研究 主要有好氧菌如嗜纤维粘菌属( c y t o p h a g a ) 、纤维弧菌属( c e l l v i b r i o ) 、纤维单胞菌属 ( c e l l u l o m o n a s ) 等，厌氧菌如奥氏梭菌( c l o s t r i d i u m o m e l i a n s k i i ) 、高温溶纤维素梭菌( c t h e r m o c e l l u l a s e u m ) 、真菌中的木霉( t r z c h o d e r m a ) 、曲霉( a s p e r y l l u s ) 、青霉( p e n l c i l l u m ) 、 葡萄状穗霉( s t a c h y b o t r y s ) 、好热霉( n l e 肌o m y c e s ) 等1 1 8 】。 1 2 2 3 纤维素酶活的测定 酶活力测定是在一定条件下测定酶所催化的反应速度。在外界条件相同的情况下， 桂林工学院硕士学位论! 文 !苎!竺!苎-一-一i ni 竺! 苎! ! ! 反应速度越大，意味着酶活力越高。酶催化反应速度通常用单位时间内底物的减少量或 产物的增加量表示。 1 9 6 1 年国际生物化学与分子生物学联合会规定：在特定条件下( 温度可采用2 5 或 其它选用的温度，p h 值等条件均采用最适条件) ，每r a i n 催化l p m o l 的底物转化为产物 的酶量定义为一个酶活力单位，这个单位为国际单位。由于这个规定没有法律效力，所 以现在在实际工作中，为了方便都采用自行规定的单位。 纤维素酶活的测定常用的有代表性的方法有多种，如梭甲基纤维素酶活( c m c a s c ) ，纤 维二糖酶活( c b ) ，滤纸酶活( f p a ) 和微晶纤维素酶活( a v i c e l a s c 或c b h ) 等t 侈2 0 。 滤纸是聚合度和结晶度都居中等的纤维材料，能够较真实的反映天然纤维素的情 况，以其为底物测得的酶活可以用来表征纤维素酶的总糖化能力，反映了3 类酶组分的 协同作用。1 9 8 4 年，国际理论和应用化学协会的发酵委员会确认滤纸酶活力测定方法 为纤维素酶活力测定标准方法【2 。但是由于其底物滤纸是不溶性的，结构比较复杂，不 同厂家生产的滤纸也不同，对实验有一定的影响，而且滤纸酶活的测定存在测定时间长， 操作烦琐等问题。所以操作过程中常常采用c m c a s c 。 1 2 3 从自然界筛选纤维素降解菌 在很多平板水解圈直接分离法分离c m c a s c 的菌株的方法中，以刚果红法为最好。 其它的方法有的受底物来源的限制，有的灵敏度低需培养较长时间，有的则因杀死菌体 而需用影印移植，这就造成很多不便。而采用刚果红法则无上述缺点，刚果红对菌体无 任何不良的影响，产生的透明圈清晰非常容易辨认，特别是它的高灵敏度，只要菌落长 到用肉眼可见，就可产生清晰的透明圈。此法除可用于识别产纤维素酶的菌株，还可用 于初步判定酶活性高低。产酶越多，透明圈越大，产酶越快，透明圈出现越早。 虽然透明圈大小直接反映了酶浓度的高低，但不能完全代表菌株产酶能力，其原因 是多方面的【1 9 1 。如固体和液体培养条件不同；各种类型分泌纤维素酶的细菌本身差异 就很大：浓度不同，细胞壁厚薄、细胞聚集成团的程度、凝固剂多少而引起的水解酶渗 过快慢、菌落与菌落之间相互位置和产物或分泌物抑制等因素不同；不同菌株具有不同 的生长和产酶速度和不同的纤维素酶系：菌苔大小及在平板上堆积情况的差异等都会造 成透明圈大小与液体发酵酶活结果的不完全一致，所以液体发酵复筛必不可少。 1 3 木质素降解研究进展 1 3 1 降解木质素的微生物 在自然界中，木质素的完全降解是真菌、细菌及相关微生物群共同作用的结果，其 6 桂林工学院硕士学位论文 ! ! i = i i ! ! ! ! 苎! ! 苎! 苎! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 中真菌起着主导作用。根据木材腐朽类型，降解木质素的真菌木腐菌可分为白腐菌、 褐腐菌和软腐菌3 类【2 2 1 。另外还有其它真菌对木质素有分解能力，较为常见的菌种有 绿色木霉、木质素木霉、康氏木酶等。 降解木质素的原核生物以放线茵为主，如链霉菌属、节杆菌属、小单孢菌属和诺卡 氏菌等 2 3 1 。细菌中的厌氧梭菌、假单孢菌、不动杆菌和芽孢杆菌等原核生物对于在土壤 中木质素的转化和降解具有重要作用，但土壤中木质素的降解是土壤微生物区系多种类 型微生物协同进行的结果，其进程缓慢，且这类原核生物的多酚氧化酶是胞内酶，这也 决定了其在木质素降解菌的研究中处于一个相对从属的地位1 2 4 ) 。 另外，细菌在木质素降解过程中主要起着间接的作用，即细菌与软腐真菌协作使木 质素易于受到真菌的攻击，且可去除对腐朽真菌有毒性的物质【2 5 1 。而真菌在木质素降解 中起主要作用。真菌通过菌丝作用进入到木质材料中，同时菌丝分泌出特殊的胞外酶攻 击植物细胞壁中的木质纤维素，导致木质素与纤维素的解聚和溶解【2 2 1 。 1 3 1 1 降解木质素的真菌 根据真菌对木质纤维素中不同组分的腐朽类型可分为白腐茵、褐腐菌和软腐菌。