（环境工程专业论文）氧化胁迫下alkalibacterium+spf26的生理应答机制.pdf

摘要 摘要 活性氧是微生物细胞在正常代谢过程中产生的一类化学性质极其活泼的基团或分 子，主要包括超氧自由基( 0 2 一) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 和羟基自由基( o h ) 。当其产生速度超 出细胞抗氧化物防御系统的清除能力时，活性氧就会攻击细胞成分引发一系列毒性效 应，造成对细胞的“氧化胁迫”作用。微生物为了生存必然对这种胁迫做出应答或应激 响应，通过自身的抗氧化防御系统降低活性氧的危害，从而表现为不同的生物学效应。 本论文以一株高产过氧化氢酶( c a t a l a s e ，简称c a t ) 的嗜盐嗜碱菌a l k a l i b a c t e r i u ms p f 2 6 为研究菌株，研究h 2 0 2 胁迫下a l k a l i b a c t e r i u ms p f 2 6 的生理应答机制。论文主要的 研究内容与结果如下： ( 1 ) 在摇瓶中采用一次性添加h 2 0 2 的方法研究h 2 0 2 瞬时刺激对c a t 合成的影响。结果表 明，不同时期添加h 2 0 2 对细胞生长和c a t 合成的影响有较大的差异，初始添加不利于 c a t 的合成，但对菌体生长抑制作用不明显；对数生长后期( 1 8 坳添加虽然对细胞生长 影响较大，但细胞对h 2 0 2 的响应程度较高，表现为c a t 合成水平较高，当添加浓度为3 m m 时，c a t 酶活达到9 4 5 6u m gp r o t e i n 。但是，当h 2 0 2 的浓度达到4m m 时，c a t 酶活 急剧下降，说明体内合成的c a t 的量远远达不到分解外来的h 2 0 2 的需求，此浓度已严重 伤害了细胞的正常代谢。 ( 2 ) 采用高效液相色谱技术测定胞内代谢物浓度，研究氧化胁迫对4 l k a l i b a c t e r i u ms p f 2 6 辅因子的影响。研究结果表明：相比低浓度h 2 0 2 ( 1r e t o o l l ) 胁迫下的应答表现更为明显，即经3m m o l lh 2 0 2 胁迫后胞内c a t 酶 活为1 0 6 5 4u m gp r o t e i n ，是对照产量的1 7 6 倍：a t p 浓度则从对照浓度2 0 5 5j - t m o l l 下降 到1 7 8 0i t m o l l ；n a d + 浓度自对照样品的6 9 8 9i m o l l 减少至3 1 7 7i _ t m o l l 。由于a t p 和 n a d + 浓度的减少，相比未经过h 2 0 2 胁迫菌体，细胞能荷值e c 从0 7 7 降低至0 6 8 ， n a d h n a d + 则从o 0 8 增加至o 4 1 。然而，这种应答机制在细胞受到低浓度h 2 0 2 的胁迫 后并不明显：除发现1 0 0i - t m o l lh 2 0 2 能够导致细胞防御机制的激活而使胞内a t p 浓度相 比对照有所增加的情况外，经5 0b t m o l l 和5 0 0 t m o l lh 2 0 2 胁迫后胞内a t p 水平从对照的 2 2 6 9i _ t m o l l 只下降至1 j 2 2 3 8i _ t m o l l 和1 3 7 0i t m o l l ；并且此种胁迫条件下n a d h 浓度变 化也不显著。 ( 3 ) 考察了不同h 2 0 2 浓度对4 翰礁z 汤口c 衙f “所s p f 2 6 对糖代谢关键酶的影响。结果发现，随 着胁迫程度的增强，磷酸戊糖途径( p e n t o s ep h o s p h a t ep a t h w a y , p p p ) 中关键酶葡萄糖6 磷 酸脱氢酶( g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，g 6 p d ) 的活性逐渐升高，而对于糖酵解途径 ( g l y c o l y s i sp a t h w a y , e m p ) 中的己糖激酶( h e x o k i n a s e ，h k ) 和丙酮酸激酶( p y r u v a t ek i n a s e ， p k ) 来说，由于高浓度的氧化胁迫导致酶中巯基发生氧化修饰，两种酶的活性随胁迫程 度的增大而降低。此外，细胞在受到微量h 2 0 2 胁迫后，为了保证细胞的正常代谢，三羧 酸循环( t r i c a r b o x y l i ca c i dc y c l e ，t c a ) 中的琥珀酸脱氢酶( s d h ) 的活性有所升高，当胁迫 程度逐渐增强，生物体内的c a t 来不及分解外来h 2 0 2 的时候，s d h 会因活性位点铁硫中 心的氧化而失活。 摘要 关键词：氧化胁迫，过氧化氢酶，辅因子，糖代谢关键酶 a b s t r a c t a b s t r a c t r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e so l o s ) ，i n c l u d i n gs u p e r o x i d er a d i c a l s ( 0 2 一) ，h y d r o g e n p e r o x i d e ( h 2 0 2 ) a n dh y d r o x y lr a d i c a l s ( 。