（环境工程专业论文）淡水底质中厌氧氨氧化菌的原位鉴别及培养研究.pdf

摘要 厌氧氨氧化过程是水生生态系统氮循环中的氮转化新途径，并在自然界氮素 的转化过程起着重要的作用。但刑于这一过程中起作用的微生物厌氧氨氧化菌的 生态学特性以及这一过程在环境污染物微生物修复中的应用研究还仅仅是一个 开端。本论文在前人研究的基础上，开展了以下两个方面的工作： ( 1 ) 采用分子生物学技术荧光原位杂交( f i s h ) 、多聚酶链式反应( p c r ) 、 d n a 克隆和测序等对采自江苏省苏州市、东太湖、新沂河等6 个底质样品进行 了厌氧氨氧化菌和传统氨氧化菌的原位检测； ( 2 ) 探讨了以底质作为接种体进行厌氧氨氧化菌富集培养的可行性，为天 然底质环境中厌氧氨氧化过程的强化，富营养化底质微生物修复的可行性提供一 定的依据。 通过上述研究，主要得出了以下结论： ( 1 ) 在新沂河底质样品x y r 2 中检测到了厌氧氨氧化菌，系统发育分析表 明该细菌是b r o c a d i a 的新种类： ( 2 ) 新沂河底质样品x y r l 和x y r 2 中存在属于p l a n c t o m y c e t e s 新分支的 微生物，这些微生物的功能特性有待进一步研究； ( 3 ) 新沂河底质样品x y r 2 中至少存在两种亚硝酸单胞菌属的好氧氨氧化 菌，一种属于亚硝酸单胞菌属的群组6 b ，与n i t r o s o m o n a sm a r i n a 相似，另一种 属于亚硝酸单胞菌属的群组5 。这一结果说明好氧和厌氧氨氧化细菌可以在自然 环境中共同生存； ( 4 ) 底质样品厌氧氨氧化菌的连续培养试验由于时间的限制，尚不能得出 关于厌氧氨氧化菌富集培养成功与否的结论，但为后期试验提供了一定的依据。 关键词：氮循环、厌氧氨氧化菌、分子生物学技术、富集培养 a b s t r a c t a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n ( a n a m m o x ) i san e w l yd i s c o v e r e dp r o c e s si n n i t r o g e nc y c l ei na q u a t i cs y s t e m s ，a n di tp l a y sas i g n i f i c a n tr o l ei nt h ec o n v e r s i o no f n i t r o g e n h o w e v e r ，t h er e s e a r c ho nt h ee c o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fa n a m m o x b a c t e r i a a n dt h ea p p l i c a t i o no fa n a m m o xp r o c e s si nb i o a u g a m e n t a t i o no fe n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o ni s s t i l la tt h eb e g i n n i n g b a s e do nt h ep r e v i o u ss t u d i e s ，t h er e s e a r c hi nt h i s p a p e rw a sc a r r i e do u t ，m a i n l yi n c l u d i n gt w op a r t sa sf o l l o w s ： ( 1 ) a n a m m o xb a c t e r i aa n da e r o b i ca m m o n i ao x i d i z e r sw e r ed e t e c t e di ns i t ui n6 s e d i m e n ts a m p l e st a k e nf r o mj i a n g s np r o v i n c e m o l e c u l a rt e c h n i q u e s ，s u c ha sf i s h ， p c r ，d n ac l o n i n ga n ds e q u e n c i n ge t c w e r eu s e df o rt h i sp u r p o s e ( 2 ) t h ec o n t i n u o u sc u l t i v a t i o no fa n a m m o xb a c t e r i af r o ms e d i m e n ts a m p l e sw e r e s t u d i e d ，w h i c hp r o v i d e se x p e r i m e n t a lb a s i sf o rt h eb i o a u g a m e n t a t i o no fe u t r o p h i c a t e d s e d i m e n ta p p l y i n gf l n a