（分析化学专业论文）利用滚环扩增反应检测汞及单核苷酸多态性.pdf

摘 要 i 摘 要 核酸是重要的生命大分子，核酸的分析在生命科学研究中具有重要的意义。核酸特 殊序列及单核苷酸多态性（snp）的检测，在临床诊断、病理分析等方面都有很重要的 作用。汞污染是一个世界性问题，对人类健康造成重要影响。滚环扩增(rca)是新近发 展起来的一种恒温核酸扩增方法。 该方法具有简单、 快速、 高灵敏度和特异性好的特点， 对核酸及单核苷酸多态性（snp）检测具有广泛的应用前景。本论文主要应用滚环扩增 技术，结合分子荧光检测开发了检测 snp 和汞的新方法。 1、结合灵敏度高、特异性强的滚环扩增技术和荧光共振能量转移技术，建立了一 种均相检测 snp 的新方法。 设计挂锁式 dna 探针， 其 3,5端与突变型 dna 完全匹配。 以突变型 dna 为模板使挂锁式 dna 探针特异性连接成环， 然后以突变型 dna 作引物 进行 rca 反应。同时，在 rca 反应过程中，加入荧光标记的 dgtp，使其结合到新合 成的 dna 链上，利用阳离子共轭聚合物（ccp）与 dna 之间强烈的静电作用，在 ccp 和结合到 dna 链上的荧光分子之间发生有效的荧光共振能量转移（fret） 。而野生型 dna 与挂锁式探针有错配碱基，不能使其连接成环，不能形成 rca 反应。根据二者荧 光信号的显著差异可实现突变型 dna 高灵敏度和特异性的检测，可精确测定 1%的突 变。 2、设计含有 9 个碱基的环形 dna 探针，基于汞离子可以特异性连接 t-t 碱基，即 形成 t-hg2+-t 结构，设计一段含有 9 个 t 碱基序列的引物，它能与含有多个 t 碱基的 环形探针在汞离子的作用下结合。再利用 dna 聚合酶的顶替作用，以环形探针为模板 进行滚环扩增。以荧光染料 sybr green 检测 rca 产物，可实现汞离子的高灵敏度 检测，汞检出限为 1 nmol/l。 关键词 滚环扩增 单核苷酸多态性 荧光共振能量转移 汞 荧光检测 abstract ii abstract nucleic acid is one of the most important biomacromolecules. analysis of nucleic acids plays a very important role in life science. detection of special sequence of dna and single nucleotide polymorphism (snp) is important in clinical diagnosis, analysis of medicament and so on. mercury pollution pervades the globe and remains a danger to human health. rolling circle amplification (rca) is an isothermal nucleic acid amplification method which is simple，rapid，highly sensitive and specific. rca has a broad application prospects for detection of nucleic acid and snp detection. in this we paper mainly developed new methods for detection of snp and mercury by combining rca with fluorescence detection. combination of high sensitivity and specificity of rca with fluorescence resonance energy transfer (fret) technology, a new method for homogeneous snp detection has established. the padlock probe was designed, in which 3 and 5 terminus sequences were perfectly complementary to the mutant dna. the padlock probe was ligated by using the mutant dna as template to form circle probe. then, the mutant dna can act as a primer to initiate rca. during the rca, fluorescence-labeled dgtp is incorporated into the new dna strand produced by rca. upon adding the cationic conjugated polymer (ccp), strong electrostatic interactions between dna and ccp bring them close and efficient