o h ) a r e ag r o u po fa c t i v a t e dm o l e c u l e st h a t c o n t i n u o u s l yf o r m e dd u r i n gn o r m a la e r o b i cm e t a b o l i s mi nm i c r o o r g a n i s m t h ec o n d i t i o n k n o w na so x i d a t i v es t r e s sr e s u l t sw h e nt h ep r o d u c t i o no fr o se x c e e d st h ec a p a c i t yo ft h e c e l l st or e m o v et h e ms a f e l y i nt h ec o n d i t i o no fo x i d a t i v es t r e s s ，r o sc a no x i d i z ep r o t e i n ， n u c l e i ca c i d sa n dl i p i dp e r o x i d a t i o n ，l e a df u r t h e rt od i s r u p t i o no fn o r m a lm e t a b o l i s m ， m u t a t i o n s ，a n du l t i m a t e l yc e l ld e a t h t op r o t e c tc e l l sa g a i n s tr o s ，a 1 1a e r o b i cm i c r o - o r g a n i s m i n s t i n c t i v e l yr e s p o n dt ot h es t r e s su s i n ge n z y m a t i ca n dn o n - e n z y m a t i cd e f e n c es y s t e m s ，a n d t h u ss h o wd i f f e r e n tb i o l o g i c a lp h e n o m e n o n s t u d yt h em e c h a n i s mo fc e l l sr e s p o n s et o o x i d a t i v es t r e s si sh e l p f u lt ou n d e r s t a n dt h ec a u s a t i o no fh u m a nd i s e a s ec a u s e db yr o sa n d f i n de f f e c t i v em e a n so fp r o t e c t i o na n dc l e a r a n c e i nt h i sp a p e r , t h ep h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s m st oo x i d a t i v es t r e s so fas l i g h th a l o p h i l i c a l k a l i p h i l es t r a i n a 2 l k a l i b a c t e r i u ms p f 2 6 ，w h i c hp r o d u c e dh i g hl e v e lo fi n t r a c e l l u l a rc ：a t w e r ei n v e s t i g a t e d t h em a i nc o n t e n t so ft h i sd i s s e r t a t i o ni n c l u d e da sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ee f f e c to fh 2 0 2i n s t a n t a n e o u ss t r e s so nc a ts y n t h e s i st h r o u g hs i n g l ea d d i t i o no fh 2 0 2 i ns h a k ef l a s k sw a ss t u d i e d i tw a sf o u n dt h a ti n f l u e n c eo fh 2 0 2s t r e s so ne e l lg r o w t ha n dc a t s y n t h e s i sw a sl a r g e l yd e p e n d e n to nc e l lg r o w t hp h a s e i n i t