（生物物理学专业论文）模拟空间辐射对果蝇基因组和凋亡的影响.pdf

中文摘要 摘要 为研究空间辐射环境引起生物材料基因组和凋亡信号通路的影响，我们用2 个不同传能线密度( l e t ) 的1 2 c 6 + 粒子对红眼黑腹果蝇进行处理，2 个传能线密度 分别为3 0 k e v u m 和6 3 3 k e v u m 。在每一个传能线密度下又设计4 个不同的辐射 剂量组，分别为2 m g y ，2 0 m g y ，2 0 0 m g y ，2 0 0 0 m g y ，以此来模拟空间重粒子处 理，探究空间辐射对生物体的影响。 本实验以野生红眼黑腹果蝇为材料( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) ，分别选取4 对引物对野生型果蝇和辐射组果蝇进行a f l p 实验，实验结果表明：辐射组果蝇 突变率大于野生型；在辐射组中，传能线密度为6 3 3 k e v u m 实验组的突变率大于 3 0 k e v u m ，且在同一传能线密度时，随着辐射剂量的不断增加，突变率也随之增 加，在2 0 0 0 m g y 时辐射组果蝇的突变率与野生对照相比增加显著。同时，本次实 验共回收差异条带1 3 条，通过在g e n eb a n k 上的序列比对发现，其中6 条位于果 蝇染色体( 5 条位于常染色体，1 条位于x 染色体) ，4 条与果蝇的转座予相关， 推测转座相关机制可能参与模拟空间辐射诱导果蝇的突变。 本实验采用i h p c r 的方法对果蝇凋亡网络核心基因p 5 3 ，s k i ，r p r ，g r h n ， h i d ，d i a p l ，d i a p 2 的表达进行了分析，发现在受到2 0 m g y 、2 0 0 m g y 、2 0 0 0 m g y 的低剂量辐射以后，p 5 3 ，s k i ，r p r ，g r i m ，h i d 表达量与野生型相比出现了下调， d i a p l ，d i a p 2 的表达量上调，从而提示低剂量地面模拟辐会促进果蝇修复，抑制 果蝇凋亡。 关键词：模拟空间辐射；a f l p ；果蝇基因组；突变率；细胞凋亡基因 英文摘要 a b s t r a c t t of i n dt h ei n f l u e n c e sa b o u tg e n o m ea n da p o p t o s i so no r g a n i s ma f t e rs p a c er a d i a t i o n ， 1 2 c 6 + p a r t i c l ew i t hd i f f e r e n tl e t ( 3 0 k e v u ma n d6 3 3 k e v u m ) a n dd o s e s ( 2 m g y ， 2 0 m g y ，2 0 0 m g ya n d2 0 0 0 m g y ) v a l u e sw a sa d o p t e dt o r a d i a t ew i l dd r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r a f l pw i t h4p a i r so fp r i m e r sw e r eu s e di nt h ee x p e r i m e n to nt h ew i l dd r o s o p h i l a a n dt h er a d i a t e do n e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h ep o l y m o r p h i cf r e q u e n c yo fr a d i a t e d d r o s o p h i l aw a sh i g h e rt h a nt h ew i l do n e ；t h ep o l y m o r p h i cf r e q u e n c yo f6 3 3 k e v u m w a sh i g h e rt h a nt h a to ft h e3 0 k e v u m ，t h ep o l y m o r p h i cf r e q u e n c ye n h a n c e da l o n gw i t h t h er a d i a t i o nd o s ei nt h es a m el e tg r o u p ；i n2 0 0 0 m g yd o s e ，t h ed i f f e r e n c ei st h em o s t p r o m i n e n tb e t w e e nd i f f e r e n td o s eg r o u p s i nt h ee x p e r i m e n t ，13d i v e r s ef r a g m e n t sw e r e i s o l a t e da n ds e q u e n c e d ，6o ft h e mw e r el o c a t e do nd r o s o p h i l ac h r o m o s o m e s ( 5o