（环境工程专业论文）毛细管扩散微滴定技术及其应用研究.pdf

浙江大学硕士学位论文摘要 摘要 本文提出了一种新型的微滴定技术，滴定试剂经毛细管扩散到样品溶液完成 微滴定过程，采用指示剂法和自制红外光光电检测器检测微滴定终点，建立了计 时微滴定分析方法。通过影响毛细管扩散微滴定扩散速率各项因素分析，在相同 的试剂贮液器液位高度和搅拌速率的情况下，扩散速率只与毛细管的内径、长度 等特性有关，而与待测样品溶液浓度、滴定反应类型无关，为计时法计量微滴定 试剂用量提供了依据。同时对称重法和计时法所得的结果进行了比较，两者的相 对误差均小于1 2 。用常规滴定分析对毛细管扩散微滴定技术进行了可行性论 证，显著性检验表明两种方法不存在系统误差，毛细管扩散微滴定方法是可行的。 微滴定方法的重现性优于常规滴定分析。 ；设计和制作了一套微型蒸氨预处理装置，以微型试管代替传统法使用的圆底 烧瓶，采用氮气来加速氨的逸出速率，样品用量只需1 om l ，且可以在低温下进 行操作。与常规蒸氨预处理装置相比，设备更简单，操作更方便，且可以同时处 理多个样品。使用微型蒸氨预处理装置及毛细管扩散微滴定技术测定了水样中铵 离子浓度，得到了最适宜蒸馏时间和蒸馏温度分别为4 5 m i n 和6 0 。c ，装置的氨蒸 出率均大于9 2 0 ，平均回收率为9 7 0 。毛细管微滴定测定水样中铵离子浓度 结果与纳氏试剂比色法结果基本一致“ 毛细管微滴定技术+ 已用于酸碱滴定、氧化还原滴定、水样和降尘中铵离子浓 度的测定，样品用量小到5 0 0 儿。 ，拶岩 关键词：毛细管，微滴寇7 扩散速率，微型蒸氨装置，微波消解， 红外光电检测器 感谢浙江大学曹光彪高科技基金和国家自然科学基金( 2 9 8 7 7 0 2 3 ) 对本课题的资助。 塑坚奎兰堡主兰垡堡苎 垒! ! ! 竺! a b s t r a c t an o v e lm i c r o - t i t r a t i o nm e t h o dw a sd e v e l o p e db yu s i n gf u s e ds i l i c a c a p i l l a r y c o l u m na sv o l u m e t r i cm i c r o b u r e t t e ，a c i d b a s et i t r a t i o na n do x i d a t i o n r e d u c t i o na st h e m a i nt y p e s ；b o t hi n d i c a t o ra n di n f r a r e dd e t e c t o rw e r eu s e dt od e t e c tt h ee n dp o i n t c o m b i n e dw i t hp r e d i s t i l l a t i o ns y s t e m ，t h i st e c h n i q u eh a db e e na p p l i e dt od e t e r m i n e a m m o n i u mi o ni nw a t e ra n d p a r t i c l e s t h ee f f e c t so fm a n yf a c t o r so nd i f f u s i o nr a t ew e r ea l s o s t u d i e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ed i f f u s i o nr a t e sw e r e o n l y r e l a t e dw i t ht h ei n n e rd i a m e t e ra n d l e n g t ho f c a p i l l a r y a tt h es a m el e v e l o f r e a g e n t r e s e r v o i ra n d m a g n e t i cs t i r r i n gs p e e d i np r a c t i c a l o p e r a t i o n ，d i f f u s i o nr a t em a yb es i m p l yc h a n g e db ya d j u s t i n gt h el e n g t ho ri n n e r d i a m e t e r o f c a p i l l a r yc o l u m t os u i ta n a p p r o p r i a t ed e t e r m i n a t i o n am i c r o d i s t i l l a t i o nd e v i c ew a sa l s o a s s e m b l e d ，a n dt h ef a v o r a b l ed i s t i l l a t i o n t e m p e r a t u r ea n dt i m ew e r e6 0 。