i a la d d i t i o no fh 2 0 2w a sn o t a d v a n t a g e o u sf o rc a tp r o d u c t i o n a n dn oo b v i o u sb a de f f e c t so fe e l lg r o w t hw e r eo b s e r v e d s i g n i f i c a n te n h a n c e m e n to fc a ra c t i v i t yw a so b s e r v e db yh 2 0 2s t i m u l a t i o nw h e nc e l lg r o w t h e n t e re x p o n e n t i a lp h a s e08h ) ，a l t h o u g hc e l lg r o w t hw a si n h i b i t e db yh 2 0 2a d d i t i o n t h e a c t i v i t yo fc a ti n c r e a s e dt o9 4 5 6u m gp r o t e i nw i t ha d d i t i o no f3m mh 2 0 2 h o w e v e r , t h e n o r m a lm e t a b o l i s mw a sb a d l yd a m a g e d ，c a s u s i n gc a tl e v e lr a p i d l yd e c r e a s e dw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2i s4m m ( 2 ) t h ee f f e c to fh 2 0 2o nc o f a c t o r sl e v e lw a sa l s oc a r e f u l l yi n v e s t i g a t e db yu s i n gh p l c n l er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta l k a l i b a c t e r i u ms p f 2 6h a do b v i o u sr e s p o n s e st oh i g h e r c o n c e n t r a t i o n ( 1m m o l l ) o fh 2 0 2t h a nt h a tt ol o w c rh 2 0 2 ( 1m m o l l ) c h a l l e n g ef r o m t h o s ea s p e c t so fd e f e n s i v ee n z y m es y n t h e s i sa n dc o l a c t o r sl e v e lv a r i a t i o n a sf o rc a t a l a s e p r o d u c t i o n ，t h ea c t i v i t yi n c r e a s e du pt o10 6 5 4u m gp r o t e i n ，w h i c hw a s1 7 6f o l do ft h e c o n t r o lw h e nc e l l sw e r ec h a l l e n g e db y3m m o l lh 2 0 2 ，b u ti t sa c t i v i t yo n l yw a s1 13f o l d w h e nh 2 0 2w a s10 0p m o l l a s 缸鹤e n e r g ys t a t ew a sc o n c e r n e d ，a t pp r o d u c t i o na n dn a d + g e n e r a t i o nw e r es i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e df r o m2 0 5 5l a m o l lt o1 7 8 0l m a o l la n d6 9 8 9p m o l l t 031 7 7l x r n o l l ，r e s p e c t i v e l y , l e a d i n gt ot h ed r o po fe n e r g yc h a r g ef r o m0 7 7t oo 6 8a n dt h e i n c r e a s eo ft h ep o r t i o no fn a d h n a d + f r o m0 0 8t o0 41i nt h ef o r m e rc a s e h o w e v e r , t h e s e e f f e c t sw e r e1 e s sd i s t i n c tu n d e rl o w e rc o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2 e x c e p to