nt h e e u c h r o m o s o m e s ，1o nt h exc h r o m o s o m e ) ，3o ff r a g m e n t sb e l o n gt ot r a n s p o s o n ，w h i c h i n d i c a t et h a tt r a n s p o s o nm a yb er e l a t e d 、i t ht h em u t a t i o ni n d u c e db yl o wd o s e r a d i a t i o n i nt h ee x p e r i m e n t ，r t p c tw a su s e dt oa n a l y z et h ee x p r e s s i o no ft h ek e ya p o p t o s i s r e l a t e dg e n e s ，i n c l u d i n gp 5 3 ，s k l ，r p r ，砌，h i d , d b t p l ，d l a p 2 t h er e s u l t sw e r et h a t ： t h ee x p r e s s i o no f p 5 3 ，s k i ，r p r ，矿砌，h i d , i nr a d i a t e ds a m p l e sw e r el e s st h a nt h ec o n t r o l g r o u p ；w h i l et h ee x p r e s s i o no fd l a p l ，d l a p 2i sh i g h e rt h a nt h ec o n t r 0 1 t h e s er e s u l t s s h o w e dt h a tt h el o wd o s es i m u l a t i o nr a d i m i o nc a nr e s t r a i nt h ea p o p t o s i sp r o c e s so f d r o s o p h i l a k e y w o r d s ：s i m u l a t i o ns p a c e r a d i a t i o n ；a f l p ；g e n o m eo fd r o s o p h i l a ； p o l y m o r p h i cf r e q u e n c ys t a t u s ；a p o p t o s i sg e n e 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 撰写成硕士学位论文：槿型窒间缉魁过墨蝇基固丝塑迥圭的毖啦：。除论文中已 经注明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体已经公开发 表或未公开发表的成果。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：数 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连海事大学有关保留、使用研究生学 位论文的规定，即：大连海事大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士 学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论 文全文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式 出版发行和提供信息服务。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文属于：保密口在年解密后适用本授权书。 不保密一( 请在以上方框内打“4 ，) 论文作者签名：视& 仅 导师签名： 日期：瑚7 年6 月扣日 模拟空间辐射对果蝇基冈组和凋亡的影响 引言 近几年来随着我国载人航天航空技术的不断发展，特别是在神舟五号、神舟六 号载人飞船的成功共发射以后，人们逐渐地意识到空间辐射已经成为了限制卒问探 测的主要因素，同时空间辐射已经被证明是一种广能量谱的低剂量辐射，因此低剂 量模拟空间辐射就成为了人们研究空间辐射的一种良好的实验手段，因为这样就可 以克服空间辐射实验的许多限制因素。利用低剂量模拟空间辐射实验再结合有限的 空间飞行机会就可以帮助我们更好的探索空间辐射规律，同时将利用模式生物所得 到的实验结果外推到人体就可以帮助我们更好地制定空间辐射防护方案，有效地做 好航天员的安全保障工作。 本实验采用野生型红眼黑腹果蝇作为实验材料，研究低剂量模拟空间辐射对果 蝇基因组造成的影响，同时考察低剂量模拟空间辐射对果蝇凋亡的影响，来分析低 剂量辐射对果蝇造成的影响，从而进一步揭示低剂量辐射的规律，最终为! 航员的 低剂量空间辐射防护提供基础实验研究数据。本次实验使用a f l p 分子标记技术分 析受到模拟空间辐射的果蝇基因组，同时采用r t - p c r 的实验手段分析模拟空间辐 射果蝇凋亡相关基因的表达，得到了一定的实验结果，希望通过本次实验可以更好 地说明低剂量辐射规律，探讨空间辐射生物学的效应，从而帮助我们更好揭示空问 辐射的机理。 