ca n d4 5m i n ，r e s p e c t i v e l y c o m p a r i s o nw i t ht h e t r a d i t i o n a lp r e d i s t i l l a t i o nd e v i c e ，i ti ss i m p l ei no p e r a t i o n ，l o w e r o p e r a t i n gt e m p e r a t u r e ， o n l y1 0m ls a m p l en e e d e da n dm a y b et r e a t e ds e v e r a ls a m p l e ss i m u l t a n e o u s l y u s i n g t h i sm i c r o d e v i c e ，a m m o n i ad i s t i l l a t i o nr a t i o sw e r ea l lo v e r9 2 0 a n dt h em e a n r e c o v e r yw a s 9 7 o b y m e a n so fs t a t i s t i c a l c a l c u l a t i o n ，t h e r e s u l t so b t a i n e d b y d i f f u s i o n a l m i e o t i t r a t i o nw e r e c o r r e s p o n d e n t t ot h o s eb yt r a d i t i o n a lt i t r a t i o n k e y w o r d s ：c a p i l l a r y , m i r o t i t r a t i o n ，d i f f u s i o nr a t e ，m i c r o d i s t i l l a t i o nd e v i c e ， m i c r o w a v e d i g e s t ，i n f r a r e dd e t e c t o r 浙江大学硕十学位论文 第一章前言 第章前言 随着工业、农业的迅速发展，人们的生存环境正不断受到各种污染物不同程 度污染各种水体受到侵蚀、空气质量下降。依据国家制定的有关环境质量控 制标准，我们需要借助各种监测手段来评价受污染的程度，如废水中有机物的含 量测定、富营养化因子氨氮含量的分析等等。不仅为废水的处理工艺及其处理方 法的研究提供依据，而且通过水质分析结果及时掌握废水处理过程中污染物在各 个阶段的降解程度及其降解行为。虽然现有的各种仪器分析方法很多，但许多项 目的监测仍需化学分析，如评价水体有机物含量的一项指标一一化学需氧量 ( c h e m i c a lo x y g e nd e m a n d ，简称c o d ) ，国家标准方法即是常用的返滴定技术； 测定含干扰组份较多的废水中氨氮含量，通常将废水蒸馏预处理，释出的氨经吸 收液吸收后，采用酸滴定方法来得到氨氮含量的数值等等。 滴定分析是定量分析中较为可靠、精确度较高和应用广泛的方法之一“3 。滴 定分析通常是将标准滴定试剂通过滴定管滴加到含有指示剂的试样溶液中，借助 指示剂的颜色变化作为化学计量点到达的信号。根据滴定反应达到化学计量点 时所消耗标准溶液的体积和浓度计算待测组分的含量。但是，传统滴定分析方法 的使用具有局限性：第一，试剂消耗量很大，一方面使实验室废水量明显增加； 另一方面，如果实验试剂昂贵，则会提高整个分析成本：第二，对于一些毒性较 大的分析试剂，势必会造成环境污染以及对操作人员健康构成伤害；第三，待测 样品用量小于1 0 0 “1 时，传统滴定技术显得精确度过低而不能满足分析要求“1 。 然而，在实际应用中，微量滴定分析的需求越来越大，特别是样品供应量有限及 一些稀有金属、贵重样品的分析时，希望样品的用量越少越好。因此，在保证实 验结果精确度的前提下，使滴定装置微型化，既能减少试剂的消耗量、降低成本， 又能做到操作方便、快速，实现微滴定技术具有重要意义，迎合了绿色化学的需 求。 本文建立了一套微型滴定分析装置，即采用熔融石英毛细管作为试剂扩散通 道，试剂在扩散和重力影响下经毛细管扩散到样品溶液，实验以酸碱滴定、氧化 还原反应为主要滴定反应类型，根据溶液中指示剂的颜色变化情况，分别采用指 示剂法和红外光光电检测器两种方法来检测滴定终点；以称重和计时相结合的方 法来计量试剂用量，同时对所得结果进行评价。 为了验证毛细管扩散微滴定技术在环境监测中的应用，选择了水样、小球藻 浙江大学硕上学位论义第一章前言 及降尘中的铵离子或氨氮浓度测定为应用实例。建立了一套与毛细管扩散微滴定 规模相配套的微型蒸氨预处理装置，用于样品的预处理。使用该微型装置，完成 了以上样品的分析，不仅使分析时间大大缩短，而且可以同时处理多个样品，提 高了分析效率。通过小球藻及降尘中氨氮含量的测定，发现毛细管微滴定技术还 适用于测定固态样品基质中的有机氮含量的测定。 随着该项技术的不断完善，这一技术的应用范围可以扩展到工业、环境、医 学等微量样品分析过程。 