（环境工程专业论文）生化需氧量在线自动监测仪的研制及应用.pdf

摘要 摘要 生化需氧量是反映水体被有机物污染程度的综合指标，也是研究污水可生化降 解性和生化处理效果的主要指标。在水质环境监测中，生化需氧量是重要的监测项 目，是生化处理污水工艺设计和动力学研究的重要参数，是保证水体自净的重要指 标之一。 ， ， ， 目前国内外普遍采用五日生化培养法，该方法操作比较复杂、耗时长，对操作 人员要求较高、不能迅速地反映水体污染状况和判断有机物降解情况，信息反馈滞 后，不能起到及时指导生产和科研的作用，也无法及时为环境管理和决策提供科学 的依据。虽然近年来出现了如库仑滴定法、b o d 测压法、活性污泥法、相关计算法 等新方法，但均有一定的局限性而不能满足快速测定的要求。 随着环境污染问题日益严重，建立和发展快速测定生化需氧量的体系尤其重要。 微生物传感器法是近几年发展起来的一种快速测定生化需氧量的方法，它具有操作 简便、快速、易于掌握，且精密度和准确度较好、抗干扰性较强等特点，本文研制 的生化需氧量在线自动监测仪具有自动采样、自动进样功能，以微生物传感器为核 心元件，实现了生化需氧量的在线自动监测。 本实验从某淀粉厂土壤中经过反复分离、筛选、驯化后，获得一株性能稳定、 对有机物有广谱降解性能的高活性好氧微生物菌株，经鉴定该菌为芽孢杆菌；然后 对材料的选择、材料的配比、制膜工艺等进行了大量试验，在此基础上，提出了用 多种材料混合包埋固定化微生物的制膜法，该方法在常温下固定化，对微生物的活 性无损伤，制备得的微生物膜装卸方便，易于保存，可反复使用，其机械强度、韧 性和透气性良好；后用特制的o 型圈将制备的微生物膜固定在微型氧电极上，完成 了微生物传感器的装配工作。经测试，研制的生化需氧量微生物传感器的线性响应 范围为：2 6 0 m g l ；测量周期：3 1 0 r a i n ；使用寿命：6 个月。 为了保证测量结果的精密度和准确度，本课题考察了稀释倍数对测定结果的影 响，并对测试条件如：测试温度、缓冲溶液的p h 值、鼓气泵的鼓气量等进行了优化 选择，为本实验研究的生化需氧量在线自动监测仪的实际应用提供了技术保障。 为了考察本仪器的测定结果与标准五日培养法的相关性，在选定的测试条件下， 分别用标准样品和实际污水样品进行了对比试验，结果证明仪器法与标准五日培养 法的测定数据有很好的相关性，该仪器能满足实际测量的要求。 为了验证仪器的实际运行情况，委托某市城市排水监测站和某制药厂对仪器进 行了试运行。在选定的实验条件下，利用本课题研制的生化需氧量在线自动监测仪 分别对某制药厂的制药废水和某城市排水监测站的生活污水进行了在线监测，并将 其测定数据与标准五日培养法的测定数据进行了比较，数据比较结果显示两种方法 河北科技大学工程硕士学位论文 i _ 目= = = = = = 目_ i j = = = = = = = ；= = j 目_ l _ = = = = = = = 目= i = = = = = = = ；= = = = = ；目l _ l i 目：= ；l _ - = = ：= = ；_ l _ 目= 的相对误差在8 0 之间，符合标准要求，能满足实际应用的需要。 关键词生化需氧量；微生物传感器；在线自动监测；制药废水：生活污水 i i a b s t r a c t a b s t r a c t b i o c h e m i c a lo x y g e nd e m a n di sac o m p r e h e n s i v ei n d e xt or e f l e c tw a t e rp o l l u t i o n l e v e l sb yo r g a n i cm a t t e r m e a n w h i l ei ti sa l s oam a i ni n d e xt or e s e a r c ht h es e w a g e d e g r a d a t i o nb ym e a n so fb i o c h e m i c a l u n d e rt h ec o n d i t i o no ft h ew a t e rm o n i t o r i n g ， b i o c h e m i c a lo x y g e nd e m a n di sa ni m p o r t a n tr e f e r e n c e f u r t h e r m o r ei ti st l l ev i t a ld a t ao f t h es e w a g ed i s p o s a la n dd y n a m i c sr e s e a r c h r e c e n t l y , t h ef i v ed a y sb i o c h e m i s t r yt r a i n i n gm e t h o dh a sai m p o r t a n tp o s i t i o na t h o m ea n da b r o a d b u tt h i sm e t h o dh a sl o t so fd i s a d v a n t a g e s ，s