（皮革化学与工程专业论文）胶原的提取及其复合纺丝液的制备.pdf

四川大学硕士学位论文y6 54545胶原的提取及其复合纺丝液的制备皮革化学与工程专业硕士生：周文常指导老师：但卫华胶原蛋白不仅具有独特的理化性质和优良的生物相容性、可降解性、低免疫原性以及止血功能，而且在生物体内容易被吸收、亲水性强、无毒安全性好。因此，胶原蛋白作为生物医用材料的理想原料在临床医学各学科中发挥着越来越重要的作用。本论文基于胶原蛋白的性能优势与不足，选取资源丰富、价廉质优的猪皮为原料，经过c o 。超i 临界处理器处理、再进一步纯化后，对从中提取的胶原蛋白进行分析表征的基础上，与高分子化合物一壳聚糖、聚乙烯醇一一进行共混。再用明胶取代胶原，配制明胶共混纺丝液，围绕两类共混纺丝液的性能以及共混物之间的相互作用、相容性进行了研究，将明胶形成的复合膜与胶原形成的复合膜进行比较。论文研究的主要内容和取得的结果如下：1 在胶原的所有提取方法中，酶法是比较理想的提取方法，不仅提取产率高，对环境友好，而且提取的胶原样品基本维持了天然胶原的三股螺旋结构2 猪皮经过c 也超临界处理器处理后，其油脂含量有很大程度的降低，使从中提取的胶原纯度大大提高，从而有利于提取胶原的长期保存，同时此处理过程也不会影响皮胶原的结构，所以是一种比较理想的纯化手段。3 共混温度、时间对共混液性质的影响比较小，而影响其性质的关键因素是共混物的配比，它对共混体系的相容性、稳定性以及共混物之间的相互作用都有着很大的影响。4 胶原与壳聚糖共混后，能使胶原的抗水性、热稳定性、机械强度等性能得到很大程度的改善，从而弥补了单一成分或结构的胶原材料的不足。通过动四j i i 大学颁士学位论文物实验表明：此共混液具有良好的生物安全性，注射后的1 周内基本上无任何异常反应，不影响机体的生长发育。5 明胶一壳聚糖形成的共混膜的各种性能都不如胶原一壳聚糖，明胶各共混体系的相容性也比胶原相对应的共混体系的相容性差。6 以来源广泛、价廉易得的猪皮为原料，提取皮胶原，并与高分子化合物共混制备具有良好生物相容性的胶原基复合纺丝液是完全可行的。论文前部分工作填补了以猪皮为原料来提取生物医用材料用的胶原蛋白的空白，还丰富了有关胶原提取的基础理论；后部分工作填补了壳聚糖改性胶原蛋白复合医用纤维材料应用于生物医学领域的研究空白。研究结果不仅证明了从猪皮中提取胶原蛋白用作生物医用材料的可行性，而且为胶原蛋白改性制备生物材料的研究提供思路、方法和实验数据，为猪皮资源得到合理有效的利用提供一条可行的途径，为胶原基复合医用纤维的后续研究及其开发应用提供有价值的理论依据。关键词：胶原提取医用生物材料聚乙烯醇壳聚糖明胶共混纺丝液型型查堂堡圭兰堡垒塞一e x t r a c t i o no fc o l l a g e na n dp r e p a r a t i o ni t sb l e n ds p i n n i n gs o l u t i o nm a j o rl e a t h e rc h e m i s t r ya n de n g i n e e r i n gp o s t g r a d u a t ez h o uw e n c h a n gt u t o rd a nw e i h u ac o l l a g e nh a sc h a r a c t e r i c a l l yp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ，l o wa n t i g e n i e i t ya n de x c e l l e n tb i o c o m p a t i b “i t y d e g r a d a b i l i t ya n dh e m o s t a s i aa b i l i t y a n di ti sh i g h l yh y d r o p h i l i c ，e a s i l ya b s o r b a b l ea n dn o n t o x i ci nt h eb o d y s oc o l l a g e np l a y sm o r ea n dm o r ei m p o r t a n tr o l e sa sb i o m e d i c a lm a t e r i a li na l lf i e l d so fc l i n i cm e d i c i n e r e g a r d i n gi t sa d v a n t a g e s ，a n db a s e do na n a l y s i sa n dc h a r a c t e r i z a t i o no fc o l l a g e ne x t r a c t e df r o mr i c ha n dc h e a pp i gs k i na n dp u r i f i e db ys u p e r c r i t i c a