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湖泊沉积物微生物多样性和厌氧氨氧化菌鉴别研究 摘要 氮素是生物体的基本营养物质之一，也是水体富营养化的主要限制因子之一， 在自然水体中存在着众多的氮反应过程，维系着全球氮平衡及生物生长。现在我国 许多湖泊都面临着较严重的氮素污染威胁，湖泊中氮素的去除主要是靠沉积物中微 生物的硝化、反硝化及厌氧氨氧化的作用来实现。因此，探讨淡水沉积物中微生物 的物种多样性及分布特性，阐明厌氧氨氧化细菌的动态变化，为丰富湖泊氮素循环 理论，深入了解水陆氮素循环过程提供科学依据，对于水体氮素污染治理也具有现 实意义。 本文以武汉东湖、南湖以及南湖周边养殖塘为研究区域，通过沉积物中细菌基 因组d n a 的提取、p c r 扩增、d g g e 等分子生态学手段，对淡水湖泊沉积物中的 微生物群落结构、生物多样性进行研究，对沉积物中的厌氧氨氧化菌的系统发育进 行了较为详细的探讨。研究表明： ( 1 ) 东湖、南湖、藕塘及鱼塘沉积物中细菌多样性十分丰富，种群结构复杂； 夏季细菌丰度和多样性指数普遍高于冬季，推测温度是导致这一结果的原因之一。 ( 2 ) 随着污染物质浓度的降低，沉积物中细菌群落的多样性呈增大的趋势，表 明水质状况对浅水湖泊沉积物的细菌群落结构会产生一定的影响。 ( 3 ) 南湖的群落结构比东湖更加复杂，说明不同区域内相对稳定的沉积物微生 物群落结构有所差异，原因与各湖泊水质和沉积物的理化性质相关。湖泊内部各采 样点之间的相似性更大，表明各湖泊内形成了独特的微生物群落结构。鱼塘比藕塘 的丰度以及多样性指数更高，藕塘与东湖的细菌群落结构较为相似，鱼塘沉积物的 细菌群落结构与南湖的更为接近，说明人类活动的同质性导致微生物群落趋向的同 质性。 ( 4 ) 东湖和南湖湖心的沉积物细菌群落结构多样性指数由表层向深层呈现先升 高再下降的趋势，在6 1 2c m 处达到最大，细菌群落结构在6 8c m 深度发生明显的 转变和过渡，原因可能与风浪的扰动及沉积物中氧含量有关。 ( 5 ) 3 6 条典型条带的测序及系统发育分析显示，回收的条带主要是伉变形菌 纲、伊变形菌纲、6 一变形菌纲、) ，一变形菌纲，少量的黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲，及芽孢 杆菌纲。其中m a s s i l i a 属、m e t h y l o t e n e r a 属以及假单胞菌属占有优势地位。 ( 6 ) 通过巢式p c r 成功从东湖、南湖、藕塘及鱼塘中发现了厌氧氨氧化菌的存 华中农业大学2 0 1 2 届硕士研究生学位论文 在。经过比对分析发现菌种的多样性不高，c a n d i d a t u sb r o c a d i af u t g i d a 占有绝对优 势地位。另，在鱼塘中发现一种可能属于b r o c a d i a 的一个新菌种，其功能和特性还 有待研究。 关键词：氮循环；淡水湖泊：沉积物；生物多样性：厌氧氨氧化菌：p c r d g g e ； 巢式p c r i i 湖泊沉积物微生物多样性和厌氧氨氧化菌鉴别研究 a bs t r a c t n i t r o g e ni so n eo ft h ee s s e n t i a ln u t r i e n t sf o ro r g a n i s m s ，a n di t sa l s ot h em a i n n u t r i e n te l e m e n t so fe u t r o p h i c a t i o n t h e r ea r eal a r g en u m b e ro fn i t r o g e nr e a c t i o nt o m a i n t a i nt h eg l o b a ln i t r o g e nb a l a n c ea n db i o l o g i c a lg r o w t hi nn a t u r a lw a t e r b o d i e s m a n y l a k e si nc h i n aa r en o wf a c i n gam o r es e r i o u st h r e a to fn i t r o g e np o l l u t i o n ，n i t r o g e n r e m o v a li nl a k e sr e l yo nm i c r o b i a ln i t r i f i c a t i o n ，d e n i t r i f i c a t i o na n da n a e r o b i ca m m o n i u m o x i d a t i o ni ns e d i m e n t t h e r e f o r e ，t h ed i s c u s s i o no fs p e c i e sd i v e r s i t ya n di m p o r t a n c eo f m i c r o o r g a n i s m si nf r e s h w a t e rs e d i m e n t sc l a r i f i e st h es e a s o n a lc h a n g e so ft h ea