u c ha sc o m p l e x i t y , t i m e c o n s u m i n g ，h i g hr e q u i r e m e n t st oo p e r a t o r s ，a n di tc a n n o tr e f l e c t st h ei n f o r m a t i o n a n d t h es c i e n t i f i cr e f e r e n c e e v e ni ft h e r eh a v es o m en e wm e t h o d s c o u l o m e t r y , b o dt e s t m e t h o da n da c t i v a t e ds l u d g ep r o c e s si nt h i sf i e l d ，t h e ya l s oh a v es o m ew e a k n e s sa n d c a n n o ts a t i s f yt h ea d m e a s u r e m e n t s w i t ht h e i n c r e a s i n g l y s e r i o u se n v k o n m e n t a lp o l l u t i o n , t h es y s t e mo fr a p i d d e t e r m i n a t i o no fb i o - c h e m i c a la e r o b i cq u a n t i t yi sb e c o m i n gm o r ea n dm o r ei m p o r t a n t n o w a d a y sm i c r o b i a l s e n s o rm e t h o di so n ek i n d o fb i o c h e m i c a lo x y g e nd e m a n dt e s t m e t h o d ，i th a sl o t so fa d v a n t a g e s i m p l e ，q u i c ka n de a s yt og r a s p ，p r e c i s i o na n da c c u r a c y , e a s yt om a s t e ra n da n t i - i n t e r f e r e n c ea u t o m a t i o na n ds o o n i t i st h ec o r ee l e m e n tt o m i c r o b i a ls e n s o ra n da c h i e v e st h eo n l i n ea u t o m a t i cm o n i t o r i n g ，n l i s e x p e r i m e n ti s a b o u ts t a r c hf a c t o r y ss o i l ，a n dw eg e tt h ea e r o b i cm i c r o b i a l s t r a i n st h r o u g hs e p a r a t i o n ，s c r e e n i n g ，d o m e s f i c a t i o na n ds e r i e so fo t h e rs t e p s ，t h e ni ti s p r o v e dab a c i l l u s w ec o n t i n u et o l o t so ft e s t s c h o i c e ，p r o p o r t i o n i n ga n dm a k i n gt h e a d v a n c e dm i c r o b i a lm e m b r a n eb ym a n ym a t e r i a l sm i x e dt h em i c r o o r g a n i s m s a to r d i n a r y t e m p e r a t u r e s ，t h i sm e t h o dh a sm a n ya d v a n t a g e s ，i m m o b i l i z a t i o n , n od a m a g e ，c o n v e n i e n c e f o rl o a d i n ga n du n l o a d i n g ，e a s yt op r e s e r v e ，u s e dr e p e a t e d l y , g o o dm e c h a n i c a ls t r e n g t h , t o u g h n e s sa n dp e r m e a b i l i t y t h e nw eu s es p e c i a lt y p eom a t e r i a lm a k i n gm i c r o b i a l m e m b r a n ea n dp u ti to nt h em