浙江大学硕_ 上学位论文 第一章文献综述 第二章文献综述 微型化学实验是近些年来国内外迅速发展的一种实验方法与技术。国内也相 继出现了许多微型、半微型实验装置，其试剂用量约为对应常规实验的数十分之 一，并在教学、科研和实践中得到了广泛的应用。微型滴定技术随着微型化学实 验的出现而产生，并且微滴定技术在化学定量分析及工业、医学、环境中的应用 也越来越多。 2 1 微量滴定技术 2 1 1 微滴定的方法及装置 目前，国内大多数微滴定操作方式基本上停留在常量滴定分析基础上，操作 过程相似，不同之处是微滴定所用仪器的尺寸比常量滴定分析仪器小得多。常用 的微滴定装置有：微型滴定管( 1 5 m 1 ) 、微型滴定盘、微型容量瓶、微型锥形瓶 等等，样品和试剂的消耗量均在0 5 m l 以上。经过多年的努力，相继出现了一些 新的微滴定装置，而且自动微滴定技术也已初见成效。 1 微量滴定管 在9 0 年代，刘金霞等人。1 对微量滴定装置及滴定分析微量化进行了初步的 探讨，自制了微量滴定装置用精度为0 0 0 1m l 的色标吸量管代替常规滴定 法中所用的酸式或碱式滴定管，色标吸量管和注射器之间采用乳胶管连接，通过 注射器内的弹簧伸、缩来移取滴定试剂、控制滴定速度，滴定所耗的试剂量直接 从吸量管的刻度读出。虽然该滴定方法在操作误差和精度方面与传统滴定装置相 当，但文中采用玻璃棒搅拌样品溶液欠合理，因为样品量本身只有0 5m 1 ，一 方面容易引起样品溶液的挥发和搅拌损失，另一方面会加速空气中的气体如c o 。 溶解到样品溶液中，影响最终的实验结果，特别是碱性样品溶液。 曹玉华等人也提出了自制的微型滴定装置”1 ，2m l 吸量管的下端接废旧的医 用输液管和4 、5 号针头( 1 m l 试剂a 1 7 0 滴) ，上部接5 c m 左右的乳胶管制成微 滴定管，试剂用量1 5 - 1 8 m 1 。采用螺旋夹控制液滴速度。得到的结果与理论值 接近，而且精度和方法的重现性均比较满意。 陆俭洁5 3 采用2 m l 微量滴定管完成了重铬酸钾法测定铁矿石中铁含量的实 浙江大学硕 学位论文 第二章文献综述 验，并且采用毛细滴管滴加溶液提高准确度。 2 微量注射器 徐春放提出了采用5 m 1 废旧、带针头的医用塑料注射器来代替传统的滴定管 进行无汞定铁微滴定实验”1 。通过手动的方法控制注射器滴加试剂的速度，采用 微量注射器滴加试剂操作费力，特别是滴加试剂量较多时，操作欠方便，而且难 以做到均匀滴加。 3 自动微量滴定方法 自动化滴定分析操作是分析发展的方向，也是每一个分析工作者的愿望。目 前自动化滴定分析已初见成效。比如自动电位滴定仪，上海天美科技有限公司已 经推出了自动滴定计量器以及由计算机控制的全自动滴定系统。1 9 9 4 年，谭爱民 等”1 提出了流动注射式微滴定分析法。该法采用一个特制的、由有机玻璃制成的 滴定池( 1 0 m 1 ) ，流动注射装置采用l z 一1 0 1 0 型蠕动泵和l z 一1 0 3 0 型旋转式自动 阀，采用光电检测连续检测滴定终点，用于终点检测的发光二级管( l e d ) 和光敏 三级管固定在滴定池池壁上，采用单片机自动计时。 瑞士梅特勒一托利多d l s o 型滴定仪，自动电位滴定仪”1 是利用化学反应所引 起的物质的电位变化进行化学分析，由仪器自动判断滴定终点，实验结果由仪器 自动记录，因此自动电位滴定法可以消除人工操作所带来的误差。自动电位滴定 ( e l e c t r i c a lp o t e n t i a lt i t r a t i o n ) 的特点是无需指示剂，对有色试样、浑浊 和无合适指示剂的试样均可使用，其使用范围也从环境、化工等领域扩展到食品 卫生检疫方面。 2 1 2 滴定终点的判别 常规人工滴定方法通常根据指示剂的颜色变化指示滴定终点，然后目测标准 溶液消耗的体积来计算结果。由于人们对颜色的敏感程度不同，目测法存在主观 误差，而且实验结果有时还会受到指示剂变色范围的限制。特别是随着定量分析 的微型化，单独凭借指示剂变色指示剂法引起的人为误差会更大，从而影响 实验结果的准确度和重现性。仪器法是利用滴定体系或滴定产物的光学、电化学 性质的改变，用仪器检测滴定终点，因此将指示剂法与仪器法相结合来确定终点 或用仪器方法自动检测滴定终点可以提高微滴定分析方法的精密度、准确性，比 如，通过仪器检测光透过率的变化来指示终点的光电检测方法；根据电位的变化 由仪器自动判断终点的自动电位滴定法；根据反应热的多少来判断滴定终点的量 热法等等。 4 浙江人学硕士学位论文 第= 章文献综述 2 1 3 试剂用量的计量 常量滴定分析，试剂用量一般直接从滴定管上读取数据。但是随着分析样品 用量的减少，受传统滴定管最小读数的限制，结果就显得不够精确。随着滴定装 置的微型化，现已相继出现了不同的计量方法。 1 直接读数法 随着滴定规模的逐渐缩小，常量滴定分析所用的酸式、碱式滴定管的读数误 差以及滴定过量引起的误差也越来越大。比如，滴定试剂用量为l m l 时，常量分 析滴定管过量1 滴的量约为0 0 2 o 0 4 m l ，则过量一滴的量占总滴定量的2 4 。为了克服上述问题，人们相继制造出各种各样高精度的微型吸量管，其最小 读数为0 0 0 1 0 0 0 2 m l ，比常规滴定管的最小读数( 0 o l m l ) 提高了1 0 倍。