m m o xp r o c e s s t h r o u g ht h ea b o v es t u d i e s ，t h ef o l l o w i n gc o n l u s i o n sw e r eg a i n e d ： ( 1 ) a n a m m o xb a c t e r i u mi sp r e s e n ti ns a m p l ex y r 2t a k e nf r o mx i n y ir i v e n p h y l o g e n e t i ca n a l y s i ss h o w e dt h a tt h i sn e w l yd i s c o v e r e da n a m m o xb a c t e r i u mi s a f f i l i a t e dt ob r o c a 讲口 ( 2 ) s o m eo ft h ec l o n e so fs a m p l ex y r la n dx y r 2f o r man e wb r a n c h o f p l a n c t o m y c e t e s b u tt h ef u n c t i o n so ft h e s eb a c t e r i aa r eu n k n o w n ( 3 ) t h e r ea r ea tl e a s tt w os p e c i e so fa o bb e l o n g i n gt on i t r o s o m o n a si ns a m p l e x y r 2 o n eo ft h e mi sa f f i l i a t e dw i t hn i t r o s o m o n a sm a r i n a ( c l u s t e r6 b ) ；w h i l e a n o t h e ri sa f f i l i a t e dw i t hn i t r o s o m o n a sc l u s t e r5t h i sr e s u l ti n d i c a t e st h a ta o ba n d a n a m m o xb a c t e r i acana l s oc o e x i s ti nn a t u r a le n v i r o n m e n tb e s i d e sb i o r e a c t o r s ( 4 ) c o n c l u s i o n ss t i l lc a n tb em a d ef r o mt h ec o n t i n u o u sc u l t i v a t i o no fa n a m m o x b a c t e r i ab e c a u s eo fl i m i t a t i o no f t i m e b u ti tj st h eb a s i sf o rf u r t h e rs t u d y k e yw o r d s ：n i t r o g e nc y c l e ，a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d i z i n gb a c t e r i a ， m o l e c u l a rb i o t e c h n i q u e s ，c u l t i v a t i o n 日u舌 河湖水体的富营养化问题一直是水环境治理和保护领域的重点和难点，氮素 污染物由于其在水体富营养化过程中的重要性及其转化途径的复杂性，又成为富 营养化控制的重点和难点。除了外源污染以外，水体的内源污染是导致水体富营 养化的另一个重要原因。外源污染的控制措施己相对成熟，而内源污染( 底质释 放) 由于其复杂性和多变性，成为许多研究者试图进行机理性和实践性研究的对 象。 由于在氮素转化过程中起主要作用的是各种氮循环微生物，研究微生物在这 一过程的功能和作用以及不同微生物的时空分布，搞清底质环境中氮素污染物的 变化过程，可以为氮素污染控制措施提供理论依据。 传统上，人们认为微生物作用下的硝化和反硝化等过程是各种不同形态氮素 转化的主要途径，而最近有研究者在实验室生物反应器以及自然环境( 主要是海 洋环境) 中发现了一种氮转化的新途径，即厌氧氨氧化菌作用下的厌氧氨氧化过 程，同时也通过试验研究证实了这一过程在污水处理以及海洋氮循环中的重要 性。由于这一过程是一个高效的脱氮过程，它的发现有可能为富营养化水体及底 质的修复提供一种新的途径，即在发现厌氧氨氧化菌的前提下，强化自然界中的 厌氧氨氧化过程，使富集在水体及底质中的氮素得到高效的降解。但是，目前对 于自然界( 尤其是淡水生态系统) 中这一过程的研究还仅仅是一个开端。 本论文研究工作是基于这一研究背景，并结合中荷水利教育科技合作项目第 六专题“水管理中的生态环境因素研究”以及国家重大科技专项( 8 6 3 ) “苏州市水 环境质量改善与综合示范项目”开展的，其中论文试验部分的工作于2 0 0 3 年1 0 月至2 0 0 4 年2 月底期间在荷兰n i j m e g e n 大学微生物系实验室完成。 