n a t l l l t l o x b a c t e r i a , a n dp r o v i d e sas c i e n t i f i cb a s i sf o re n r i c h i n gt h en i t r o g e nc y c l et h e o r yo fl a k e s a n dr e p a i r i n ge u t r o p h i cw a t e r i tw i l lb em o r ec o n d u c i v et o g i v eu s a ni n d e p t h u n d e r s t a n d i n gt h en i t r o g e nc y c l eo fl a n dw a t e r , a n di ta l s oh a sap r a c t i c a ls i g n i f i c a n c ef o r w a t e rp o l l u t i o nc o n t r o lo fn i t r o g e n l a k ed o n g h u ，l a k en a n h ua n dt w op o n d ss u r r o u n d i n gn a n h uw a ss e l e c t e da so u r s t u d ya r e a w es t u d i e dt h em i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r ea n db i o d i v e r s i t yo ff r e s h w a t e r s e d i m e n tb ye x t r a c t i o no fb a c t e r i ad n a ，p c r , d g g ea n do t h e rm o l e c u l a re c o l o g y m e t h o d s a n ds e q u e n c i n ga n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s i so fa n a n l n o xb a c t e r i ai ns e d i m e n t s w a sd i s c u s s e da tl a r g ei nt h i sp a p e r t h em a i nr e s u l t so fr e s e a r c ha r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h eb a c t e r i u mi ns e d i m e n t so fl a k ed o n g h u ，l a k en a n h ua n dt h et w op o n d sh a v e av e r yr i c hb i o d i v e r s i t ya n dac o m p l e xc o m m u n i t ys t r u c t u r e s u m m e rb a c t e r i a lr i c h n e s s a n dd i v e r s i t yi n d e xi sg e n e r a l l yh i g h e rt h a nt h ew i n t e r w es p e c u l a t e dt h a tt e m p e r a t u r ei s o n eo ft h er e a s o n sf o rt h i sr e s u l t ( 2 ) t h eb i o d i v e r s i t yh a s at r e n do fi n c r e a s e 淅t 1 1t h er e d u c t i o no fp o l l u t a n t s c o n c e n t r a t i o n i ts h o w st h a tw a t e rq u a l i t yc o n d i t i o n sw o u l dp r o d u c eac e r t a i nn e g a t i v e i m p a c to nb a c t e r i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r ei ns h a l l o wl a k es e d i m e n t s ( 3 ) t h ec o m m u n i t ys t r u c t u r eo fl a k en a n h ui sm o r ec o m p l e xt h a nl a k ed o n g h u ， w h i c hd e c l a r e st h a tt h er e l a t i v e l ys t a b l es e d i m e n tm i c r o b i a lc o m m u n i t i e s s t r u c t u r ei s d i v e r s ei nd i f f e r e n ta r e a s t h er e a s o ni sr