i n i a t u r eo x y g e ne l e c t r o d et oa c h i e v et h ea s s e m b l yw o r k t h e t e s ts h o w s 一m i c r o b i a ls e b s o r sl i n e a rr e s p o n s er a n g e ，c y c l eo fm e a s u r e m e n ta n dl i f ea r e 2 - 6 0 m g l ，3 - 10 m i na n d6m o n t h s i no r d e rt og e tt h ep r e c i s i o na n da c c u r a c yr e s u l t sa n dt h ee f f e c tb yd i l u t e dt i m e s ，t h e t e s t sn e e dt h i sc o n d i t i o n s ：t e s tt e m p e r a t u r e ，p hv a l u e ，a n db u f f e rs o l u t i o no ft h ed r a m p u m p a l lp r o v i d et h eo n l i n ea u t o m a t i cm o n i t o r i n gw i t h t h et e c h n i c a la s s u r a n c e t of m dt h er e l e v a n c eb e t w e e nt h i si n s t r u m e n tm e a s u r i n gr e s u l t sa n dt h ef i v ed a y s b i o c h e m i s t r yt r a i n i n gm e t h o d ，w eu s et h ec o m p a r a t i v et e s t s o ns t a n d a r ds a m p l e sa n d i i l a 肌l a ls e w a g es a n l p l e sa 1 1 df m d 也e yh a v ew e l lr e l e v a n c e ；t h i sn e w m 咖m e n tc a i ls a t l s t y a c t u a lm e a s u r e m e n tr e q u i r e m e n t s ho r d e rt 0a n a l y s i st h en e wi n s t r u m e n to p e r a t i o n , t h e ya u t h o r i z ec i t y u r b a i ld r a l n a g e s m t i o n 锄dd h 猢a c e u t i c a lf a c t o r yt ot e s tt h en e w i n s t r u m e n t u n d e rt h i sc o n d i t l o 玛w e l l s e 也eo n - l i n ea u t o m a t i cm o n i t o r i n gi n s t r u m e n t t os u r v e yt h ep h a r m a c e u t i c a lw a s t e w a t e r a n d s e w a g ec o m p a r ew i t ht h e 帆d a t e s 。t h e n t h er e s u l ts h o wt h e e r r o r1 sa r o u n d 士芍u w o a c c o r d i n g t ot h es t a n d a r d ，a n di ts a t i s f i e st h e n e e d so fp r a c t i c a la p p l i c a t l o m 时w 。r d b i 。c h e m i c a lo x y g e nd e 珈加d ；m i c r o b i a l s e n s o rm a c l l i n e ；o n - l i n ea u t 。 m o n i t o r ；p h a r m a c e u t i c a lw a s t e w a t e r ；s e w a g e i v 目录 第1 章绪论 1 1 课题的背景及意义 随着社会的发展，人类的进步，人们在进行生产和享受现代化生活的同时，将 大量的工业污水、生活污水、医院污水、农业回流水以及其他未经处理的废物排入 水体，造成了水体污染。 这些排入水体中的工业污水、生活污水、医院污水、农业回流水中含有大量的 有机物。这些有机物在水体中分解时要消耗大量溶解氧，从而破坏水体中氧的平衡， 水体中的溶解氧含量降低，水体中因缺氧会造成鱼类及其它水生生物死亡，使水体 受到损害直至恶化，破坏了水体功能，降低了水体的使用价值。 