因 此采用高精密度的微型吸量管进行微滴定，而且数据直接从吸量管刻度读出，操 作较为方便。 2 称重法 徐春放在微型称量滴定无汞定铁法一文中提出了称量法作为计量试剂消 耗量的方法。该法要求所用的试剂及样品的浓度采用质量摩尔浓度。通过称量盛 有试剂的医用注射器滴定前后的重量，利用差减法得到反应所耗的试剂量。称量 法应该说比较精确，但是称量注射器比较麻烦，同时还应考虑到试剂是否会渗漏 等问题。 3 量热法 从热力学角度看，通过反应的热力学数据( 如反应热) 可以计算出反应进行 的程度。目前，微量滴定热量计大多用于热力学机理的研究，文献。1 采用量热法 对十二烷基硫酸钠( s d s ) 和双十二烷基二甲基溴化铵( d d a b ) 自发形成囊泡热力 学及其相转变进行了研究。文献“”采用等温微量滴定量热仪对锌硫蛋白和脱金属 硫蛋白与c d 2 + 、p b ”络合反应的热效应进行计量。但是对于一般的滴定过程，由于 反应热效应很小，采用量热法不是很理想。 4 计时法 谭爱民等人设计了一套流动式自动微滴定方法”1 。该法采用光电检测器检测 滴定池内指示剂变色情况，整个微滴定从滴定开始到滴定终点所耗的时间由单片 机自动计录，同时操作过程中要求控制试剂注入滴定池的速率并保持匀速。滴定 所耗试剂用量即为试剂注入滴定池速率与滴定时间的乘积。因此通过实验发现， 试剂用量与滴定时间成线性关系，试剂注入速率即为直线的斜率，因此只要控制 合适的试剂流动速率，通过计时法来得到试剂用量使操作变得非常简单。计时法 值得借鉴，关键是怎样才能保证试剂匀速地添加到样品中，特别是微型化实验， 浙江大学硕f ：学位论文 第二章文献综述 样品用量一般只有零点几毫升甚至几微升，有没有必要采用蠕动泵来匀速添加试 剂，值得进一步探讨，我认为应该寻找一些其它更简单的方式来解决微量滴定过 程试剂添加的问题。 5 计滴数法 计滴数法是指采用微型滴定管进行微滴定时，对整个微滴定过程中所耗的试 剂量采用计滴的方法。计滴数法必须先知道单个液滴的体积。单个液滴的体积乘 以所耗试剂滴数即为试剂用量。因此，计滴数法要求先测出微型滴定管单个液滴 的大小，然后根据滴定开始至滴定到达终点时所耗试剂的总滴数来计算试剂用量 体积。计滴数方法虽然传统、设备简单，但是试剂消耗量较大时，不仅滴定时间 长，而且由于滴数过多，人工数滴数很容易出差错。比如说，采用微型滴定管来 进行滴定，消耗l m l 试剂，与传统的滴定相比，滴定规模缩小了，但是微型滴定 管单个液滴的体积也随着减小，因此滴定规模缩小不等于试剂液滴滴数减少。文 献1 采用改进后的微型滴定管，单个液滴体积为0 0 1 2 0 0 2 2 m l 时，消耗l m l 试剂就有8 3 4 5 滴，人工计数很容易产生误差。建议采用仪器自动计数较为准确， 计滴数法作为微升级试剂用量的计量较为合理。 2 2 膜扩散微滴定技术 国外g r a t z l 等人从8 0 年代初就开始研究微量滴定技术，特别是膜扩散微滴 定( d i f f u s i o n a lm i c r o t i t r a t i o n ) 技术的研究，在膜的制备、保存及固定形式、 样品液滴的制备、微滴定装置的设计、改进、微滴定反应终点的检测、数据处理 及微滴定技术的应用等方面都已取得了较大地进展，待测样品用量由l o o g l 减小 到微微升甚至毫微微升级。 2 2 1 膜扩散微滴定方法简介 在常量( 或半微量) 滴定分析过程中，试剂主要通过手控方法滴加到样品溶 液中，为了使试剂与样品溶液混合均匀，通常采取摇动锥形瓶或使用磁力搅拌器 等方式。1 9 8 8 年，m i k l o sg r a t z l 首先提出了一种新型的扩散微滴定技术。 扩散微滴定是指滴定试剂在扩散和毛细管力的作用下，通过膜( 通常采用琼 脂膜) 扩散到微量样品溶液或液滴中进行滴定的过程。扩散微滴定技术完全改变 了常量、半微量滴定分析中试剂的加入方式，使样品用量减少到液滴级，而且随 着待测样品液滴的逐渐减小，扩散微滴定过程只需通过改变琼脂膜的尺寸和试剂 的浓度就可以实现更小规模的滴定。因此采用扩散微滴定技术不仅可以大大减少 浙江大学硕t 学位论文 第二章文献综述 分析试剂费用，而且还可以减轻实验废弃物对环境的负担。 在实际应用方面，微滴定技术的应用需求越来越大，如生物学研究过程需要 对单个细胞进行分析”3 ；监测有机微合成产物”；涉及到生化反应的蛋白质或核 酸的测定，其量往往只有微克或更小 1 3 】；两相( 有机相水相) 微样的分析【1 4 】；贵 重辐射性制品的纯度或酸碱含量的测定【1 6 】；部分贵重物体( 如考古人工制品) 的分析；或者太空爆炸收集到的样品( 如月球岩石等) 分析【”。微滴定技术在环 境监测、工业和医学上的应用也显得特别重要，主要表现为以下几方面： 第一，在可供检测的样品量有限的情况下，比如医院里经常会给新生儿作一 些血液检查，有时候甚至需要同时做多个血液分析，而新生儿又不可能抽取大量 的血液进行分析。 第二，样品价格很高，如在医学和工业过程中使用的酶“；一些贵重金属的 分析等等。 