e l a t e dw i t ht h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s o fw a t e rq u a l i t ya n ds e d i m e n ti nv a r i o u sl a k e s t h es i m i l a r i t i e sb e t w e e ne a c hs a m p l i n g p o i n ti nt h el a k ea r ee v e nb i g g e r , w h i c he x p l a i n st h a te a c hl a k eh a sf o r m e dau n i q u e m i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e t h ea b u n d a n c ea n dd i v e r s i t yi n d e xo ff i s hp o n di sh i g h e r t h a nl o t u sr o o tp 0 0 1 t h el o t u sr o o tp o o li ss i m i l a rt ot h eb a c t e r i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r eo f i i i 华中农业大学2 0 1 2 届硕士研究生学位论文 l a k ed o n g h u ，a n dt h ef i s hp o n d ss e d i m e n tb a c t e r i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r ei ss i m i l a rt o l a k en a n h u , w h i c hs t a t e st h a ts i m i l a rh u m a na c t i v i t i e sm a k ea s s i m i l a t e dm i c r o b i a l c o m m u n i t i e s ( 4 ) t h eb i o d i v e r s i t yi n d i c e so fs e d i m e n t si nl a k ed o n g h ua n dl a k en a n h uc e n t r e i n c r e a s e sf i r s t l ya n dt h e nb e g i n sd e c r e a s i n gf r o ms u r f a c et ot h ed e e pt h a tt h em a x i m u mi s i nt h ed e p t ho f6 12c m ，a n da no b v i o u sc h a n g eo fb a c t e r i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r ei si nt h e d e p t ho f6 - 8c m ，w h i c hr e l a t e st h ed i s t u r b a n c eo fw i n dw a v e sa n ds e d i m e n to x y g e n c o n t e n t ( 5 ) s e q u e n c i n ga n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s i s o f3 6 t y p i c a l b a n d ss h o w e dt h a tt h e r e c o v e r yb a n d sa r e0 【- p r o t e o b a c t e r i a ，1 3 - p r o t e o b a c t e r i a , 6 - p r o t e o b a c t e r i a ，t - p r o t e o b a c t e r i a , af e wo ff l a v o b a c t e r i u m ，b a c i l l ia n db a c i l l u s m a s s i l i a ，m e t h y l o t e n e r aa n dp s e u d o m o n a s a r ea td o m i n a n tp o s i t i o n ( 6 ) a n a m m o xb a c t e r i aw a sf o u n df r o ml a k ed o n g h u ，l a k en a n h ua n dt h et w op o n d s s u c c e s s f u l l yb yn e s t e dp c r ，w h i l et h eb i o d i v e r s i t yo fa n a m m o x b a c t e r i ai sl o wa f t e rb l a s t a n a l y s i s i ts h o w st h a tc a n d i d a t u sb r