ft h ec o n d i t i o no f10 0 l a m o l lh 2 0 2 ，u n d e rw h i c ht h ea c t i v a t i o no fd e f e n s i v em e c h a n i s mr e s u l t e di na ni n c r e a s eo f a t p t h el e v e lo fa t pd r o p p e df r o m2 2 6 9l m a o l lo ft h ec o n t r o lt o2 2 3 8t t r n o l la n d1 3 7 0 l a m o l lw h e nc h a l l e n g e db y5 0i - t m o l la n d5 0 0 ”m o l lh 2 0 2 b e s i d e s ，t h ec o n c e n t r a t i o no f n a d hf l u c t u a t e da n dt h en a d + g r a d u a l l yr e d u c e dw h e nh 2 0 2b e l o w1m m o l l ( 3 ) n l ei n f l u e n c e so fh 2 0 2o nk e ye n z y m e so fg l u c o s em e t a b o l i s mw e r es t u d i e d t h er e s - i a b s t r a c t u l t ss h o w nt h a tg 6 p do fp p pw a si n d u c e d 、撕t 1 1t h ei n c r e a s i n ge x t e n to fo x i d a t i v es t r e s s i n t h ec a s eo fh ka n dp ko fe m p , b o t ho ft h e i ra c t i v i t yd r o p p e db e c a u s eo fo x i d a t i o no f s u l f h y d r y l g r o u p b e s i d e s ，s d ho ft c a l e v e li n c r e a s e du n d e rt r a c ec o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2t o m a i n t a i nn o r m a lm e t a b o l i s mo fc e i l s h o w e v e r , i n a c t i v a t i o no fs d ho c c u r r e dd u et o o x i d a t i o no fa c t i v es i t e ，i r o n s u l f u r , w h e ne x p o s e dt oh i g l ls t r e s s k e yw o r d s ：o x i d a t i v es t r e s s ，c a t a l a s e ( c a t ) ，c o f a c t o r s ，k e ye n z y m e so fg l u c o s em e t a b o l i s m i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： l 垒丕圣 日期：沙口g 年月劢日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致a 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 垦盘盗 导师签名：燮 日期：加彦年6 月) 。日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 概述 地球上除厌氧生物外，所有动植物和需氧生物都离不开氧气。氧气参与生物体的新 陈代谢，线粒体的呼吸和氧化磷酸化过程，产生能量a t p 。它几乎是一切生命活动的基 础物质之一。但另一方面，氧气又是一切氧自由基的来源和引起氧自由基损伤的物质基 础。氧分子在生物体内经还原反应生成水的过程中，可以通过单电子还原反应，依次转 变为超氧阴离子自由基( 0 2 一) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 和羟自由基( o h ) 等中间产物( 如图1 1 所 示) ，由于这些物质都是直接或间接由氧分子转化而来，而且具有较氧分子活泼的化学 反应性，因而被统称为活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 1 1 。 