（环境工程专业论文）新型荧光探针的合成及其在病原微生物监测中的应用研究.pdf

s t u d yo ns y n t h e s i sa n da p p l i c a t i o no fn o v e lf l u o r e s c e n tp r o b e si n p a t h o g e nm o n i t o r i n g 一 一 一 b y h eh u i b e ( h u n a nu n i v e r s i t y ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fe n g i n e e r i n g l n e n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a n u n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rn i u c h e n g g a n g m a y ，2 0 1 1 帅3哪45肌70川9iiiiily 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 、 作者签名： 日期：弘。1 年厂月3 0 e i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 作者签名： 导师签名： l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密g o ( 请在以上相应方框内打“ ) 日期：加1 年f 月了q 日 日期： 加1 1 年f 月为日 新型荧光探针的合成及其在病原微生物髋测中的应用研究 摘要 荧光分析法因其灵敏度高、选择性好、检出限低等优点，受到越来越多研究 人员的关注。其中荧光探针杂交检测技术在病原微生物检测中具有广泛的应用前 景。 本论文主要是合成一种新型的稀土配合物荧光探针。实验考察了稀土配合物 荧光探针的发光性能和它在环境病原微生物检测中的应用。具体完成内容如下： ( 1 ) 合成了四种具有长寿命荧光的稀土三元配合物：包括以噻吩甲酰三氟丙 酮( t t a ) ，5 氨基邻菲哕啉( 5 n h 2 p h e n ) 为配体的稀土铕配合物 e u ( t t a ) 3 ( 5 一n h 2 一p h e n ) ；以噻吩甲酰三氟丙酮( t t a ) ，邻菲哕啉( p h e n ) 为配体 的稀土铕配合物e u ( t t a ) 3 p h e n ；以l ，3 二苯基1 ，3 丙二酮( d b m ) ，邻菲哕啉 ( p h e n ) 为配体的稀土铕配合物e u ( d b m ) 3 ；p h e n 和以2 烯丙基1 ，3 二苯基1 ，3 丙二酮( a d b m ) ，邻菲哕啉( p h e n ) 为配体的稀土铕配合物e u ( a d b m ) 3 p h e n 。 通过系统地研究四种稀土铕配合物的发光强度、荧光寿命和稳定性，选择发光性 能最好的e u ( t t a ) 3 ( 5 n h 2 p h e n ) 作为标记探针的荧光物质。其中单分子配合物 e u ( t t a ) 3 ( 5 - n h 2 p h e n ) 的量子产率高达0 6 2 ，具有良好的光稳定性。既带有活性 基团又能发长寿命荧光( 荧光寿命0 6 8m s ) ，是一种很好的荧光材料。 ( 2 ) 以自制合成的长寿命发光单分子e u ( t t a ) 3 ( 5 n h 2 p h e n ) 作为标记物，建 立了一种基于两探针串联的三明治杂交检测模型。该模型包括了捕获探针d n a i ， 识别探针d n a 2 和目标探针d n a 3 。单分子e u ( t t a ) 3 ( 5 n h 2 p h e n ) 中苯环上氨基的 取代使得单分子能够标记连接上寡聚核苷酸链以用于时间分辨荧光检测。我们根 据文献报道，通过p r i m e rp r e m i e r5 0 软件设计了实验所需的阴沟肠杆菌和表皮葡 萄球菌的捕获探针，识别探针以及目标探针的d n a 序列。实验过程中，将捕获 探针d n a l 共价固定在已醛基化处理的玻片上，然后与配合物 e u ( t t a ) 3 ( 5 - n h 2 p h e n ) 标记的识别探针d n a 2 ，目标探针d n a 3 在玻片表面形成杂 交体，在激发光激发下产生磷光信号。通过时间分辨荧光分析法检测玻片表面的 荧光强度来达到检测病原微生物的目的。实验中阴沟肠杆菌纯d n a 的检测限低 至5 x1 0 以1t o o ll ，表皮葡萄球菌的检测限为8 0 1 0 。om o ll 一，表现出了较高的 灵敏度和较好的选择性。事实证明，该方法是一种病原微生物检测的有效方法， 可以进一步应用于实际样品中的病原微生物检测。 ( 3 ) 我们从纯培养的阴沟肠杆菌和表皮葡萄球菌中提取目标d n a ，继续以 稀土铕配合物e u ( t t a ) 3 ( 5 n h 2 p h e n ) 作为荧光标记物，基于两探针串联的三明治 杂交检测模型对纯培养的阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌进行了检测。此外，从环境 n 样品中提取总d n a ，通过杂交检测模型初步检测环境中阴沟肠枰菌的d n a 浓度。 实验进一步证明了所建立的杂交检测系统具有很高的选择性和灵敏度，操作简单， 标记物发光稳定等优点，在病原微生物检测中具有广泛的应用前景。 关键词：荧光分析；荧光探针；铕配合物；时间分辨荧光；病原微生物 l l l 新型荧光探针的合成及其在病原微生物监测中的应用研究 a b s t r a c t m o r ea n dm o r er e s e a r c h e r sp a ya t t e n t i o nt of l u o r e s c e n c ea n a l y t i c a lm e t h o d sf o r i t sh i g hs e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t y ，l o wd e t e c t i o nl i m i t so t h e ra d v a n t a g e s a m o n gt h e s e m e t h o d s ，t h eh y b r i d i z a t i o nt e c h n i q u eo ff l u o r e s c e n tp r o b e sh a sm o r ea p p l i c a t i o n si n m o n i t o r i n gp a t h o g e nm i c r o o r g a n i s m s i nt h i sd i s s e r t a t i o nt h ea u t h o r ss y n t h e s i z e dan o v e lf l u o r e s c e n tp r o b eo fr a r ee a r t h c o m p l e x e s w es t u d i e dt h ef l u o r e s c e n c e t i m eo ft h en e wc o m p l e x e s t h e yw e r e a p p l i e di nt h ed e t e c t i o no fp a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m so ft h ee n v i r o n m e n t t h ed e t a i l s a r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： f o u rk i n d so fr a r ee a r t he u r o p i u mc o m p l e x e sw e r es y n t h e s i z e d ， i n c l u d i n g c o m p l e xe u ( t t a ) 3 ( 5 - n h 2 - p h e n ) ，e u ( t t a ) 3 p h e n ，e u ( d b m ) 3 p h e n a n d c o m p l e x e u ( a d b m ) 3 p h e n t h ee u ( t t a ) 3 ( 5 - n h 2 一p h e n ) c o m p l e x ( e t n ) w a ss y n t h e s i z e du s i n g t t aa n d5 - n h 2 - p h e na st h el i g a n d sa n dt h ee u ( t t a ) 3 p h e nc o m p l e xu s i n gw i t ht t a a n dp h e ni n s t e a d t h ec o m p l e xe u ( d b m ) 3 p h e nw a ss y n t h e s i z e du s i n gd b ma n dp h e n a n dt h ec o m p l e xe u ( a d b m ) 3 p h e nw a ss y n t h e s i z e dw i t ha d b ma n dp h e n w ed i d s c i e n t i f i cs t u d i e so nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya n dl i f et i m eo ft h ef o u rr a r ee a r t h e u r o p i u mc o m p l e x e s ，a n dt h e nc h o s et h el o n g - l i v e dl u m i n e s c e n te u r o p i u mc o m p l e x e t na st h eb i o m a r k e ro ft h ep r o b e t h ec o m p l e xe t nh a ds t a b l e l i g h ta n dh i g h f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l do f0 6 2 i th a da c t i v er a d i c a la sw e l la sl o n gl i f et i m e ( 0 6 8m s ) i tw a sp r o v e da sak i n do ff l u o r e s c e n c ed y ew i t hs u p e rl u m i n e s c e n c e p r o p e r t y ( 2 ) at w o p r o b et a n d e md n as a n d w i c hh y b r i d i z a t i o na s s a yi n c l u d i n gc a p t u r e d n a t ，p r o b ed n a 2 ，a n dt a r g e td n a 3w a sp r e p a r e d t h el o n g l i v e dl u m i n e s c e n t e u r o p i u mc o m p l e xe t nw a su s e da st h eb i o m a r k e r t h er e p l a c eo fa m i n oi nt h e p a r t i c l ee t n w e r ee a s yt ol a b e lo l i g o n u c l e o t i d ef o rt i m e r e s o l v e df l u o r e s c e n c ea s s a y s t h es e q u e n c e so f e n t e r o b a c t e rc l o a c a ea n ds t a p h y i o c o c c u se p i d e r m i d i sg e n e sw e r e d e s i g n e du s i n g s o f t w a r ep r i m e rp r e m i e r5 0 a c c o r d i n g t ot h el i t e r a t u r e a m i n o - m o d i f i e dc a p t u r ed n a lw a sc o v a l e n t l yi m m o b i l i z e do nt h e g l u t a r a l d e h y d e t r e a t e d g l a s ss l i d e s t h ed e t e c t i o nw a sd o n eb ym o n i t o r i n gt h et i m e r e s o l v e d f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yf r o mt h eg l a s ss u r f a c ea f t e rt h eh y b r i d i z a t i o nr e a c t i o nw i t ht h e e t nl a b e l e dp r o b ed n a 2a n dc o m p l e m e n t a r yt a r g e td n a 3 t h ed e t e c t i o nl i m i to ft h e e n t e r o b a c t e rc l o a c a ed n aw a sl o wo f5 x10 。m o ll ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i to ft h e i v 硕十学位论文 o f p u r es t a p h y i o c o c c u se p i d e r m i d i sd n a w a sl o wo f8 0 x10 。