第1 章绪论 1 1 模拟空间辐射 第1 章绪论 1 1 1 模拟空间辐射概述 随着科技水平的不断进步，空间环境已经成为了人类探索的一个新兴领域，空 间环境有着不同于地面环境的特点，除了接近真空、微重力和弱磁场以外，最为重 要的是它还存在着太阳辐射和强电离辐射，其中强电离辐射又是宇宙众多复合因 素之中的关键。人们通过实验发现模拟空间辐射可以在一定程度上帮助我们研究空 间辐射的规律，因此模拟空间辐射作为一种新兴的补充实验手段得以快速的发展。 模拟空间辐射就是利用地面的高能粒子加速器对不同的生物材料进行辐射处 理，从而研究辐射对生物体损伤的一种实验手段。空间辐射环境是一个极其复杂的 综合环境，不仅粒子种类多、能量分布广，而且还有微重力、高真空等复合环境因 子的共同作用，地面条件难以完全模拟这样复杂的环境，因此仍然需要利用空间飞 行的机会开展相关研究工作，但是开展空间辐射实验受到比如技术、成本、资源等 多方面条件的限制，实验机会非常有限，而与此同时，模拟空间辐射实验又存在着 许多优点，因此模拟空间辐射虽然不能完全模拟空间复杂环境，但是由于单一辐射 因素的生物学效应研究具有较高的可信性，所以模拟空间辐射也是目前研究空间辐 射的一种必备的补充实验手段。模拟空间辐射主要存在如下优点：第一，模拟空间 辐射的实验变量易于控制，可以选择不同的重金属离子作为辐射的粒子源，同时辐 射的能量范围可控，可以根据不同的实验需求实现从几个电子福特到几十兆电子福 特的能量变化，在一次实验中可以实现从辐射粒子种类到辐射剂量的全控制；第二， 与空间辐射实验的高成本、高技术要求相比，模拟空间辐射实验成本相对较低，而 且不需要航天航空技术作为支持，只需要高能粒子加速器就可以完成相关实验；第 三，模拟空间辐射实验可以进行多次实验重复，从而为实验提供更加全面、可靠的 数据；第四，模拟空间辐射实验不用考虑成载重量，可以进行大样本量的实验，从 而避免了空间辐射实验在样本量上的不足的缺陷，为实验提供了更多、更细的分组 模拟空间辐射对果蝇基因组和凋亡的影响 可能，保证实验结果可以真实的反映科学问题。因此，模拟空问辐射是研究空间辐 射的一个非常必要的途径，同时也是目前各国丌展空间辐射生物学研究的重要手段 之一。 模拟空间辐射的发展主要是伴随着高能粒子加速器的发展而同步进行的，j f 是 高能粒子加速器的不断发展才使得模拟空问辐射实验成为了可能。模拟空间辐射实 验装置简单来说就是一套以粒子加速器为核心的实验设备。粒) - d n 速器是利用电场 来推动带电粒子并且使之获得高能量的设备。粒子加速器有两种基本型式，环形加 速器和直线加速器，其中比较常见的是环形加速器，即所谓的回旋加速器。目前世 界上比较先进的空间辐射模拟实验装置主要有德国的重离子研究中心( g s i ) 、美国 b r o o k h a v e n 国家实验室( b n l ) 、同本放射线医学研究所( n i r s ) ，以及我国兰州 的重离子加速器( h i r f l ) 【2 j 。这些粒子加速器可以为实验提供不同类型的霞离子在 多个传能线密度下( l e t ) 彳 j 司剂量的辐射，粒子能量最多可以达到儿白兆电子伏 特，从而满足不同模拟空间辐射实验对于辐射参数的要求。所谓传能线密度是指直 接电离粒子在其单位长度径迹上消耗的平均能量，生物效应大小与l e t 值有重要关 系，一般说来，l e t 值越大，生物效应亦越大。目前模拟空间辐射实验所选取的材 料通常都为模式生物，世界卜公认的用于生命科学研究的常见模式生物主要有酵母、 线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、水稻、拟南芥等等【3 j 。 1 1 2 空间环境与模拟空间辐射 空间物理环境与地面相比存在着很大的区别，其主要特征有：强辐射、微重力、 弱磁场、高真空、无昼夜变化、超净环境和温差大等等。其中空问环境中的强辐射 和微重力是其中具有强生物学效应的两个重要因素。空间辐射是在空间飞行中导致 生物体损伤的主要因素之一，严重危害着空问飞行的安全，因此对于空间辐射对生 物机体辐射效应的研究就成为人类探索空间环境的一个重要方面。空间辐射是不同 于地面辐射的，它不是一个单因素的辐射，而是一个由多种射线组成的复合型辐射 效应，空间辐射根据其辐射来源不同可以分为太阳宇宙射线( s p e ) 、银河宇宙射线 ( g c r ) 和地球辐射捕获带( v a na l l e nt r a p p e d ) 【4 5 】。太阳宇宙射线由太阳粒子事 件、太阳耀斑和日冕质量喷射产生的高通量带电粒子组成，能量范围一般为1 m e v 一- 第1 章绪论 1 0 g e v ，大多数在1 m e v - - 几百g e v 。银河宇宙射线是指来自太阳系外银河系的高 能粒子，由电子和元素周期表中所有原子核组成，元素周期表中前2 8 种的核离子是 它的丰要成份，其中丰度最大的是质子，约占8 8 ；其次是0 【粒子，约为1 0 ；其 余部分为重核子。粒子的能量范围约为4 0 m e v - - - 1 0 t e v ，平均能量约为3 5 0 0 m e v 。 地球周围一定的空间范围内存在着大量被地磁场捕获的高能带电粒子，此捕获区称 为地球辐射带( 又称v a na l l e n 辐射带) 。