0 2 sd 骂i - h 0 2 三乌o h 三sh 2 0 l ( p k a 4 8 ) h o o - 图1 - 1 氧分子还原生成活性氧的过程示意图【2 1 f i g 1 - 1 t h ep a t h w a yf o rt h ep r o d u c t i o no fr o sb yr e d u c t i o no f0 2 由于活性氧的性质都很活泼，反应性强，因此可以通过抽氢、歧化、化合、取代加 成等多种反应与细胞中的生物大分子发生反应，造成细胞的氧化损伤【”l ，包括蛋白质、 d n a 和脂类等。所以长期以来，活性氧一直被人们认为是一类损伤细胞的毒性物质， 但近年来的研究表明，活性氧对生物体既有损伤的一面，又有相对的积极意义，微生物 体内的活性氧是处于不断产生、不断利用又不断被清除的过程中，当活性氧不断产生增 加以致超出生物体的承受能力时就会对细胞产生危害，而生命的进化过程使得细胞逐渐 拥有了有效的抗氧化防御机制。 生物体的抗氧化防御系统根据其作用的部位和作用性质可以分为两大类。一类叫预 防性抗氧化剂，包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 、谷胱甘肽过氧 化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g p x ) 和谷胱甘肽还原酶( g l u t a t h i o n er e d u c t a s e ，g r ) 等，还 有金属螯合剂如e d t a 和去铁敏，它们的作用是阻断自由基的生成。其中，抗氧化物酶 类是微生物细胞中主要的自由基清除剂。另一类叫自由基捕捉剂，包括维生素c 、维生 素e 、酚类化合物、没食子酸和右旋儿茶素等。 过氧化氢酶( h y d r o g e np e r o x i d eo x i d o r e d u c t a s e ，c a t a l a s ee c1 1 1 1 6 ) 是生物体抗氧化 防御系统的一个关键之物，它可催化过氧化氢分解为水和氧气，使过氧化氢不至于与超 氧化物自由基反应生成有害的0 h ；并对血红蛋白及其它的含巯基蛋白质起到保护作用， 使它们不被氧化，对减轻活性氧损伤具有重要意义。 此外，近年来随着h 2 0 2 在纺织、造纸、制浆等行业的普遍应用，市场对c a t 的需 求也呈大幅增长趋势。其中，用c a t 去除氧漂后残留的过氧化氢是己建立的生物技术 婆堕盔堂婴主堂垡笙塞 在棉、纺织行业应用的一个最好例子。在染整工艺中使用过氧化氢酶替代多次清洗及化 学还原剂去除漂白液中残留的h 2 0 2 ，具有很大的经济优势和环保优势。因此，应用氧 化胁迫有助于生物体产生高量过氧化氢酶的原理来生产纺织用酶，对于实现清洁生产具 有不可忽略的意义。 1 1 1 活性氧的种类及其性质 ( 1 ) 超氧阴离子自由基 0 2 一是基态氧接受一个电子形成的第一个氧自由基。自从上世纪6 0 年代m c c o r d 和 f r i d o v i c h 发现超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 是生物体中专一清除0 2 - 的酶 以来，0 2 一的生物化学研究引起人们广泛的兴趣。f r i d o v i c h 提出氧毒性的0 2 一学说主要 依据为：所有的需氧生物体内均可产生0 2 一；0 2 一可损伤重要生物分子，造成机体 的损伤；需氧生物体内s o d 可清除0 2 一，故可在空气中生存，而不需要氧的生物体 内缺乏s o d ，故在有氧的环境中不能抵御0 2 一的毒害，以致不能生存。与其它氧自由基 相比，0 2 一不很活泼，在水溶液中的存活时间约为1 秒钟，在脂溶性介质中的存活时间 约为1 小时【3 1 。因此许多学者曾经认为其毒性可能不大。其实，正是由于它寿命较长， 使其能够从生成位置扩散到较远的距离达到靶位置，从这种意义讲，0 2 一具有更大的危 险性。另外，由于它是生物体中第一个生成的氧自由基，又是所有氧自由基的前身，可 以经过一系列反应转化为其它的氧自由基，因此对于生物体具有重要的意义。据报道， 0 2 一可降低乌头酸酶，延胡索酸酶，二羟基酸脱水酶与n a d h 脱氢酶的活性，而且还可 与核糖核甘酸还原酶的酪氨酸自由基结合，从而使该酶失去活性【4 ，5 6 】。 微生物体内产生0 2 一的途径有很多，主要包括酶促反应和非酶促反应。非酶促反应 主要是指诸如甘油醛，还原型核黄素，血红蛋白等生物分子的氧化过程中能产生0 2 - ； 酶促反应主要是指一些酶类如黄嘌呤氧化酶，n a d p h 氧化酶，谷胱甘肽还原酶等都可 以催化一些反应产生0 2 一【7 】o 氧化线粒体传递链是细胞中产生活性氧的主要部位，在正 常生理条件下约有2 的氧分子从呼吸链泄露生成了活性氧【8 】。因此线粒体也是细胞中 最容易受到活性氧攻击的部位。细胞核膜也含有电子传递链，也可以将电子漏传给氧气 产生0 2 一，由于产生的活性氧更接近细胞核d n a ，对细胞的危害性就更大。 虽然0 2 一的化学性质不是很活泼，但它具有多种的反应性，既可作为还原剂和氧化 剂又可以作为碱、亲和物和配体参与反应。更为重要的是，0 2 一能够与h 2 0 2 发生h a r b e r w e i s s 反应生成o h ( 反应式1 1 ) ，这也是0 2 - 对细胞产生氧化毒性最主要的反应。 