fref from ccp to fluorescein occurs. the wild dna contains a mismatch base with the padlock probe. therefore, the padlock probe can not be ligated and rca can not take place. according to the significant difference of the fluorescent signals between mutant dna and wild dna, highly sensitive and specific detection of dna can be realized. the method can accurately measure 1% mutations. the circle dna probe containing nine t base was designed. mercury ions can specifically connect t-t bases by formation of t-hg2+-t structure. we design a primer sequence containing nine t bases which can interact with the circle probe by introduction of mercury ions. then, rca is initiated by using dna polymerase with the replacement activity. the products of rca are determinated by specific fluorescent dye sybr green i. so a new abstract iii method for sensitive detection of mercury is proposed. detection limit of mercury is 1 nmol/l. key words rolling circle amplification single-nucleotide polymorphism fluorescence resonance energy transfer mercury fluorescence detection 第 1 章 引 言 1 第 1 章 引 言 核酸作为一类重要的生物大分子，核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物、 生物体内。它不仅对于生命的延续、生物物种遗传特性的保持、生长发育、细胞分化等 起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传疾病等密切相关。因此被称为是生命 遗传信息的携带者和传递者。核酸是一种多聚核苷酸（polynucleotide） ，它的基本结构 单位是核苷酸（nucleotide） 。含有特定遗传信息的核苷酸序列被称为基因，是遗传物质 的最小功能单位,是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一1。 研究检测特定核酸序列和基因突变， 以及它们与人类重大疾病之间的关系日益重要 2-5。 由单个碱基突变形成的基因单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism， snp） 是基因突变最常见的形式。作为基因图谱标志的单核苷酸多态性，与基因功能研究密切 相关，同时可以作为在基因水平上诊断重大疾病、研究不同个体之间药物响应等的有力 工具6-9。因此，核酸特殊序列及 snp 的检测，在临床诊断、病理分析、食品与药物检 测以及环境监测方面都有很重要的作用。 汞污染对环境和人类健康造成重要影响，甲基汞对人的大脑、精神系统、免疫系统 和其他器官都是有害的。 （美国）环境保护局（epa）规定可饮用的水中汞离子的含量 要低于 10 nmol/l，而能够检测到该检测线的方法很少，因此对建立高灵敏度和特异性 的检测汞的方法提出了挑战。 滚环扩增技术是基于 dna 或 rna 引物沿环状 dna 等温滚动复制的技术。在滚环 扩增反应中，引物在具有顶替作用的 dna 聚合酶作用下，以环形探针为模板进行重复 扩增，一般引物可被延伸成千上万个碱基，表现出很强的扩增能力。利用滚环扩增技术 进一步开发均相、简单、灵敏的检测 snp 的方法具有重要意义。 1.1 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp) 单核苷酸多态性是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的 90%以上。它是在由于单个核苷酸位置上的转换或颠换等变异所引起的 dna 序列多态 性。转换即 c 与 t 互换，在其互补链上则为 g 与 a 互换；颠换即 c 与 a，g 与 t，c 与 g，a 与 t 互换。snp 在人类基因组中广泛存在，约占基因中的 12，总数 河北大学理学硕士学位论文 2 可达 300 万个甚至更多。 