（环境工程专业论文）松花江流域底泥真菌的分类与鉴定.pdf

摘要 摘要 本文运用聚合酶链式反应( p c r ) 与变性梯度凝胶电泳技术( d g g e ) 相结合对 松花江底泥中的真菌群落结构进行了研究，在全面了解了松花江流域四大干流 底泥真菌多样性的基础上，以现代分子生物学手段对松花江流域优势性和特异 性底泥真菌进行了分类与鉴定。与传统的微生物培养技术相比，该方法可获得 更全面的真菌群落结构信息，克服了传统方法中因培养条件的限制而致使大量 真菌无法被分类、鉴定的缺陷。该方法还具有快速、全面、灵敏度高的特点， 是一种突破了传统方法的建立在现代分子生物学层面上的菌种分类鉴定技术。 本文应用d g g e 变性梯度凝胶电泳技术对松花江干流、嫩江干流、第二松花 江干流、牡丹江干流8 9 个采样点的底泥真菌的群落结构进行了相似性和多样性 分析，结果表明，松花江流域底泥真菌具有局部相似，整体差异的总体特征。 松花江干流底泥沉积物真菌多样性最高，牡丹江干流底泥真菌多样性最低，嫩 江干流和第二松花江居中。 对流域中普遍存在的优势性条带和各采样点独有的特异性条带进行切割回 收和测序，测序结果与g e n b a n k 数据库进行比对，共有4 6 条条带测序成功，其 中2 7 条序列属于非培养得到的真菌( u n c u l t u r e df u n g u s ) ，1 2 条无法鉴定出菌 属( u n i d e n t i f i e d ) 。通过系统进化树找到鉴定菌属间的进化关系，其中共有9 种未 发现近似菌属。 对鉴定出的菌属在环境中起到的作用进行了分析评价，按功能划分，鉴定出 的菌属大致可分为环境修复功能菌和致病菌两类，如青霉菌，曲霉菌，白腐霉 菌等为环境修复常见功能菌；蛙粪霉菌属，轮枝孢属等为致病菌；也鉴定到极 端环境下的具有环境修复作用的微生物：耐冷酵母g u e h o m y c e s 和假丝酵母属。 以第二松花江为重点研究对象，研究了环境因子与所鉴定真菌间的相互关 系，结果发现各采样点真菌对该地环境具有指示及修复作用。如在总磷含量和 氨氮含量最高的采石场发现了对磷化物和几丁质等氮化物具有较强耐受性和降 解作用的拟青霉属( s i m p b c i l l i u m ) ，今后可在此基础上寻找适合的培养条件， 以分离筛选出对磷、氮具有高降解率的功能性修复菌。 关键词：松花江；底泥真菌：变性梯度凝胶电泳：真菌多样性：鉴定；环 境修复 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i st h e s i s ，t h es t r u c t u r e so ff u n g a lc o m m u n i t i e si nt h es e d i m e n to fs o n g h u a r i v e rw e r es t u d i e db yd e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( d g g e ) w ea n a l y z e d t h ef u n g a ld i v e r s i t yi nt h es e d i m e n t so ff o u rm a i ns t r e a m so fs o n g h u ar i v e rb a s i n p r e d o m i n a n ta n dr e g i o n a lu n i q u ef u g a ls p e c i e sw e r ei d e n t i f i e d u s i n gm o l e c u l a r t e c h n i q u e s c o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a lf u n g a lc u l t i v a t i o nm e t h o d s ，t h ep c r - d o g e i s n o td e p e n d e n to n f u n g a lc u l t i v a b i l i t y i ti s af a s t ，c o m p r e h e n s i v ea n ds e n s i t i v e m e t h o d i nt h i st h e s i s ，w ea n a l y z e dt h ef u n g a lc o m m u n i t ys t r u c t u r ea n dd i v e r s i t yf r o m8 9 s a m p l i n gp o i n t so fs o n g h u ar i v e r ，n e n j i a n gr i v e r ，t h es e c o n ds o n g h u ar i v e ra n d m u d a n j i a n gr i v e ru s i n gd g g e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ef u n g a ls t r u c t u r ei n s e d