受到污染的水体中存在着大量的有机化合物，这些有机物通常以高毒性、强致 癌性级消耗水中溶解氧的形式在水中产生危害作用，所以对水中有机化合物的测定 对评价水体水质是十分重要的。但是，由于水体中有机化合物的种类繁多，难以对 每一个组分逐一定量测定，目前多采用测定与水中有机化合物相当的需氧量来间接 表示有机化合物的含量如化学需氧量、生化需氧量等。 生化需氧量是反映水体被有机物污染程度的综合指标，也是废水的可生化降解 性和生化处理效果，以及生化处理废水工艺设计和动力学研究中的重要参数，其标 准测定法国内外一直都沿用美国公共卫生协会规定的标准稀释法，但在环境分析高 度发展的今天，这种测定生化需氧量的经典法的缺陷日益明显，致使在废水生物处 理工程、发酵工业副产品综合利用及事故性监测等工作中，不能及时反映水质变化、 判断有机物降解情况，不能同步指导生产和科研工作。虽然近年来出现了如库仑滴 定法、b o d 测压法、活性污泥法、相关计算法等新方法，但是均因为有一定的局限 性而不能满足快速测定的要求。 微生物传感器法是近几年发展起来的一种快速测定生化需氧量的方法，它具有 操作简便、快速、易于掌握，且精密度和准确度较好、抗干扰性较强等特点，以微 生物传感器为基础的生化需氧量快速测定仪，目前国内虽有报道，但目前均没有实 现连续在线监测。国内目前使用的连续监测仪器均为国外产品，其价格昂贵，运行 费用高。本项目则研制一种性能与国外产品相当，而价格却远低于国外产品的生化 需氧量在线自动监测仪。 1 2 生化需氧量测定方法概述 1 2 1 生化需氧量的传统测定方法 生化需氧量是反映水体被有机污染程度的综合指标，其标准测定方法是美国公 河北科技大学工程硕士学位论文 共卫生协会规定的稀释接种法( b o d 5 法) l l 】，这种方法自1 9 6 3 年被美国公共卫生协会 标准方法委员会所采用以来国内外一直沿用至今。稀释接种法的测定原理是水样经 稀释后，在2 0 - 4 ：1 培养5 天，求出培养前后水样中溶解氧含量，二者之差即为b o d 5 。 稀释接种法测定污水的生化需氧量时，需要测定水中的溶解氧含量，水中溶解 氧的常用测定方法为碘量法，前后必须两次用化学分析法测定水中的溶解氧，操作 繁琐：每次检测必须经过5 天才能得到结果，测定周期长；数据缺乏时效性，致使 在废水处理工程及事故应急监测等多项工作中，难以起到及时掌握水质变化情况、 判断有机物污染和降解程度、指导生产和科研的作用。 1 2 2 基于传统生化需氧量测定方法的改进 ( 1 ) 活性污泥曝气法 活性污泥曝气法在测定地表水和工业废水中的生化需氧量时，控制温度在 3 0 3 5 ，利用活性污泥强制曝气降解样品2 h ，经重铬酸钾硝解生物降解前后的 样品，测定生物降解前后的化学需氧量，其差值即为生化需氧量【3 1 。根据与标准方法 的对比试验结果，可换算成b o d 5 值。 由于曝气时培养瓶中的空气流量不易准确控制，会给体积定量造成困难。因此这 种方法还没有普遍适用于日常监测。 ( 2 ) 测压法 把水样注入培养瓶内，同时放入c 0 2 吸收剂氢氧化钠，然后将培养瓶密封置于 2 0 - 士1 恒温箱内，在密闭的培养瓶中，水样中的溶解氧被微生物消耗，微生物因呼 吸作用产生于耗氧量相当的c 0 2 ，当c 0 2 被吸收后使密闭系统的压力降低，根据压 力测得的压降可求出水样的生化需氧量值1 4 , s , 6 。 采用测压法时，样品的温度及吸收剂的用量都会影响测定的准确度，投样时样品 的温度超过2 0 士1 时测得结果会偏高，低于2 0 士1 时结果会偏低。假若氢氧化 钠的用量不够，不能将c 0 2 完全吸收，使分压增加，影响测定结果的准确性。 ( 3 ) 减压式库仑计法 其原理为装在培养瓶中的水样，其溶解氧因生物降解有机物被消耗时，培养瓶内 空间中的氧溶解进入水样，生成的c 0 2 被吸附剂吸收，使瓶内的氧分压和总气压下 降。然后检出压力下降量并转换成电信号，电解瓶电解产生氧气供给培养瓶，待瓶 内气压回升至原来的压力时，停止工作。根据法拉第定律，由恒电流电解所消耗的 电量便可计算出耗电量【7 】。 虽然，近年来出现了基于传统生化需氧量测定的改进方法，如减压库仑法、测压 法、活性污泥曝气降解法、相关计算法等快速测定生化需氧量的方法，但均因有一 定的局限性而未能实现快速在线自动监测【8 】。 2 第1 章绪论 1 2 3 微生物传感器法 微生物传感器法是近几年发展起来的一种快速测定生化需氧量的方法，它具有 操作简便、快速等特点。生化需氧量微生物传感器是由氧电极和微生物膜构成，在 选定的测试条件下，当不含有机物的测试底液通入测量池时，由于微生物的呼吸活 性一定，测试底液中的溶解氧分子通过微生物膜扩散进入氧电极的速率一定，电极 输出一稳态电流；当测量池中通入水样时，水样中的有机物与氧分子一起扩散通过 微生物膜，因膜内的微生物同化有机物而耗氧，导致扩散进入氧电极的氧分子速率 降低，电极输出电流下降，但在几分钟内电极电流降至新的稳态值，两稳态电流之 差与膜内微生物同化该样品中有机物时消耗的溶解氧存在定量关系，因此，可从电 流降低值计算出样品的生化需氧量值1 9 j 。 微生物传感器法具有操作简单、重复性高、测定时间短、智能化程度高、适用范 围广、灵敏度高、可以联网等特点i l o 】。 