本论文主要进行了两个方面的工作：( 1 ) 厌氧氨氧化菌和传统氨氧化菌的原 位检测。采用分子生物学技术荧光原位杂交( f i s h ) 、多聚酶链式反应( p c r ) 、 d n a 克隆和测序等进行了这部分的实验。( 2 ) 厌氧氨氧化菌的培养试验。探讨 底质作为接种体进行厌氧氨氧化菌富集培养的可行性，从而为天然底质环境中厌 氧氮氧化过程的强化，富营养化底质微生物原位修复的可行性提供一定的依据。 此项试验研究工作是在导师阮晓红教授、荷兰n i j m e g e n 大学的s m i t s 教授、 j e t t e n 教授以及m a r k u s 博士的共同指导下完成的，在此对他们的帮助表示我最 衷心的谢意。 学位论文独创性声明： 本人所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工 作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。如不实，本人负全部责任。 警鬈黧，盟加口忙厂月乙7 日( 注：手写亲笔签名) 学位论文使用授权说明： 河海大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期 刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件或电 子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文 档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允 许论文被查阅和借阅。论文全部或部分内容的公布( 包括刊登) 授权河 海大学研究生院办理。 篙笔篡至，型量址聊乒年r 月彳日( 注：手写亲笔签名) 缩略词 a o b s o n a n a m m o x a m o h a 0 r r n a f i s h p c r b p p b s s d s e d t a b s a d n t p t b e 缩略词 英文 中文 a e r o b i ca m m o n i ao x i d i z e r好氧氨氧化菌 s o l u b l eo g a n i cn i t r o g e n 可溶性有机氮 a n a e r b o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n厌氧氨氧化 a m m o n i am o n o o x y g e n a s e氨单氧酶 h y d r o x y l a m i n eo x i d o r e d u c t a s e 羟胺氧化还原酶 r i b o s m a lr n a核糖体r n a f l u o r e s e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n荧光原位杂交 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 多聚酶链式反应 b a s ep a i r碱基对 p h o s p h o r u sb u f f e rs a l i n e 磷酸盐缓冲液 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 e d i t i ca c i d乙二胺四乙酸 b o v i n es e r k l ma l b u m e n牛肉血清蛋白 d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核酸 t r i sb a s e ，b o r i ca c i d ，e d t at b e 电解缓冲液 绪论 第一章绪论 1 1 研究的目的和意义 氮是水生态系统初级生产力的限制性营养元素，氮素的循环无论在天然还是 人工生态系统中都起着重要的作用。由于氮素与水环境污染，尤其是水体富营养 化的相关性，水生环境中氮的生物地球化学循环研究一直是国内外研究的热门领 域之一。 水生生态系统整个氮循环中的主要过程包括氮的固定、有机氢的矿化、氨的 同化、硝化及反硝化作用，以及最近发现的异氧硝化、好氧反硝化1 2 培口厌氧氨 氧化过程( 以亚硝酸氮为电子受体在厌氧条件下氧化氨氮【3 1 ) 等等。其中厌氧氨 氧化过程是在研究污水处理脱氮工艺过程中发现的氮转化的新途径【4 1 ，v a nd e g r a a f 等【5 】通过实验证实了该过程是在微生物( 厌氧氨氧化菌) 的作用下进行的。 最近有研究发现黑海中的氮循环与厌氧氨氧化过程有关【6 】，厌氧氨氧化过程能够 占到海洋总氮气产量的3 0 5 0 口】，此外在哥斯达黎加的g o l f od u l c e 【8 也发现了 厌氧氨氧化菌( 以下称a n a m m o x 菌) ，这些发现使人们对海洋环境中的氮循环有 了新的认识。但有关淡水生态系统氮循环中的厌氧氨氧化过程及其对淡水生态系 统氮循环的环境效应虽有所报道，还认识不足，因而，有必要重新认识湖泊及河 流的自然氮循环过程，以便为淡水生态系统的保护提供科学的依据。