o c a d i am g i d ao c c u p i e sa na b s o l u t e l yd o m i n a n t p o s i t i o n i nt h ef i s hp o n dw ef o n da nn e w s t r a i nb e l o n g sb r o c a d i a ，b u ti t sf u n c t i o n sa n d f e a t u r e sn e e dt ob ef u r t h e rs t u d i e d k e y w o r d s ：n i t r o g e nc y c l i n g ；f r e s h w a t e rl a k e s ；s e d i m e n t ；b i o d i v e r s i t y ；a n a m m o x b a c t e r i a ；p c r - d g g e ；n e s t e dp c r 1 v 湖泊沉积物微生物多样性和厌氧氨氧化菌鉴别研究 l l - 1 刖舌 1 1 湖泊富营养化与氮素污染 水体富营养化是指在人类活动的影响下，生物所需的氮、磷等营养物质大量进 入湖泊、河口、海湾等缓流水体，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体溶解氧 量下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死亡的现象。在自然条件下，湖泊也会从 贫营养状态过渡到富营养状态，不过这种自然过程非常缓慢，而人为排放含营养物 质的工业废水和生活污水所引起的水体富营养化则可以在短时间内出现。水体出现 富营养化现象时，浮游藻类大量繁殖，形成水华。这种现象在河流湖泊中出现称为 水华，在海洋中出现称为赤潮。因占优势的浮游藻类的颜色不同，水面往往呈现蓝 色、红色、棕色、乳白色等。 我国约有两万多个湖泊，其水资源占中国城镇饮用水的5 0 以上( 余德辉， 2 0 0 1 ) 。然而，近三十年来，我国大部分湖泊的总体水质正在持续下降，生态系统退 化，主要表现为湖泊富营养化，蓝藻水华频繁爆发。我国在零五年一月的地表水水 质报告显示：太湖、巢湖、滇池等我国大中型湖泊的水质均为劣五类。而最新的全 国淡水资源质量评价表明，我国湖泊富营养化的形势严峻，1 3 1 个大型湖泊中，达 富营养态的就有6 7 个。有关部门对水库水质的评价结果显示，1 0 0 多座水库中，有 2 2 余座收到不同程度的污染，其中有1 3 个水库已呈现富营养态，这些受到污染的 水库往往是一个城市供水用水的重要来源。 武汉东湖、南京玄武湖、杭州西湖、云南滇池、合肥巢湖等城市近郊水体富营 养化程度普遍偏高，有些甚至达到高度富营养化程度。随着中国的生态环境形势越 来越严峻，湖泊的富营养化己成为当今我国水资源亟待解决的重大环境问题( 王渺 林和夏军，2 0 0 5 ) 。 在自然条件下，水生生物的残骸和其他物质会被河流夹带冲击进入湖泊，沉降 在湖底，湖泊会从平营养湖渐渐转变为富营养湖。随着社会的发展，人类活动对自 然水体的影响越来越大，大量未经处理的生活污水和工业废水排入水库、湖泊、河 口、海湾等缓流水体，农田径流中的营养物质也随着雨水的冲刷进入自然水体中， 造成水生生物尤其是藻类大量繁殖，破坏了水体的生态平衡，造成生物种群和数量 的改变。我国湖泊富营养化的成因，除了人类的生产生活，也有自然因素。一些长 江中下游的湖泊，营养背景值本就较高，加上洪水泛滥，这些浅水湖泊容易受到风 浪和湖流作用，从而导致水沉积物界面往往处于一种不稳定状态，表层沉积物的再 华中农业大学2 0 1 2 届硕士研究生学位论文 悬浮使营养物质受到扰动而被释放进入水体。据估算，一次大的风浪过程会使得水 体t n 和t p 浓度分别增加0 0 0 5m g l 和o 1 2m g l ( 秦伯强等，2 0 0 3 ) 。导致湖泊 富营养化的根本原因是湖泊周围的农业点源、面源污染，湖泊周边的生活污水、工 业废水过量排放。然而，即使外源污染得到了控制，湖泊的富营养化问题却仍旧由 于内源污染而存在，这也是湖泊的富营养化问题难以得到解决的原因之一。 水体的富营养化常导致水生生物物种的减少，破坏水体的多样性，使水生生态 系统发生紊乱。2 0 世纪5 0 年代到8 0 年代，昆明滇池的水质从贫营养状态过渡到富 营养化状态，浮游植物属数由5 0 年代的8 7 属降至4 5 属，大型水生植物种数从4 4 种降至2 0 种，土著鱼种数由1 5 种降至4 种；1 9 9 2 年，武汉的汉江发生水华，检测 到其藻类的种群多样性也有所下降。 1 2 氮素循环中的微生物作用 1 2 1 氮素循环过程 氮循环是描述自然界中氮单质和含氮化合物之间相互转换过程的生态系统的物 质循环( 朱兆良和邢光熹，2 0 1 0 ) 。在地球生物圈中，氮元素的分布极为广泛且含量 十分丰富。它是地球上所有生物体结构组成和所有生化反应中的重要生命元素之一， 是生命体中d n a 、r n a 和蛋白质的主要成分。 一般来说自然界中的氮元素通常以有机结合态、无机结合态以及分子态三种形 式存在( 刘金风，2 0 0 7 ) 。其中，根据相关学者统计，地球上有机结合态的氮素约有 2 5 0 亿吨；无机结合态的氮素包括硝酸盐和铵盐等，约占有机态氮含量的1 ；而生 物圈中绝大部分的氮是以分子态的氮素即氮气存在于大气中，约占空气成分的7 9 ( 徐选旺，2 0 0 1 ) 。 