1 3 微生物传感器的研究进展 微生物传感器是根据生物反应进行检测的一类化学传感器，它是由生物识别元 件和物理换能器所组成，能将被测物的浓度与可测量的物理化学信号关联起来。被 测物通过扩散进入生物敏感膜层，经分子识别元件识别发生生化反应，所产生的信 息被相应的换能器转换成与被测物浓度相关的物理化学信号从而实现对待测物质的 定量测定。 生物传感器因其体积小、响应快、能在浑浊的溶液中操作；具有较高的灵敏度 并且容易微型化，可以在线测定物质的变化，已成为现代分析监测主要发展方向。 从1 9 6 2 年c l a r k 最先提出生物传感器的设想【l l 】距今已有4 0 多年，在生物传感器发展 的最初1 5 年里，主要以酶传感器为主【1 2 】。随着微生物固定化技术的发展产生了微生 物传感器，微生物传感器以微生物活体作为识别元件，特别适用于需复酶和辅酶再 生系统参与的生物反应测定，在生化需氧量和生物毒性等综合指标的监测上表现出 独特优势【1 3 】。 1 3 1 微生物传感器的结构和功能 微生物传感器由分子识别元件、换能器和信号输出装置组成，利用固定化微生 物代谢消耗溶液中的溶解氧或产生一些电活性物质并放出光或热的原理实现待测物 质的定量测定，原理见图1 1 。 河北科技大学工程硕士学位论文 待测物 电信号或光信号 图1 - 1微生物传感器原理示意图 f i g 1 - 1 p r i n c i p l eo fm i c r o b i a ls e n s o r 1 3 1 1 换能器 换能器的作用是将分子识别元件所产生的信息转换成相关的物理化学信号。最 早应用的换能器是电化学电极，主要有氧电极、二氧化碳电极等；随后出现了燃料 电池、光敏二极管、场效应晶体管等其他类型的换能器。离子敏场效应管作为换能 器被认为是发展新型微生物传感器的有效手段【l4 i 。1 9 8 0 年c a r a s 等人发表了第1 篇 关于青霉素场效应管生物传感器的文章【l5 】后，近年来，光纤微生物传感器发展迅速。 光纤微生物传感器【1 6 】检测不受外界电磁场的干扰，成为原位监测的方法之一。 1 3 1 2 分子识别元件 分子识别元件( 即生物敏感膜) 是生物传感器的关键部分，也是传感器进行选择性 检测的基础，它直接决定传感器的功能与质量。按被选材料不同，固定化微生物是 传感器的信息捕捉功能元件，是影响传感器性能的核心部件。它既要求将微生物限 制在一定的空间，不流失，又要求保持微生物的固有活性和良好的机械性能。固定 化技术决定传感器的稳定性、灵敏性和使用寿命等性能指标。 1 3 1 3 微生物传感器的类型与特征 按被选材料不同：可将生物传感器分为酶传感器、免疫传感器、组织传感器、 微生物传感器及细胞传感器等。按生物传感器与底物作用机理的不同，又可将传感 器分为生物催化型传感器和生物亲和型传感器。根据生物反应产生信息的物理或化 学性质，换能器通常采用电化学、光谱、热、压电及表面声波等技术与之相匹配， 而由此衍生出电化学生物传感器、半导体生物传感器、光生物传感器、热生物传感 第1 章绪记 器和压电晶体生物传感器等。 1 9 7 5 年d i v i e s l l 7 埔0 成了第1 支微生物传感器到目前，微生物传感器可测定物质 己达六七十种，表1 1 列出了一些典型微生物传感器及其特性。 表1 - 1典型微生物传感器一览表 l a b 1 】t h es c h e d u l eo fm i c r o b i a ls e n s o r 1 3 2 微生物传感器应用领域的发展 微生物传感器不仅可以测定单一成分物质，如葡萄糖等各类碳水化合物【1 8 2 3 】、 甲酸等各类有机酸【1 5 ，17 1 、硝酸盐等各类含氮化合物【1 9 ，2 0 1 和各类氨基酸等，还可以测 定多种化合物的总量和集合效应【2 1 1 。 在发酵工业领域，微生物传感器已应用于原材料、代谢产物的测定。应用微生 物传感器可不受发酵过程中常存在的干扰物质的干扰，并且不受发酵液混浊程度的 河北科技大学工程硕l 二学位论文 限制。 在生物工程领域，微生物传感器已用于酶活性的测定。微生物传感器还能用于 测定微生物的呼吸活性，在微生物的简单鉴定、生物降解物的确定、微生物的保存 方法的选择等方面也有应用 2 2 1 。 在医学领域里，着眼于致癌物质对遗传因子的变异诱发性，人们利用微生物传 感器对致癌物质进行一次性筛选。在临床检验中，v i n c k e 等人于1 9 8 3 年利用变形杆 菌制成了尿素传感器。同年，k a b o 等人制成了用于测定血中肌酸肝含量的微生物传 感器。 环境监测领域是微生物传感器应用最为广泛的领域，其典型代表是生化需氧量 传感器。它可以测定水中可生物降解有机物的总量即生化需氧量。自1 9 7 7 年k a r u b e 使用活性污泥混合菌制出第1 支生化需氧量传感器【2 4 】至今已报道针对不同水质的生 化需氧量传感器数十种 2 5 - 3 0 】。另外，微生物遇到有害离子c n ，a r ，c u 2 + 等会产生 中毒效应，可利用这一性质，实现对废水中有毒物质的评价。