同时，由于 厌氧氨氧化过程脱氮的高效性 3 ，研究和开发富营养化水体底质氮污染的厌氧氨 氧化原位修复技术，对于富营养化水体的治理具有十分重要的意义。 由于a n a m m o x 菌的生长速率极低【3 】，传统方法往往难以对这种特殊微生物 的存在及其功能进行鉴别和评价。目前，主要运用分子生物学技术，如荧光原位 杂交( f i s h ) 、多聚酶链式反应( p c r ) 、d n a 克隆及测序等技术对a n a m m o x 菌 进行检测、生理特性、细胞结构、系统发育及应用研究【6 l 【”。分子生物学技术的 发展为a n a m m o x 菌的生理特征及应用研究提供了有力工具。 本论文采用f i s h 、p c r 、d n a 克隆及测序等分子生物学技术，从不同生境 的湖泊和河流底质中检o n , 0a n a m m o x 菌：在a n a m m o x 菌鉴别的基础上，对a n a m m o x 菌进行富集培养，试图强化自然水体底质中的厌氧氨氧化作用，对富营养化水体 底质的氮污染进行原位修复，探索一种新的、生态安全的水体内源氮污染的强化 净化技术，这对于富营养化水体的治理具有十分重要的实践意义。 河簿大学硕士学位论文 绪论 1 2 水生环境中的氮循环 1 2 1 概述 在水生植物系统( 如湿地、河流和湖泊等) 中，氮素既是维持生态系统营养 物质循环的重要元素之一，也是引起水质恶化、生物多样性降低和生态系统失衡 的因素之_ 。为了控制氮素引起的污染，有必要也必须首先深入了解氮的各种转 化途径。水生生态系统的氮循环如图1 1 所示，其中氮主要以有机氮、氨氮和硝 酸氮的形式存在，当氮在输运过程中与颗粒物结合时就形成颗粒态氮。 系统中的有机氮主要来自植物腐质、动物分泌物或死亡动物体。硝酸氮主要 来自农业非点源、污染地下水等，当系统存在可利用有机碳源时，硝酸氮在厌氧 条件下很容易通过反硝化作用转化成氮气；此外，硝酸氮也可以被植物体吸收利 用。氨氮主要来自废水、畜牧、养殖废水或者系统中有机物的矿化，氨氮能够黏 附于带负电的颗粒( 如黏土) 沉淀下来，或者被植物吸收。 图11 水生植物系统中的氮循环( 虚线：可能的过程：s o n ：可溶性有机氮) f i g 1 ln i t r o g e nc y c l ei na q u a t i cv e g e t a t i o ns y s t e m s 另外，生态系统氮循环中还有一种氮素的重要形式是皿硝酸氮。亚硝酸氮不 仅对植物还是动物及人类都是有毒的氮化合物，但由于它的不稳定性， 自然生态系统中亚硝酸氮的浓度并不是很高。然而，在某些环境条件( p h i l 氨 氮浓度较高，溶解氧浓度较低) 下亚硝酸氮也能得到积累纠【】，这是由于在这 些环境条件下，与氨氧化菌相比，亚硝酸氮氧化菌对氧气的竞争能力相对较弱 一，使硝化和反硝化过程中的中间产物得不到充分转化。因此，在自然环境 河海大学硕士学位论文 有可能在缺氧条件下出现弧硝酸氮和氨 氮的同时存在，这是前述厌氧氨氧化过 程存在的前提条件，因此，这一氮转化 的新途径很有可能是水生生态系统氮循 环中氮素的一个重要的转化途径 2 0 】 ( 图1 1 中虚线表示) 。从图l2 可以更清 楚的看出厌氧氨氧化过程在氮转化途径 中的位置。 从更广泛的角度来说，除了上述谈 到的氮素在水生态系统中的主要存在形 式以外，氮循环中氮素的存在形式还包 括联氨( n 2 h 4 ) 、羟氨( n h 2 0 h ) 、氮气 眵一一毒 ，7 。 l n h 4 + 化 n o 。 图1 2 氮转化途径示意图 f i g 1 2n i t r o g e nt r a n s f o r mp a t h w a y s ( h t t p ：w w w a n a n l l t l o x c o m r e s e a r c h h t m l ) ( n 2 ) 、一氧化二氮( n 2 0 ) 、一氧化氮( n o ) 和二氧化氮( n 0 2 ) 等。这些氮化 合物在氮循环中可能发生的转化关系见表1 1 【2 2 】。 表1 1 氮循环中的酶及其催化的反应 反应名称酶反应式 a g o ( k j m 0 1 ) 发生位置 氨单氧酶n h 4 + + 0 2 + h + 2 e = n h 2 0 h + h 2 0 1 4 06 横跨膜 亚硝化 羟氨氧化还原酶n h 2 0 h + h 2 0 = n o f + 5h + + 4 e 2 25外周胞质 硝化亚硝酸氧化还原酶n o z - + h 2 0 = n 0 3 - + 2 h + + 2 e 8 3 - 3 细胞膜 联氨水解酶n h 4 十+ n h 2 0 h = n 2 h 4 + h 2 0 + h + 4 6 1周质 厌氧氨氧化联氨氧化还原酶n 2 h 4 = n 2 + 4 h + + 4 e 。 2 8 8 1 羟氨氧化还原酶n 0 2 _ + 4 e _ + 5 h 十一n h 2 0 h + h 2 0 2 25 硝酸还原酶n 0 3 - + 2 e 。+ 2 h + = n 0 2 + h 2 0 一8 2 9 细胞膜 反硝化和 亚硝酸还原酶 n o r + e + + 2 h + = n o + h 2 0 。