通过人类的生产生活、自然现象以及动植物与微生物的相互作用完成氮素在大 气圈、土壤圈、生物圈和水圈之间的流动这样一个复杂的过程，如图1 1 所示，在 氮循环中，自然界里三种不同形式的氮完成了相互转化。通过微生物的固氮作用， 大气中n 2 进入生物圈后，被根瘤菌固定后转化为提供给豆科植物生长的养料，还可 以被固氮菌包括固氮蓝细菌固定成n h 3 ，n h 3 溶于水生成n h 4 + ，在硝化细菌的作用 下被氧化成硝酸盐，供植物吸收利用，无机氮转化为有机氮化合物，如动植物和微 生物体内的d n a 、r n a 、氨基酸和蛋白质等；动物吃掉植物后，将其转化为自身的 动物蛋白，氨化细菌将动植物尸体和人与动物排泄物中的有机氮转化成为n h 3 ，继 而被硝化细菌氧化成亚硝酸盐，再进一步被氧化为硝酸盐被植物吸收；反硝化细菌 湖泊沉积物微生物多样性和厌氧氨氧化菌鉴别研究 将硝化作用的产物还原为氮气进入大气圈，无机氮和有机氮如此循环往复完成了自 然界中的氮循环过程( 王钰国，1 9 9 0 ；徐清平，2 0 0 5 ；s c h m i d te ta 1 ，2 0 0 2 ) 。氮的 循环过程主要是通过生物，绝大部分是微生物驱动来完成的( 朱兆良和邢光熹， 2 0 1 0 ) 。 图1 1 氮素循环 f i g 1 1n i t r o g e nc y c l i n g 1 2 2 氮素循环中的生化反应及其微生物 ( 1 ) 固氮作用 固氮作用( n i t r o g e n f i x a t i o n ) 是将气态的游离态氮转化为可被机体吸收的化合 态氮的必经过程。固氮方式有很多种，一部分氮素由闪电所固定，但最主要的固氮 方式为生物固氮，绝大部分氮素被共生或非共生的固氮微生物所固定。这些微生物 中的固氮酶和辅酶可利用游离态的氮气和氢化合成为氨，生成的氨被这些细菌通过 其他的生化反应同化形成自身的一部分，如蛋白质和氨基酸等。存在于土壤中的固 氮菌主要有两类：一种为自生固氮菌，自由的生活在土壤或水域中，能独立进行固 氮作用的某些细菌，如圆褐固氮菌，它们不依靠植物，自己从空气中吸收n 2 做为氮 素营养，并将其还原为n h 3 后合成核酸、蛋白质和氨基酸等，繁衍后代，死后残体 被微生物分解。它们包括好氧细菌，如固氮螺菌属、固氮菌属还有少数自养型菌； 兼性厌氧菌，如克雷伯氏菌属；厌氧菌，如梭状芽孢杆菌属的一些种。还有光合细 菌如绿菌属、红螺菌属以及蓝藻( 蓝细菌) ，如念珠藻属、鱼腥藻属等。另一种为共 华中农业大学2 0 1 2 届硕士研究生学位论文 生固氮菌，这种菌与植物共生，固氮产物氨可以直接为共生体提供氮源。主要有主 要有根瘤菌属( r h i z o b i u m ) 的细菌与豆科植物共生形成的根瘤共生体，弗氏菌属 ( f r a n k i a ，一种放线菌) 与非豆科植物共生形成的根瘤共生体。根瘤菌生活在土壤 中，以动植物残体为养料，过着“腐生生活”，与豆科植物形成共生关系，因此根瘤 菌也被称为共生固氮菌( 徐选旺，2 0 0 1 ) 。此外，闪电作为一种自然固氮方式，能使 空气里的氮气转化为一氧化氮，一次闪电能生成8 0 1 5 0 0k g 的一氧化氮，但自然固 氮远远满足不了农业生产的需求。 ( 2 ) 氨化作用 氨化作用( a m m o n i f i c a t i o n ) 又叫脱氨作用，是指微生物分解有机氮化合物而产 生氨的过程。氨化过程一般分两步：首先含氮有机化合物如核酸、蛋白质等在蛋白 质水解酶的作用下被降解为多肽、氨基糖、氨基酸等简单含氮化合物，然后降解产 生的简单含氮化合物在脱氨基酶的作用下被脱氨基转变为氨氮。一部分氨氮作为微 生物或植物的养料被同化，另一部分被转变成硝酸盐。蛋白质被许多细菌、放线菌 和真菌分泌的蛋白酶分解为多肽、氨基酸和氨。氨化微生物的分解能力强，广泛存 在于自然界，在好氧或缺氧条件下，不同的微生物均能将含氮有机物和蛋白质分解 并生成n h 3 。细菌中氨化作用较强的有假单胞菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、沙雷氏 菌属及微球菌属中的一些种；真菌中氨化能力强的微生物有曲霉属、毛霉属、青霉 属、根霉属以及交链孢霉等属中的许多种；有不少放线菌能参与较难分解的有机含 氮化合物的分解( 贺秋芳，2 0 0 9 ) 。 ( 3 ) 硝化作用 硝化作用( n i t r i f i c a t i o n ) 是指氨氮被硝化细菌氧化成为硝酸盐的过程。硝化细 菌是一类化能自养细菌，根据其利用的底物类型，分为两类：氨氧化菌( a m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i a ，a o b ) ，将氨氮氧化为亚硝酸盐；亚硝酸盐氧化菌( n i t r i t eo x i d i z i n g b a e t e r i a ，n o b ) ，将亚硝酸盐继续氧化为硝酸盐。传统的硝化菌是典型的好氧自养 型革兰氏阴性菌，在生物圈的氮循环中扮演着极为重要的角色。在伯杰氏细菌鉴定 手册第9 版( h o l te ta 1 ，1 9 9 4 ) 中将它们统归于硝化杆菌科，并分为了7 个属：硝 化杆菌属、硝化刺菌属、硝化球菌属、亚硝化单胞菌属、亚硝化螺菌属、亚硝化球 菌属、亚硝化叶菌属、硝化螺菌和亚硝化弧菌，共2 0 种硝化细菌。