g e o r g i o ud 【3 l 】使用基于 活性污泥的微生物传感器监测印染废水中染料对微生物的毒性影响，从而避免有毒 染料进入生物反应器内，确保废水处理体系稳定运行。 微生物传感器还可应用于测定多种污染物：氮氧化物气体传感器【3 动用于监测大 气中氮氧化物的污染；硫化物微生物传感器【3 3 ，3 4 】用于测定煤气管道中含硫化合物； 酚微生物传感器【3 5 】能够快速并准确地测定焦化、炼油、化工等企业废水中的酚。 1 4 微生物固定化技术研究进展 固定化技术是微生物传感器制作的核心，它影响着传感器的灵敏度、响应时间、 使用寿命等性能【3 6 1 。微生物固定化可采用化学或物理的手段将游离微生物固定于一 定的的空间内，使其保持活性并反复利用的一项技术，自1 9 7 7 年k u r a b e 等首次将 丝孢酵母菌分别用聚丙酰胺和骨胶原固定在多孔纤维素膜上，利用其测定水中生化 需氧量( b o d ) ，此项技术得到了迅速的发展。目前，国内外用于生化需氧量( b o d ) 微生物传感器上的微生物固定化技术主要有吸附法、夹层法、交联法、包埋法【3 7 3 9 】。 1 4 1吸附法 吸附法是利用载体之间的静电相互作用的机理进行细胞固定的。可分为物理吸附 法和离子吸附法，物理吸附法是利用有吸附能力的吸附剂将细胞吸附到表面上使其 固定；离子吸附法是在解离状态下可用静电引力而固着于带有相异电荷的离子交换 剂。 k a r u b e 等【2 4 j 最早利用聚丙烯酰胺和骨胶原用吸附法固定活性污泥混合菌，响应 时间分别为3 0 r a i n 和1 5 m i n 稳定性均能达到1 0 天。刘宪梅等1 4 1 , 4 2 , 4 6 1 采用简单的吸附 和涂层方法固定微生物，在测定内充醋酸缓冲溶液焦化废水时微生物膜电极可连续 6 第1 章绪论 稳定的工作2 0 天以上。s u r i y a w a t t a a a k u l 将菌悬液注入孔径为0 4 x n 聚碳酸酯膜上， 用抽气装置使微生物固定在微孔中成膜。制得的微生物膜响应时间为1 0 1 5 m i n 连 续使用5 8 次，相对标准偏差为3 6 。h i k h ar a s t o g i 利用不同浓度的细菌悬浊液用点 滴的方法固定在适当空隙的多孔渗水的尼龙网膜上。该方法制成的微生物膜p h = 6 5 ， 温度为4 c 的条件下可保存1 8 0 天，微生物传感器可重复使用2 0 0 次，并且线性相关 系数为0 9 9 9 。 吸附法制备的微生物膜在短期内响应时间短，灵敏度高，制备方法简单。但它的 菌种在长时间使用时易流失，使用寿命短，一般在1 5 - 2 0 天时它的响应信号就会减 弱，影响测定结果1 4 3 4 6 | 。 1 4 2 夹层法 h i k u m a 等利用多空醋酸纤维素膜夹层法固定酵母菌，使之使用寿命延长到17 天。 张先恩等【47 】利用聚乙烯膜和多孔膜夹层法固定假单胞菌制成微生物膜，响应时间为 5 m i n ，稳定性为2 5 天。孔继烈等【4 8 】利用醋酸纤维素薄膜夹层法将培养好的湿菌体直 接涂于醋酸纤维素膜上，该方法活化时间短，在一个星期内活性较高，但稳定性差， 极易流失。魏恩棋等【4 9 j 利用夹层法将适量菌体夹在两层孔径为0 4 5 p a n 醋酸纤维素膜 之间，用适当黏合剂将两层膜边缘粘贴在一起。利用该方法解决了夹层法菌体易流 失的缺陷，并且传感器在两个多月的多次测定中，具有良好的活性。m u r a k a m i 等【5 0 】 将带4 m m 孔的双面黏合剂带放在直径为2 5 m m 、孔径为0 8 1 x m 的醋酸纤维素膜上， 将l m g 细胞过滤到孔中，用相同的醋酸纤维素膜覆盖在上面粘接好，对微生物进行 固定。g a b j o oc h e e 等将菌悬液滴在直径2 0 mm 、孔径0 4 5 t x m 的硝酸纤维素膜上， 用抽吸装置使细菌固定在膜上，用一个相同的膜覆盖上，然后用适当粘接剂使其粘 紧。该方法的线性相关系数为0 9 7 1 。 夹层法制备的微生物膜，虽然延长膜的使用寿命，解决了菌体易流失的问题，但 活化时间较长，在制备过程中存在菌种定量问题，制备方法比较复杂1 4 s , 4 9 , 5 0 1 。 1 4 3 交联法 交联法与共价结合法都是靠化学结合的方法，但是采用的载体是非水溶性的。应 用此方法的常见载体主要有戊二醛和偶联苯胺等。 郭鼎力等【5 l j 利用b s a g a 交连法进行固定菌种，生化需氧量( b o d ) 测量范围 为l 8 5m e j e ，响应时间为3 m i n ，稳定时间为7 天。刘宝红等【4 8 】利用戊二醛、牛血 清蛋白交联法制成的微生物膜稳定性好，寿命可达4 0 天。( 该方法是先将湿菌体与 牛血清蛋白混合，再加入戊二醛，在致密的尼龙网上涂成均匀薄层，室温减压干燥 成膜。) s u z u k i 将混合微生物悬浮液，磷酸缓冲溶液、交联树脂按1 ：1 ：1 的比例配制， 然后将活性电极浸入上述溶液中，在氮气条件下用紫外灯照射3 m i n 进行微生物固定。 7 河北科技大学工程硕：i - 学位论文 该方法制成的生物膜在磷酸缓冲溶液中，室温条件下保存4 周。