i m e n to fs o n g h u ar i v e rb a s i nw e r eq u i t ed i v e r s ei ng e n e r a lo nt h eb a s i ns c a l e ， w i t hh i g hr e g i o n a ls i m i l a r i t y f u r t h e r m o r e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tf u n g a ld i v e r s i t y w a sh i g h e s ti ns o n g h u ar i v e r ，f o l l o w e db yt h es e c o n ds o n g h u ar i v e r ，m u d a n j i a n g r i v e ra n dn e n j i a n gr i v e r t h ep r e v a l e n ta n dr e g i o n a lu n i q u eb a n d so fd g g ew e r ec u t ，r e c o v e r e d ，a n dt h e n s e q u e n c e d t h es e q u e n c e dd a t aw e r et h e n ，b l a s t e dw i t hg e n b a n k sd a t a at o t a lo f4 6 b a n d sw e r es u c c e s s f u ls e q u e n c e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t18b a n d sb e l o n g e dt o u n c u l t u r e df u n g u s ，a n d12b a n d sb e l o n g e dt ou n i d e n t i f i e do n e s b a s e do nt h e p h y l o g e n i ca n a l y s i s ，9o ft h es e q u e n c e db a n d sr e p r e s e n t e dn e wf u n g a ls p e c i e s w ef u r t h e ra n a l y z e dt h ee n v i r o n m e n t a lf u n c t i o no fi d e n t i f i e df u n g i s o m eo ft h e m w e r eo f t e nu s e df o re n v i r o n m e n t a lr e m e d i a t i o n ，f o re x a m p l e ，p e n i c i l l i u m ，a s p e r g i l l u s ， p h a n e r o c h a e t ee t c o t h e r sw e r ep a t h o g e n ss u c ha sb a s i d i o b o l u sa n dv e r t i c i l l i u me r e g u e h o m y c e sa n dc a n d i d aw e r er e p o r t e dt oh a v ee n v i r o n m e n t a lr e s t o r a t i o nf u n c t i o n i ne x u e m ec i r c u m s t a n c e s t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ne n v i r o n m e n t a lf a c t o r so ft h es e c o n ds o n g h u ar i v e ra n d f u n g a ls p e c i e si d e n t i f i e dw a sa n a l y z e d t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ef u n g i i i a b s t r a c t i d e n t i f i e df r o me a c hs a m p l i n g p o i n t sh a dc l o s e l yr e l a t e dt ot h er e g i o n a lc h a r a c t e r i s t i c s f o re x a m p l e ，as i m p l i c i l l i u ms p e c i e sw h i c hh a sh i g ht o l e r a n c ea n dt h ed e g r a d a t i o n a b i l i t yt o w a r d sp h o s p h i d e ，c h i t i na n do t h e rn i t