1.1.1 snp 的特点以及研究意义及进展 snp 的特性使其适合于对基于群体的基因识别以及疑难复杂病理与遗传疾病 的解剖等方面的研究。 1 数量多、分布广泛 据估计， snp 的比例占人类基因组中核苷酸的 1， 即总数可达到 300 万以上。 snp 分布广泛，根据 snp 在基因中的位置，可分为基因编码区、基因周边以及基 因间等三类。 2 适于快速、规模化筛查 组成 dna 的碱基有 4 种（a、t、g、c），但 snp 一般是由两种碱基组成的， 是一种二态的标记，即二等位基因。这种特性使得 snp 在基因组筛选中不用分析 片段的长度而利于发展自动化技术筛选或检测 snps。 3 等位基因频率的测定 对混和样本中等位基因的频率的估算的原理是：选择参考样本制作标准曲线， 然后将待测的混和样本进行测定，将其与标准曲线进行比较，根据所得信号的比 例确定混和样本中等位基因的频率。 4 易于基因分型 snps 的二态性有利于对其进行基因分型，对 snp 进行基因分型包括：1、鉴 别基因型所采用的化学反应（dna 杂交、引物的延伸、等位基因特异的寡核苷酸 连接反应、侧翼探针切割反应等）。2、完成这些化学反应所采用的模式（液相反 应、固相支持物上进行的反应）。3、需要应用生物技术系统检测化学反应结束后 的结果。 1.1.2 snp 检测的方法和技术10-12 按分析方式的不同可分为固相和均相方式；依据不同的检测手段可以分为标 记探针检测和无标记检测。 1、固相分析方式 将特异性基因探针固定在固体支持物上（如玻璃载玻片、硅芯片、乳胶微球、 磁性微球或微孔板等）进行杂交反应，捕获目标核酸序列。目标核酸序列可以是 第 1 章 引 言 3 被捕获的目标核酸与表达探针杂交形成三明治结构，也可先进行标记后直接被检 测，根据表达探针的信号可实现对目标核酸的检测。固相分析方式具有高通量、 多元性、特异性好等优点。缺点是在整个反应过程中需要设计和优化大量的基因 探针，这使得实验成本提高、分析时间长；试验过程中需要多步杂交与分离、洗 涤与纯化、实验操作复杂。 2、均相分析方式 可以在溶液中通过逐步添加试剂进行反应后检测，也可直接进行分析检测。 均相分析方式操作简单、快速、检测灵敏度高、实验费用低，无需分离、洗涤和 纯化等步骤。但是不易同时检测多个目标、检测的背景信号较高。均相检测方法 主要有荧光偏振（fluorescence polarization，fp） 13，14和荧光共振能量转移 （fluorescence resonance energy transfer，fret）15-17 。 3、标记探针检测 目前主要有两种标记探针检测方法，包括放射性同位素标记的探针和荧光标 记的探针。同位素标记具有灵敏度高、特异性强的优点，但其寿命短，放射性物 质操作和处理不方便，对人体、环境造成了严重的危害，所以在有些研究中避免 使用该方法。荧光标记的探针需要复杂的荧光或激光扫描进行定量，在一定程度 上限制了其广泛应用。此外，需要利用电泳分离或固相的分析模式18-21区别结合 与未结合的标记探针，从而提高选择性。该方法的缺点是分析时间较长、操作复 杂、费用高。 4、无标记检测方法 通过观察目标分子和探针分子杂交前后的光学、质量、构象和介电常数等性 质的变化来进行分析与检测，检测技术包括光学22、石英晶体微天平23 ，24，电化 学检测25 ，26表面等离子共振27，28、质谱29，30等。无标记检测方法可降低成本、 提高效率，具有很高的灵敏度，但一般需要凝胶分离或异相的分析模式实现测定。 由上述分析可以看出，不同分析方式和检测手段各具优缺点。在实际的核酸 和 snp 的分析检测中，根据样品的性质和特点选择合适的分析方法很重要。一般 的分析研究是根据实验目的和要求，以及具备的实验条件来选择合适的分析模式 和检测手段，从而实现测定。 河北大学理学硕士学位论文 4 1.2 汞 1.2.1 汞的危害、安全标准及来源 汞中毒对人体健康带来多方面影响。甲基汞进入人体后影响各个器官，例如精神系 统、免疫系统、肝脏以及其他器官。脑组织的中毒表现的症状有：头痛、疲倦感、健忘、 精神失常等。还会出现其他症状：四肢麻木、听说障碍、肌肉酸痛、痉挛等。甲基汞容 易通过母体进入到胎儿体内。 研究表明， 胎儿红细胞中甲基汞的含量要比母亲的高 30%， 胎儿性甲基汞中毒已有许多报道，因此检测汞对人类健康及环境污染具有重要的意义。 （美国）环境保护局（epa）规定可饮用的水中汞离子的含量要低于 10 nmol/l。我 国规定汞在室内空气中的最大允许浓度为 0.01 毫克/立方米， 一般认为人在汞浓度为 1.2 毫米8.5 立方米的环境中很快会引起中毒。1995 年国际指定的甲基汞“安全”计量标准 是 0.1 微克/公斤/天，此标准正在更严格化的进行。通常检测汞的方法，灵敏度较低， 组分干扰较大，反应时间长。因此研究简便、快速的高灵敏度检测汞的方法具有重要意 义。 1.2.2 检测汞的方法、特点及测定仪器 原子光谱法包括：原子发射光谱法(atomic emission-spectrometry，aes)、原子吸收 光 谱 法 （ atomic absorption spectrometry ， aas ） 原 子 荧 光 光 谱 法 (atomic fluorescence-spectrometry, afs)等。 