d a n d a nc h c n 等将 2 5 r a g 酵母菌与2 m l a l 2 0 3 凝胶体混合，放在3 0 0 目的尼龙网膜上，在室温的条件下 干燥1 5 m i n 成膜，该膜的相关系数为0 9 9 7 4 。 此方法制备的微生物膜在使用寿命上有了很大的提高，但用这种方法固定微生物 的成活率比较低，制备过程比较复杂1 4 8 , 5 2 , 5 3 1 。 一 1 4 4 包埋法 包埋法是最常用的方法，它是将细胞裹于凝胶的微小格子内或半透膜聚合物的超 滤膜内。 h i k u m a 等利用p v a 包埋法固定丝孢酵母菌，该膜的稳定性为4 0 天，响应时间 为0 5 r a i n ，生化需氧量( b o d ) 的测量范围5 - 一1 0 0 m g l 。此后r i e d e l 等也利用p v a 固定枯草芽孢杆菌，稳定性也为4 0 天，响应时间为0 2 m i n ，测量范围2 - 2 2 m g l 。 吴蕴青等【5 2 】用4 海藻酸钠溶液将地衣芽孢杆菌进行固定。实验结果表明，该微生物 活性高，寿命长，响应信号稳定；线性响应范围为1 0 - - 一6 0 m g l ，响应时间为5 r a i n ， 寿命在3 0 天以上。孙裕生等【4 6 j 将少量纤维素等填料加入用磷酸盐缓冲液调制的菌液 中，利用p v a 包埋法对其进行固定。该方法制成的微生物膜4 个月内活性、重现性 良好。m a t t h i 2 l s 等1 2 ”又利用p c s 和p e i 等物质对菌悬液进行了固定，在2 7 7 下干燥 2 4h 成膜。用这种固定化方法制各的微生物传感器的检测时间从过去的5 - 3 0 m i n 减 小到1 0 0s ，使用时间可达2 个月。张悦等【5 4 j 分别利用海藻酸钠、c a c l 2 混合液和 p v a - h 3 8 0 3 的方法对微生物进行固定，实验显示，前者在测定中容易发生溶涨现象， 后者在测定中具有较高的机械强度，在水中浸泡1 0 天，机械强度没有下降。陈曦等 p 5 j 利用四甲氧基硅烷和二甲基二甲氧基硅烷以及h c l 水溶液配置凝胶，与p v a 1 2 4 水溶液混合固定微生物，成功解决了单纯使用p v a 包埋制备微生物膜的溶涨现象， 在冰箱中能够长期保存。使用一年未见破损，而且稳定性良好1 4 8 , 5 5 , 5 6 。 包埋法、特别是p v a 包埋法制备的微生物膜机械强度虽有提高，微生物的活性 也比交联法高，但此方法不适用于涉及大分子物质的反应，所以在实际监测中需把 废水进行预处理才能确保测定顺利进行。 尽管微生物固定化方法多种多样，但还没有一种理想的、普遍适用的方法，每 种微生物固定化方法测得的结果都有明显的差异。因此优化微生物固定化方法的 条件，如找到合适的载体、改变各成分用量配比等，制备出标准化的生化需氧量 ( b o d ) 微生物传感器将成为今后微生物固定化技术的发展方 4 8 , 5 7 , 5 8 】。 通过查阅大量的资料，本课题在总结经验和问题的基础上，提出了切实可行的 固定化微生物的制备微生物膜方法，此方法具有操作简易，不损伤微生物活性等优 点。 8 第1 章绪论 1 5 生物传感器测定仪的发展趋势 迄今为止，不少国家对利用生物传感器快速测定生化需氧量( b o d ) 都制订了相 应的标准，并进行了相关的技术说明。但目前生物传感器生化需氧量( b o d ) 快速测 定仪大多数研究处于实验室阶段，距普遍应用还有相当的距离，少数成形产品也存 在一些问题。 1 5 1生物传感器测定仪存在的问题 ( 1 ) 微生物培养的不稳定性使传感器不能保持良好的稳定运行。 ( 2 ) 不同菌种对不同有机物的降解能力不同，使其响应和重现性不同，从而只 适合于定点水系的测量。对于特定水样和许多实际废水，还应进行有针对性的研究， 如微生物种类、标准溶液及其标准曲线、生物识别元件的制备等。 ( 3 ) 微生物膜电极的响应时间较长，为缩短响应时间，需要选用新的更有效的 微生物固定化材料和方法。 ( 4 ) 微生物的活性会逐步降低，每次测量后需要进行活化处理，且固定化微生 物颗粒或微生物膜的一致性或互换性差。因此，每次更换新的微生物敏感元件后， 需要对工作曲线进行重新调整和校正，增加了测定的繁琐程度。 ( 5 ) 测量一些含有毒有害有机物的样品时，微生物缺乏抵抗性，测量结果与实 际情况会有一定的偏差。 以上不足在一定程度上限制了生化需氧量( b o d ) 生物传感器的工业化应用，因 此，迫切需要开发适合实际情况、性能优异、价格合理的生化需氧量( b o d ) 快速测 定仪。 1 5 2 生物传感器测定仪的研究方向 目前，生物传感器生化需氧量( b o d ) 测定仪的研究和开发主要是围绕着采用更 优化的敏感元件和换能器以及标准溶液等方面展开的。研究的内容包括：采用适宜 的微生物、开发切实可行的微生物膜固定化方法，以获得性能稳定、活化时间短、 对样品溶液浓度变化适应性强、使用寿命长的敏感元件；研究相应的信号检测方法、 数据处理方法；采用尽可能与实际废水成分接近的标准溶液等。纵观生物传感器生 化需氧量( b o d ) 测定仪的研究历史、现状和实际使用的需要，未来对它的研究将主 要集中在以下几个方面： ( 1 ) 在微生物选择方面进行完善，力求拓宽对于多种废水的测定范围，满足更 多行业的使用需要。 ( 2 ) 制作活性高、对有机物具有广谱降解性能的生物敏感元件，提高仪器的稳 定性。 ( 3 ) 简化生物敏感元件的更新和设计，提高仪器的重现性。 9 河北科技大学工程硕士学位论文 ( 4 ) 对微生物膜或固定化微生物的方法进行研究，保证敏感元件的一致性。 ( 5 ) 研究合适的水样预处理方法，提高传感器的响应能力和速度，更真实准确 地反映水样的生化需氧量( b o d ) 水平。 ( 6 ) 开发更合理、更先进的换能器和信号处理设备，例如，半导体技术、压电 晶体技术等新的传导技术的应用，以及传感器同计算机相结合，将有助于生化需氧 量( b o d ) 传感器的微型化，便携化和实用化。2 5 钊。 1 5 3 生物传感器测定仪的发展趋势 生物传感器生化需氧量( b o d ) 快速测定仪可以缩短生化需氧量( b o d ) 测定时 间，节省人力、物力和财力、具有高选择性、高灵敏度、较好的稳定性和低成本， 更重要的是能及时为管理部门和决策部门提供科学决策的依据，便于掌握水体污染 状况、了解工业废水和生活污水排放现状( 尤其是事故的发生) 。同时，也可以为工 业企业的污水治理、污水处理厂的运行管理及时提供参考。可以预见，该仪器将成 为水污染控制领域中最为重要的监测工具，其推广应用具有较大的环境效益和社会 效益，生物传感器生化需氧量( b o d ) 快速测定仪的研究与开发，近年取得了一些进 展，但如何提高仪器的性能、降低成本，还有大量的工作有待进行。总之，开发适 合我国国情的、性能优越且价格合理的快速生化需氧量( b o d ) 测定仪，将是一项 非常必要和迫切的重要研究课题。 1 6 本课题研究的内容 ( 1 ) 微生物传感器的研制：筛选出对有机物有广谱降解性能的高活性好氧微生 物，选择合适的固定化方法制备微生物膜，与溶解氧电极集成传感器，提出固定微 生物的方法制备微生物膜，将微生物膜用特定的技术固定在微型氧电极上，制备出 微生物传感器。 ( 2 ) 自动采样、自动稀释进样系统的研制：自动采样器接到系统取样指令后， 采样泵启，水样由采样器自动、定时打入储水瓶。当水样浓度超出传感器线性范围 时，稀释器按设定的稀释倍数自动稀释，到设定测量时间后，仪器自动进样测量。 ( 3 ) 仪器性能测试：通过对测试温度、缓冲溶液的浓度及p h 值、样品的稀释 倍数、稀释次数对测定结果的影响，选择仪器的最佳工作条件；并在选择的工作条 件下，对仪器的性能如稳定性、重现性、精密度、准确度和线性范围等进行测试。 ( 4 ) 仪器实际应用及运行：为了考察仪器的实际应用情况，利用所研制的生化 需氧量在线自动监测仪分别用标准样品和实际污水样品与标准生化需氧测定法进行 对比；为了考察仪器的实际运行情况，委托相关部门对本实验研制的生化需氧量在 线自动监测仪进行试运行试验。 。 1 0 第2 章传感器的研制 第2 章生化需氧量微生物传感器传感器的研制 2 1生化需氧量微生物传感器工作原理 生化需氧量是指在有溶解氧的条件下，好氧微生物在分解水中有机物时消耗溶 解氧的量。这种生物化学反应所产生的信息被相应的换能器转变成可定量的、可处 理的电信号，电信号的大小可以间接反映待测物质的含量。 本课题选择微生物分解有机物需消耗溶解氧的原理来检测有机物含量，其测定 原理是：微生物的外源呼吸是微生物对底液的好氧代谢，是在有氧条件下微生物细 胞对底液中外源物质的氧化和同化的过程，以微生物对氧的消耗作为检测指标。当 不给予有机物时，微生物的呼吸活性一定，此时，扩散到分子识别元件中的氧是一 恒定值，即输出的电信号也是一个恒定值；当给予一定浓度的有机物时，扩散到微 生物膜中的有机物被分解时消耗一定量的溶解氧，此时，扩散到分子识别元件中的 氧减少，输出的电信号也将减少，电信号减少量与有机物浓度在一定范围内存在定 量关系，依此可以从电信号的降低值计算出样品的生化需氧量值。 2 2 生化需氧量传感器的响应机理 用于生化需氧量检测的微生物传感器由溶解氧电极、固定化微生物膜和信号输 出装置组成，微生物传感器的结构如图2 1 所示。 将筛选出的高活性好氧微生物用多种材料混合包埋固定化微生物的方法制备微 生物膜，将制得的微生物膜润湿，用特制的o 型圈固定在微型氧电极上，既组成测 定生化需氧量专用微生物传感器。 将传感器置于温度、通气速度均恒定的含有一定浓度底物的磷酸盐缓冲溶液时， 则微生物膜内的微生物内源呼吸活性一定，溶液中溶解氧分子扩散进入传感器氧电 极的速率一定，此时电极输出稳定的电流值( 基线) 而 将传感器置于含有好氧物质的磷酸盐缓冲溶液时，则因微生物对好氧物质的同 化作用，使其活性增强而耗氧，导致传感器输出信号降低，并在几分钟内建立起新 的动态平衡，再一次获得稳定的电流值倒，如图2 2 所示，两次稳定电流之差，即输 出电流降低值。 a = 而一五 ( 2 - 1 ) 当溶解氧电极板结构、溶液温度及固定化微生物膜一定时，即在一定条件下， 输出电流的降低值与主体溶液中有机物质浓度厣7 0 成正比。 胪j 嘲o( 2 - 4 ) 此即用微生物电极测定溶液中有机污染物质含量的定量依据【2 0 】。 河北科技大学工程硕士学位论文 l 一塑科管2 _ 内充澈3 - 聚四氟乙烯浮膜4 压帽 5 _ 微生物膜6 - 金e g