通常分为内辐射带和外辐射带，内辐射带距 地面较近，中心位置高度为3 0 0 0 k m - - - 1 r e 左右( 其中r e 为地球半径) ，纬度范围在南 北纬4 0 0 之间；外辐射带的空间分布范围较广，中心位置约3 5 r e - - 一5 r e ，纬度约在 南北纬5 5 0 - 7 0 0 之间。在辐射带区域内的带电粒子运动状态和空间分布强烈地受地 磁场控制，并随地磁场的变化而变化。 空间辐射与地面接受到辐射的最大区别在于，宇宙辐射包含原子序数1 9 2 各元 素成分的粒子辐射，能量谱也从几个电子伏特到超过1 0 2 0 电子伏特，可以说是一种 高能量、广剂量的辐射效应，在空间环境的电离强辐射中，质子的数量是最多的， 其次便是高原子序数高能量( h z e ) 粒子，也可以称为高能重离子【6 】，但是其中对于辐 射生物影响和贡献率最大的是高能重离子，高能重离子也是最重要的辐射因子【_ 7 1 ， 此外空间辐射还包括一些0 【粒子及其它的低能量的重粒子，这些粒子的能量范围一 般在1 0 m e v 到2 0 0 m e v ，对生物体造成的影响十分有限。正是因为高能重粒子是空 间环境产生诱变效应的最主要因素，而且它会对生物体基因组水平造成不可恢复性 的损伤，因此我们可以利用高能量重离子的模拟空间辐射来研究空间辐射对生物体 基因组造成的影响。模拟空间辐射可以很好的为我们提供各种不同能量、不同种类 的重离子辐射，可以很好的模拟空间环境下高能重离子对生物体的辐射效应，虽然 只是一种单因素的模拟辐射但是对于研究空间辐射效应还是有着很重大的意义，尤 其是用模式生物开展的模拟空间辐射实验，使我们可以获得更多对人体有参考意义 的资料，同时也为我们提供很多的实验数据，从而便于我们更好的研究空间辐射对 人体的损伤效应。所以说模拟空间辐射提供的高能重离子辐射可以帮助我们发现空 间辐射损伤效应的一些现象，从而揭示空间辐射的损伤机制。 模拟空间辐射对果蝇基因组和凋亡的影响 1 1 3 模拟空间辐射的诱变效应 模拟空间辐射主要是利用重离子对实验材料进行辐射处理，从而研究重离子辐 射对生物材料产生的诱变效应，这种诱变效应主要是指辐射对生物体造成的损伤效 应，以及材料的物理或化学性质因受到电离辐射而引起的有害变化，主要包扩对机 体的整体损伤、细胞水平的损伤以及分子水平的损伤。 对于机体的整体损伤主要是指机体在受到辐射诱变以后产生的整体损伤效应， 比如宇航员在经过太空飞行以后，空间辐射会对其身体器官产生不同程度的损伤， 同时机体在受到辐射以后其整体代谢水平也会发生变化，同时免疫系统也会随之发 生相应的变化。当人体吸收辐射能量以后，体内分子产生电离和激发，其直接作用 就是使大分子的某些链断裂，使大分子遭到损伤，然后会持续发展变化，这些变化 主要包括分子、细胞功能、代谢或结构的变化以及完整机体各组成部分之间的变化 等，既彼此不同，又相互制约，有些异常迅速，有些可延续数年。对于细胞水平的 损伤主要是指，辐射会影响生物体的细胞生长、发育，会改变细胞周期，造成细胞 周期的阻滞引起细胞分裂的障碍，同时辐射还会对细胞的程序性死亡过程产生。定 的影响，当然这也与细胞本身对辐射的抗性有关，很多文献都曾报道，辐射会对调 控细胞凋亡基因的表达量产生影响，高剂量的辐射甚至会直接将细胞杀死【8 j ，d e e p a s r i k a n t a y e 也曾报道对于低剂量辐射引起的g 2 m 阻滞来说，其中a t m 和m r e l1 基 因起着非常重要的作用【9 】。分子水平的诱变效应主要是指辐射对生物体d n a 造成的 损伤，这也是辐射对生物体最主要的诱变效应。 辐射对于d n a 的损伤主要包括：直接损伤和间接损伤，其中其中起主要作用的 是直接损伤，直接损伤主要包扩如下两个方面：第一，d n a 结构的损伤：包括碱基本 身的损伤，链的断裂和交联。此外，d n a 分子的二级和三级结构在受到辐射后也会 出现变化，会出现碱基的错配或缺失。d n a 大分子还会发生变性和降解，d n a 变 性是指其氢键断裂，双螺旋结构解开，而d n a 降解伴有多核苷酸链内共价键断裂， 分子量降低，d n a 结构的破坏通常伴有性质的变化，比如粘度的下降：第二，d n a 代谢和功能的变化：比如辐射导致d n a 合成受抑制，引起d n a 的生物学功能的改 变，诸如转化活力、转录活性和复制能力等都将发生变化。问接损伤主要是指辐射 第1 章绪论 所引起生物体基因组的不稳定性。基因组不稳定性是d n a 接受损伤因素作用后重要 的生物学效应，它不仅使受损细胞的损伤敏感性提高，加速损伤，而且具有传递性， 即基因组不稳定性所致的遗传效应并不是直接出现在受照细胞本身，而是以加强自 发突变的形式表现在受照细胞的子代细胞中，也就是说辐射使子代细胞中的突变频 率增加，但是却表现出滞后的遗传变化【】们。 总而言之，模拟空间辐射会对生物体产生多方面的诱变效应，这些诱变效应在 有时候是对生物体有益的，但更多的时候却是对生物体有害的，因此充分利用模拟 空间辐射研究其辐射损伤机理就可以帮助我们理解辐射生物损伤与修复的机制，从 而为充分利用空间辐射资源，同时减轻辐射对人体的损伤提供理论依据。 