原子发射光谱法（aes）是根据待测物质的气态原子被激发时所发射的特征线状光 谱的波长及强度来测定物质的元素组成和含量的一种分析技术。 原子发射光谱的光源包 括电弧光源、电火花光源、电感耦合高频等离子体光源(1cp)。aes 在激发光源不同的 情况下可得到不同灵敏度的检测形式，具有较好的选择性。此外，电感耦合等离子体原 子发射光谱备受关注，icp-aes(也称 icp-oes)广泛地用于质量控制的元素、超微量元 素的分析和检测等领域。由于仪器价格昂贵，维护成本高，操作技术性要求严格限制了 icp-aes 在汞分析中的广泛应用。 原子吸收光谱法（aas）是利用气态原子可以吸收一定波长的光辐射，使原子 中外层的电子从基态跃迁到激发态的现象而建立的。aas 是目前痕量汞分析应用最 广泛的检测方法之一，具有检出限低、准确度高、选择性好、分析速度快等优点。 第 1 章 引 言 5 尤其是冷蒸汽原子吸收分光光谱法(cvaas)，它极大地提高了测定的灵敏度，可方便进 行汞的分析。 原子荧光光谱法（afs）是介于原子发射光谱（aes）和原子吸收光谱（aas） 之间的光谱分析技术。基态原子吸收合适的特定频率的辐射而被激发至高能态， 而后激发过程中以光辐射的形式发射出特征波长的荧光，通过检测荧光的强弱来检 测试样的成分和浓度。afs 测定汞大多采用冷原子荧光光谱法，该法灵敏度很高，适用 于空气、水、食品等物质中超微量汞的测定。 其他的检测汞的方法还有： 分光光度法 （分光光度计比色法、 动力学分光广度法等） 、 x 射线荧光分析法(x-ray fluorescence，xrf)、化学滴定法。 常用测试仪器及设备 1 电感耦合等离子原子发射光谱仪(1cp-aes) 2 原子吸收分光光度计(aas) 3 气相色谱-质谱联用仪(gc-ms) 这些方法主要是利用原子光谱进行检测，其仪器昂贵、条件复杂、反应时间较长。 而利用滚环扩增方法检测汞的方法未见报道。因此我们利用滚环扩增技术，基于汞离子 特异性连接 tt 碱基，研究简单、快速、高灵敏度检测汞的方法。 1.3 滚环扩增技术31 滚环扩增（rolling circle amplification，rca）是一种常见的复制环状核酸的 方式。它是借鉴病原生物体的滚环复制方式而提出的一种体外核酸扩增技术，在 室温下即可进行， 不需要特定的热循环仪， 是现代分子生物学实验中的一项重要技术。 它使微量的核酸（dna 或 rna）操作变得简单易行，同时还可使核酸研究脱离于活体 生物而进行。 1.3.1 滚环扩增的原理 滚环扩增是当核苷酸在单链闭合状态下有相应引物存在时等温延伸的技术。 设计一 个大概 60-90 个碱基的单链寡核苷酸，其 3和 5端各有一段序列可以与目标 dna 上一 段序列完全互补， 当被检测的目标样品中含有可与单链环两端序列完全匹配的序列时将 与之杂交， 并形成具有一个缺口的双链 dna， 在连接酶的作用下可以将杂交在目标 dna 上相邻的两个基因间的这个切口连接起来形成锁式环形结构， 而杂交的那段引物可以以 河北大学理学硕士学位论文 6 该环为模板进行滚环扩增反应，形成一条单链重复体，通常称其为线性滚环扩增。设计 与该序列上一段序列匹配的另一段引物，使之结合到滚环扩增后的产物上再进行扩增， 其扩增产物序列又可成为新的模板再进行新一轮扩增， 如此循环最终扩增出以滚环长度 为单位的不同长度双链 dna 产物，这种扩增形式称作超支化滚环扩增，其扩增产物在 凝胶电泳中也呈现阶梯样分布。如果样品中不含有要检测的匹配序列，则不能形成环形 探针，这些扩增反应将不能进行，所以也称这种反应为连接依赖性 rca32。kuhn 等33 专门对拓扑结构下的滚环扩增过程进行研究， 结果表明模板 dna 或 rna 的拓扑结构并 不影响通常的聚合酶对 rca 的聚合反应，并且在 rca 反应后模板 dna 又可恢复天然 的拓扑结构。 1.3.2 实用滚环扩增的形式 滚环扩增的实现形式通常有两种： 一种是已经成环的单链模板在聚合酶的作用下扩 增，然后进行针对性检测。例如：测序模板的制备，测序的起始物可来源于的环形模板 如：菌类、培养物、甘油储存的细菌或噬斑等34；另一种则是在模板两端有与靶分子互 补的一段序列杂交，然后利用连接酶反应将其连接、再进行环化探针扩增，然后检测扩 增信号。例如，snp 检测。这种形式中的探针常被称为锁式探针(padlock probe)或耳环 式探针（earring probe） 。锁式探针的两端与靶核酸序列特异性互补，当有错配存在时， 探针的连接反应就无法完成，从而确保了 dna 和 rna 检测中的高特异性35。 1.3.3 滚环扩增反应的优点与缺点 与其他核酸扩增技术相比，滚环扩增反应有许多优点: 1、扩增条件温和，反应简单 36。滚环扩增反应与 pcr 技术相比，可以直接扩增 特定的 dna 或 rna 分子，实现靶分子信号的放大，在恒温条件下进行，不需要特定的 热循环仪器，条件温和。 2、灵敏度高。滚环放大的扩增能力很强，线性滚环扩增的效率可达到 105倍，超分 支滚环扩增的效率可达到 109倍， 能够达到一个拷贝的分子检测37； 可利用化学发光法， 荧光法等方法检测扩增产物，成本低、灵敏度高。 3、特异性强。对 snp 位点的识别具有极高的选择性，将信号放大与 snp 识别集成 为一体，滚环扩增反应在恒温条件下进行可实现多个目标 dna 分子的同时扩增，形成 高通量分析技术。