lc 0 2 ，f u r t h e rp u r i f i e dc o l l a g e nw a sb l e n d e dw i t hp o l y m e r s c h i t o s a na n dp o l y v i n y la l c o h o l ( p v a ) t h e nc o l l a g e nw a ss u b s t i t u t e db yg e la n dt om a k eg e lb l e n ds o l u t i o n s p r o p e r t i e so fb o t hb l e n ds o l u t i o n s ，i n t e r a c t i o na m o n gt h et h r e ec o m p o n e n t sa n dc o m p a t i b i l i t yw e r es t u d i e da n dc o m p a r e d t h ec o n t e n t sa n dr e s u l t so ft h i sp a p e ra r ea sf o l l o w s ：f i r s t ，e n z y m eh y d r o l y s i si st h ep r e m i u me x t r a c t i n gm e t h o d ，w h i c hh a sb o t hh i g hp r o d u c t i v i t y ，f r i e n d l ye n v i r o n m e n ta n dt h eo r i g i n a lt r i p l eh e l i xs t r u c t u r e s e c o n d ，t h eg r e a s ec o n t e n ti np i gs k i ni sd e c r e a s e da f t e rt r e a t e db ys u p e r c r i t i c a lc 0 2 t h ep u r i f i e dc o l l a g e ne x t r a c t e df r o mi ti ss t a b l ee n o u g ht ok e e pf o ral o n gt i m e ，a n dh a sm a i n t a i n e dt h eo r i g i n a ls t r u c t u r e ，s oi ti st h ep r e m i u mm e t h o d t h i r d ，t e m p e r a t u r ea n dt i m ed u r i n gbl e n d i n gh a sl i t t l ee f f e c to nt h ep r o p e r t i e so fb l e n ds o l u t i o n t h em a s sp e r c e n to ft h ec o m p o n e n ti sk e yf a c t o rt op r o p e r t i e s ，c o m p a t i b i l i t y ，s t a b i l i t yo fb l e n ds o l u t i o n sa n di n t e r a c t i o na m o n gc o m p o n e n t s 四川大学硕士学位论文f o u r t h ，a f t e rb l e n d i n gw i t hc h i t o s a n ，w a t e rr e s i s t a n c e ，t h e r m o - s t a b i l i t ya n dm e c h a n i c a ls t r e n g t ho fc o l l a g ea r ei m p r o v e dg r e a t l y ，w h i c hh a sc o m p e n s a t e df o rt h ed i s a d v a n t a g eo fo n e c o m p o n e n tc o l l a g e nm a t e r i a l s t h er e s u l to fa n i m a le x p e r i m e n ts h o w st h ea n i m a lh a sn oa b n o r m a lp h e n o m e n aw i t h i naw e e ka f t e ri n j e c t i o n ，a n dn oe f f e c to ng r o w t ho fa n i m a l s ，s ot h eb l e n ds o l u t i o nh a sg o o db i o c o m p a t i b