它们广泛分布 于湖泊及底泥、陆地土壤、海洋等环境中。所有的氨氧化菌中都含有氨单加氧酶基 因a m o a ，此基因在a o b 中普遍存在，因此可以作为特异性分子标记来研究a o b 4 湖泊沉积物微生物多样性和厌氧氨氧化菌鉴别研究 在氮循环中的作用，并可以指示生态系统中环境因子的变化( 贺纪正和张丽梅， 2 0 0 9 ) 。古细菌曾被认为只存在于极端环境中，后来发现嗜温古菌不仅普遍存在于海 洋( d e l o n g ，1 9 9 2 ；f u h r m a ne ta 1 ，1 9 9 2 ) ，也存在于大多数温环境中。近年来有研究 表明，古菌中也包含a m o a 基因，且海洋的沉积物、深层缺氧区及强光带中都普遍 存在( f r a n c i se ta 1 ，2 0 0 5 ) ，人们将其定义为氨氧化古菌( a m m o n i a - o x i d i z i n ga r c h a e a ， a o a ) ，并认为它在海洋氮循环中具有重要的意义。 硝化作用包含两个独立而又连续的步骤： 氨氧化反应，n h 4 + 被氨氧化细菌a o b 在氨单加氧酶a m o ( a m m o n i a m o n o o x y g e n a s e ) 的作用下被氧化为n h 2 0 h 并生成h 2 0 ，接着在羟胺氧化还原酶 h a o ( h y d r o x y l a m i n eo x i d o r e d u c t a s e ) 的作用下n h 2 0 h 被氧化为n 0 2 。( b e c c a r ie ta 1 ， 1 9 7 9 ) ，反应方程如下： n h 3 + 0 2 + 2h + + 2e 。一n h 2 0 h + i - 1 2 0 n h 2 0 h + h 2 0 n 0 2 + 5h + + 4e 。 亚硝酸盐氧化反应，上一个反应的产物n 0 2 - 被n o b 在亚硝酸氧化酶n o r ( n i t r i t eo x y g e n a s e ) 氧化为n 0 3 。，同时产生n a d h 和a t p 。 有研究报道，n 0 2 - 在硝化反应过程中一般积累很少，因为相比于n h 4 十被氧化为 n 0 2 的反应速度来说，n 0 2 - 被氧化为n 0 3 - 的速度要快得多，因此硝化反应的第一步 即氨氧化反应是整个反应的限速步骤，是全球氮循环的中心环节( b o e re ta 1 1 9 9 1 ； p r o s s e r , 1 9 9 0 ) 。 硝化作用尽管只改变氮元素的存在形式，对氮素的收支不产生影响，但它把氨 化作用与反硝化作用连接起来，实现了有机物的降解到固定氮去除的过程。 ( 4 ) 反硝化作用 生物反硝化作用又称生物脱氮作用，是指在无氧或低氧条件下，微生物将硝酸 盐n 0 3 和亚硝酸盐n 0 2 - 还原成气态氮n 2 的生物反应过程。反硝化反应对全球氮循 环的氮通量计算有着极为重要的意义。参与这一反应的微生物广泛存在于自然界的 土壤、沉积物、海洋、地表水、地下水中，称为反硝化细菌( d e n i t r i f y i n gb a c t e r i a ) 。 大部分反硝化细菌是异养菌，以有机物为电子供体，n 0 3 为电子受体，最终生成n 2 ， 如反硝化假单胞菌、脱氮小球菌等，其生化反应式如下： c 6 h 1 2 0 6 + 1 2n 0 3 一6h 2 0 + 6c 0 2 + 1 2n 0 2 。+ 能量 c h 3 c o o h + 8n 0 3 。一6h 2 0 + 1 0c 0 2 + 4n 2 + 8o 盯+ 能量 还有少数自养型如脱氮硫杆菌的反硝化细菌，它们通过氧化硝酸盐或氧化硫获 华中农业大学2 0 1 2 届硕士研究生学位论文 得能量，吸收c 0 2 ，以硝酸盐作为最终的电子受体。反应式如下： 5s + 6k n 0 3 + 2h 2 0 一3n 2 + k 2 s 0 4 + 4k h s 0 4 能进行反硝化作用的微生物非常多，除了细菌之外，还有古菌、真核生物，如 海底栖居的孔虫( n i l se ta 1 ，2 0 0 6 ) 等5 0 多个属的生物。尽管自养反硝化菌种类很 多，但环境中的反硝化过程主要还是由异养反硝化菌来完成。 反硝化作用的总反应式： 2n 0 3 - + 1 0e - + 1 2h + 一n 2 + 6 h 2 0 细菌将硝酸盐( n 0 3 - ) 作为电子传递链的最终电子受体，来完成物质能量交换。 通常认为反硝化作用的反应条件是厌氧或缺氧，但目前在污水处理工程中已发现相 当数量的好氧反硝化细菌。尽管硝化和反硝化过程所需要的环境是相斥的硝化 作用为需氧反应，反硝化作用为厌氧反应，但是在许多有氧缺氧界面，如沉积物 水界面、海水中的有氧缺氧梯度层、菌藻席等环境中，二者相互影响协同作用( 删， 1 9 9 6 ) 。 ( 5 ) 厌氧氨氧化作用 通常认为n h 4 + 的氧化作用是在绝对好氧环境中进行( 陈伏生等，2 0 0 4 ；s c h m i d t e ta 1 2 0 0 2 ) ，但1 9 9 4 年，荷兰的m u l d e r 等人的研究小组在d e f l t 大学的一个污水脱 氮流化床反应器中发现了n h 4 + 和n 0 2 - 的消失同时发生，且有一定比例，同时伴随 着有n 2 的生成，他们将此反应命名为厌氧氨氧化反应( a n a e r o b i ca m m o n i ao x i d a t i o n ， m n a m m o x ) ，它是以n h 4 + 为电子供体，n 0 3 - 为电子受体的氧化还原反应( m u l d e re ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。 