3 2 9 周质 n o 还原酶 2 n oi - 2 e 。+ 2 h + ：n 2 0 + h 2 02 2 6 4周质 异化作用 n 2 0 还原酶n 2 0 + 2 c - 十2 h + = n 2 + h 2 0 2 6 18 周质 亚硝酸异化还原酶n 0 2 - + 6 e + 8 h + = n h 4 + + 2 h 2 0 4 3 6 注：“? ”表不目前还不清楚该反压发生的位置。 1 2 2 氮循环中的微生物 生物新陈代谢在整个氮循环中起着重要的作用。在自然生态系统中，从化合 态氮到气态氮从而从根本上去除氮污染物质的转化主要通过硝化和反硝化过程 起作用【2 3 j 。 氨氮向亚硝酸氮的转化( 即亚硝化过程) 由亚硝酸单胞菌属( n i t r o s o m o n a ，) 、 亚硝酸球菌属( n i t r o s o c o c c u s ) 及亚硝酸螺菌属( n i t r o s o s p i r a ) 等起作用，但其 中在湿地和其它生态系统中亚硝酸螺菌属比亚硝酸单胞菌属更普遍 2 3 】一。至今， 所有内陆发现的氨氧化菌都属于蛋白菌( p r o t e o b a c t e r i a ) 的卢亚纲，海洋中发现 河海大学硕士学位论文 承 飞。一 ，fl、叭jj q “1 硝 的属于蛋白菌的p 和，y 亚纲 2 8 2 9 。亚硝酸氮向硝酸氮的转化主要通过硝化杆菌属 ( n i t r o b a c t e r ) 、硝化球菌属( n i t r o c o c c u s ) 起作用。它们都是好氧化能自养菌， 适宜在中性和偏碱性的环境中生长。 反硝化作用是指硝酸氮被还原为氨或是气态氮，前者也被称为异化作用，大 多数细菌、放线菌和真菌都能利用硝酸氮为营养，在硝酸还原酶的作用下将硝酸 还原为氨，进而合成氨基酸、蛋白质和其它含氮有机物。硝酸氮向气态氮的转化 主要通过反硝化菌在厌氧条件下进行。反硝化菌主要有施式假单胞菌 ( p s e u d o m o n a ss t u t z e r i ) 、脱氮假单胞菌( p sd e n i t r i f i c a n s ) 、荧光假单胞菌( p s f l u o r e s e e n s ) 、色杆菌属的紫色杆菌( c h r o m o b a e t e r i u mv i o i a c e u m ) 、脱氮色杆菌 ( c h r o m d e n i t r i f i i c a n s ) 等。 新发现的厌氧氨氧化过程中，起作用的细菌属j ? p l a n c t o m y c e t a l e s 目吼迄今 为止，已鉴定的a n a r n m o x 菌主要有：来自生物反应器的c a n d i d a t u s “b r o c a d i a a n a m m o x i d a n s 9 1 和c a n d i d a t u s “k u e n e n i as t u t t a r t i e n s i s 、来自黑海的 c a n d i d a t u s “s c a l i n d u as o r o k i n i ”【6 、以及英国p i t s e a 垃圾渗滤液处理厂的 c a n d i d a t u s “s c a l i n d u ab r o d a e ”；f 口c a n d i d a t u s s c a l i n d u aw a g n e r ”刚等。 1 3 氨氧化一一氮循环中的重要过程 由于本论文主要研究淡水生态系统底质中的氨氧化菌，包括好氧和厌氧氨氧 化菌，重点是后者，接下来着重介绍氨氧化过程及相应细菌的各种特性。 1 3 1 传统好氧氨氧化 1 3 1l 过程概述 氮的硝化过程包括氨的氧化和亚硝酸氮的氧化两个反应，其中氨氧化过程是 关键步骤l 碓) 。好氧氨氧化过程的路径如图1 3 所示，它包括两个步骤：氨氮在氨 单氧酶( a m m o n i am o n o o x y g e n a s e ( a m o ) ，一种含铜膜蛋白质吲) 的作用下被 氧化成中间产物羟胺：羟胺在羟胺氧化还原酶( h y d r o x y l a m i n eo x i d o r e d u c t a s e ( h a o ) ，一种血红素蛋白 3 6 1 ) 的作用下将羟胺氧化为亚硝酸氮。 羟胺氧化 笋 。赛27 n h 3 ：歹7 7 5 ：羟胺歹歹7 。芸i ：_ n 0 2 0 2h 2 0h 2 0 4 h 2h+h+ 图13 好氧氨氧化过程 f i gt3t h ep a t h w a yo fa e r o b i ca m m o n i ao x i d a t i o n 河海大学硕士学位沦文 绪论 1 3 1 2 好氧氨氧化菌( a o b ) 以往的研究表明，迄今培养和有描述的化学无机自养好氧氨氧化菌( 如参考 文献 3 7 3 8 3 9 ) 属于蛋白菌纲两个不同的菌群( 如参考文献 2 8 4 0 4 1 ) 。