最后，对于需要使用一些有毒试剂进行分析时，为了保护操作人员的身体健 康，也同时为了保护环境，微滴定操作具有非常重要意义。 2 2 2 膜扩散微滴定装置 扩散微滴定装置主要由以下几部分组成：试剂贮存器、膜及膜的支撑物、样 品液滴及液滴制备装置、终点检测装置。其中最主要部件就是微型扩散膜。 根据琼脂膜的固定方式不同，膜扩散微滴定方法分为扩散微滴定管滴定和平 面膜扩散微滴定。 膜扩散微滴定装置通常可以分为两大类： ( 1 ) 扩散微量滴定管( d i f f u s i o n a m i c r o b u r e t ，d m b ) 将玻璃毛细管的一端拉成锥形，然后在毛细管尖端内侧注入琼脂膜，制成膜 扩散微滴定管，如图2 1 所示。 根据扩散微滴定管琼脂膜一端的形状不同，d m b 分为圆锥形和圆柱形两种， 如图2 2 所示。在滴定过程中为了防止样品液滴在扩散微滴定管尖端外表面爬行， 通常对扩散微滴定管外表面进行硅烷化处理，但有时这种处理方法也不太理想。 文献“”通过实验发现采用圆柱形尖端，即使没有硅烷化处理，也可以避免样品液 滴的爬行。除此之外，圆柱形尖端扩散微滴定管还具有以下一些优点：易于制备 尖端尺寸和形状相同的扩散微滴定管( d m b ) ，且扩散微滴定管内控制传质的区域 明显。 常用圆锥形扩散微滴定管尺寸“”为：尖端内径为2 3m ，滴定端长度为4 0 一6 0 m ；圆柱形扩散微滴定管：尖端内径为7 5 i ii l l ，滴定端长度为5 0 一7 0pm ) ，尖端 浙江大学硕士学位论文 第二二章文献综述 内琼脂膜的厚度为4 0 l o o m 。 f r o m l i g h t s o u r c e i ! ! f if i l0 m m l 一一 = 墨亡i 酒岬 誓：二l _ = i 二高己兰唠1 2 岬 m g t mi nfh 1 0 0 - 2 。0 忑0i n n i ii 一l i 图2 1 扩散微滴定装置示意图 a 基本结构b 扩散微滴定管 划锥形尖瑙孵护敬徽滴定斡 图2 2 不同形状尖端的扩散微滴定管 ( a ) 圆锥形尖端的扩散微滴定管( b ) 圆柱形尖端的扩散微滴定管 浙江大学硕士学位论文第章文献综述 ( 2 ) 平面膜扩散微滴定装置 平面膜扩散装置如图2 4 所示。试剂和样品液滴通过琼脂膜隔开，在试剂贮 液器上方基质上开一个小孔，孔内注入琼脂就构成圆柱形扩散微滴定膜，在膜的 四周放置一个疏水性硅弹性环，使样品液滴保持半球形状，减少样品液滴与空气 的接触面积。根据终点检测方法不同，试剂贮液器的形状稍有不同。 在显微镜的辅助下，扩散微滴定管已成功应用于酸碱滴定“1 、络合滴定”“操 作，样品液滴可以小到毫微微升( f e m t o 一) ，微微升( p i c o 一) ，纳升( n a n o l i t e r ) 。 而平面膜扩散微滴定还是属于宏观分析( m a c r o s c o p i ca n a l y s i s ) ，最典型的样品 液滴体积为1 2 0 ul 。 因此，分析样品量为o 1 2 0 u1 时，一般采用圆柱形平面扩散膜作为滴定 试剂的输送装黄；如果分析样品量为小于1 0 0n l 时，则采用扩散微滴定管d m b 进行滴定操作”。 2 2 3 膜扩散微滴定的原理 不论是平面膜扩散微滴定还是扩散微滴定管滴定，试剂都是在毛细管力和扩 散力的作用下，自发地扩散到样品液滴内完成滴定过程。由于扩散微滴定管尖端 膜的形状与平面膜不同，因此试剂在膜内的扩散模型有些不同。 1 扩散微滴定管内扩散理论。” 在琼脂膜扩散微滴定管内，试剂以扩散的方式通过琼脂膜与样品液滴进行滴 定反应。假设： ( 1 ) 每一次滴定之前，整个扩散微滴定管内试剂浓度分布均匀，也即假定琼 脂膜内溶液浓度与试剂浓度相同，即c ，( x ，t = 0 ) = c ，。 ( 2 ) 滴定过程中，试剂与琼脂膜界面浓度始终等于试剂浓度，即 ( x = o ，t ) = c r 。 ( 3 ) 样品液滴内，试剂与样品液滴瞬间达到混和均匀。 因此，可以认为扩散微滴定管尖端与样品液滴一接触，滴定反应就开始，而且 由于试剂与样品液滴瞬间接触反应，滴定到达终点以前，d m b 尖端试剂浓度可以 认为零，即( x = 乙，0 ，白) = 0 。 第二章义献综述 塑垩奎兰堕主堂垡丝苎一 d l r 。 三 s l o l l 1 7 a n e删 、- r e a g e n t s o l u t i o n f 垄 r i m r s d r r 牛o ， b ， l 图2 3 扩散微滴定管内试剂扩散及结构示意图 在扩散稳态的情况下，扩散微滴定管内扩散膜的横截面积为： a ( x ) = r o 一( 一) x 2 ( 2 1 ) 式中： 一一扩散微滴定管内试剂与琼脂膜边界处滴定管的半径； 一一滴定管尖端的半径； l m - - - 琼脂膜厚： x 一一与d m b 轴线平行的横向坐标。 在x 和工+ 血微单元内建立扩散方程，在以上假设条件下 滴定管琼脂膜内试剂浓度分布c 州为： c ：( x ) = 。，0 ( k z ) r o k 一( r 0 一r 卅) x 推导可得扩散微 ( 2 2 ) 式中： c ，滴定所用试剂浓厦； c ：膜内稳态浓度分布。 