i l i t y ，f i f t h ，c o l l a g e n c h i t o s a nf i l mc h a r a c t e r i z e sw i t hb e t t e rp r o p e r t i e sa n dc o m p a t i b i l i t yt h a ng e l c h i t i nf i l m s i x t h ，i ti sf e a s i b l et om a k ec o l l a g e nb l e n ds p i n n i n gs o l u t i o nw i t he x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i i i t yb yb l e n d i n gc h i t o s a na n dc o l l a g e ne x t r a c t e df r o mr i c ha n dc h e a pp i gs k i n t h ef o r m e rp a r to ft h er e s e a r c hh a sf i l l e dt h er e s e a r c hb l a n ki na p p l i c a t i o no fc o l l a g e ne x t r a c t e df r o mp i gs k i na sar e s o u r c eo fm e d i c a lb i o m a t e r i a l sa n de n r i c h e dt h eb a s i ct h e o r ya b o u te x t r a c t i o no fc o l l a g e n ，a n dt h el a t t e rp a r th a sf i l l e dt h er e s e a r c hb l a n ko fc o l l a g e n - c h i t o s a nb l e n dm e d i c a lf i b e rm a t e r i a l sa p p l i c a t i o ni nb i o m e d i c a lf i e l d s t h er e s e a r c hh a sp r o v e dt h ef e a s i b i l i t yo fc o l l a g e ne x t r a c t e df r o mp i gs k i na n dp r o v i d e dan o v e lt h o u g h t ，m e t h o d sa n de x p e r i m e n t a ld a t u mf o rc o l l a g e nm o d i f i c a t i o nm a k i n gb i o m e d i c a lm a t e r i a l s ，af e a s i b l ew a yf o rr e a s o n a b l ea n de f f e c t i v eu t i l i z a t i o no fp i gs k i na sw e l la sv a l u a b l et h e o r yb a s i sf o rc o n t i n u o u sr e s e a r c ha n de x p l o i t a b l ea p p l i c a t i o no fc o l l a g e nb l e n dm e d i c a lf i b e r k e yw or d s ：c o l l a g e ne x t r a c t i o nm e d i c a lb i o m a t e r i a l sp o l y v i n y la l c o h o lc h i t o s a ng e lb l e n ds p i n n i n gs o l u t i o n四川大学硕上学位论文前言1 本课题的研究背景生物医用材料是一种用于诊断、治疗或替代人体组织、器官或增进其功能的新型高技术材料，是材料科学中的一个正在发展的新领域，不仅技术含量高，而且与患者生命和健康密切相关。近1 0 多年以来，生物医用材料及制品的市场直保持2 0 的增长率。生物医用材料按组成和性质分为医用金属材料、医用高分子材料、生物陶瓷材料和生物复合材料等。金属、陶瓷、高分子及其复合材料是应用最广的生物医用材料。按应用生物医用材料分为可降解与吸收材料、组织工程材料与人体器官、控制释放材料、仿生智能材料等。而胶原是属于医用高分子材料，它以其独特的结构和性能在生物医学领域中得到了广泛的应用。1 1 胶原蛋白的类型和结构1 1 1 胶原的类型长期以来，人们一直将胶原看作一种分子，但实际上胶原涵盖了一类很宽范围的蛋白分子，其主要结构都是相同的三股螺旋结构。