1 0m o ll 一t h er e s u l t so f t h ep r e s e n tw o r kp r o v e dt h a tt h i sn e wa p p r o a c hw a se a s yt o o p e r a t ew i t hh i g h s e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y i tc o u l db ec o n d u c t e da sap o w e r f u lt o o lf o rt h ed e t e c t i o n o fp a t h o g e nm i c r o o r g a n i s m si nt h ee n v i r o n m e n t ( 3 ) t h eo r i g i n a le x t r a c t e dd n as a m p l e sf r o me n t e r o b a c t e rc l o a c a ea n d s t a p h y l o c o c c u se p i d e r m i d i sw i t h o u ta n yp u r i f i c a t i o na n da m p l i f i c a t i o np r o c e s sw e r e d i r e c t l yu s e di nt h eh y b r i d i z a t i o na s s a y t h ee t nl a b e l e dp r o b e sw e r ee m p l o y e df o r t h es p e c i f i cd e t e c t i o no fo r i g i n a le x t r a c t e dd n af r o me n t e r o b a c t e rc l o a c a ea n d s t a p h ) l o c o c c u se p i d e r m i d i ss t r a i n f u r t h e r m o r e ，t h ed n ac o n c e n t r a t i o no f e n t e r o b a c t e rc l o a c a ew a sd e t e c t e di nt h et o t a le x t r a c t e dd n af r o me n v i r o n m e n t t h i s n o v e lm e t h o dw a sv e r i f i e df o r w a r de a s i e rt o o p e r a t ew i t hh i g hs e l e c t i v i t ya n d s e n s i t i v i t y i ti sp r o m i s e dt ob ea ni m p o r t a n tp l a y e ri nt h ef u t u r ed i a g n o s i so fp a t h o g e n m i c r o o r g a n i s m s k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n c ea n a l y s i s ；f l u o r e s c e n c ep r o b e ；e u r o p i u m ( i i i ) c o m p l e x e s t i m e r e s o l v e df l u o r e s c e n t ；p a t h o g e n v 新型荧光探针的合成及其在病原微生物监测中的应用研究 目录 学位论文原创性声明和学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i v 插图索引i x 第1 章绪论1 1 1 荧光产生的理论基础1 1 1 1 荧光的定义1 1 1 2 荧光量子产率1 1 1 3 荧光强度l 1 1 4 荧光寿命2 1 1 5 荧光激发光谱和发射光谱。