扩散时间为t 时，通过扩散微滴定管扩散到样品液滴中的试剂量为r ( ) ， 用下式表示： r ( f ) = r s ( f ) 十r t ( f ) ( 2 3 ) 脚1 ：( d m c r r o r m 石l 。) t ( 2 4 ) 浙江大学硕上学位论文 第一二章文献综述 r o ) = ( 2 石) c ，芝n = l ) 1 可删幄 ( 2 5 ) 其中 r 。一扩散方向的试剂量 r 5 由稳态浓度分布引起的试剂扩散部分 见为试剂在琼脂膜内扩散系数。 当扩散时间t 焉e l 丌2 时，即扩散时间足够长时，通过琼脂膜的试剂量可简 化为： r ( f ) z r 。( r ) = r 。( t t 。+ 1 ) ( 2 6 ) r o = o ，刀厶3 ( 2 7 ) f 。= ( 鼍3 d o ) ( ，。r o ) ( 2 8 ) 通过以上公式的关联，在试剂、扩散微滴定管尺寸定以及稳态扩散的情况 下，r ( t ) t 之间的关系式为计时定量提供了基础。 2 平面扩散膜扩散理论 采用平面膜进行扩散微滴定时必须满足以下几个条件： ( 1 ) 试剂在琼脂膜内的扩散速率必须明显地低于其在样品和试剂贮液器中 的扩散速率，只有这样才可以保证整个微滴定过程中样品与试剂充分混和。 ( 2 ) 为了避免待测样品液滴通过琼脂膜向试剂贮液器方向扩散而引起样品 损失，要求试剂的浓度必须高于样品的浓度，这样就保证了试剂至样品液滴的单 向扩散。 ( 3 ) 与传统的滴定相似，滴定反应和终点的检测必须快速。 在上述三个条件都满足的前提下，即满足琼脂膜内浓度梯度一定的条件下， 在扩散滴定时间t 内，试剂以扩散方式通过琼脂膜扩散到样品液滴中的量r ( t ) ， 根据费克第一定律( f i c k sf i r s tl a w ) 可以得到以下计算式子： r ( t ) ：旦! 兰堡；堡：f( 2 9 ) 4 ，。 式中：d ，试剂在琼脂膜内的扩散系数，a m 2 s ； c 。试剂贮液器内试剂的浓度，m o l g ； 浙江大学顾上学位论文 第二章文献综述 d 。，l 。琼脂膜的直径和厚度，m m ； t 滴定时间，s 。 由式2 9 可知，稳态扩散条件下，滴定所耗的试剂量与试剂在琼脂膜内的 扩散系数、扩散琼脂膜的直径、膜厚、试剂浓度、滴定时间有关。在琼脂膜尺寸、 试剂浓度一定的情况下，滴定试剂消耗量只与滴定时间有关，试剂消耗量的计量 只需通过计时的方法来实现。 2 2 4 扩散微滴定的操作方式 1 扩散微滴定管 为了减少周围环境因素对微滴定的影响，扩散微滴定管滴定过程以及样品液 滴的制备、保存都在装有已被水饱和的庚烷溶剂的透明的聚苯乙烯培养皿( 1 0 0 1 5m m ) 内完成。同时为了能使样品和水滴能保持球形，要求聚苯乙烯培养皿底 部是疏水性的”3 。 ( 1 ) 制备小水滴 首先采用简单的水喷雾器使透明的塑料培养皿底部充满小水滴( 2 02 0 0 1 - q n ， 2 0 滴m m 2 ) 。然后，用微型操作器将扩散微滴定管尖端移到较大的液滴内，为微滴 定作准备。同时要求扩散膜的表面保持亲水性，培养皿内2m e 厚的庚烷溶剂应先 用蒸馏水预饱和，防止试剂中的水扩散到庚烷溶剂中而影响试剂浓度。 ( 2 ) 制各样品微液滴 用机械微型操作器将一个尖端开口、内有样品溶液的微量吸管( 外径为l “ m ) ，插入到靠近培养皿底部的庚烷溶剂中，推出一滴样品溶液液滴。此时样品液 滴呈球形粘附于微量吸管的尖端，在显微镜下采用微型直尺量出液滴的直径，以 计算样品液滴的体积。最后轻轻地移动微量液滴，在粘附力作用下，使液滴与培 养皿底部紧密接触以后移开微量吸量管。 ( 3 ) 扩散微滴定 扩散微滴定管通过庚烷从水滴移到刚制好的样品液滴中，扩散微滴定管的尖 端接触到样品液滴时，微滴定过程就开始了。反应终点可以采用不同的检测方法， 如光学检测，电位检测等。 滴定结束以后，扩散微滴定管的尖端移到另一个样品液滴中进行另一个滴定 操作。 为了保证扩散微滴定管稳态操作，要求每一次实验之前扩散微滴定管( d m b ) 尖端和琼脂膜内的浓度分布与稳态操作时相同。因此扩散微滴定管尖端常浸没在 1 2 浙江大学硕+ 学位论文 第一二章文献综述 浓度与待测物相同的大液滴中。同时为了避免视觉上的误差，d m b 尖端只插在待 测液滴的边缘。每一个实验之前，用影像记录仪( v i d e oc a m c o r d e r ) 记录下待测液 滴的体积“。 该滴定装置可以使滴定操作的范围扩展到毫微微升或毫微微摩尔的范围。试 剂通过扩散微滴定管内琼脂膜的速率是一定的，以体积流率计相当于1ul a 一。 扩散速率的大小主要与吸量管的锥度和吸量管尖端的内径有关。该项技术的特征 包括：( 1 ) 试剂通过扩散( 自发的过程) 的方式连续输送到很小的样品溶液中； ( 2 ) 微小样品的精确输送可以达到毫微微摩尔；( 3 ) 滴定过程中，样品体积没有 减少，即样品没有被稀释“。 2 平面膜扩散微滴定 平面膜扩散微滴定试剂通常装在试剂贮液器内。用无渗透性的基质将试剂与 样品液滴隔开。在基质中央开一个小孔，孔内注入琼脂膜，为了使样品液滴呈半 球形状以及确保扩散微滴定在径向方向对称扩散，往往在基质上方琼脂膜的周围 放置一个疏水性硅橡胶环。