1 1 4 低剂量辐射效应 人们早期关于辐射的研究主要集中在大剂量辐射的损伤效应方面，低剂量辐射 由于观察现象存在不确定性和研究的难度较大而被人们所忽略，近几年来随着人们 对于辐射研究的不断深入，低剂量辐射效应已越来越受到人们的关注，因为与大剂 量照射事件或事故的发生相比，人群受到低水平辐射暴露的几率要更大，同时空间 环境中的辐射效应是一种高能量、低剂量的辐射，因此人们开始将更多的注意力转 移到低剂量辐射效应上。 低剂量辐射通常是指辐射剂量小于2 g y 的辐射，众所周知大剂量的辐射会对生 物体造成不同程度的损伤，但是大量研究表明低剂量辐射会对生物体造成一些特殊 的影响，会对细胞功能和机体免疫造成影响。比如：r o t h k a m m 的实验就表明几个毫 g y 低剂量照射，可以使处于非分裂增殖状态细胞，产生的双链断裂，并且这种断裂 可以维持数天时间不被修复，表现出d n a 断裂损伤的滞留性，这种滞留性是在大剂 量辐射中所观察不到的i l ，同时有许多研究表明，细胞在受到低剂量辐射时，细胞 凋亡是其死亡的主要形式，一些基因或蛋白，如p 5 3 ，b c l 2 的表达水平会出现显著的 变化1 12 1 。此外，细胞对低剂量辐射也存在着超敏感性，所谓超敏感性是指一定范围 的低剂量照射所表现出来的单位剂量的急性损伤效应比较高剂量照射损伤的更大， 产生这种效应的剂量大小通常在0 2 - - 一0 5 g y 范围，此后，随着剂量的增加，细胞对 模拟空间辐射对果蝇基因组和凋亡的影响 辐射的诱导抵抗性也相对增强，因而出现增加的辐射耐受性现象。低剂量辐射还会 对机体的免疫功能产生影响，适宜的低剂量辐射可以明显增强细胞免疫功能受损的t 淋巴细胞d n a 、蛋白质的合成能力，使机体在对抗外界病原入侵时有更加的迅速免 疫反应。在许多研究中，对产生肿瘤有显著效应的最低急性剂量在1 0 0 2 0 0 m g y 范 围内，慢性照射后引起癌症危险有显著增加的最低剂量通常高于急性照射剂量，也 就是说急性照射需要更大辐射剂量才能够引起机体的癌变效应，因为低剂量率辐射 降低了诱发癌症的有效性。但是由于物种问的敏感性不同，因此相同的低剂量辐射 对不同的物种会造成不同的影响，而且这种辐射效应也会随着生物体的不同发育时 期而改变，比如同样的低剂量辐射就会对果蝇的卵和幼虫造成不同程度的影响。 此外，还有报道显示低剂量辐射会引起机体的兴奋效应，所谓兴奋效应是指， 机体或者细胞在预先接受低剂量刺激后，随后一定时间内能够对大剂量辐照产生一 定的保护作用，也就是说低剂量辐射可以更好的修复后续大剂量辐射造成的损伤， 对机体产生一定程度的保护作用。例如，l u c k e y 首先提出小剂量辐射兴奋效应的概 念，并且认识到并非任何低剂量辐射都对健康有害，适宜的低剂量辐射对人体存在 有益作用 1 3 j 。 生命的特点就是可以对刺激作出响应，若刺激过于强烈，则生命体就会以应激 的甚至病态的反应来应答。对于低剂量辐射的正效应，即是辐射的新认识，又是医 疗应用和临床治疗提供了新手段。低剂量辐射具有与高剂量辐射迥然不同的细胞和 分子机制，其对免疫系统的兴奋效应和刺激作用早为人们注目，目前对于低剂量辐 射适应性反应对辐射组织损伤的保护效应以及与机体免疫系统的生物学效应研究报 道还不多见，随着空间计划的研究和进行，人们越来越多地接触到低剂量重离子辐 射。 1 1 5 模式生物与模拟空间辐射 目前模拟空间辐射实验所选择的实验材料多为模式生物，因此这里就有必要提 到模式生物学效应。所谓模式生物就是指人们研究生命现象过程中，长期和反复作 为研究材料的物种，比如海胆、果蝇、线虫、拟南芥等等。模式生物通常有如下的 特点：第一，生理特征能够代表生物界的某一大类群体，从中获得的结论可以得到 第1 章绪论 推广，并且应用到其他类似的生物体中；第二，容易获得并易于在实验室内饲养繁 殖，这就为实验室开展大规模实验提供了基础；第三，容易进行实验操作，特别是遗 传学分析，因此清楚的遗传背景也是模式生物的一个特征。模式生物在辐射生物学 的研究中有着重要的意义，特别是随着功能基因组计划的开展，多种模式生物的基 因组序列已经获得，这就为基因功能的深入研究打下了坚实的基础。 所谓模式生物学就是指用模式动物进行辐射效应的研究，这种研究可以获取对 人体有参考意义的资料，为正确评估人在空间的辐射风险以及辐射防护的建立提供 基础和依据。现在地面用小鼠或大鼠进行了很多模拟辐射实验，研究了重离子剂量 与致癌率的关系，实验表明：用5 6 f e 辐照人表皮细胞后几个月，会有一个恶性转化 的过程，这种辐照可以在裸鼠中形成瘤。但是对于低剂量的5 6 f e 却没有这种效应。 用低l e t 辐照时，经过低剂量5 6 f e 处理的人体表皮细胞会对肿瘤发生易感【1 4 】。所以 说很多从模式生物上得到的结论会有助于我们更加深刻地理解关于人体的相关情 况。 随着辐射生物学的不断发展，这种将模式生物和模拟空间辐射相结合的研究方 法已经被越来越多的科学家所接受，因为它不仅可以提供辐射效应的相关参数，而 且还能为辐射防护提供很多有效支持。所以说，有关模式生物的研究必将继续为人 类探索生命规律的调控机制做出更大贡献，最终帮助我们真正了解我们最关心的模 式生物一人类。 1 2 果蝇模拟空间辐射的分子生物学研究 1 2 1 果蝇作为实验材料的优点 果蝇属于果蝇科果蝇属双翅目的昆虫，近几年来随着人们研究的不断深入，果 蝇作为一种重要的模式生物已经称为了生物界新的宠儿。