2 1 2 荧光分析概述3 1 2 1 荧光分析的特点3 1 2 2 常规的荧光定量分析法3 1 2 3 荧光分析的影响因素及注意事项4 1 2 4 荧光分析的应用：5 1 3 荧光探针及其初步应用6 1 4 时间分辨荧光分析技术6 1 4 1 稀土离子配合物探针的特点7 1 4 2 时间分辨荧光测定原理7 1 4 3 时间分辨荧光分析技术的应用一8 1 5 环境中病原微生物的检测9 1 5 1 传统病原微生物的检测方法l o 1 5 2 现有的病原微生物检测方法1 0 1 6 本文构想l o 第2 章长寿命荧光铕配合物的合成及其发光性质1 2 2 1 前言12 2 2 实验部分13 2 2 1 实验仪器一1 3 2 2 2 实验原料及试剂1 3 2 2 3 稀土铕三元配合物的合成一1 3 硕十学位论文 2 3 实验结果的讨论与分析2 4 2 3 1 四种稀土铕配合物的发光性能2 4 2 3 2 配合物e u ( t t a ) 3 ( 5 - n h 2 p h e n ) 的荧光寿命和稳定性2 5 2 3 3 配合物e u ( t t a ) 3 ( 5 - n h 2 p h e n ) 的发光稳定性2 6 2 4 结沧2 6 第3 章稀土铕配合物荧光探针检测环境中的病原微生物2 7 3 1 前言2 7 3 2 实验部分2 7 3 2 1 实验仪器2 7 3 2 2 实验原料及试剂2 8 3 2 3 探针的设计和合成2 8 3 2 4 杂交模型的建立3l 3 2 5 杂交玻片的修饰3 l 3 2 6 捕获探针d n a i 在醛基化玻璃上固定3 2 3 2 7 单分子铕配合物e u ( t t a ) 3 ( n h 2 p h e n ) 的醛基化3 2 3 2 8e u ( t t a ) 3 ( 5 - n h 2 - p h e n ) 标记识别探针d n a 2 3 3 3 2 9 相关温度的控制3 3 3 2 1 0 探针杂交及杂交后处理：3 4 3 3 实验结果的讨论与分析3 4 3 3 1 检测信号强度随浓度的变化3 4 3 3 2 滴加捕获探针浓度的优化3 5 3 3 3 洗涤温度的优化3 6 3 3 4 杂交时间的优化3 7 3 3 5 检测系统的选择性能及可行性3 7 3 4 结论3 9 第4 章铕配合物荧光探针在环境病原微生物检测中的初步应用4 0 4 1 前言4 0 4 2 实验部分4 0 4 2 1 实验仪器4 0 4 2 2 实验试剂4 l 4 2 3 阴沟肠杆菌和表皮葡萄球菌的纯培养4 1 4 2 4 菌种基因组d n a 的提取与检测4 2 4 2 5 杂交模型的建立4 3 4 3 实验结果分析与讨论一4 4 4 3 1 目标d n a 的检测4 4 v l l 新型荧光探针的合成及其在病原微生物监测中的应用研究 4 3 2 杂交温度的优化4 5 4 3 3 杂交时间的优化4 6 4 3 4 检测系统的选择性能及可行性4 7 4 4 环境样品中病原微生物的检测初探4 8 4 4 1 环境样品的初处理4 8 4 4 2 环境样品中目标d n a 杂交检测4 9 4 5 分析和展望5 0 4 6 结论5 0 第5 章结论51 参考文献5 2 致谢5 9 附录攻读学位期间所发表的学术论文目录。6 0 v i i i 硕士学位论文 图 图 图 图 图 图 1 1 1 2 插图索引 时间分辨荧光测定的原理8 三明治杂交模型示意图1 l 硝基邻菲哕啉n 0 2 p h e n 的合成1 4 氨基邻菲哕啉( n h 2 p h e n ) 的合成1 4 氨基邻菲哕啉( n h 2 p h e n ) 的质谱图1 5 e u ( t t a ) 3 ( n h 2 p h e n ) 的合j 或1 5 图2 5e u ( t t a ) 3 ( n h 2 - p h e n ) 的荧光发射光谱( k x = 3 6 8a m ，延迟时间o 1m s ， 门时间1 0m s ) 1 6 图2 6 配合物e u ( t t a ) 3 ( n h 2 p h e n ) 的红外光谱图1 6 图2 7 配合物e u ( t t a ) 3 p h e n 的合成l7 图2 8e u ( t t a ) 3 p h e n 的磷光发射光谱( e x = 4 0 0n m ，延迟时间o 1m s ，门时间 1 0m s ) 1 7 图2 9 配合物e u ( t t a ) 3 p h e n 的红外光谱图：1 8 图2 1 0 配合物e u ( d b m ) 3 p h e n 的合成1 8 图2 1 le u ( d b m ) 3 p h e n 的磷光发射光谱( 九。x = 4 1 l n m ，延迟时间0 1 m s ，门时间 1 0 m s ： 19 图2 1 2 配合物e u ( d b m ) 3 p h e n 的红外光谱图j1 9 图2 1 3 丙烯基二苯甲酰甲烷( a d b m ) 的合成2 0 图2 1 42 烯丙基1 ，3 二苯基1 ，3 丙二酮( a d b m ) 的质谱图一2 0 图2 1 5 配体a d b m 的红外光谱2 0 图2 1 6 配合物e u ( a d b m ) 3 p h e n 的合成2 l 图2 1 7e u ( a d b m ) 3 p h e n 的磷光发射光谱( 。