r i d e sw a sf o u n di naq u a r r yw h e r et h e c o n c e n t r a t i o no ft o t a l p h o s p h a t ea n da m m o n i aw a sh i g h t o g e t h e rw i t hp r o p e r c u l t i v a t i o nm e t h o d s ，w es h o u l db ea b l et oc u l t i v a t e f u n g iw h i c hc o u l de f f i c i e n t l y d e g r a d et h ep h o s p h o r u sa n dn i t r o g e np o l l u t a n t s o u rr e s u l t sp r o v i d e ds o l i df o u n d a t i o n f o re n v i r o n m e n t a la p p l i c a t i o n su s i n gf u n g ii ns o n g h u ar i v e r k e y w o r d s ：s o n g h u ar i v e r ；s e d i m e n tf u n g i ；d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( d g g e ) ；f u n g a ld i v e r s i t y ；i d e n t i f i c a t i o n ；e n v i r o n m e n t a lr e m e d i a t i o n i i i 第一章绪论 第一章绪论 第一节研究背景 1 1 1松花江流域环境特征 松花江是黑龙江最大的支流，介于北纬4 1 0 4 2 5 1 0 3 8 、东经1 1 9 0 5 2 1 3 2 0 3 1 之间，全长1 9 0 0 公里，流域面积5 4 5 6 万平方公里，超过珠江流域面积， 占东北三省总面积6 9 3 2 。径流总量7 5 9 亿立方米，超过了黄河的迳流总量。 由松花江干流、第二松花江、牡丹江、嫩江干流等大小数十条河流汇合而成。 2 0 1 0 年，松花江水质总体为轻度污染，流入黑龙江的断面水质稳定达到i i i 类，松花江流域i 至i i i 类水质断面比例为5 2 9 ，比2 0 0 5 年提高2 9 个百分点； 劣v 类水质断面比例为1 7 6 ，比2 0 0 5 年降低2 个百分点；国控监测断面高锰 酸盐指数、氨氮、化学需氧量平均浓度比2 0 0 5 年分别下降2 0 5 、3 7 5 、2 4 2 。 利用微生物的自净作用尤其是土著微生物的自净作用来改善松花江的水污染状 况，恢复松花江流域水生态系统功能被认为是目前最为经济和实用的方法。 1 1 2 底泥成分及与河流水体的关系 河流底泥是由黏土、泥沙、有机质、矿物质、腐殖质及多种原生动物、微 生物组成的混合物，这些混合物经过长时间的物理、化学、生物等作用及水体 传输而沉积于水体底部，就形成了河流底泥。厚度在0 至1 5 公分的底泥称为表 层底泥，超过1 5 公分厚的底泥称为深层底泥。 底泥是河流的重要组成部分，是河流水生态系统中物质交换和能流循环的 重要枢纽之一，能够反映河流演化的历史过程，同时也是底栖生物的生存场所。 河流底泥长期被水体淹没，与河流水体相互依存，相互影响。由于水体中 含氧量低，底泥沉积物中有机物质的分解消耗了大部分氧，所以河流底泥，常 随深度的增加而形成厌氧环境。 进入水体的污染物通过沉积作用，在底泥中逐渐富集起来，由于水体的流 动会导致底泥中污染物的重新释放，从而影响上覆水体的水质及水生生物、人 类的健康。 河流底泥对河流水质的影响主要通过两个方面：1 ) 底泥沉积物中污染物的 第一章绪论 释放和吸附，致使水质发生变化；2 ) 表层污染底泥沉积物中含有大量微生物， 微生物通过新陈代谢作用对污染物进行降解，使水体得到自净【2 1 。 1 1 3 底泥中的真菌 真菌是底泥微生物中非常重要的组成部分，在水生态系统中的物质循环、 能量流动以及在维持生态平衡和环境净化等方面发挥着十分重要的作用。它们 可以分解底泥中的污染物，同时真菌的菌丝体可以吸附水体中的悬浮颗粒物质、 各种有机物，并形成菌胶团，从而起到絮凝、沉降的作用。在河流淡水生态系 统中，底泥真菌对促进底泥沉积物中有机质的分解、减少有机质的积累、保持 良好水质有着重要的作用。 第二节真菌在生态环境修复中的作用 近年来具有低耗、高效和环境安全特色和优点的微生物修复技术逐渐成为 环境技术的主攻方向之一。所谓微生物修复，即利用微生物的代谢活动，将环 境中的污染物降解或转化为其他无害物质的过程。在微生物修复过程中，首先 要考虑适宜微生物的来源，防止因添加外来微生物而造成的新物种入侵引发新 的环境问题。其次，微生物的代谢活动需在适宜的条件下才能进行，而天然污 染的环境中，条件往往较为恶劣，因此需选择耐受性好，或可通过人为提供适 宜生长条件以强化微生物对污染环境的修复作用。国内外研究人员已经分离出 很多具有降解活性的微生物，包括细菌、放线菌、真菌、酵母以及一些微型藻 类。