所 有目前鉴定的内陆氨氧化细菌均属于蛋白菌纲的口亚纲，包括亚硝酸单胞菌属 ( n i t r o s o m o n a s ) 和亚硝酸螺菌属( n i t r o s o s p i r a ，现还包括n i t r o s o v i b r i d 和 n i t r o s o l o b u s 属) 4 2 1 , 而海洋环境中存在的氨氧化细菌属于蛋白菌纲序亚纲亚硝酸 球菌属( n i t r o s o c o c c u s ) 及蛋白菌纲诬鲥2 8 2 9 l 。 1 _ 3 1 3a o b 的检测方法 过去，人们对好氧氨氧化菌的检测，主要采用1 6 sr r n a 技术，并为硝化细 菌的研究提供了一些有价值的信息 4 引。然而，1 6 sr r n a 的分析受到引物特异性 的限制，而且当两种好氧氨氧化菌非常接近时，基于1 6 sr r n a 的分子生物学技 术也难以将它们区分 4 ”。为了克服这一缺陷，好氧氨氧化菌的功能基因氨单氧酶 的亚单元a ( a m o a ) 代替1 6 sr r n a 成为检测好氧氨氧化菌的分子指标4 4 ”1 。对 于好氧氨氧化菌的研究，这个基因是一个尤其有用的分子指标，因为它不象其它 许多生物地球化学功能基因( 如反硝化过程的n j 心基因) 那样，具有明显的平行 基因传递；而且a m o a 基因的系统发育关系与基于1 6 sr r n a 碱基序列的系统发育 关系一致 4 2 1 。就象绝大部分蛋白质编码基因一样，a m o a 基因能够比不参与蛋白 质编码的r r n a 基因提供更多的系统发育信息。此外，a m o a 基因的分歧性比1 6 s r r n a 基因的多样性在功能上具有更大的重要性。a m o a 基因系统发育信息的可靠 性、序列分歧的充分性以及在氨氧化过程中的功能重要性，使之成为环境样品中 好氧氨氧化菌研究的有力工具。近年来，研究者对不同自然环境样品( 包括土壤、 底质、植物根系、地下水、海洋和淡水水域以及海口等) 中的a m o a 多样性进行 了大量的研究【4 3 】【4 6 】- 【5 ”。 1 3 2 厌氧氨氧化 1 3 2 1 过程概述 自然界中至少存在两种厌氧氨氧化途径：好氧氨氧化菌在厌氧条件下的氨氧 化过程以及最近发现的在a n a m m o x 菌作用下的氨氧化过程。 好氧氨氧化菌，女h n i t r o s o m o n a se u t r o p h a 5 2 1 能在厌氧条件下以羟胺或氨氮为 电子供体还原亚硝酸氮或n 0 2 。当以n 0 2 作为电子受体时，最大厌氧氨氧化速率 为2 n m o ln h 4 + r a i n 。1 ( m g 蛋白质) 。 3 】。这个反应过程产生的能量足够使这些细菌 在厌氧条件下生存，但不能增殖。 河海大学硕士学位论文 绪沦 厌氧氨氧化过程是在a n a m m o x 菌的 作用下直接以亚硝酸氮为电子受体，氨 氮为电子供体，在厌氧条件下将这两种 氮素同时转化为氮气的过程。这一过 程反应机理如图1 4 所示。在厌氧氨氧化 过程中，涉及到三种酶【5 4 ：在初始反应 过程中，氨氮与羟胺在联胺水解酶 ( h y d r a z i n eh y d r o l a s e ) 的作用下反应生 成联胺( 式1 1 5 5 ) ；然后，联胺在联胺氧 a n a r n m o x s 。s 。m e 细胞质 瓣 阳 图1 4 厌氧氨氧化过程及机理 f i g 14a n a m m o xp r o c e s sa n dm e c h a n i s m 化酶( h y d r a z i n eo x i d i z i n ge n z y m e ) 的作用下分解成氮气( 式1 2 ) ：初始反应过程 中的联胺是在亚硝酸氮还原酶( n i t r i t er e d u c i n ge n z y m e ) 的作用下将亚硝酸氨还 原而成( 式1 3 ) 的。 n h 4 + n h 2 0 h n 2 h 4 + h 2 0 + h +( 式1 1 ) n 2 h 4 一n 2 + 4 h + 4 e 一( 式1 2 ) n 0 2 一+ 5 h + + 4 e 一，n h 2 0 h + h 2 0 ( 式1 - 3 ) 越来越多的研究者已经关注到自然和人工生态系统中的厌氧氨氧化过程和 细菌 9 1 3 1 l f 5 6 】 4 1 。这是用于污水处理的极具前景的处理工艺，也对自然生态系统( 如 海洋系统口】) 中的氮循环起着重要的作用。对于污水处理而言，厌氧氨氧化过程 具有如下优点：( 1 ) 如果厌氧氨氧化过程与硝化过程结合使用，只需氧化部分的 氨氮，从而减少硝化反应器氧气的消耗量：( 2 ) 由于厌氧氨氧化过程是化学无机 自养过程，不需要外加碳源；( 3 ) 由于a n a m m o x 菌的生长十分缓慢，在实验室条 件下的世代期为2 3 周口”，厌氧氨氧化过程的生物产量很低，从而使污泥产量很 低。 对于自然生态系统，厌氧氨氧化过程的发现使人们能更深入的了解这一过程 对水生态系统氮的生物地球化学循环作用规律，这对于保护和修复被损坏的水生 态系统都具有重要的意义。由于已经有研究发现，a n a m m o x 菌在自然生态系统中 的存在5 8 【5 9 】，很有可能在更广泛的天然水域中检测到a n a m m o x 菌。