利用锁式探针检测目标 dna，需要探针两端各有一段序列完全互补， 第 1 章 引 言 7 应用特异性的连接酶可区分到一个碱基的差异，该方法适用于 snp 检测。 rca 检测方法的缺点： 1、成本高。实验中的锁式探针的长度一般在 60-90 个碱基，都是由专门的生化公 司合成的，它合成的费用较高。但是当需要较多数量的锁式探针时，可以采用以连接序 列为模板、特异性互补区序列为引物的 pcr 反应来合成探针。采用这种方法实现了 60%70%探针产物的正确合成和相应的连接效率38，降低了成本。 2、背景信号高。rca 过程中未成环的锁式探针和未与锁式探针结合的模板 dna 或者 rna 也会产生信号。固相 rca 反应，选用磁珠等作为固体支持物固定 dna 或者 rna，再进行扩增来降低背景信号 39；而在液相 rca 反应中，引入 dmso 和 t4 基因 结合蛋白来增强扩增的效率； marianna 和 szemes 等应用 exonuclease与 exonuclease 混合的酶反应液35， 能够在连接反应后有效地去除线性锁式探针和未结合的模板 dna， 消除背景信号。 1.3.4 rca 的主要应用 1、在核酸测序中的应用 利用滚环扩增反应对噬菌斑或细胞的环状 dna 扩增，处理后的产物可以直接 进行测序。与传统方法相比，减少了连接转化、扩大培养、提取分离等繁琐步骤40 ， 41。目前 amersham biosciences 公司利用滚环扩增测序技术，建立了可应用于克隆 技术、合成探针、文库构建等的分子生物学实验。 2、检测单核苷酸多态性以及在细胞原位检测中的应用 近年来，滚环扩增技术在单核苷酸多态性检测及细胞原位检测等方面被广泛 的应用42-43，人工合成的一段 60-90 个碱基的核苷酸探针，序列的两端各有一段 碱基与检测的模板互补，3端是多态性位点，不同等位基因型对应的寡核苷酸探 针有一段与之不匹配的序列。寡核苷酸探针与检测的模板杂交后，在连接酶的作 用下连接、成环，引物 5端设计成类似分子信标的结构结合到模板后可以产生特 定的荧光信号，检测该信号又判断出目标 dna 的多态性位点的基因型。滚环扩增 技术不但可以对体外分离的核酸进行基因分型，还可以检测细胞点突变达和 mrna 表达水平进行定量检测。此外，滚环扩增技术还可以实现单碱基突变的检 测和对固定的细胞在原位进行基因拷贝数的检测，效率可达 90%以上。 河北大学理学硕士学位论文 8 3、在 dna 芯片中的应用 不同的寡核苷酸具有不同的位点标记，目标模板与探针的微阵列杂交，与模 板匹配的探针发生连接反应后成环，随后环状产物进行滚环扩增，多种特定的探 针信号放大，检测到不同目标物模板的系统信息，实现高通量的分析。滚环扩增 技术可以实现野生位点中 1%的突变位点的检测，又实现了低丰度突变的检测，因 此对于癌症等重大疾病的早期检测和监测分析具有重要的意义。此外，利用 dna 芯片技术结合滚环扩增技术可以进行多个热点突变位点的多重检测，具有分辨率 高、特异性好、高通量等特点。与金字塔式扩增的原位检测技术相比，滚环扩增 技术可以使灵敏度提高 10 倍以上44 ，45 。 4、在蛋白质芯片中的应用 在蛋白质芯片的微阵列标记不同特定抗体，当样本进入微阵列后特定抗原和 某一位点的抗体 a 发生特异反应而被捕获。加入抗体 b 与该抗原继续反应后 b 被 捕获（即双抗体夹心反应），将抗体 c(抗抗体)标记引物，进一步结合在抗体 b 上 进行滚环扩增反应，位点信号显著放大，进行高灵敏度和特异性的检测。此技术 可进行大规模的多重反应，可以对数百个分析物同时进行检测。kingsmore 等46-49 人基于滚环扩增反应建立了类似的免疫方法，在引物的 5端标记抗体，进行抗体 抗原反应， 对环状 dna 模板进行扩增， 标记有荧光素的探针与扩增产物原位杂交， 此后再进行荧光检测，该方法的灵敏度可达 0.1 pg/ml。 将荧光标记物结合到滚环扩增反应中去，具有较高的灵敏度。但是多数是在 固相中进行的，需要洗涤和分离的步骤，较为繁琐。而在均相中进行不仅能达到 较高的灵敏度而且方法简单、快速。因此，将水溶性阳离子共轭聚合物结合到检 测中去，发生荧光共振能量转移，即可达到在均相中的检测。 1.4 水溶性阳离子共轭聚合物以及荧光共振能量转移 1.4.1 水溶性阳离子共轭聚合物 水溶性阳离子共轭聚合物（ccp）具有特殊的光学和电化学性能，它具有常规 的共轭分子结构，可作为生物传感器中的信号转换材料。可以通过简单的化学修 饰对共轭聚合物的光电性质进行改进，此外，其光电性质还受周围环境如温度、 溶剂和 ph 值等的影响。共轭聚合物具有很强的光捕获能力，可以有效的倍增光学 第 1 章 引 言 9 信号，可作为荧光共振能量转移的给予体从而实现核酸的检测，具有很强的优势。 例如：水溶性聚芴具有最大吸收峰在 380 nm 左右，荧光发射峰在 429 nm 左右， 作为良好的光能采集器是一个很好的能量共振转移的给予体。利用该水溶性阳离 子共轭聚芴，bazan 研究小组利用荧光比率测定的方法研究了一系列新型的检测 dna 的体系 50 。 