真菌作为微生物中的一大类，广泛存在于自然界，以产生菌丝体和孢子的 方式进行生长。目前针对于真菌用于污染物降解、生态修复的研究主要集中在 污染土壤的修复上，而应用于水体修复的研究相对较少。 1 2 1石油污染土壤中真菌的降解作用 有研究表明，在被石油污染的土壤中真菌降解石油的效果比细菌更好，虽 然真菌的数量相对较少，但他们能够比较容易的适应不利的环境条件，例如有 限的氮磷含量或低水分、低p h 的环境。一些丝状真菌还能间接的促进土壤中石 油的生物降解，因为他们的菌丝体能深入石油中，使其与石油接触面积变大， 且孢子比细菌更能适应各类不良环境，这些特征有利于对石油烃类的充分降解 【3 。胡长庆等人分离得到的丝壶菌属( h y p h o c h y t r i u mz o p f ) 、网囊霉属( d i c t y u c h u s 2 第一章绪论 三e f 留已6 ) 和腐霉属( 砂砌f “研朋，硭 p 砌) 均具有降解原油快速高效的特点4 1 。与细菌 不同，在受到石油污染后，土壤中真菌的群落多样性没有明显的改变，但其中 部分种属的真菌出现选择性的增加，而且真菌在土壤中能够持续的活动，在细 菌的活动逐渐减弱后，真菌的活动一般却能长久的持续下去。 1 2 2 菌根真菌在土壤修复方面的应用 菌根真菌是一类特殊的高等真菌，能与高等植物的营养根系形成高度平衡 的联合共生体一菌根。在自然界中植物与真菌共生是一种普遍的现象，菌根的 形成对促进植物生长、增强植物的适应能力和抗病能力均有明显作用，同时植 物根区的菌根真菌具有的独特酶系统和代谢途径，可以降解不能被细菌单独降 解的有机物。另有研究表明，菌根的形成可以显著提高植物对土壤中有机污染 物的修复效率，及重金属的吸收。 l e y v a l 等通过试验发现，接种菌根真菌( g l o m u sm o s s e a e ) 能提高黑麦草在工 业污染土壤中的存活率，并促进植物的生长，b i n e t 等证实，在蒽严重污染的工 业土壤中，菌根化黑麦草明显比非菌根化黑麦草存活率高，菌根化植物根际蒽 的降解也明显比对照高，可能是丛枝状真菌加速了葸的降解；根据m e h a r g 等的 总结，许多外生菌根真菌对持久性有机污染物具有降解作用【5 】。 科学家通过对菌根植物修复重金属污染土壤的能力和菌根植物抗重金属机 理的大量研究显示，菌根能促进植物富集重金属离子，起到转移土壤重金属污 染物、达到植物修复重金属污染土壤的目的。 另外，茵根化植物对农药有很强的耐受能力，并能把一些有机成分转化为 菌根真菌和植物的养分，降低农药对土壤的污染程度。林先贵等研究了土壤施 用绿麦隆、二甲四氯和氟乐灵对接种菌根真菌的影响，发现接种菌根真菌后， 白三叶草的菌根侵染率、生长量和对n 、p 元素的吸收量都高于不接种的对照植 株。m e n e n d e z 指出，菌根真菌( g l o m u sm o s s e n e ) 侵染的大豆，其生长不受杀虫剂 乐果的影响，在施用o 5m g l 乐果时反而增加了g l o m u sm o s s e n e 的孢子萌发【6 】。 可见，菌根真菌对修复农药污染的土壤有一定作用。 1 2 3 水生真菌在环境修复中的应用 水生真菌即生活在水体中并能完成生活史的真菌。水生真菌在江河、小溪、 沼泽等环境中均能栖息。水生真菌在生态系统中发挥的作用也是非常明显的。 3 第一章绪论 一方面水中含有的异养型真菌可把腐殖质、有机废弃物等分解并部分转化；另 一方面，因为是初级生产者，可成为水中低等动物的食料而进入食物链。 天然水体中的真菌对于水体中的一定浓度范围内的有机或无机污染物，具 有一定的分解和吸附作用，这种作用叫做水体的自净作用 7 1 。 水体中的真菌在木质素的降解上也起着主导作用，木质素是植物残体中最 难分解的组分，研究表明，具有水解酶( 包括淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶等) 的 水生真菌可以分解复杂的碳水化合物，生理学研究结果表明水生真菌通过产生 木质素修饰酶( 漆酶、酪氨酸酶和木质素过氧化物酶) 加速了木质素的降解【8 1 。 水生真菌还可以吸收水体中多余的氮、磷等营养盐，从而控制避免水体的 富营养化。 1 2 4 底泥真菌在环境修复中的应用 底泥沉积物是河流的重要组成部分，水体中的悬浮颗粒物质、污染物质、 动植物的遗骸腐烂所产生的各种有机物的沉积，使得底泥沉积物成为了有机物 的富集区，故其性质类似于土壤，但较陆上土壤又缺少氧气。在河流淡水生态 系统中，底泥真菌对促进底泥沉积物中有机质的分解、减少有机质的积累、保 持良好水质有着重要的作用。 目前国内外学者的研究方向主要集中于水生真菌的分离和培养，及多样性 分析上，而关于水生尤其是底泥中的土著优势真菌、特异性真菌在生态修复中 的作用机理却少有报道。 y u r i k o 等人通过i t s p c r 基因测序分析了1 0 个日本岛附近深海底泥样品中 的真菌多样性及真菌进化，使用多组引物扩增，研究了不同深度和不同深海底 泥环境中可能存在的未知真菌组成，并发现了子囊菌门新菌群，研究表明深海 环境存在着许多未发现的真菌 9 】。