凰q + q 一_ 1 q + 肋+ d h 一( 1 - 1 p 这个反应本身很难进行，但在f e 2 + 的催化下，反应效率大大提高 凡2 + + e q _ 肋+ d 日一+ n “( 1 - 2 p 凡3 + + d ，一_ 1 d ，+ 凡2 + f 1 3 ) 反应式( 1 2 ) 也称为f e n t o n 反应，它也是产生o h 常用的方法。 在水中，0 2 一可视为碱性成分。它可以接受一个矿形成质子化的自由基h 0 0 h 0 0 2 墨二兰堑笙 也可以再分解为0 2 - 和旷，两者在水溶液中保持平衡，p k a 约为4 。8 。0 2 一和h o o 的性 质差别很大，0 2 一带有负电荷，是亲水性的，因此不能穿过细胞膜；而h o o 不带电荷， 是疏水性的，可以穿过细胞膜，并在膜的疏水区聚集，由于h 0 0 的氧化能力远比0 2 一 强，同时细胞表面的p h 接近酸性，因此更有利于h o o 的生成，这就为细胞膜的脂质 过氧化创造了充分的条件。h o o 相对0 2 - 是很强的还原剂和氧化剂，有研究表明【9 】，h 0 0 可直接氧化n a d h ( k = i 8 x1 0 5l m o l - t s - 1 ) ，h o o 还原细胞色素c 的速率常数为2 xi 0 6 l m o l q s ，而对于0 2 一，只有2 6 x 1 0 5 l m o l 1 s 一。在生理条件下，细胞内生成的主要是 0 2 一，只有少量的转化为h 0 0 ，但由于形成的h o o 更接近细胞( 器) 膜，因此对细胞的 损伤程度更大。 ( 2 ) 羟基自由基 o h 是已知的氧化能力最强的自由基，它比高锰酸钾和重铬酸钾的氧化性还强，反 应性极强，寿命也很短，在水溶液中的存在时间仅为1 0 币秒，它几乎可以和所有的细胞 成分发生反应，如糖、磷脂、氨基酸、d n a 碱基和有机酸等。因此o h 也被认为是毒 性最大的氧自由基。研究表明几乎所有的活性氧对生物体的毒性作用都与o h 有关。o h 主要的反应类型包括抽氢反应、加成反应和电子转移反应。通过这些反应，o h 可以从 磷脂中抽氢，启动脂质过氧化反应；与d n a 和r n a 的嘌呤和嘧啶碱基发生加成反应， 在氧气存在的情况下，进一步反应生成胸腺嘧啶自由基，甚至引起键的断裂，若细胞无 法修复这些严重的损伤，则会引起细胞的突变和死亡；同时- o h 还可以从0 2 一得到一个 电子变为o h 一，并使0 2 - 变为单线态氧【l 0 1 。 在生物体中，o h 的产生途径主要是f e n t o n 和h a r b c r - w e i s s 反应；带有醌型的抗肿 瘤药物在体内代谢过程中也可能产生o h ；黄嘌呤氧化酶、鸟嘌呤环化酶、微粒体乙醇 氧化体系在反应过程中也会产生o h 。除此之外，离子辐射和臭氧也能够产生一定数量 的o h 。 ( 3 ) 过氧化氢 h 2 0 2 是氧气二电子的还原产物，与其它自由基相比，h 2 0 2 的性质较为稳定。有研 究表明，在3 0 时，纯的h 2 0 2 一年中的分解率仅为1 ，只有在混有少量的杂质或在 加热、光照的条件下它的不稳定性才会表现出来，但大多数情况下是不能立即分解完全。 h 2 0 2 具有较强的氧化性，它可以直接氧化一些酶的巯基，使酶失去活性，如甘油醛 3 磷酸脱氢酶。同时h 2 0 2 还可以通过非酶反应氧化丙酮酸。虽然通过0 2 一或h 0 0 的自 动歧化反应可以产生h 2 0 2 ，但是在p h 为7 4 的生理条件下，主要还是0 2 一的产生。0 2 一的歧化反应速度极为微小，几乎达到不会发生的程度，因此在生物体内通过非酶促反 应产生h 2 0 2 的可能性是很小的【l l 】。 在生物体内产生h 2 0 2 的酶促反应是比较多的，如黄嘌呤氧化为尿酸，d 氨基酸氧 化为酮酸，d 葡萄糖氧化为d 葡糖酸内酯，胺类化合物氧化为醛类以及0 2 一在s o d 作 用下的歧化反应。线粒体内质网产生的0 2 一是h 2 0 2 产生的主要来源，其h 2 0 2 产量约占 氧耗量的1 7 【1 2 】。 ( 4 ) 其它种类的活性氧 3 婆堕盔堂堡主堂垡丝塞 除了0 2 一、h 2 0 2 和o h 外，微生物体内的活性氧种类还有单线态氧( 1 0 2 ) 、一氧化氮 ( n o ) 以及脂质过氧化中间物。1 0 2 是普通氧的激发态，能量极高，极易衰减为基态氧。 单线态氧没有太大的生物意义，但因解除了自旋限制，反应性极强，很容易与一些物质 发生反应，包括维生素e 、d n a 、氨基酸等。n o 是最小的几个分子之一，在分子轨道 上含有一个未成对电子。n o 可以与0 2 一以极快的速度反应生成过氧亚硝基o n o o 及其 质子化产物o n o o h ，它们的部分化学性质类似o h ，可以看成活性氧和活性氮，或显 示具有活性氧和活性氮双重作用的活性物质。 1 1 2 环境与自由基 自由基的产生主要有两种途径：其一是来自生物体内，生物体内也会自然产生自由 基，这是生物体代谢过程中的正常产物。除此之外，环境也会产生大量自由基，如环境 污染、紫外线照射、室内外废气、化学试剂等，都会直接导致生物体内产生自由基( 活 性氧) ，从而对生物体产生危害。 ( 1 ) 化学试剂与自由基 除草剂 i 除草剂和自由基 i 除草剂对植物的危害 目前使用比较广泛的两种除草剂百草枯( p a r a q u a t ) 和杀草快( d i q u a t ) 属于双吡啶化合 物。这两种除草剂很容易穿过叶绿体膜，从与光系统相联的非血红素铁蛋白接受一个电 子，也可以从铁氧还蛋白- n a d p h 还原酶活性位置上接受一个电子，形成自由基。若用 p a r a q 2 + 表示除草剂，这一过程可以用下列反应表示： 砌r a q “ 由罕竽) p a r a q + ( 1 4 ) p a r a q + + q 中p a r a q 2 + + 晖( 1 - 5 ) 厶二 反应中生成了0 2 。因此用百草枯和杀草快处理过的叶绿体会导致氧的快速吸收。 i i 除草剂对动物的危害 在有n a d p h 存在时，动物的肺组织的微粒体可以还原百草枯形成自由基，然后百 草枯自由基和氧反应生成0 2 。大鼠静脉注射百草枯，很快引起肺戊糖磷酸支路活化。 用百草枯处理肺组织，脂肪酸合成减少，在蛋白质s h 基和氧化谷胱甘肽之间形成的混 合二硫键增加【1 3 ，1 4 1 。 卤代烃和自由基 i i 四氯化碳 因为四氯化碳很容易溶解油污，所以它是很多干洗液的成分。四氯化碳的脂溶性使 得它可以快速穿过细胞膜，一旦吸入体内就会很快分布到全身的各个器官，其主要的毒 害对象是肝脏。肝脏的内质网的结构此时会发生变化，肝脏蛋白质合成变慢，位于内质 网的葡萄糖6 磷酸酶和p 4 5 0 体系酶活性降低。四氯化碳的毒性作用主要是由于它是肝 细胞色素p 4 5 0 体系的底物，当有n a d p h 存在时，四氯化碳就能使n a d p h 细胞色素 4 第一苹绪论 p 4 5 0 还原酶发生作用，微粒体迅速过氧化，酶失活，细胞色素分解。四氯化碳可能被 p 4 5 0 体系首先代谢成了碳中心的三氯甲烷自由基，而三氯甲烷自由基能直接同生物分 子结合引起共价修饰，从膜脂夺氢启动脂质过氧化，而脂质过氧化的产物可以使得葡萄 糖6 磷酸酶失活【1 5 】。 氯仿 氯仿对肝的损伤作用比四氯化碳小，对分离的肝微粒体脂质过氧化的启动速率较 低。这可能是由于均裂氯仿产生三氯甲烷自由基所需能量比四氯化碳高。氯仿的毒性可 能是由于肝p 4 5 0 体系代谢的结果，代谢产物同细胞膜分子共价结合，氯仿代谢过程也 产生光气。 溴代乙烷和溴苯 溴代乙烷广泛用于汽油的“铅清除剂 和工业溶剂，但它是一个突变剂和致癌物， 特别能引起自由基参与肝和肾的损伤，溴代乙烷可以同g s h 共轭代谢形成硫醚或被细 胞色素p 4 5 0 体系氧化通过自由基中间物生成溴代乙醛。毒性剂量的溴代乙烷引起g s h 快速消耗和脂质过氧化。溴苯在肝中也会产生快速消耗g s h 和引起脂质过氧化【1 6 】。 v 卤代烷 用卤代烷和鼠肝微粒体共同培养，在n a d p h 存在时，用p b n 捕集到形成的自由 基。卤代烷同肝微粒体共同形成活性中间代谢产物，可以共价结合到膜上，引起脂质过 氧化。细胞色素p 4 5 0 和卤代烷作用形成的自由基之一为f 3 c c h c l ，该自由基可以和氧 结合形成反应性很强的过氧自由基1 7 1 。 ( 2 ) 空气污染与自由基 臭氧 臭氧是目前空气污染的一个严重问题。臭氧在大气高层发挥着重要作用，但如果它 在大气底层就是一个严重问题。空气中的氧化氮和少量烃类的光化学反应就可以产生臭 氧。汽车尾气正是这样一种混合气体。臭氧是强氧化剂，可以导致脂质过氧化，在水溶 液中可以产生h o 。h o 可以消耗肺中的抗坏血酸，维生素e 和谷胱甘肽，通过氧化q 一 抗蛋白酶的甲硫氨酸使其失活。将成年大鼠预先放在臭氧中，可以使鼠肺中s o d 、c a t 、 g s h 过氧化物酶和葡萄糖6 磷酸脱氢酶活性增加。臭氧也能使大肠杆菌合成s o d 和 c a t 的量增多。 二氧化硫 在城市，另外一个空气污染是s 0 2 。它是含硫燃料燃烧时形成的无色、令人窒息的 气体，s 0 2 溶于水可逆地生成亚硫酸并离解生成相应的酸根离子。 s q + 吼0 声- - - - - i 4 ：s 0 3 # 2 h + + h s q # i 2 日+ + 鹏卜 ( 1 - 6 ) 亚硫酸根离子也可以直接进入人体，常被用作酒和食物的保护剂，可以被亚硫酸氧 化酶氧化成硫酸( 5 0 4 2 0 。但s 0 3 2 。也可参与脂质过氧化启动反应而刺激自由基的产生。 粉尘 城市大气被污染后，其上空的自由基占分子污染物总量的1 1 0 ，它们来源于 燃料废气、香烟及一些粉尘。现在对大气可吸入粉尘( p m l 0 ) 和内燃机燃烧颗粒( d e p ) 的 5 坚堕盔堂堡主堂垡丝塞 研究已成为热点。d o n a l d s o n 等的研究表明，p m i o 通过产生h o 造成对d n a 的损伤， 且p m i o 的活性或来源于粉尘本身成分，或来源于粉尘释放到溶液中的自由基产生体系。 a t h a n a s i o s 等研究了大气悬浮微粒、d e p 和汽油燃烧颗粒以及城市街道粉尘，认为在 h 2 0 2 的存在下，这些粉尘都能在磷酸缓冲溶液中产生h o i s 】。 ( 3 ) 电磁辐射污染与自由基 目前高频与微波技术已广泛应用于各个领域，人们的生产和生活环境也不可避免地 受到了电磁污染。