果蝇之所以会成为辐射生 物学重要的模式生物是与其自身的独特优点分不开的。首先，果蝇的全基因组不大， 而且果蝇基因组测序工作已经完成，果蝇全基因组大小约1 8 0 m b ，大约6 1 的已知 人类疾病相关的基因与果蝇同源，5 0 果蝇的蛋白质序列与哺乳动物是同源【1 5 】，而 且果蝇染色体数量少，只有8 条，便于实验观察，常被用于研究伴性遗传，美国生 - 8 一 模拟空间辐射对果蝇基冈组和凋亡的影响 物学家摩尔根就曾利用这一性状研究基因的连锁与互换定律；其次，果蝇的生 命周期短，繁殖能力强，幼虫在经过2 4 小时发育后就会发生第一次蜕皮，并且f i 断 生长，以到达第二幼体发育期。经过三个幼虫发育阶段和四天的蛹期，在2 5 f 过 一天，就会发育为成虫。果蝇的生命周期大约是2 周，经历了从卵到幼虫再到蛹最 后到成虫的过程，因此可以在很短的时间内对多个世代进行研究【l6 1 ，是研究遗传的 良好材料；第三，果蝇的个体很小，雌性体长2 5 毫米，雄性较之还要小，成年果蝇 平均体重约为2 0 m g ，同时果蝇对于环境的要求不是十分苛刻，在异常的温度环境下 也可以维持机体，可以在逆境下生存【l ，尤其是处于卵和幼虫阶段的果蝇对于营养 的消耗很低，容易存活，因此在空间飞行时只需要很少的空问和资源需要就可以携 带较多量的果蝇，这样即可以满足在研究样本量上的要求同时又方便对照组的设置， 为准确全面反应真实的结果提供了保证；第四，果蝇具有与人类相似的先天性免疫 系统l 埔j ，免疫学家称此为“先天”，是因为这防卫力似乎是所有动物天，l 二都具仃 的，所谓先天免疫就是指生物体内没有b 细胞和t 细胞，但是却可以识别相关病原 分子，然后受体激活血淋巴的蛋白酶和细胞内的信号转到途径，引起的免疫反应。 在黑腹果蝇中存在着8 种不同的t o l l 受体【l9 。，同时果蝇还具有完善的神经系统，果 蝇的整个中枢神经系统大约分布了3 0 0 ，0 0 0 个神经元，可以帮助我们研究由于辐射所 导致的神经系统的发育与损伤，以及免疫相关基因表达量的改变情况。综上所述， 果蝇是进行辐射生物学研究的良好模式材料，而且已经被许多国家运用在辐射生物 学多个领域的研究之中。 1 2 2 果蝇辐射相关研究进展 红眼黑腹果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 是一种良好的模式生物，凶此有很多 人从事关于果蝇辐射的相关研究，目前研究主要集中在辐射后行为、形态上的变化、 生理指标的变化、基因组层面的变化以及蛋白质组水平的变化。而且对与果蝇辐射 研究的辐射源也是多种多样的，常见的有紫外线( u v p 、u v c ) 、x 射线( x r a y ) 、 重金属粒子等等，作为一种热门的实验材料，d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 的序列在 s c i e n c e 上的发表已经占有了举足轻重的地位，成为9 0 年内组织研究的单程碑，f 面就按照辐射源种类的不同，详细介绍一下果蝇辐射研究的主要进展。 第l 章绪论 首先介绍紫外线，紫外线是电磁波谱中波长从o 0 1 0 4 0 微米辐射的总称，也 是目前研究果蝇辐射的一种常见的粒子源。之前很多文献都曾报道，紫外线辐射会 对果蝇的基因组产生定影响，主要包括：紫外辐射会损伤果蝇基因组d n a ，从而 引起更多的细胞凋亡【2 0 1 ，同时a r k 基因对于辐射引起的细胞凋亡来说是必须的【2 l 】。 紫外线辐射还会引起果蝇视网膜细胞中h i d 基因表达量的上调【2 2 1 ，此外紫外辐射还 会引起果蝇基因损伤修复水平的变化，造成损伤修复能力的增强【2 3 1 ，另外紫外辐射还 会对果蝇寿命、繁殖力、求爱行为和一些生理生化指标造成不同程度的影响，有文 章曾报道低剂量的紫外辐射会引起果蝇寿命的延长【2 4 】。紫外辐射还会对果蝇的细胞 结构产生影响，低剂量、短时间的紫外辐射会影响果蝇幼虫的细胞形态，并且影响 果蝇的细胞分裂1 2 5 1 。 其次，目前在果蝇辐射方面还有许多外国的科学家从事关于x 射线辐射对果蝇 影响的一系列研究，x 射线具有很强的穿透力，能激发荧光、使气体电离。目前的 研究主要集中在一些果蝇细胞凋亡和部分信号通路的研究，结果证明x 射线会对果 蝇染色体造成影响，使果蝇染色体的重组、迁移频率增加，并且造成染色体稳定性 的变化【2 6 , 2 7 1 ，同时x 射线会引起果蝇x 染色体上某些基因的不稳定甚至会诱发基因 突变，并且随着辐射剂量的增加突变率也成正相关趋势变化( 2 8 j 。 除此之外，使用重金属粒子作为辐射源对果蝇进行不同剂量的辐射实验，也是 目前比较热门的种实验思路。大量的实验结果证明电离辐射可以影响果蝇的细胞 凋亡过程，从而影响果蝇的寿命。而且m e d l ar o s a 就曾经在文章提到，低剂量辐射 会增加果蝇的寿命和提高果蝇的生育能力【2 9 】，而且这种对亲代果蝇的辐射是会对子 代造成影响的【3 0 j ，虽然这种影响是会随着世代的增加而逐渐减弱的。电离辐射还会 对果蝇的信号传导通路产生影响从而影响果蝇的免疫系统，比如t o l l 受体信号传递 的通路，t o l l 受体家族是从苍蝇到人类进化中保留下来的保守家族，在启动细胞固有 免疫应答中发挥中心作用【3 1 1 。