对a 1 1 a m m o x 菌环境生存因子更深入的了解可以为a n a m m o x 菌富集培养物的获得及其在人工 和自然生态系统中氮污染物的去除中的应用提供定的理论基础。 厌氧氨氧化过程中起作用的细菌是化学无机自养细菌，首先鉴定并暂时给定 名字的a n a m m o x 菌是c a n d i d a t u s “b r o c a d i aa n a m m o x i d a n s ” 9 i 、c a n d i d a t “s 。 k u e n e n i as t u t t g a r t i e n s i s ” 3 0 和c a n d i d a t u s “s c a l i n d u as o r o k i n i i ” 6 1 。不久前，s c h m i d 等口】应用分子生物学技术( 如1 6 sr r n a 基因库、荧光原位杂交( f i s h ) 、活性分 河海大学硕士学位论文 绪论 析、电镜观察和细胞膜脂类成分分析等) 又在英国p i t s e a 垃圾渗滤液处理厂发现 了两利1 与前面三种不同的a n a m m o x 菌，c a n d i d a t u s “s c a t i n d u ab r o d a e ”和 c a n d i d a t u s “s c a t i n d u aw a g n e r i ”。这些不同种类的a n a m m o x 菌形成了 p l a n c t o m y c e t a l e s 目( 细菌中的一个重要分支 6 0 1 ) 的一个单源群组。 1 3 2 ，2a n a m m o x 菌的生理特征 厌氧氨氧化过程最重要的生理特性是氨氮和亚硝酸氮的同时减少并生成氨 气川。厌氧氨氧化过程的完全化学计量学由v a nd eg r a a f 等首次在一流化床反 应器内通过物质平衡得出，后又被s t r o u s 等【57 j 修正为下式： n h 4 + + 1 3 2 n 0 2 - + 0 0 6 6 h c 0 3 。+ 01 3 h + 专0 2 6 n 0 3 + l0 2 n 2 + o 0 6 6 c h 2 0 05 n 0 15 十2 0 3 h 2 0 2 0 0 0 年，s t r o u s 在他的1 尊士论文中总结了a n a m m o x 菌的各生理参数( 表l - 2 ) 。 由表中的数据可以看出，好氧和厌氧氨氧化的各生理参数值十分相似，但 a n a m m o x 菌的最大生长速率比好氧氨氧化菌低的多。 表1 2 氮循环中化学无机自养细菌的生理学参数 参数 亚硝化硝化a n a m m o x单位 g i b b s 自由能变化( p h7 ：2 5 ) 一2 7 57 4 3 5 7k j m 0 1 基质 “活化能” 6 84 47 0 k j t o o l 基质 生物产量 o0 8o0 20 0 7 c m o l m o l 基质1 最大好氧比转化率 o 2 0 600 7 2 6 o m m o l g 蛋白质m i n 最大厌氧比转化率 0 0 0 2 0 0 5 m m o l g 蛋白质m i n 最大生长速率 0 0 40 0 4 0 0 0 3 h 1 。 最小世代期 o7 3o 7 l 1 0 6天 n h 。+ 的亲和常数 5 2 6 0 0 5p m n 0 2 的亲和常数 1 4 5 0 0 s z r 2 x y r l t l l x y r 2 t l 2 。 综合比较各环境特征条件，这些底质样品采样点的生境条件可归为优良( 东 太湖) 、一般( 新沂河) 和较差( 苏州城市河道) 三类。 3 2a n a m m o x 菌的原位检测 对于所采集的6 个底质样品采用不同分子生物学技术所进行的a n a n l m o x 菌 的原位检测结果总结如下表： 表3 4 底质样品a l l a m j n o x 菌原位检测结果 t a b l e3 4r e s u l t so f t h ei ns i t ud e t e c t i o no f a n a n h n o xb a c t e r i a 样品 f i s hp c rd n a 测序 系统发育分析 与a r l a m n l o x 菌 p l a n c t o m y c e t e s 一般污 x y r la r l 3 1 t i m o x 特异性 得到目标接近的细菌新分支 水通道 探针杂交细胞，具 扩增产物 含a n a m n l o x 菌 及与b r o c a d i a 的新种类，及 x y r 2特殊环状形态 a n a m l n o x 菌接近的细菌p l a n c t o m y c e t e s 新分支 城市 s z r l 无无 河道s z r 2无无， t l l 无无 | 湖体 t l 2 无无 ， 注：表中“无”表不没有检测到目标微生物，裹不禾进行此骢工作。 以下分别对a n a l n l t l o x 菌原位检测的各项结果进行分析和讨论。 3 2 1f i s h 检测结果与分析 对于两种已鉴定的a n a m m o x 菌( b ，a n a m m o x i d a n s 和足s t u t t g a r t i e n s i s ) 的细 胞结构研究9 】【3 。