可见光、紫外光、x 射线和其他能产生电离作用的射线都称为电磁辐 射，它们所提供的能量也能使共价键裂解生成自由基。生物体中的蛋白质和核酸等成份 是极易吸收辐射而产生自由基的，酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、色氨酸和半胱氨酸对光 都很敏感l l 引。 ( 4 ) 重金属污染与自由基 由于工业废水未加处理排放或进行不合理污水灌溉，重金属污染水体和土壤，并进 一步危害生物。研究表明，重金属对生物的伤害与自由基有关：铁铜离子会增加自由基 反应速率，另外一些金属离子，如p b 2 + 、c 0 2 + 、h 9 2 + 、n i 2 + 、c d 2 + ，常常会增加分离细 胞的脂质过氧化，毒害和损伤组织【2 u 川。 1 1 3 活性氧对生物体的氧化损伤及修复作用 ( 1 ) 活性氧对蛋白质的氧化损伤及修复 活性氧对蛋白质的损伤是对生物体造成的最严重的危害。活性氧会通过氧化蛋白质 中的半胱氨酸与甲硫氨酸使得生物体内许多酶活性降低，甚至丧失。金属离子介导的活 性氧产生体系，如n a d ( p ) h 氧化酶n a d ( p ) h 0 2 f e ( r i ) ，黄嘌呤氧化酶黄嘌呤 f e ( 1 1 1 ) 0 2 ，p 4 5 0 p 4 5 0 还原酶f e ( 1 t i ) n a d p h 0 2 均可使蛋白质发生损伤。其作用机制是 金属离子进入蛋白质分子，在体系中产生o h 作用下，蛋白质发生氧化损伤。此外，活 性氧还可通过对芳香族与杂环氨基酸残基及脂肪族氨基酸残基的修饰，或经由肽的折 断，或蛋白质问的相互交联而损伤蛋白质。对于己受损的含s h 蛋白质，生物体会在谷 氧还蛋白( g l u t a r e d o x i n ) ，谷胱甘肽还原酶( g l u t a t h i o nr e d u c t a s e ) ，硫氧还蛋白( t h i o r e d o x i n ) 与硫氧还蛋白还原酶( t h i o r e d o x i nr e d u c t a s e ) 的作用下将其修复；也可通过蛋白酶的催化， 将蛋白质降解为氨基酸，其中未损伤的氨基酸进入氨基酸库，进行蛋白质的重新合成， 而氧化损伤的氨基酸只能进入分解代谢，作为碳的来源被利用。 ( 2 ) 活性氧对d n a 的氧化损伤及修复 活性氧对d n a 分子的攻击可分为d n a 分子的碱基修饰，d n a 单双键的断裂等田】。 研究发现，自由基极易与亲核性的d n a 分子结合，导致d n a 碱基的修饰改变，其中 鸟嘌呤c 8 位的氧化( 形成8 - o h d g ) 是最多见的，d n a 链中8 - o h d g 的存在，可以引起 d n a 复制时碱基的错误配对及编码，导致基因突变。此外，活性氧还可使d n a 中脱氧 戊糖的每个碳原子和o h 上的氢都能与o h 反应，在碳位上抽氢加氧，导致碱基不稳定 键的形成，糖基的结构受到破坏。活性氧还可以直接攻击d n a 分子引起d n a 链断裂 和d n a 的交联，其中o h 的作用更为突出。细胞的d n a 损伤后，生物体可通过碱基切 除，核甘酸切除等手段修复受损的d n a ，但参与d n a 修复的酶也同时受到自由基的攻 6 第一章绪论 击而影响其功能的发挥，因此修复过程可能会出现编码的错误，导致基因突变，甚至引 起细胞的死亡。由于线粒体是细胞产生活性氧的主要部位，因此线粒体中的d n a 与核 d n a 相比更易受到活性氧的攻击，有研究表明前者受到活性氧攻击的频率是后者的 1 0 0 0 倍。 ( 3 ) 活性氧对脂类的氧化损伤及修复 脂质中的不饱和脂肪酸含有多个双键，化学性质活泼，最易受到自由基( 特别是o h ) 的攻击而引起氧化反应。其中磷脂富含多不饱和脂肪酸又是构成生物膜的重要部分，因 此自由基能够影响生物膜的生理功能，造成细胞代谢的极大紊乱。自由基与多不饱和脂 肪酸的反应是典型的自由基链式反应。用o h 发生体系产生o h ，从磷脂的多不饱和脂 肪酸分子中抽提一个氢原子，则o h 与h 结合生成h 2 0 ，而脂质( l h ) 成为l ，然后l 与0 2 反应，生成脂质过氧基( l 0 0 ) 。( l 0 0 ) 再从另一磷脂的多不饱和脂肪酸分子抽取 一个氢原子，成为l o o h ，同时又生成新的l ，重复上述反应，成链式传播，持续进行。 o 日+ l 日哼三+ 日d ( 1 7 ) 一 + o ，争e 0 0 - ( 1 8 ) 一 z o o + 厶日争l o o h + ( 1 9 ) 经脂质过氧化后，生物膜中联结磷脂上的脂肪酸的脂质过氧化物就是磷脂氢过氧化 物，可被磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶识别，并在该酶的作用下由l o o h 转变为 l o h ；或在磷脂酶a 2 及c a 2 + 存在下，被切去而磷脂成为溶血磷脂，通过脂肪酰辅酶a 的再酰化作用，补入另一不饱和脂肪酸。此外，脂过氧自由基还可以形成环氧化合物和 内环氧化合物自由基，最后断裂生成各种醛类和短链烃类【l 】。 1 1 4 微生物体内