此外，国际上也有人在做关于重金属粒子引起果蝇s n p 的实验，主要是通过s n p 实验确定果蝇中的点突变，实验结果证明重组s n p 活性更 高，但是s n p 在果蝇的凋亡中并不起主要的作用，而只是一种辅助作用【3 2 , 3 3 】。一些 模拟空间辐射对果蝇基冈组和凋亡的影响 研究果蝇表观遗传学的文献报道，在果蝇的基因组中d n a 的甲基化与转座子的控制 有关，d n a 的甲基化可以改变部分基因的表达量f 3 4 】。 关于果蝇的空间辐射研究，在国际上，主要是n a s a ( 美国国家航天航空局) 和 e s a ( 欧洲航天局) 从事相关研究。目前美国国家航天航空局己开始对航天辐射引 起的辐射早期以及急性损伤和辐射对生殖、不育和遗传的危害等辐射生物效应进行 了系统的研究m 】。n a s a 每年都在空间辐射以及模拟空间辐射方面投入大量的人力 物力，2 0 0 6 年7 月，美国n a s a 在其发射任务中携带数千只果蝇和部分微生物进行了 为期1 2 天的空间飞行实验，以此研究空间环境下果蝇免疫系统的改变以及与这些有 可能发生改变的微生物之间的相互作用。同时，国外的许多科学家也在从事关于果 蝇辐射的研究，主要集中在紫外线和重金属粒子辐射引起果蝇基因组水平变化的方 面。 国内关于果蝇的空间辐射方面的研究尚处于起步阶段，关于空间辐射方面的研 究主要是以植物作为对象，主要是集中利用各种返回式卫星和神舟飞船系列，通过 搭载模式生物材料与空间辐射生物探测仪，进行天基( 不同天的低轨道飞行) 和地 基( 1 ，辐射和各种传能线密度重离了模拟辐照) 研究。本实验时曾经对神舟6 吁匕_ | | 搭载的水稻品种珍珠红、莲粳2 号及越光的当代材料，应用a f l p 技术进行基因组 水平变化分析，三个品系中分别检测到1 0 6 1 、9 3 3 、1 0 5 4 个位点，其中，兰个品种 的基因组突变率分别为3 4 1 0 1 、3 3 8 5 及4 0 一1 0 1 。从国内外发展趋势 来看，辐射生物学研究将更多的选用已知遗传背景的动物模式生物材料，从天基和 地基两个平台上进行研究，探讨空问辐射生物学效应与机制。 由于果蝇自身存在着很多生理和形态上的优点，因此利用果蝇开展的辐射研究 已经成为一个热门领域，本论文综合考虑了国内外利用果蝇进行的辐射研究进展， 对果蝇低剂量辐射效应的研究有一定的指导意义，同时也为辐射生物学研究提供了 借鉴的依据。 1 2 3 辐射对果蝇凋亡影响的研究进展 凋亡( a p o p t o s i s ) ，也叫做细胞程序性死亡( p r o g r a m m e d c e l ld e a t h ) ，是指体 内的健康细胞在特定的细胞外信号诱导下，其死亡途径被激活，于是在有关基因的 第l 章绪论 调控下发生的死亡。凋亡过程对于生物体来说具有极其重要的意义：首先，凋亡是 个体发育模式形式的需要，比如果蝇在变态发育的过程中就需要依靠凋亡来完成中 肠和唾腺器官的形成；其次，凋亡可以根据需要调节细胞数量，使机体处于一种平 衡状态：第三，保持成体器官的正常体积，机体中的很多器官体积都与细胞数有密 切关系，正是由于凋亡的存在爿使得器官可以保持j 下常体积；第四，更新衰老的细 胞，这对于机体有着十分重要的作用，只有衰老的细胞不断被更新才。能使机体处于 健康状态。 凋亡最早在线虫中被发现，随着人们研究的不断深入人们逐渐发现了很多与果 蝇相关的凋亡通路，目前辐射对果蝇细胞凋亡影响的研究已经成为了一个热点问题 很多文献证明低剂量的辐射会引起果蝇细胞水平的变化，会造成果蝇细胞凋亡的变 化，所谓细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自 动结束生命的过程，细胞凋亡可以清除无用或者多余的细胞，也可以除去一些发育 不币常或者有害的细胞，细胞凋亡是一种毛动的细胞代谢过程。动物的大多数细胞 在发育的某一阶段都会有一种有秩序的、受到控制的、有预定程序的生理性死亡过 程，因此细胞凋亡又称为细胞程序死亡。细胞程序死亡与病理死亡有根本的区别， 细胞程序死亡最明显的形态学变化是细胞变圆，细胞核及胞质浓缩，染色质浓缩， d n a 降解成寡聚核苷酸片断。细胞凋亡是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自 t 的、有序的、为更好地适应环境而主动采取的一种死亡，涉及到一系列基因的激 活、表达及调控等作用。细胞凋亡的过程大致可分为四个阶段：第一阶段凋亡信号 的转导，当细胞内外的凋亡诱导因素与被作用的细胞受体结合后，细胞产生复杂的 生化反应，并形成与凋亡有关的第二信使：c a m p 、c a 2 + 、神经酰胺等信号分子形成 死亡信号；第二阶段凋亡基因的激活，调控的凋亡基因在接受死亡信号后，开始按 预定程序启动，并合成执行凋亡所需的各种酶和相关物质。第三阶段凋亡的执行， 它是凋亡的核心步骤，主要是完成细胞内物质的分解，执行凋亡过程主要依靠两类 酶，分别是核酸内切酶( e n d o g e n o u sn u c l e a s ed n a s e ) 和蛋白激酶家族( c a s p a s e s ) 。 