直到2 0 世纪7 0 年代，人们才逐渐认识到不同组织中遗传各异的胶原的多样性，并逐渐对各种性能独特的胶原类型进行了描述。迄今为止，已定义了1 8 种在遗传学上是独特的胶原类型，包括3 2 种具有各自遗传特征的多肽链“1 。他们在组织内的分布具有一定的组织特异性，如肌键中主要含有i 型胶原：软骨中主要含有i i 型胶原；而血管壁、皮肤和各种软组织或器官的阎质中却同时含有i 型和i i i 型胶原，只是不同的器官中，这两种胶原含量的比例不同；型胶原只存在于基膜中；v 型胶原似仅分布在细胞的外周。i 型胶原是生物体最丰富的胶原。1 ，占生物体胶原总量的9 0 ，因而对i 型胶原的研究最多，在生物材料中的应用也最为广泛。1 1 2i 型胶原的结构胶原一般为白色、透明、无分支的原纤维，具有四级结构。胶原的单体是原胶原。原胶原分子为细长三股螺旋链，电镜下测得直径约为1 5 a ，长约3 0 0 0 a ，呈棒状结构。i 型胶原的肽链上特定的氨基酸顺序构成其一级结构；其二级结构指的是n 链上因为出现了甘一脯- y 三肽而形成胶原特有的、紧密的左手螺旋；四川大学硕上学位论文而由于甘氨酸在三肽周期中的存在，使得三条左手螺旋链互相折叠缠绕形成一股紧密的右手复合螺旋，这是胶原的三级结构：四级结构一般指原胶原分子“四分之一错列”方式超分子聚集形成很稳定的、韧性很强的原纤维，胶原分子间聚集依靠氢键、离子键和疏水作用形成“1 ，除这些作用外，分子内及分子问的共价交联赋予胶原高度的物理化学稳定性。( 1 ) 胶原的多肽序列一a ( i ) 链的( g l y x y ) 。三肽周期i 型胶原是由三条左旋肽链缠绕扭曲而成，其中两条a ( i ) 链，一条a ( 1 1 )链，各链均含1 0 5 2 个氨基酸残基。三条n 链互相缠绕构成胶原三级结构一右手复合螺旋。a ( i ) 链和a ( i i ) 链只是在氨基酸顺序上有微小差异，这已经通过试验测定得到证实“剖。这三条胶原特有的左旋链相互缠绕构成胶原的右手复合螺旋。胶原分子多肽链的基本顺序是周期结构，其中甘氨酸( g l y ) 占3 0 ，脯氨酸( p r o ) 和羟脯氨酸( h y p ) 共占约2 5 “1 。胶原螺旋中甘一脯一x 占全数甘一x y 三肽总和的三分之一，正是由于脯氨酸吡咯环的存在，使得胶原多肽链只能形成左手螺旋。因此，这种有规律的周期结构对胶原肽链的构象形式和稳定性极为重要。胶原氨基酸序列的三肽周期特征，是分子模型的骨架和建立的基础。此外，胶原是天然的极性蛋白质，i 型胶原含有4 4 ，天门冬氨酸( a s p ) 残基，7 2 谷氨酸( g l u ) 残基，2 8 赖氨酸( l y s ) 残基“3 。在肽链上酸性和碱性氨基酸大多集中出现在一定的区段而不是均匀分布，这样使肽链上交替出现极性氨基酸区域。b e a r通过小角x 一射线衍射分析，认为非极性或弱极性氨基酸( 如g l y 、a l a 、p r o 、h y p ) 富集区域有序性较高，多肽链聚集得更紧密，而极性氨基酸( 如h r g 、l y s 、a s p 、g l u ) 富集区域，肽段有序性较低，结构较松散。( 2 ) 胶原的超分子聚集一原胶原分子的四分之一错列排布天然胶原在电镜下可看到明暗相间的横纹，均匀分布于胶原整个长链。横纹周期d 约为6 7 r i m ( d 对应的氨基酸残基数为2 3 4 个) 。后来研究结果，s m i t h提出，这种周期性与胶原分子的四分之一错列排布有关9 1 ，并提出了相应的模型。该模型的要点可归纳为：原胶原分子聚集时不仅侧向聚集而且轴向延伸。在侧向聚集时，平行的原胶原分予不是齐头并尾，而是按6 7 n r n 的交错距离排布的。因为6 7 n m 的交错距离是原胶原分子长度( 约3 0 0 0 a ，对应1 0 5 0 个氨基酸残基)的四分之一弱一点，所以相临轴线上的两个原胶原分子的头和尾重叠了约2 5 n m ，形成电镜观察下的暗带。在轴向延伸时，同一轴线上的前后两个原胶原分子并竖坐奎堂堡：! 堂焦堡塞一没有首尾紧密相临，而是留有4 2 r i m 的空隙，形成明带。这样，就在原胶原中有规律地交替出现空隙区和重叠区，从而构成了胶原特有的周期性明暗横纹。i型胶原的四分之一错列模型在2 0 世纪8 0 年代初得到进一步论证和补充。在胶原微纤维的计算机模型设计中，一般都以此作为建立模型的基础。1 2 胶原作为生物医用材料的主要性质与应用1 2 1 生物医用性能天然高分子材料是人类最早使用的医用材料之一，由于天然高分子材料的多功能性质和与机体的相容性、生物可降解性以及对其进行改性与复合，特别是近年来对其进行复合的研究，使其更显示出其它材料无法替代的优点和其独特的性能，使之成为不可缺少的重要生物材料，在医药、食品、化妆品等工业中的重要性f i 益突出，特别在现代医学的发展过程中正在发挥并将继续发挥重要作用。天然高分子材料最具有代表性的有天然蛋白质材料，如胶原蛋白和纤维蛋白，天然多糖类材料，如纤维素、甲壳素和壳聚糖等，而其中又以胶原蛋白的应用最为广泛。