s a m i rd a m a r e 等人采用各种培养基对中印度洋 盆地深海底泥真菌进行了分离培养，研究了在不同深度底泥中随温度和压力条 件变化下真菌的适应变化，共分离得到了1 8 1 种可培养真菌，其中大部分属于 陆生孢子真菌【l o 】。肖凯等人采用了不同的p c r 引物对广东金山温泉沉积物中原 核与真核微生物多样性进行了初步的分析，分别对原核微生物的1 6 sr d n a 基 因和真核微生物i t s 序列进行相似性比较，构建系统发育树，通过基因测序发 现沉积物种中真核类群有p e n i c i l l i u ms p ，l o d d e r o m y c e ss p 和g l o e o t i n i as p 三类 群，大部分基因序列与青霉属相似性在8 8 - 9 0 之间，结果表明温泉沉积物 4 第一章绪论 中微生物多样性十分丰富【1 l 】。 第三节真菌的分类与鉴定方法 用作微生物分类的指标有形态学、生理生化、免疫学和遗传学等方面的性 状。根据目前使用的技术和方法，微生物分类鉴定方法可分为四个不同的水平： 1 ) 细胞形态和习性水平；2 ) 细胞组分水平；3 ) 蛋白质水平；4 ) 基因组水平。 在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标基于细胞形态和习性水平， 称为经典的分类鉴定法。后三种水平是在2 0 世纪6 0 年代后才发展起来的，主 要分类鉴定法有化学分类法、数值分类法、遗传分类法等，称为现代的分类鉴 定方法，对于真菌也是如此。 1 3 1经典分类鉴定方法 用于真菌鉴定的经典分类方法，鉴定指标主要是依据其形态学、生理学和 生态学等特征，这些指标类型很多。形态学特征不仅是真菌鉴定的重要依据， 也是系统发育相关性的一个标志。因为1 ) 它易于观察和比较，可通过菌落特征 直观鉴定，也可通过显微观察分辨出是否存在有隔菌丝或无隔菌丝；2 ) 因为遗 传的稳定性，同一物种的形态学特征在个体形态和群体形态表征上基本相同。 如菌丝体特征( 菌丝长短、粗细、分枝状况、疏密、有无横隔和颜色等) ；无性 和有性繁殖阶段的特征以及繁殖器官的形态与结构；孢子的种类、形态、大小、 数目、着生状态、颜色与表面纹饰等都是重要的分类依据。群体形态特征为在 平皿培养或液体中培养的特征。通过观察平皿中单个菌落生长的形状、大小、 颜色、菌丝形态、菌丝长短、隆起程度等；液体培养特征包括生长量、浑浊度、 表面生长状态、沉淀物、气味、颜色等。 生理生化特征也是真菌分类的重要依据。可通过测定真菌中含有的特定酶 和蛋白质组成来进行鉴定，也可通过营养类型、细胞壁组成、生长温度、菌丝 生长速度、代谢产物、次级代谢产物等进行鉴定。 1 3 2 化学分类法 化学分类法是根据生物所含有的化学成分的种类、结构、性质等化学特征 对生物进行分类鉴定的方法。化学分类法建立在经典分类法的基础上，应用电 泳、色谱、质谱等化学分析技术，通过比较不同微生物细胞组分、代谢产物的 5 第一章绪论 组成等进行分类的方法。 在真菌的分类鉴定中，化学分类法应用广泛。如用于测定物种之间亲缘关 系远近的精密血清反应技术；可溶性蛋白电泳图谱和一些重要酶及其同工酶酶谱； 菌体蛋白的凝胶电泳技术等都为真菌系统学和种类划分提供了可靠证据。一直 以来，人们多习惯依赖形态特征观察法来鉴定真菌种属，这种方法虽然简单直 观但不够严谨且存在着一定的片面性。随着化学分类法的发展和应用，真菌系 统分类学将提高到一个新的层次 1 2 】。 1 3 3 数值分类法 数值分类法是根据生物表型特征总的相似性进行分类，通过广泛比较分类 单元的性状特征，然后计算性状相似性，再根据相似性的数值划分类群的一种 分类方法。 数值分类法用尽可能多的同级别的分类特征来分析各菌种间的关系，且按 特征的相似度归为等同分类单位或分类群的表观群或表元( 数值分类所划分的 类群即称为表观群或表元) 。数值分类使真菌的分类从定性描述发展到定量分析 的水平，以分析大量分类特征为基础，通过计算机辅助，可存储、分析、处理繁琐复 杂的指标数据，实现聚类分析并自动输出鉴定结果。 数值分类以菌株、种、属等为分类单位，并将数值分类中最低等级的分类 单位作为操作分类单位( o p e r a t i o n a lt a x o n o m i cu n i t ，o t u ) ，在o u t 确定的基础 上选择分类特征，如形态特征、遗传免疫特征、生理生化特征、生态特征等， 分类项目种类越多，鉴定结果越精准。 1 3 4 遗传分类法 遗传分类法是以微生物的遗传型特征为依据，判断微生物间的亲缘关系，从 而鉴定出分类群。 ( 一) d n a 中( g + c ) m 0 1 的测定 核酸是生物遗传的基础单位，核酸组成上的差异决定生物间的亲缘关系远 近。d n a 的碱基组成和排列顺序决定生物的性状，分类学上用( g + c ) 的摩尔 百分比( g + c ) m 0 1 ( g u a n i n ep u l sc y t o s i n eb a s em o l ep e r c e n t ) 来表示各类生物 的d n a 碱基组成特征。 ( g + c ) m o l ： 堡 10 0 ，4 + 7 + 仃+ p 6 第一章绪论 使用热变性法，通过加热使g c 、a _ t 的氢键断裂，d n a 双螺旋结构解开， 此时d n a 在2 6 0 n m 处的紫外吸收值增加，且与解链程度成正比。