1.4.2 荧光共振能量转移原理 荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer ，fret）是指在两个 不同的荧光基团中，如果一个荧光基团的发射光谱与另一个基团的吸收光谱有一 定的重叠，这两个荧光基团间（供体 donor 和受体 acceptor）的距离合适时(一般 10 nm 左右)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。即前一种基团的激 发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。在供体基团的激发状态下由一 对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程，此过程没有光子的参与，所以是 非辐射的。给予体分子被激发后，当接受体分子与给予体分子相距一定距离，且 给予体和接受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应 时，处于激发态的给予体将把一部分或全部能量转移给接受体，使接受体被激发， 在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。如果接受体荧光量子产 率为零，则发生能量转移荧光熄灭；如果接受体也是一种荧光发射体，则呈现出 接受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红移。 1.4.3 荧光共振能量转移探针概述 能量供给体接受体（da）对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主 要包括51 ，52： 1、能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠。 2、能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列。 3、能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。 此外，对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能 力等方面还有众多的要求。可见，要找到一个合适的 da 对是很不容易的。 河北大学理学硕士学位论文 10 图 1 荧光共振能量转移 阳离子共轭聚合物具有庞大的共轭结构和巨大的摩尔吸光系数， 在荧光共振能量转 移中对目标荧光信号产生强烈的放大作用，而且阳离子共轭聚合物的正电荷与 dna 链 的负电荷进行强烈的作用大大增强了荧光共振能量转移的效率，同时降低了荧光背景， 由此使荧光共振能量转移分析的灵敏度大大提高。 1.4.4 荧光共振能量转移在生化分析中的应用 荧光共振能量转移的荧光探针主要有荧光蛋白、 有机荧光染料、 镧系染料和量子点， 测试方法上与时间分辨、单分子检测、荧光寿命和荧光光谱等技术联用取得了更好的成 效，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。 1、利用荧光共振能量转移技术研究蛋白质相互作用，与酵母双杂交、磷酸化抗体、 免疫荧光、放射性标记及质谱等技术相比适用于固定细胞和活细胞的分子，检测灵敏度 高、分辨率高、能清晰成像，最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息，不需要 破碎细胞或对细胞造成损伤，做到在活细胞生理条件下对细胞内蛋白质-蛋白质间相互 作用进行实时的动态研究，因此荧光共振能量转移研究蛋白质相互作用受到广泛重视。 2、利用荧光共振能量转移与核酸杂交技术相结合，可快速简便的进行核酸的突变 检测、 同源性分析和定量分析等。 省去了固相杂交种反复洗涤等步骤， 节省了分析时间。 标记在核酸上的能量供受体之间的距离会因探针结合状态的不同而改变， 通过荧光的变 第 1 章 引 言 11 化检测出来。阳离子共轭聚合物具有庞大的共轭结构和摩尔吸光系数，受激发后能转移 给能量受体，荧光信号被显著放大，广泛应用于核酸分析53 ，54 。 1.5 本论文主要研究内容 本论文利用滚环扩增技术， 应用共轭聚合物结合荧光共振能量转移对单核苷酸多态 性进行定量检测； 应用t-t碱基特异性结合汞的原理， 成环， 连接反应后结合sybr green i 染料可以对 dna 特异性检测，从而高灵敏度检测汞。 1、结合滚环扩增技术和荧光共振能量转移技术，突变型 dna 与模板特异性杂交后 直接作为引物进行滚环扩增反应，同时，引入荧光标记的 dgtp 使其结合到 rca 产物 中。 从而将扩增产物与阳离子共轭聚合物 pfp 形成能量受体对， 发生荧光共振能量转移， 而野生型 dna 则不会发生该反应。根据二者荧光信号的显著差异可实现突变型 dna 高灵敏度和特异性的检测，随着 rca 在生化分析中的广泛应用，所建立的荧光共振能 量转移检测 snp 的方法，为今后的研究提供了新的策略。 2、基于滚环扩增技术，首先设计一段完全互补的序列，与探针杂交，成环。然后 在外切酶 i 和外切酶 iii 的作用下将其未成环的单链和双链切断，留下一个环状探针以 备下步反应。利用汞离子可以特异性连接 t-t 碱基，即形成 t-hg2+-t 结构的原理，设计 成环的 dna 模板上有一段序列与引物 dna 在汞离子的作用下杂交， 成环。 再利用 dna 聚合酶的顶替作用，以环形探针为模板进行滚环扩增。 