x = 3 9 5 n m ，延迟时间0 1 m s ，门时间 1 0 m s ) 2 2 图2 1 8 配合物e u ( a d b m ) 3 p h e n 的红外光谱图2 2 图2 1 9 配体d b m 的红外光谱图2 2 图2 2 0 配体t t a 的红外光谱图2 3 图2 2 l 配体p h e n 的红外光谱图2 3 图2 2 2 单体n h 2 一p h e n 的红外光谱图2 3 图2 2 3 两种稀土配合物的荧光发射光谱2 5 图2 2 4 荧光强度的自然对数l n f 与延迟时间的线性拟合2 5 图2 2 5 配合物e u ( t t a ) 3 ( 5 - n h 2 p h e n ) 的光稳定性2 6 i x 新型荧光探针的合成及其在病原微生物髓测中的戍用研究 图3 1p e r k i n e l m e rl s 5 5 荧光磷光分光光度汁2 7 图3 2 探针的设计1 2 9 图3 3 探针的设计2 2 9 图3 4 探针的设计3 3 0 图3 5 两探针串联的d n a 杂交模型3 1 图3 6 单分子配合物e u ( t t a ) 3 ( 5 - n h 2 p h e n ) 醛基化示意图3 2 图3 7d n a 2 与醛基修饰的单分子配合物e u ( t t a ) 3 ( 5 - n h 2 p h e n ) 交联示意图 ：；：； 图3 8 不同目标d n a 3 浓度下的时间分辨荧光光谱图3 5 ( 目标d n a 3 溶液浓度从上到下分别是5 0 1 0 。7m o ll 一，5 0 x1 0 8m o ll ，5 0 x l0 。9 m o ll 1 ，5 0 x1 0 1 0m o ll 1 ，5 o 1 0 1 1t o o ll 。1 ) 3 5 图3 9 不同捕获探针d n a l 浓度下的时间分辨荧光光谱图3 6 图3 1 0 不同杂交温度对杂交效率的影响3 7 图3 1 1 阴沟肠杆菌与不同目标d n a 杂交的荧光强度3 8 图3 1 2 表皮葡萄球菌与不同目标d n a 杂交的荧光强度3 8 图4 1 单分子铕配合物e u ( t t a ) 3 ( 5 - n h 2 p h e n ) 的结构式4 1 图4 2 杂交后示意图4 4 图4 3 不同目标d n a 3 浓度下的时间分辨荧光光谱图4 5 ( 目标d n a 3 浓度从上到下分别为4 1 0 。7m o ll 一，4 x 1 0 8m o ll ，4 x 1 0 。9m o l l ，4 10 1 0 m o ll ，0m o ll 。1 ) 4 5 图4 4 荧光强度与阴沟肠杆菌目标d n a 3 浓度c 线性拟合4 5 图4 5 阴沟肠杆菌和表皮葡萄球菌不同杂交时间的影响4 7 图4 6 检测体系对阴沟肠杆菌的选择性4 8 图4 7 检测体系对表皮葡萄球菌的选择性4 8 图4 8 环境样品中的阴沟肠杆菌d n a 检测的荧光强度4 9 x 硕士学位论文 附表索引 表3 1 清洗液配制2 8 表3 2 两种菌种的核酸序列2 9 表3 3 阴沟肠杆菌d n a 的参数3 l 表3 4 表皮葡萄球菌d n a 的参数3 l 表3 5 不同杂交温度对杂交效率的影响3 6 表3 6 不同组分的d n a 序列3 8 表4 1 不同杂交温度对杂交效率的影响4 6 表4 2 不同组分的d n a 序列4 7 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 荧光产生的理论基础 1 1 1 荧光的定义 当某种波长的入射光( 大多为紫外光) 照射到某些物质的时候，这些物质会 发射出各种不同颜色和强度的可见光，而当入射光停止照射时，发光现象也随着 入射光的消失而消失，这种发射光称为荧光，属于光致发光【l ，2 1 。荧光物质所吸 收的光为激发光。荧光物质产生荧光的过程大致可以分为四个步骤： ( 1 ) 处于基态最低振动能级的荧光物质受到入射光的照射，吸收了与入射光 的特征频率一致的光，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级； ( 2 ) 被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，在无辐射跃迁的作用 下，降落到第一电子激发态的最低振动能级； ( 3 ) 降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子，再以辐射弛豫的形式跃 迁到基态中各个不同的振动能级，并发射出分子荧光； ( 4 ) 降落到基态的各个不同振动能级的分子，最终无辐射跃迁至基态的最低 振动能级。 1 1 2 荧光量子产率 荧光量子产率( f l u o r e s c e n tq u a n t u my i e l d ) ，它是表示一种物质荧光特性的重 要参数，通常用f 表示。定义为激发态分子中通过发射荧光而回到基态的分子 占全部激发态分子的分数，也就是处在电子激发态的分子发射荧光的比率，其数 值小于或等于1 。 