热变性温度 w m ( m e l t i n gt e m p e r a t u r e ) 表示d n a 分子中5 0 解链时的温度，在一定条件下， t m 与( g + c ) m 0 1 成正比。所以，只要应用紫外分光法测出d n a 的t m ，就可 知道( g + c ) m 0 1 的含量。 不同菌属间的( g + c ) m 0 1 各不相同，跨度大约在2 5 7 5 ；但同一种属 的真菌( g + c ) m 0 1 含量相当稳定，不会受外界因素的影响，如培养条件、培 养时间等。亲缘关系越近的真菌，( g + c ) m 0 1 值越接近。有研究认为( g + c ) m 0 1 差别在5 内，则属于同一种；若( g + c ) m 0 1 差别大于5 ，小于1 0 ， 则可归为同一属。可见，亲缘关系相近的菌，其( g + c ) m 0 1 含量相同或近似， 但是由于( g + c ) m 0 1 的值不能反映出碱基的排列顺序，所以( g + c ) m 0 1 含 量相同或近似的菌，其亲缘关系并不一定相近。故若要判断菌株间是否同源， 除了需要测定( g + c ) m 0 1 含量外，还要对碱基的排列顺序及其他特征进行分 析比较。 ( 二) 核酸分子杂交 鉴于( g + c ) m 0 1 含量不能反映菌种d n a 碱基序列的问题，现代的分类 学引用了核酸分子杂交法来比较d n a 碱基序列的相似性。核酸分子杂交技术的 原理是按照碱基的互补配对原理，对两条来源不同的单链核酸进行复性，从而 建立新的杂合双链核酸。核酸分子杂交在微生物分类鉴定中的应用包括 d n a d n a 杂交、d n a r r n a 杂交以及核酸探针杂交。 ( 1 ) d n a d n a 杂交 d n a d n a 杂交是利用d n a 解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来 源的d n a 在体外加热，经热变性解链后，在适当的条件下，使互补的碱基间重新形 成氢键，结合成双链d n a ，但凡具有同源互补性的碱基排列顺序，就可以形成双 链结构。因此，通过d n a d n a 杂交技术可以鉴定d n a 分子间的杂合程度。 杂合率反映菌株间d n a 碱基序列的相似度和亲缘关系的远近如果两条单 链d n a 的碱基顺序完全相同，则杂合率为1 0 0 ，如果碱基顺序只有部分相同，则 它们所形成的双链含有部分单链。由此可见，碱基序列相同部分越多，杂合率 越高，菌株间的亲缘关系越近。有学者认为，d n a d n a 杂交最适合于微生物种 一级水平的研究。根据约翰逊1 9 8 1 年的试验指出，d n a d n a 杂合率在6 0 以 上的菌株可认为是同一个种，杂合率在2 0 6 0 之间可视为同属不同种，杂合率 7 第一章绪论 低于2 0 者为不同属的关系【1 3 】。 ( 2 ) d n a r r n a 杂交 d n a r r n a 的灵敏度相对较高，当两个菌株d n a d n a 杂合率很低或不能 杂交时可利用d n a r r n a 进行进一步的比较，从而实现属和属以上等级的分类。 d n a r r n a 杂交与d n a d n a 杂交技术原理相近，但也存在差异： a d n a d n a 杂交中同位素标记部分是d n a ，d n a r r n a 分子杂交中，同 位素标记的部分是r r n a 。 b d n a d n a 杂交结果用杂合率表示，d n a r r n a 分子杂交结果是以t m 值来表示。t m 值越高，表示亲缘关系越近。 ( 3 ) 核酸探针杂交 核酸探针是指能够识别特异核苷酸序列的、带标记的一段单链d n a 或r n a 分子。此种鉴定方法可以快速、准确的鉴定出微生物。核酸探针种类很多，按 其来源及性质可分为基因组d n a 探针、c d n a 探针、r n a 探针和人工合成的寡 核苷酸探针等【1 4 】。 ( 三) 真菌核型脉冲电泳分析( p f g e ) 作为真核生物，不同真菌细胞核的数目和染色体的数目都各不相同，如青 霉属的细胞核可达2 0 3 0 个；裂褶菌的染色体数目为3 条，而粗糙脉孢菌的染 色体数目是7 条。在脉冲电场电泳中由于不同染色体在凝胶中的迁移速度不同， 所以可形成不同的染色体带，即电泳核型，根据电泳核型的差异可分析出染色 体的数目、大小等基因信息，从而判断真菌间的亲缘关系。 ( 四) 线粒体限制性片段长度多态性( r f l p ) 限制性内切酶片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) ， 简称r f l p ，由于不同种群之问d n a 片段酶切位点是不同的，根据这一原理利 用限制性内切酶进行消化，得到长短、种类、数目不同的限制性片段并分析。 真菌中普遍含有线粒体，且线粒体中d n a ( m t d n a ) 分子的进化速度大于 核d n a ，因此使用m t d n a 进行r f l p ，灵敏度比核d n a 要高【l 5 | 。 ( 五) 真菌核糖体间隔区分析 真菌中编码核糖体r n a 的r d n a 一般由编码区和间隔区构成。