在进行扩散微滴定之前，需要给予一定时间，让试剂 湿润琼脂膜，然后用lul 或2 0u1 的微量移液管移取样品于琼脂膜上方，样品液 滴一接触到琼脂膜，扩散微滴定就开始了。采用光电检测或电位检测法检测微滴 定终点，滴定结束后，移走样品液滴，准备下一个滴定操作。 2 2 5 扩散微滴定影响因素分析 微滴定技术不是常量滴定分析的等比例缩小，随着分析规模的微量化，微滴 定技术的应用必须考虑常量分析中可以忽略的一些因素，比如环境因素的影响( 如 酸碱滴定过程中，空气中二氧化碳的影响) ；样品与试剂的挥发性；试剂或样品在 容器表面的吸附等，因为在微量分析中，这些因素的影响将直接影响结果的准确 性。 在扩散微滴定过程中，为了能使整个操作稳定，精确度高，必须考虑以下几 方面： 1 搅拌 常量滴定过程，为了使指示剂均匀变色以便准确判定滴定终点，通常采用搅 拌或摇动锥形瓶的方法使试剂与样品溶液混和均匀。而微滴定过程，因样品本身 用量很少，根本无法采用上述方法来实现，因此必须选择一种合适的方式来达到 上述目的。6 r a t z 等人在研究平面膜扩散微滴定过程时，采用了对样品液滴吹氮 气的方法，即以一定的角度( 切向) 对样品液滴吹湿润的氮气，使样品液滴微微 浙江大学硕上学位论文 第二章文献综述 颤动，达到混和均匀的目的”。同时考虑到样品液滴直接与大气接触，对样品液 滴吹氮气还可以避免大气中的组分( 特别是二氧化碳) 对样品液滴产生干扰。但 必须控制好氮气的通入速度，通入速度太快，液滴有可能被氮气吹起，造成样品 液滴一试剂之间的扩散微滴定过程不连续，使终点时间延长，最终影响结果的准 确度。在扩散微滴定管滴定过程中，对庚烷溶剂表面吹湿润的氮气虽不能起到搅 拌的作用，但也可以避免大气中的组分通过庚烷有机溶剂扩散到样品液滴内而影 响滴定结果。 2 环境因素 对于易挥发样品的分析，最好采用扩散微滴定管进行微滴定。采用与水互溶 或部分互溶的有机溶剂( 常用庚烷) ，起到试剂或样品液滴与环境隔离，避免环境 中的气体，特别是二氧化碳在样品液滴中溶解而引起误差。 文献”“通过实验发现，络合滴定过程中，由于样品液滴较高的表面积与体积 比，空气中二氧化碳通过庚烷层，再经过庚烷与样品液滴界面进入样品液滴，从 而对液滴p h 值的改变起到了主要的作用，而且二氧化碳在微微升( p i c o l i t e r ) 样品液滴中传质的通量是1 毫升样品液滴中的1 0 4 倍。因此对于碱性样品液滴或 者p h 值必须大于7 的溶液液滴，为了避免或减少空气中c o 。在碱性液滴中的溶解， 一方面，可以在庚烷的表面层水平方向吹湿润氮气的方法来降低庚烷表面二氧化 碳的浓度，另一方面，通过增加培养皿底部碱性液滴分布密度的方法来改变二氧 化碳的传质模型，因为圆柱形二氧化碳的传质效率比径向扩散效率低一些。 对于酸性样品液滴，无论是扩散微滴定管操作还是平面膜扩散微滴定，环境 中二氧化碳对样品液滴的影响都不大。 3 基质表面的吸附 平面膜扩散微滴定技术，用于隔离试剂与样品液滴的基质选择非常重要。实 验过程中，如果试剂及样品液滴可以通过基质相互扩散，不仅使微量滴定样品终 点无法检测，而且很难保证每次实验的初始条件相同，因此，要求基质对试剂或 样品液滴不具有渗透性，只有这样才能保证滴定过程中试剂只通过琼脂膜扩散到 样品液滴内。文献“”以硫代硫酸钠为样品，以三碘化钠为试剂进行碘量分析，采 用了氧化铝陶瓷和硬质玻璃( p y r e xg l a s s ) 两种基质进行了对比实验。实验发现， 试剂和样品液滴在氧化铝陶瓷基质上的残留或前后滴定样品的交叉残留非常明 显，试剂在基质上的吸附使得终点时间缩短，反过来，样品液滴的吸附会使终点 时间延长，因此对样品测定精确度影响较大。而采用硬质玻璃基质则可以减少基 质对样品液滴和试剂的吸附，呈现较好的重现性( 1 6 ) 。因此m i k l o sg r a t z l 等 人认为硬质玻璃基质是用于平面膜扩散微滴定比较理想的基质。 浙江大学硕j j 学位论文 第二章文献综述 4 等待时间t 。( w a i r i n gt i m e ) 无论是扩散微滴定管滴定还是平面膜扩散微滴定，制好的琼脂膜通常保存在 试剂溶液内，只要使用和保管得当，一般可以使用三个月。这意味着一层膜可以 重复使用很多次，如果前一次滴定结束，马上进行第二次滴定，则前一次滴定样 品的残留可能使下一次滴定时间延长，因此，前后两次使用时间问隔的长短会影 响实验结果。 为了保证每次微滴定之前，试剂在琼脂膜内的初始浓度分布相同，前后两次 滴定之间需要一定的时间使试剂在琼脂膜内重新建立平衡，重新建立平衡的时间 称为等待时阳j t 。等待时间可以根据样品量终点时间之间的修正直线在终点 时间轴上的截距一t o 估算出来。 t o = ，：3 d r ( 2 1 0 ) 式中： ，卅琼脂膜的厚度； d r 试剂在琼脂膜内的扩散系数。 由式( 2 1 0 ) 、( 2 i i ) 可知，等待时间t 。的长短主要与琼脂膜的厚度与试剂 在琼脂膜内的扩散系数有关。琼脂膜越厚，试剂在琼脂膜内的扩散系数越小，等 待时间t 。就越长。