3n 0 3 。+ 5n h 4 十一4n 2 + 9h 2 0 + 2 h 十a g ”= - 2 9 7k j m o l v a nd eg r a a f 等( 1 9 9 7 ) 通过同位素”n 标记实验发现，厌氧氨氧化反应是以 n 0 2 - 为电子受体，而不是以往所认为的n 0 3 ，其反应式为： n h 4 十+ n 0 2 一n 2 + 2h 2 0 a g o = - 3 5 8k j m o l 1 5 n 标记实验还显示了厌氧氨氧化反应的重要代谢中间产物是联胺和羟胺，且有 少量的n 0 2 氧化为n 0 3 。通过氮平衡计算转化过程中n h 4 + 和n 0 2 - 的去除，且产生 部分n 0 3 的比率为n i - h + ：n 0 2 ：n 0 3 = 1 ：1 3 2 ：o 2 6 ( s t r o u se ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 参与a n a m m o x 反应的微生物叫厌氧氨氧化细菌。它属革兰氏阴性光损性球 状菌，是专性厌氧化学无机自养细菌( 贾振杰等，2 0 0 6 ) ，它属于最古老的古生物菌 ( a a c h a e a ) 或分支很深的细菌栖热孢菌属( t h e r mo t o g a ) 和产液菌属( a q u i f e x ) 。 厌氧氨氧化菌生长十分缓慢，用传统的微生物培养方法目前还未分离出a n a m m o x 6 湖泊沉积物微生物多样性和厌氧氨氧化菌鉴别研究 菌的纯培菌种，且此细菌在高浓度时才显示出活性( s c h m i de ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 近几年，对厌氧氨氧化菌的研究取得了相当的进展( e t t e ne ta 1 ，2 0 0 5 ) ，在海洋 ( j e r e ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 、淡水( s c h m i de ta 1 ，2 0 0 7 ) 和污水处理设施等环境中发现的厌 氧氨氧化过程及其机制的阐明，使人们意识到，该过程不仅可以应用于废水处理领 域，在自然界氮循环过程中也同样具有重要意义( m c c a r t h ye ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 目前，利用现代的分子生物学技术发现，厌氧氨氧化菌有5 个属1 0 个种( 周英 杰等，2 0 1 2 ；h ue ta 1 ，2 0 1 0 ；k a r t a le ta 1 ，2 0 0 8 ；o s h i k ie ta 1 ，2 0 1l ；w o e b k e ne ta 1 ， 2 0 0 8 ) ，其中c a n d i d a m sb r o c a d i aa n a m m o x i d a h s ， c a n d i d a t u sb r o c a d i af u l g i d a ， c a n d i d a t u sk u e n e n i as t u t t g a r t i e n s i s ，c a n d i d a t u ss c a l i n d u ab r o d a e ，c a n d i d a m s s c a l i n d u aw a g n e r i ，c a n d i d a m sj e t t e n i aa s i a t i c a ，c a n d i d a m sa n a m m o x o g l o b u s p r o p i o n i c u s ，c a n d i d a t u sa n a m m o x o g l o b u ss u l f a t e 等分离自污水处理厂构筑物或实验 室反应器内( l i use ta 1 ，2 0 0 8 ；k a r t a lbe ta 1 ，2 0 0 4 ；k a r t a le ta 1 ，2 0 0 7 ；s c h m i dm e ta 1 ， 2 0 0 0 ；s c h m i dm e ta 1 ，2 0 0 3 ；t s u s h i m a aie ta 1 ，2 0 0 7 ) ，c a n d i d a t u ss c a l i n d u as o r o k i n i i 分离白海水中( k u y p e r se ta 1 ，2 0 0 3 ) ；c a n d i d a m ss c a l i n d u aa r a b i c a 分离自阿拉伯海、 秘鲁海低氧区、坦桑尼亚湖、中国南海的沉积物中( w o e b k e ne ta 1 ，2 0 0 8 ) 。