编码区主要 负责5 s 、5 8 s 、1 8 s 、2 8 sr r n a 的编码。间隔区分为：内转录间隔区( i n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r , i t s l ) * d c b 转录间隔区( e x t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r , e t s ) 。从5 到 3 ，真菌d n a 的基因顺序依次为e t s 、1 8 sr d n a 、i t s l 、5 8 sr d n a 、i t s 2 、 8 第一章绪论 2 8 sr d n a 和基因间隔序列f i n t e r g e n i es p a c e r ，i o s ) 。 核糖体d n a 中的1 8 s 、5 8 s 和2 8 sr d n a 基因组序列具有保守性，而非编码 区( 内转录间隔区i t s ) 在进化中承受的选择压力较小进化速率相对较快，相对 变化较大，体现出广泛的序列多态性。目前关于i t s 序列标记已广泛用于研究真 菌的系统发育、菌种鉴定、种内差异性分析和检测中【16 1 。 通过多聚酶链式反应技术( p c r ) 可实现真菌r d n a 序列的扩增。选用合适 的引物用于基因扩增，如引物i t s l 和i t s 2 用于扩增1 8 sr d n a 和5 8 sr d n a 之 间的转录间隔区i t s l ；引物i t s 3 和i t s 4 用于扩增5 8 sr d n a 和2 8 sr d n a 之 间的转录问隔区i t s 2 ( 表1 1 ) 1 7 】。 因为i t s 区序列差异性显著，所以每一个种或亚种只有一个i t s 特征序列， 可通过克隆进行分离或电泳分离后对条带进行切胶回收并测序。 表1 1 真菌l t s 区常用扩增引物1 7 1 引物序列( 5 - - 3 )位置 i t s1 t c c g t a g g t g a a c c t g c ( j c18 s i t s1 fc t t g g t c a t t t t a g a g g a a g t f a 18 s i t s1 - r ( t a ) t g g t ( c t ) ( a g t ) ( t c ) ( t c ) t a g a g g a a g t a a 18 s i t s 5g g a a g g t aa aa g t c a a g g 18 s i t s 4t c c t c c g c t t a t t g a t a t g c18 s i t s 4 b c a g g a g a c t t g t a c a c g g t c c a g2 8 s i t s 4 - r c a g a c r t f g a ) t a ( c t ) a t g g t c c a g 2 8 s 第四节真菌的分类系统 目前影响较大的真菌分类系统主要有三个( 表1 2 ) ，它们分别是安斯沃思 ( a i n s w o r t h ，1 9 7 1 、1 9 7 3 ) 提出的分类系统，是在真菌独立成界的基础上分立 两门：真菌门和黏菌门。在真菌门内，根据有性孢子的类型、菌丝是否有隔膜 等分为5 个亚门：鞭毛菌亚门、接合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门和半知 菌亚门；英国国际真菌研究所( 1 9 9 5 年) 根据真菌1 8 sr n a 序列的研究、生物 化学和细胞壁组分和d n a 序列分析结果将原来的真菌界划分为原生动物界、藻 界和真菌界，真菌界仅包括壶菌门、接合菌门、子囊菌门和担子菌门： a l e x o p u l o u s & m i n s ( 1 9 9 6 ) 提出的分类系统在我国被普遍使用，他将真菌界分 为黏菌门、壶菌门、卵菌门、接合菌门、子囊菌门、担子菌门等【l5 1 。 9 第一章绪论 表1 2 几种常用的真菌分类系统 第五节微生物的系统发育 1 5 1 系统发育分析 系统发育分析，即通过对可反映基因特征的蛋白质、r n a 和d n a 的分子序 列进行分析和比较，进而判断出生物进化的特征和相互关系。p c r 技术的发明 使目标d n a 得到大量复制，通过测序技术对d n a 片段进行分析而获得特定的 序列数据。系统发育就建立在d n a 分子序列的选择基础上，通过序列比对寻找 同源性基因，经多重连配，模型选择后作出系统进化树。常通过氨基酸序列分 析和电泳图谱分析的手段来分析蛋白质；通过r r n a 寡核苷酸编目分析和r r n a 全序列分析进行r n a 分析；对d n a 片断，可通过限制性片段长度多态性分析 ( r f l p ) 、随机扩增d n a 多态性分析( r a p d ) 、扩增片段长度多态性分析 ( a f l p ) 、变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 、单链构象多态性分析( s s c p ) 的方法 实现分类鉴定及亲缘性分析。系统发育分析一般用系统进化树的方式进行表示， 系统发育树构建程序如下图所示。 