河北大学理学硕士学位论文 12 第 2 章 利用滚环扩增荧光共振能量转移检测单核苷酸多态性 2.1 前言 人类基因组计划完成之后，研究并检测特定核酸序列和基因突变，对重大疾病的早 期诊断具有重要的指导意义。由单个碱基突变形成的基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，snp）是基因突变最常见的形式。因此，建立灵敏度高、特异 性强的检测方法非常重要。 滚环扩增 (rolling circle amplification，rca) 是近年来发展的一种恒温核酸扩增方 法55-58。滚环扩增将一条线性 dna 单链引物和环形模板单链的杂交，在连接酶的作用 下将环形模板两端链接，接着引物在 dna 聚合酶的作用下延伸，形成具有大量重复序 列且与环状模板链完全互补的线状单链。dna 可以延伸成千上万个碱基，比亲代 dna 单位长度的多许多倍。 这种方法可以直接扩增 dna 和 rna， 实现对靶核酸的信号放大， 具有很高的灵敏度。 我们利用滚环扩增的方法，荧光共振能量转移检测 snp。当锁式探针与完全匹配的 突变 dna 杂交后，在连接酶的作用下，将探针链接成环。引物在聚合酶的作用下进行 延伸反应。在此过程中荧光标记的 dgtp 将与 dna 链相结合。滚环扩增产物与阳离子 共轭聚合物 pfp 形成能量受体对，结构如图 2 所示，发生荧光共振能量转移，从而进行 snp 检测。 pfp 图 2 pfp 和 dgtp-fl 的结构示意图 pfp：ex/em=380 nm/424 nm;dgtp-fl: ex/em=480 nm/535 nm 第 2 章 利用滚环扩增荧光共振能量转移检测单核苷酸多态性 13 2.2 实验部分 2.2.1 仪器与试剂 f-4500 型荧光分光光度计（日本日立公司） pcr 仪（美国，thermo） 电泳仪（dyy-10 型三恒电泳仪，北京六一仪器厂） 凝胶成像仪（model 4000， bio-rad） 高速冷冻离心机（上海安亭） sz-93 自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂） 耐热稳定 dna 连接酶（ampligase）购自 epicentre biotechnologies（madison， wi） phi29dna 聚合酶购自 epicentre biotechnologies（madison，wi） datp、dctp、dttp、dgtp、dgtp-fl，均购自 perkin elmer 公司 pfp(中科院王树实验室合成) 所有的寡聚核苷酸都是经过 page 纯化。所合成的 dna 序列购自宝生物科技有限 公司（中国，大连） ，序列如下： 锁式探针： 5-(po4)-gtctctcccaggacaggctttcatttacagtttagcatttgcgcatta ctttcggctcttcctctgtgcgcca-3 mut 引物： 5- gcgtgtttgtgcctgtcctgggagagactggcgcacagaggaagag-3 nor 引物： 5- gcgtgtttgtgcctgtcctgggagagaccggcgcacagaggaagag-3 本实验所用缓冲溶液如下： ampligase 10 reaction buffer: : 200 mmol/l, tris-hcl (ph 8.3), 250 mmol/l kcl， 100 mmol/lmgcl2, 5 mmol/lnad, and 0.1% triton x-100 phi 29 dna polymerase 10 reaction buffer:40 mmol/l tris-hcl (ph 7.5)， 50 mmol/lkcl, 10 mmol/lmgcl2, 5 mmol/l (nh4)2so4 te buffer （1） ph 7.5 河北大学理学硕士学位论文 14 tae buffer (1) ph 8.5 0.2 mol/l pbs(含 10 mmol/l nacl，ph7.4) 实验所用试剂均为分析纯，试验用水为高纯灭菌水 2.2.2 连接反应和滚环扩增反应 在 pcr 管中加入 2.5u 的 ampligase 连接酶、10ampligase 缓冲液、适量的锁式 探针和目标 dna 的反应溶液，总体积共 20 l。将反应溶液在 95反应 3 分钟，使锁 式探针和目标 dna 变性，然后在 45反应 90 分钟，进行连接成环反应。 将含有 phi 29 dna polymerase 及其 10 倍缓冲溶液、datp、 dctp、dttp、dgtp、 dgtp-fl 总体积 20 l 混合物加入到连接反应产物中。datp、dctp、dttp 为 200 mol/l4l ，dgtp 为 200 mol/l，3.6 l ，dgtp-fl 为 100 mol/l，0.8 l。在 37 反应条件下进行 4 小时， 然后 70加热 10 分钟， 将 dna 聚合酶失活， 停止 rca 反应。 2.2.3 凝胶电泳检测 实验中使用琼脂糖凝胶电泳对 rca 产物进行分离检测， 其具体实验操作步骤如下： 1、制备 1琼脂糖凝胶：称取 0.13 g 琼脂糖置于烧杯中，加入 20 ml 1 tae 缓冲 液，加热煮沸至体积至约 15 ml 左右，摇匀，即成 1%琼脂糖凝胶液。 