一般情况下，平面膜扩散微滴定，对于2 0 u1 的样品分析，等 待时间t 。一般为5 - - 8 m i n 。对于l u1 的样品分析，等待时间t w 为5 m i n 左右。扩 散微滴定管滴定分析，t 。为0 8 s ，则等待时间f 。就很短。 2 2 6 扩散微滴定反应终点的检测 常量分析，常用滴定管终点体积与初始体积的差来表示试剂的消耗量。在扩 散微滴定分析中，通常采用终点时间( t h ee n d p o i n tt i m e ) 来换算试剂用量。 终点时间是指微滴定达到化学平衡点所需的时间。终点检测的灵敏度直接影响结 果的精确度，选择一种较好的终点检测方法很重要。 i 光电检测法 光电检测法是以发光二极管( l e d ) 为光源，以光电晶体接收器为检测器。通 过透过率的变化来决定反应的终点。光电检测装置系统”如图2 4 所示。 浙江大学硕 学位论文 第一章文献综述 哒- _ 试蠢u q 两媾燃 ， 蛾辣 图2 4 平面膜扩散微滴定光电检测系统 由于可见光发光二极管容易受周围工作环境光线的干扰，因此试剂贮液器除 了l e d 光源通过部分为透明的、薄的试剂窗外，其它部分由黑色的p y r e xg l a s s ( 普列克斯玻璃) 制成。试剂贮液器上面有两个窗口：一个用于添加试剂，另一 个是孔径与样品液滴半球形直径一致的疏水性硅胶环，环内是中心开有一个小孔、 透明的硬质玻璃基质( 孔径约为0 ，5 7m m ) ，孔内充满琼脂。高浓度的试剂通过琼 脂膜扩散到待测样品液滴。光电晶体接收器和l e d 光源分别置于试剂贮液器的上 方和下方。用微移液管将样品液滴置于琼脂膜上方小孔内，为加快扩散速度和保 证试剂与样品液滴混合均匀，通常采取向样品液滴以一定的角度吹湿润氮气的方 法，同时氮气还起到了搅拌的作用。 使用可见光光电检测器，通常需要更换l e d 光源来适宜不同的滴定类型，如酸 碱滴定，以绿色l e d 为光源，1 r d 3 0 5 6 光电晶体为检测器，在波长为5 2 0r f f f l 左右 获得最大的透射比( t r a n s m i t t a n c e ) 。络合滴定一e d t a 滴定c a c l 。溶液，以蓝色 l e d 为光源，m r d 3 0 5 4 光电晶体为检测器，在波长为5 2 0n m 左右获得最大透射比。 2 电位检测( p o t e n t i o m e t r j ci n d i c a t i o n ) 电位检测”3 3 也是微滴定过程中常用的终点检测方法。电位检测原理是根据两 电极间电位的变化来判定滴定终点。图2 5 是络合滴定终点检测的装置图，采用 金汞一汞齐电极来指示反应终点。 浙江大学硕士学位论文第一二章文献综述 i - 心带耵麟豹p r c l 艘墒是撑体 图2 5 用于络合扩散微滴定终点检测器 如图2 5 所示，整套检测装置由两部分组成，第一部分是标准参考电极，如 饱和甘汞电极，通常安装在试剂贮存器内，与试剂直接接触；第二部分是传感器， 如金碱传感器( 9 0 1 db a s es e n s o r ) 薄膜呈螺旋形沉积在硬质玻璃基质( 厚度约 0 2 3m m ) 上。螺旋形可以缩小样品液滴内浓度分布的不均一性。另外，也可以采 用铂氧化还原传感器。 基质上中心小孔和硅弹性环( s i l i c o n er i n g ) 的直径随样品用量的不同而不 同。对于1 “1 和2 0m 的样品，小孔的孔径分别为0 3m m 和o 5 7m m ，硅弹性 橡皮环的直径分别为1 5 6m i l l 和4 2 4 m m 。 微滴定过程中，微焊接的a u h g 汞齐电极和( s c e ) 参考电极之间的氧化还原 电位差由辐射计( r a d i o m e t e r ) p h m8 4 毫伏计检测，它的输出口与计算机数据 采集相连。数据由1 2 b i ta dc o n v e r t e r 计录，电位( m v ) 一一时间t ( m i n ) 关 系图由计算机自动计录、显示出来。滴定曲线采用改进的s a v i t z k y g o l a y 最小 二乘方分段多项卷积的方法进行修正和微分。终点时间对应滴定曲线上的拐点 ( i n f l e c t i o np o i n t ) ，并且由专门软件自动处理得到终点时间与样品量之间的关 系曲线，如文献 2 3 得到的关系式为： s ( n m 0 1 ) = 0 7 8 t 。( m i n ) + 1 9 4 ( 2 1 2 ) 相关系数r 2 = o 9 9 1 ， 式中：s 单个液滴内样品的量，n m o l 浙江人学硕士学位论文第= 章文献综述 t 。滴定反应开始到终点所需的时间，m i n 。 因此根据终点时间就可以得到样品的量，除以液滴的体积就可以得到样品液 滴的浓度。 平面膜扩散微滴定电位检测法已用于微量样品中金属离子( c a ”、m n ”、 z n ”、c u 2 + ) 和自来水中的硬度分析。 3 吸收微光谱( a b s o r p t i o nm i c r o s p e c t r o m e t r y ) 法“” 采用倒置的带有光谱传感器的显微镜来记录液滴的吸收光谱，光谱传感器