1 0 第一章绪论 1 5 2 构建分子系统进化树的方法 进化树常以有根树或无根树的拓扑结构进行表示。有根树是具有祖先节点 ( 树根) 且有方向的树；把有根树去掉根即成为无根树，无根树是没有方向的。 abc d 有根树 a b 图1 2 有根树无根树 无根树 d 系统发育树建立的主要方法为最大简约法( m a x i m u mp a r s i m o n y , m p ) 、距 离法( 如n e i g h b o rj o i n i n g ，n j ) 和最大似然( m a x i m u ml i k e l i h o o dm l ) 。 最大简约法，适用于序列有很高相似性时，根据信息位点提供的各序列间 的替换情况，在所有可能的树中筛选含最小替换数的树的方法，可利用最少的 离散步骤解释多重比对中的碱基差异；距离法通过各个物种间的比较，根据进 化距离模型推导出分类群之间的进化距离，构建一个进化距离矩阵，再依据进 化距离，依次将序列合并聚类，构建进化树，此方法适用于序列有较高相似性 时，通过简单的计算两两序列的差异数量求得进化距离；最大似然法通过选取 一个特定的替代模型来分析给定的一组序列数据，使得获得的每一个拓扑结构 的似然率都为最大值，然后再挑出其中似然率最大的拓扑结构作为最优进化树 这个进化树能够以最大的概率导致考察的多重比对结果。在最大似然法的分析 第一章绪论 中，所考虑的参数并不是拓扑结构而是每个拓扑结构的枝长，并对似然率求最 大值来估计枝长。 第六节d g g e 技术在环境生态研究中的应用 d g g e 凝胶梯度变性电泳技术( t h ed e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 是由f i s c h e l 和l e r m a n 】于1 9 7 9 年发明的一种可以检测d n a 突变的电泳技术。 该技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶中按梯度加入了变性剂( 尿素和甲酰胺) ，这样， 同样长度但不同序列的d n a 片段在凝胶中会在各自相应的变性剂浓度下变性， d n a 双链解开，电泳速度急剧下降，最终停留在相应变性剂梯度的凝胶中，这 样不同序列的d n a 就可以因迁移速度不同被分开。染色并成像后就可观察到不 同的条带，每个条带则代表一种d n a 片段。通过对d g g e 图谱进行统计学方法 分析，就可获得群落结构变化规律、种群遗传多样性、新菌种鉴定等信息。目 前d g g e 技术已作为一项灵敏度较高的技术在国内外被广泛应用于各种环境微 生物生态的研究中【1 9 】，利用d g g e 技术对存在于各种生境中的菌种进行多样性 研究，已成为普遍的趋势 2 呲2 1 。但将此技术用于河流底泥中优势菌群及特异性 菌群的分类鉴定的研究却少有报道。 现今国内外d g g e 技术的应用主要集中在以下几个方面： 1 6 1 检测传统方法无法培养的菌种 目前，自然界中可获得纯培养的微生物仅占l 1 5 ，这些微生物只是易 于在人工的营养条件及培养条件下形成克隆，并不一定是天然的优势菌群，而 分子生物技术又通常只能检测到优势菌的存在，因此自然界中还有很大一部分 微生物尚未被发现 2 3 1 。应用d g g e 与富集培养相结合，通过对d g g e 条带测序得 到的遗传信息并结合已知的生理生化知识有助于发现新的微生物物种，并分离 得到纯培养【2 4 】。 s a n t e g o e d s 等对美国黄石公园一温泉中的微生物进行了不同的富集培养，通 过d g g e 检测到了以往利用纯培养及分子技术均没有发现的1 0 个好氧化能合成 细菌类群基因 2 5 1 。 t e s k e 等成功地应用该方法从一菌系共生体中分离纯化得到了两个纯的菌 种：d e s u l f o v i b r i os p 和a r c o b a c t e rs p 【2 6 j 。 w a l t e r 等用p c r d g g e 方法和微生物培养技术相对比来监测人类粪便中的 1 2 第一章绪论 细菌组成，研究发现粪便中与食物有关的种如l a c t o b a c i l l u ss a k e 等不能通过 r o g o s a 琼脂培养出来，在一定程度上证明了d g g e 技术的优越性【2 7 1 。 1 6 2 用于环境中微生物变化的动态监测 d g g e 技术的一个显著特性就是可以同时对多份样品进行分析，因此适合 于监测环境中微生物在时间或空间上的动态变化 2 8 。3 6 1 。 魏薇等应用d g g e 技术分析黑龙江省沤麻系统中细菌的多样性，了解沤麻 过程中的菌群时空变化规律，并寻找出沤麻系统中的优势菌群，与传统分离培 养方法得到的结果相比较还发现了一些与未经鉴定和不可培养的细菌同源性达 1 0 0 的菌类，这些菌属在传统的沤麻过程中均没有被分离到，在一定程度上说 明了利用d g g e 分析的优势所在 27 1 。 d u i n e v e l d 等应用d g g e 研究了菊花生长过程中其根际细菌类群多样性的 动态变化，发现通过u p g m a 算法聚类分析，生长过程中根际细菌类群之间的相 似性为8 2 ，没有发生显著变化，与同时通过纯培养方法进行研究的结果一致