f = 发射的荧光量子数吸收的荧光量子数 f 表示物质发射荧光的本领，f 数值越大则化合物的荧光越强，而无荧光 的物质的f 却等于或非常接近于零。当荧光探针与细胞结构或生物分子结合时， 其荧光量子产率o f 应该接近或大于0 4 ，否则没有实用价值。 1 1 3 荧光强度 荧光强度f ( f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y ) 是指在一定条件下仪器所测得荧光物质 发射荧光强弱的一种量度，是目前最常用的参数，用某一波长的荧光强度来表示 某物种质的荧光强度，所用单位为任意单位，表示的是相对强度。荧光强度决定 了染料检测的灵敏度。荧光物质所发射的荧光无固定方向，实际上所测得的是某 一方向的荧光，它不仅与物质本身的荧光量子产率m f 有关，还受到环境、介质、 新型荧光探针的合成及其在病原微生物监测中的应用研究 能等诸多因素的影响。可用下述数学公式表达荧光强度( f ) 及其影响因 系【3 ，4 】： f = 2 3 i o o f c b c 中f 表示为荧光强度；i o 表示为照射到物质上的光强度；m f 表示物质的荧 产率：8 表示为物质的摩尔吸光系数；b 表示为检测池的厚度；c 表示物质 在稀溶液中，物质发射的荧光强度与其吸收的光能成正比，也与溶液中物质 的浓度成正比，当浓度增大到一定程度时，荧光强度的增加与物质浓度不再成线 性关系，甚至会随着浓度的增加而下降。 1 1 4 荧光寿命 荧光寿命( 1 i f eo f f l u o r e s c e n c e ) ，是指分子返回基态之前，停留在激发态的平 均时间，通常用丫来表示。荧光寿命丫可以通过下式测定： y = i n f o i n f t = - t t 通过测定不同时间的荧光强度，确定其关系曲线，其斜率就是荧光寿命丫。 式中f o 和f t 分别代表t - - o 和t = t 时的荧光强度值。 大多数荧光探针的荧光寿命在纳秒级。如果荧光分子在受到激发后迅速跃迁， 则可发生多次激发，因此荧光探针的发光寿命很短时可以适当提高灵敏度。相反， 长寿命的荧光探针对于提高检测的灵敏度也很有意义。利用稀土镧系离子配合物 的长寿命荧光而建立的时间分辨荧光分析技术，激发后延迟一段时间，在自身本 底背景荧光和短寿命的散射光等干扰信号衰减之后，再检测荧光探针的荧光信号， 这样可排除干扰的背景荧光，大大地提高检测的特异性和灵敏度。 1 1 5 荧光激发光谱和发射光谱 任何荧光物质都具有两种特征光谱：激发光谱和发射光谱。激发光谱和荧光 光谱体现了物质分子结构的信息，是对荧光物质进行定性分析的重要依据。 激发光谱是当激发光的波长连续变化时，选取最大荧光发射波长为测量波长， 在固定狭缝宽度下扫描得到的荧光激发波长和相应荧光强度的关系曲线。其中荧 光强度最强的波长为最大激发波长，通常用九e x 表示。荧光发射光谱，又称作荧 光光谱，其获得过程类似于激发光谱。固定激发波长和狭缝宽度进行扫描，得到 荧光发射波长和相应荧光强度的关系曲线，即荧光光谱。其中荧光强度最强的波 长为最大荧光发射波长，用九e m 表示。荧光光谱一般具备以下三个特征： ( 1 ) 激发光谱的形状和吸收光谱极为相似；基本上呈镜像对称关系； ( 2 ) 发射光的形态和激发光的波长无关。 ( 3 ) 通常情况下，荧光发射光谱的波长总是大于荧光激发波长，即九e m 九e x ， 两者之差为斯托克( s t o k e s ) 位移。斯托克位移说明了在激发和发射之间存在一 硕士学位论文 定的能量损失。斯托克位移越大，其激发光谱和荧光光谱的重叠就越少，就有利 于提高荧光物质的分辨率。 1 2 荧光分析概述 利用某些物质被紫外光照射后所产生、能够反映出该物质特性的荧光，以进 行该物质的定性分析和定量分析，称为荧光分析。当前，荧光分析被广泛应用在 生物、医药、环境保护、化工、司法鉴定、材料学等各种领域中，成为一种十分 重要而且有效的光谱化学痕量分析方法。凡能产生荧光的物质都可以采用荧光分 析法进行定性分析。对于某一荧光物质的稀溶液，如果保持溶液层的厚度不变， 则在一定波长和一定强度的激发光照射下，所产生的荧光强度和溶液的浓度成正 比。这是荧光定量分析的理论依据。 1 2 1 荧光分析的特点 荧光分析是依据试样溶液所产生的荧光的强度来测定试样溶液中荧光物质的 含量。荧光分析的灵敏度与溶液的浓度、紫外光照射强度以及荧光分光光度计的 灵敏度有关等多种因素有关。虽然检测时对于光敏物质所允许的光照强度有所限 制，但光度计检测的灵敏度却可以增加。而且，随着技术的不断进步，光度计对 于微弱信号检测的检出限越来越低。因此，和常规的比色法和分光光度法相比， 荧光分析具有很大的优势。比色法及分光光度法的灵敏度一般都为千万分之几； 而荧光分析法的灵敏度却可以达到亿分之几，甚至更高1 5 - 6 】。 选择性高是荧光分析法的另一大优点。这主要是指对有机化合物的分析而言。 因为凡是能够发光的物质