1 发现，它们具有明显的分层结构，即：不含核糖体的细胞质( a ) ( a n a m m o x o s o m e ) 与一个单细胞膜( a m ) 结合；再被含有似核糖体颗粒和纤 维状类核的r i b o p l a s mc y t o p l a s m ( r ) 包围，r i b o p l a s mc y t o p l a s m 又与胞质内膜 ( i c m ) 结合，后被p a r y p h o p l a s m 包围 6 “。由于不含核糖体的a n a m m o x o s o m e 河海大学硕士学位论文 试验结果与讨论 的存在，当采用以1 6 sr r n a 为分子指标的分子生物学技术对细胞进行分析时， 镜检观察能见到环形结构【5 ”。但并不是所有a r l a l t l m o x 细胞的a n a m m o x o s o m e 都 出现在细胞的中心而形成环形结构，有时a n a m m o x o s o m e 会分布在细胞的一侧， 从而形成弯月形细胞结构。由于一般情况下，细胞质中的核糖体存在于细胞的内 部，如果在f i s h 实验中发现能与a n a m m o x 特异性探针杂交又具有环形或弯月 形结构，则可以基本上说明a n a m m o x 细胞的存在。 一般情况下，进行f i s h 实验的样品应在采样后立即进行样品的固定，但是 由于本论文中样品采集和实验地点的特殊性，没有办法在现场进行样品的固定， 所以对样品用简易方法在现场进行了固定。具体固定方法为：在底质样品中加入 与样品等体积的1 0 0 7 , 醇后混合。另外，还平行采集了一个未固定的新鲜样品， 用于进行比较和进行其它实验。样品送到荷兰n i j m e g e n 大学微生物实验室后对 现场固定的样品直接进行f i s h 杂交，对于没有固定的样品按照标准操作规程同 样进行了f i s h 实验。两组样品的镜检都受到样品中化学物质( 如碳酸钙) 的自 身荧光的强烈干扰，而且现场固定的样品没有得到更好的结果。而后，对于多聚 甲醛固定的样品用o ，2 m 的盐酸进行处理后( 与碳酸钙反应等物质反应，减少它 们的干扰) 再进行了f i s h 实验，并得到了较佳的结果。对比所有的显微图片， 样品用乙醇在采样现场进行的固定对于f i s h 实验并没有什么作用。另外，盐酸 处理可以消除部分自身荧光的发生，有助于提高显微镜观察效果。 本实验中采用的寡核苷酸探针为a l l a l t l i n o x 菌特异性的探针a m x 3 6 8 、 a m x 8 2 0 、b s 8 2 0 ，p l a n c t o m y c e t a l e s 特异性探针p l a 4 6 以及细菌的特异性探针 e u b 3 3 8 ( 详见表2 2 和表3 5 ) 。 表3 5 本实验采用的不同探针组合 探针所用染料 显示颜色 a m x 3 6 8 c y 3 红色 组合1p l a 4 6f l u o s 绿色 e u b 3 3 8 c y 5 蓝色 a m x 8 2 0 c y 3 红色 组合2b $ 8 2 0f l u o s绿色 e u b 3 3 8 c y 5 蓝色 对所有样品的f i s h 实验发现，只有在新沂河底质样品x y r l 和x y r 2 中能 够观察到目标细胞( 具体如图3 1 和图3 2 所示) ，其余底质样品中均未发现目标 细胞。图中可以明显观察到具有环状形态的细胞，而且这些细胞具有a n a m m o x 特异性的杂交方式。图3 1 和图3 2a 中的黄色细胞反映了与探针a m x 3 6 8 、 河海大学硕士学位论文 试验结果与讨论 p l a 4 6 和e u b 3 3 8 的同时杂交。理论上讲，红、绿、蓝三种颜色的叠加应该是 白色的，但是由于在观察过程中调整了这三种颜色的相对强弱以得到更清晰的图 片，所以才呈现黄色。图3 2b 中的紫色细胞反映了与探针a m x 8 2 0 和p l a 4 6 的同时杂交。由于探针a m x 3 6 8 和a m x 8 2 0 都是a n a m m o x 菌的特异性探针， 从这个杂交形式可以判断a n a i l l q l o x 菌在这两个样品中存在的可能性相当大。 3 2 2p c r 检测结果与分析 对于这些底质样品的p c r 扩增实验表明，只有在新沂河样品x y r l 和x y r 2 中存在能够与a n a r l l m o x 菌特异性引物对p l a 4 6 f a m x 8 2 0 r 和p l a 4 6 f b s 8 2 0 r 杂交的目标扩增产物，即大小约为8 1 5 b p 的p c r 产物，其它样品中均观察不到 明显的d n a 条带，具体如图3 3 所示。这一结果与f i s h 结果一致。 图3 1 样品x y r l 的落射荧光显微图像。使用的探针为：a m x 3 6 8 ( c y 3 标记，红色) 、p l a 4 6 ( f l u o s 标记，绿色) 和e u b 3 3 8 ( c y 5 标记，蓝色)