前 两者都属于担子菌纲( b a s i d i o m y c e t e s ) ，软腐菌属于囊菌纲( a s e o m y c e t e s ) 或半知菌类 ( f u n g ii m p e c f e c t i ) 。 白腐菌是一种丝状真菌，它首先降解木质纤维素中的木质素，不产生色素，能在木 质材料中形成白色腐朽。目前，研究得较多的白腐菌有：黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h e t e c h r y s o s p o r i u m ) 、彩绒革盖菌( c o r i o l u s v e r s i c o l o r ) 、变色栓菌( t h a m e t e sv e r s i c o l o r ) 、糙皮 侧耳( p l e u r o t u so s t r e a t u s ) 、烟管菌( b j e r k a n d e r aa d u s t a ) 等t 2 6 - 3 们。 褐腐菌使木质材料中的纤维素受到侵蚀而对木质素的影响却极小，致使最终的降解 产物含有褐色的木质素成分。软腐菌降解多聚糖的作用优于降解木质素的作用，它一般 只能分解纤维素，木质素则被完整地保留下来。大多数软腐菌还可以从细胞腔向复合胞 间层产生腐蚀【3 i 】。由于后两者分解木质素的能力不强或没有，因此，对其研究报道也较 少。 白腐菌降解木质素的能力优于其降解纤维素的能力，它们首先使木材中的木质素发 生降解而不产生色素。而后两者降解木质素的能力弱于其降解纤维素的能力，它们首先 开始纤维素的降解并分泌黄褐色的色素使木材变黄褐色，而后才部分缓慢地降解木质 素。白腐菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，因此被认为是最主要的木质素降解微生物。 1 3 1 2 降解木质素的细菌 许多研究者相继在细菌培养基中检测到了木质素降解真菌产生的一些酶，尤其是木 质素过氧化物酶( l i p ) 。k a m o d a 等【3 2 】研究发现少动假单胞菌( p s e u d o m o n a sp a u e i m o b i l i s ) 7 桂林工学院硕士学位论文 1 m y1 0 0 9 产生木质均二苯代乙烯a ，d - 力口双氧酶。它能劈开木质素二聚物中的c 旺- c b 双 键，因此认为与木质素的生物降解有关系。b o m e m a n 等【j ) j 发现细菌能产生两类新的酶 阿魏酰脂酶和对香豆酰脂酶，这两种酶作用于木质纤维物质可产生阿魏酰和对香豆 酰，这种作用在草类物质细胞壁的生物降解中起着重要的作用。目前已肯定木质素降解 酶在细菌降解木质素过程中的催化作用，但有关产生酶的种类和能力还存在着许多争 议，这方而的研究有待继续。研究表明，细菌降解木质素发生在初级代谢阶段，木质素 降解酶的合成时间是在细菌生长的对数期和稳定期。 1 3 1 3 降解木质素的放线菌 放线菌对木质素的主要作用是在降解过程中增加木质素的水溶性促进它们的降解。 由于放线菌能穿透木质纤维素等不溶基质，在中性、微碱性土壤或堆肥中，放线菌参与 有机质的初始降解和腐殖化。其中链霉属的丝状菌降解木质素最高可达2 0 ，非丝状菌 在一定程度上也能引起木质素的降解，但对它们少有人注意。通常非丝状菌木质素降解 率小于1 0 ，只能降解木质素低分子量部分和木质素的降解产物。但其在降解过程中能 够增加木质素的水溶性，有研究表明在堆肥后期，放线菌对木质素降解起着主要作用【2 2 】。 1 3 2 木质紊降解酶 1 3 2 1 木质素降解酶的种类及特性 真菌是木质素降解的主要作用者，他们在木质素过程中能产生过氧化物酶 包括木 素过氧化物酶( l i g n i np e r o x i d a s e ，即l i p ) 、锰过氧化物酶( m n d e p e n d e n p e r o x i d a s e ，即 m l a ) 、漆酶( l a e e a s e ) 等与木质纤维素降解有关的生物酶。这些菌降解木质素主要发生 在次级代谢阶段，依靠木质素过氧化物酶( l i p ) 和锰过氧化物酶( m n p ) 等催化，靠酶触启 动一系列的自由基链反应，先形成高活性的酶中间体，将木质素等有机物( i m ) 氧化成许 多不同的自由基( r ) ，其中包括氧化能力很强的羟基自由基( o h ) ，产生具有化学不稳定 性的木质素自由活性中间体，然后发生一系列自发的降解反应，实现对木质素的生物降 解【3 4 1 。在木质素降解过程中，氧化反应占主要地位，但同时也需要还原反应的辅助。 ( 1 ) 木素过氧化物酶( l i p ) l i p 是第一个从黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p r i u m ) 发现的最早的木质素 降解酶，在木质素降解中起关键作用。l i p 的产生菌在自然界中分布相当广泛，许多腐 朽木材的白腐菌、褐腐菌都可以产l i p t 3 5 t3 6 1 。l i p 是代表一系列含f e 3 + 、卟啉环( i x ) 和血红素辅基的同工酶。