核酸内切酶的主要作用是，彻底破坏细胞的生物命令系统，而蛋白激酶的主要作用 模拟宅间辐射对果蝇基冈组和凋亡的影响 是使细胞的结构全面解体，最终完成细胞凋亡过程；第四阶段凋亡细胞的清除，凋 亡后细胞可以被邻近巨噬细胞分解。 对于果蝇的凋亡来说起最主要调控作用的是g r i m 、s k i 、h i d 、缈所编码的蛋白， 此外它们所编码的蛋白还会影响凋亡蛋白抑制因子d l a p l 和d i a p 2 ( i n h i b i t o ro f a p o p t o s i sp r o t e i ni nd r o s o p h i l a ) 及半胱氨酸蛋白酶c a s p a s e 的活性，从而直接影响 果蝇的凋亡，因此g r i m 、s k l 、h i d 、，矽这四种基因就是果蝇调控中的核心基因【3 5 | 。 在果蝇中凋亡诱导因子r e a p e r 、h i d 和g r i m 是细胞凋亡发生所必须的，它们整合和 转换许多不同的细胞死亡信号，阻止果蝇中凋亡蛋白抑制因子的功能，激活细胞凋 亡的半胱氨酸蛋白酶c a s p a s e 途径。r e a p e r 、h i d 和g r i m 分别位于果蝇3 号染色体的 7 5 c 1 1 、2 基因座中，其中r e a p e r 编码6 5 个氨基酸残基、h i d 编码4 1 0 个氨基酸残基、 g r i m 编码1 3 8 个氨基酸残基。果蝇的细胞凋亡过程主要依靠c a s p a s e 家族酶活性的 激活，而c a s p a s e 家族酶活性的激活是受到d l a p l 、d l a p 2 蛋白的抑制，g r i m 、j 肼、 h i d 、缈所编码的蛋白可以结合到d i a p l 、d i a p 2 蛋白，从而阻止d i a p l 、d i a p 2 蛋白对c a s p a s e 家族酶活性的抑制，因此换句话说果蝇体内的凋亡蛋白抑制因子能 阻止细胞内c a s p a s e 的诱导活性，r e a p e r 、h i d 和g r i m 则可以与d i a p l 、d i a p 2 形 成复合体，阻断其抑制功能，打开c a s p a s e 途径，从而引起果蝇的细胞凋亡过程【3 6 3 7 1 。 虽然凋亡诱导因子r e a p e r 、h i d 和g r i m 可以各自独立地诱导果蝇细胞凋亡，但是它 们的作用机制并不相同，g r i m 的n 末端可以抑制果蝇凋亡蛋白抑制因子的活性， r e a p e r 有一个与g r i m 相似的g h 3 结构域，它的功能与g r i m 的g h 3 结构域相似， 对自身在线粒体的定位和激活凋亡蛋白抑制因子的降解发挥作用【3 引。综上所述在果 蝇的凋亡过程中g r i m 、s 肼、h i d 、r p r 、d l a p l 、d l a p 2 是处于核心地位的6 种凋亡调 控基因，其中g r i m 、s k i 、h i d 、缈对凋亡起促进作用，d l a p l 、d l a p 2 对凋亡起抑制 作用。因此我们主要选取g r i m 、s k l 、h i d 、r p r 、d l a p l 、d l a p 2 作为我们考察的基因。 因此本实验除了考虑到辐射对果蝇基因组的影响之外还打算从果蝇细胞凋亡入 手，因为很多文献都报道过辐射甚至低剂量辐射会引起果蝇细胞凋亡过程的变化， 但对于变化的规律和原因都没有给出足够的分析，因此本实验打算考查低剂量辐射 对果蝇细胞凋亡相关基因表达量的影响，从而揭示辐射对果蝇细胞凋亡造成影响的 第1 章绪论 真正原因。g r i m 、s k i 、矗耐、印，4 种基因被公认为果蝇细胞凋亡调控的核心基因【3 9 4 0 】， 因此考察果蝇中这4 种基因表达量的变化情况就可以从侧面反映出低剂量辐射对果 蝇细胞凋亡水平的影响。c e d 3 、c e d 4 、c e d 9 三种蛋白被认为是哺乳动物细胞凋亡 中的核心蛋白，在哺乳动物的细胞凋亡过程起着非常重要的作用，目前在果蝇中已 经发现了同源的c e d 3 蛋白，同时也发现了与c e d 9 结构相似的蛋白，因此说明果 蝇的细胞凋亡与哺乳动物有着很大的相似，对于果蝇细胞凋亡的研究也将有助于我 们更好的揭示哺乳动物细胞凋亡的全过程。 说道细胞凋亡就不能不谈至i j p 5 3 蛋白，正常的p 5 3 蛋白通过介导细胞周期阻滞和 细胞凋亡等途径对细胞增殖发挥负调控作用，并促进细胞分化，同时p 5 3 对于维持遗 传物质的稳定性，也发挥极其重要的作用。p 5 3 蛋白可以激活下游凋亡起始基因的表 达从而诱导细胞发生凋亡以清除损伤细胞，同时p 5 3 也介导细胞周期阻滞，在细胞发 生d n a 损伤时，p 5 3 蛋白首先会诱导细胞发生g 期阻滞，以便有足够的时间修复损伤， 这种对于细胞凋亡和细胞周期阻滞的双重效应使的p 5 3 成为机体修复的关键基因。 p 5 3 基因在哺乳动物的细胞凋亡过程中有着重要的地位，p 5 3 基因是一种肿瘤抑制因 ，果蝇中也存在着3 基因，在果蝇的细胞凋亡中，p 5 3 基因也起着比较重要的作 用，在低剂量辐射下，p 5 3 不仅作为抑癌基因对肿瘤细胞的生长增殖进行调控，而且 可以通过增强肿瘤细胞的低剂量放射超敏感性来加强对肿瘤细胞的杀伤。在果蝇