2、胶板制备：将凝胶液稍稍冷却后倒入槽中，胶液缓慢展开，形成均匀胶层，并 在固定位置放好梳子。本实验不需要染色过程，不需要额外添加染料。室温下静置直至 凝胶完全凝固，大约 30 分钟左右，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳 槽中，添加 1 tae 缓冲液至淹没胶板为止。 3、加样：将 6 l dna 样品和 1.5 l 6 的上样缓冲液混合，用微量移液器分别将 样品加入胶板的小槽内。 4、电泳：将加样后的凝胶板通电，调整适当电压，样品由负极向正极方向移动， 电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。 5、观察照相：将凝胶置于紫外灯下观察，扩增产物存在时有明显的亮带，不存在 时则不亮，采用凝胶成像系统拍照保存。 2.2.4 荧光检测 第 2 章 利用滚环扩增荧光共振能量转移检测单核苷酸多态性 15 rca 反应结束后， 在 176 l， 0.2 mol/l 的 pbs 缓冲溶液中加入 4 l， 10 mol/l 的 pfp，再加入 rca 产物 20 l，混合均匀。在荧光分光光度计上，进行光谱扫描。激发 波长为 380 nm，负高压 700 v。 2.3 结果与讨论 2.3.1 反应原理 2.3.1.1 滚环扩增 图 3 滚环扩增原理图 如图 3 所示， 设计锁式探针有一段序列与突变型 dna 序列完全匹配， 二者杂交后， 在特异性连接酶的作用下将其连接成环，突变型 dna 直接作为引物，在聚合酶的作用 下进行滚环扩增反应。在 rca 过程中，引入荧光标记的 dgtp 结合到新生成的 rca 产 物中去。而野生型 dna 序列与锁式探针有一个错配碱基，在加入连接酶后不能被连接 成环，只能发生极小的线性扩增，荧光标记的 dgtp 只有极少的结合到其中。 2.3.1.2 荧光共振能量转移 如图 4 所示，rca 产物中带有荧光标记的 dgtp 与阳离子共轭聚合物 pfp 形成能 量受体对。扩增产物带有负电荷，阳离子共轭聚合物带有正电荷，正负离子相互作用拉 近了二者的距离，发生荧光共振能量转移，从而实现对 snp 检测。 河北大学理学硕士学位论文 16 图 4 荧光共振能量转移原理图 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳相关结果 突变性 dna 和野生型 dna 滚环扩增产物，可通过琼脂糖凝胶电泳检测其差异， 如图 5 所示。突变性 dna 经过滚环扩增得到大量 dna 长链，因此在电泳过程中不能 进入凝胶，留在槽中表现出一条亮带。野生型 dna 不能发生滚环扩增，产物将进入凝 胶中，槽中没有亮带出现。 1 2 3 4 m 图 5 单碱基差异电泳图 道 1 nor dna 25 nmol/l 道 2 mut dna 25 nmol/l 道 3 nor dna 1 nmol/l 道 4 mut dna 1 nmol/l 道 5 marker 第 2 章 利用滚环扩增荧光共振能量转移检测单核苷酸多态性 17 在滚环扩增的过程中，大量的 dgtp 和 fl-dgtp 将结合到 dna 长链中去，我们需 要将二者的量进行优化，目的是使更多的荧光标记物结合到 dna 中去，如图 6 所示， 道 1、3、5、7 为野生型 dna，道 2、4、6、8 为突变型 dna。1、2 道的 dgtp-fl 和 dgtp 的比例为 1：6；3、4 道的 dgtp-fl 和 dgtp 的比例为 1：9；5、6 道的 dgtp-fl 和 dgtp 的比例为 1：19；7、8 道的 dgtp-fl 和 dgtp 的比例为 1：39。如图，突变型 dna 进行滚环扩增后均有一条亮带出现早槽中，而野生型 dna 则没有亮带。比较亮带 的强弱。选择荧光结合效率较高的比例进行下述实验。我们选用的是 5、6 道中 dgtp-fl 和 dgtp 的比例。 1 2 3 4 5 6 7 8 图 6 不同比例 fl-dgtp 与 dgtp 量的优化电泳图 道 1、2 比例为 1：6 道 3、4 比例为 1：9 道 5、6 比例为 1：19 道 7、8 比例为 1：39 其中 1、3、5、7 为 nor dna 2、4、6、8 为 mutdna 2.3.3 荧光共振能量转移 2.3.3.1 本方法对 dna 灵敏度的检测 在前述实验条件下，溶液在 2.5 nmol/l 的环形模板和不同浓度的突变型 dna 杂交 后，经过滚环扩增后荧光共振能量转移检测光谱图。如图 7 所示，突变 dna 浓度分别 为 5 pmol/l ，25 pmol/l， 50 pmol/l， 250 pmol/l， 500 pmol/l，2500 pmol/l 随着突 变型 dna 浓度的增加，荧光共振能量转移的效率随之增加。并成很好的增加趋势。 河北大学理学硕士学位论文 18 图 7 不同浓度突变型 dna 的荧光共振能量转移光谱图 2.3.3.2 snp 分析 按照实验部分的标准进行操作，首先测定了相同浓度（5 nmol/l）的突变型 dna 和野生型 dna 荧光共振能量转移的光谱。 如图8所示。 突变型dna荧光强度大约是野生型dna荧光强度的6倍。 在amp