近年来 研究表明，厌氧氨氧化菌也存在于浅滩、海岸、入河口、淡水湖泊的底泥中，可以 看出厌氧氨氧化菌的分布极其广泛( t h a m d r u p & d a l s g a a r d ，2 0 0 2 ；s c h u b e r te ta 1 ， 2 0 0 6 ；z h a n ge ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 通过1 6 sr n a 的序列分析确定了它们在微生物分类系统中均属于浮霉状菌目 ( p l a n c t o m y c e t a l e s ) ，且a n a m m o x 茵系统之间的发育分歧很大。 1 3 环境微生物分子生物学技术 1 3 1 环境微生物学的发展 生物圈内的各种物质，都是处于不断地合成，分解和转化的动态平衡状态之中。 由此组成一个自我调节，自我维持的一个协调整体，从而保证了地球上生命的延续。 但是当人们违背了自然界的生态平衡规律，将粪便垃圾，污水等生活废弃物和工业 生产所形成的“三废”及农业生产中的使用的农药残留物等，大量排入环境中，这 些物质超过了环境所能耐受的容纳量，就破坏了自然界的生态平衡，其结果造成环 境污染。这样不仅危及国民经济发展，而且对人类健康有严重危胁，甚至影响到子 孙后代的繁衍昌盛。因此保护环境已成为人们日益关心的重大问题。世界上很多学 者致力于研究污染物在生态系统的迁移与转化，尤其是这些过程中所参与的微生物 7 华中农业大学2 0 1 2 届硕士研究生学位论文 所起的作用。在污染环境的修复与环境污染的治理中，许多环境微生物由于具有降 解和转化污染物的能力，发挥着举足轻重的作用。 早在二十世纪初期，人们便开始研究活性污泥，并利用其对污水进行处理。到 了六十年代，环境微生物学渐渐发展为一个独立的学科，从其母体微生物学中 脱离开来。 1 3 2 传统环境微生物研究方法的局限性 环境微生物是由多个种群组成的微生物群落，不同种群之间存在着共生、互利、 共存、竞争等各种复杂的关系，在物质循环和能量转化过程中发挥着重要作用。环 境微生物研究中，传统的方法主要是富集、选择、分离、培养和鉴定等步骤，与微 生物学研究中的纯培养技术一致。然而，由于环境样品的复杂性，尤其是来自于污 染环境或污染处理系统中的环境样品，能够被培养并分类出的微生物只是非常小的 一部分( 沈萍，2 0 0 6 ) 。有学者研究得到，土壤样品中的微生物种群复杂，只有不到 1 的微生物能够在实验室条件下被培养分离，而绝大部分的微生物无法被培养。再 者，即使在实验室运用培养技术而得到了纯菌株，也不可能完全还原到原始环境的 条件中去，包括微生物的种别、种群大小、种群动态变化等情况及许多重要参数都 无法被准确真实的反映( 沈萍，2 0 0 6 ；a l n a n n ，1 9 9 5 ；t i e d j ee ta 1 ，1 9 9 9 ；w a l l & v i r g i n i a , 1 9 9 9 ) 。故而，严重低估了环境微生物种群的多样性。 1 3 3 分子生物学在环境微生物学研究中的应用 随着近年来分子生物学的发展，越来越多的研究者开始运用分子生物学技术对 环境微生物进行研究。其原因主要是该手段能够准确真实快速地反应环境样品中微 生物的状态及其种群的多样性，不需要对微生物进行培养和分离，直接从环境样品 中提取微生物的d n a 、r n a 和蛋白等，甚至能在原位直接对微生物进行研究。因 此，分子生物学在环境微生物领域的应用越来越普遍与广泛。 1 3 3 1 分子生物学的定义 在分子水平上研究生命的本质通常是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本 特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础及提供新的手段( 阿 利森，2 0 0 8 ) 。所谓的分子水平是指携带遗传信息的核酸以及在传递遗传信息过程中 发挥重要作用的蛋白质等大分子物质。分子生物学的主要任务是阐明这些复杂的结 构之间及结构与功能之间的关系( 刘有胜，2 0 0 8 ) 。 湖泊沉积物微生物多样性和厌氧氨氧化菌鉴别研究 1 3 3 2 分子生态学分子生物学技术的新发展 1 9 9 2 年，b u r k e 等( 1 9 9 2 ) 在( ( m o l e c u l a re c o l o g y ) ) 发刊词中首次提出了分子生 态学的概念，分子生态学是应用分子生物学的手段包括探针、序列和引物等在种群 生物学和生态学等领域进行相关研究的学科。 1 3 3 31 6 sr r n a r d n a 序列分析技术在环境微生物学中的应用 1 6 sr r n a r d n a ( 即r r n a 基因) 和l8 sr r n a r d n a 的序列信息一直都是分子 生态学领域重要的研究对象。1 6 sr r n a r d n a 主要研究的是原核微生物，其1 6 s r r n a 长度约有1 5 4 0 个碱基；1 8 sr r n a r d n a 主要研究的是真核微生物，1 8 sr r n a 长度约有1 7 8 9 个碱基。在生物进化的漫长过程中，他们一方面延续了相对恒定的保 守碱基序列和相对稳定的生物学功能，另一方面也发生了与进化相对应的突变，从 而在结构上被分为保守区和可变区。因此，通过研究r r n a 和r d n a 序列可以发现 各物种系统之间的进化关系( k i r