胶原的生物学性质主要表现在以下几个方面：( 1 ) 低免疫原性。胶原作为医用生物材料最重要的特点在于其低免疫原性。在1 9 5 4 年以前甚至认为胶原不具有抗原性，后来研究表明，胶原有三种类型的抗原分子“，第一类是胶原肽链非螺旋的端肽；第二类是胶原的三股螺旋的构象；第三类是n 链螺旋区的氨基酸顺序。其中第二类抗原因子仅存在于天然胶原分子中；第三类只出现在变性胶原中：而第一类抗原因子在天然和变性胶原中均存在。但是，胶原的免疫原性非常低，t a k e d a 等。”的研究表明，天然胶原即使作注射试剂用也是无毒的，只有在剂量过大时才会产生免疫反应。胶原的免疫原性可以通过除去端肽或使胶原蛋白链结成网状结构来抑制。( 2 ) 生物相容性。指胶原与宿主细胞及组织之间良好的相互作用。无论是在被吸收前作为新组织的骨架，还是被吸收同化进入宿主，成为宿主的一部分，都与细胞周围的基质有着良好的相互作用，表现出相互影响的协调性，并成为细胞与组织正常生理功能整体的一部分。( 3 ) 可生物降解性。胶原能被特定的蛋白酶降解，即生物降解性。因胶原具有紧密牢固的螺旋结构，所以绝大多数蛋白酶只能切断其侧链，只有特定的蛋白酶在特定的条件下才能降解胶原蛋白，胶原肽键才会断裂。胶原的肽键3四型查堂堡主兰堡堡壅一一旦断裂，其螺旋结构随即被破坏，断裂的胶原多肽就被蛋白酶彻底水解。1 2 ，2 胶原在医学领域中的应用胶原的结构和性能表明它是一类优良的可用于引导组织再生的生物医用材料，已经广泛地应用于医学领域中。其应用主要在以下三个方面：1 2 2 1 可降解胶原缝线由于胶原植入物在人体内会降解为氨基酸而被人体吸收，因而利用胶原制成的胶原缝线用于特殊的医疗手术具有重要意义。临床应用表明，可吸收的胶原缝线用于眼科的角膜手术中，很少有不良反应。此外，还有关于动物实验中利用经过纯化的胶原膜作角膜并用液状胶原替代晶状体的报道。1 2 2 2 可注射性胶原主要用于整形美容，是纠正皮肤凹陷型缺陷的最理想材料，其主要适应症为皱纹、寻常痤疮疤痕、小型外伤疤痕等缺陷矫正。此外，对糖尿病患者在其病变部位注射胶原有助于足部溃疡和褥疮的修复。应用较为广泛的胶原植入物是可注射性胶原溶液，主要是用于矫治由于年老、刨伤、疾病和先天性畸形所引起的外形异常病。1 2 2 3 人造代血浆胶原蛋白经纯化、除去热源，把分子量控制在5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 之间，大约相当于白蛋白的分子量( 大约6 9 0 0 0 ) ，这种分子量的胶原蛋白可维持血液必要的渗透压，更接近于血浆的天然属性，效果很好。国外已大量使用，我国也正在推进其产业化。当然胶原蛋白还有很多其它的医学功用，例如可以制成止血海绵、组织引导材料以及胶原水凝胶。胶原的稀水溶液可以制成透明的凝胶用于眼玻璃体替代物，这种凝胶生物相容性很好，可在两个月内被降解吸收，但强度不够理想，通过针头注射时结构容易破碎“，胶原水凝胶亦可被制成一种良好的药物释放体系，其释放速率可被人为控制“。4四jr 1 人学硕士学位论文2 胶原基生物医用材料在研究开发中存在的主要问题通过研究分析，我们认为，自2 0 世纪7 0 年代以来，在胶原基生物医用材料的研究开发方面，国内外科技工作者已经做了大量卓有成效的工作，取得了令人瞩目的巨大成就。但是，我们发现尚存在以下问题和不足：( 1 ) 尽管胶原蛋白已被制成各种不同形状的材料，如膜、海绵、薄片等，但是由单一组分或单一结构的胶原制备的材料机械性能、抗水性均差，在体内易降解，并且降解速率也不能调节，在潮湿环境中易受细菌侵蚀而变质，有关解决这些问题的报道很少。( 2 ) 以往的研究工作基本上都是制备、研究单一组分或单一结构的胶原材料，其复合材料的研究在国内外都还是刚刚起步，特别是对纤维型的胶原基复合材料的研究就更少了。( 3 ) 目前，胶原的提取一般都是以易于处理的牛腱、鼠尾腱等为原料，而这些原料的来源很有限，价格昂贵、成本高、提取难度大、周期长；同时对牛腱胶原来说，存在着疯牛病的危险。至今还少有以其它的生物组织为原料来提取胶原制各生物医用材料的报道，特别是利用猪皮胶原为原料制备生物医用材料的报道更少。3 胶原基复合医用纤维的研究如上所述，单一胶原蛋白作为医用生物材料存在着许多不足，而胶原基复合材料具有单一组分或结构的胶原材料不可相比的独特性能，特别是纤维型的胶原基复合材料。自问世以来，在国内外受到了各界人士的极大关注和普遍重视。3 1 胶原基复合医用纤维的发展历史与现状胶原蛋白可以和许多水溶性的生物材料形成一系列均相的复合材料，胶原蛋白、陶瓷和聚合物之间也可形成异相复合材料。根据临床医学应用的不同目的可以制成各种不同性能的复合材料。在这方面，国内外科技工作者已经做了大量的研究工作。首先从国外来看，早在2 0 世纪8 0 年代末国际上就涌现出一批以胶原蛋白为主要成分的生物制品，包括可溶性胶原、不溶性胶原、以及由胶原与非胶原基质组成的复合物。这些材料可用于制备胶原溶液、胶原膏剂、四川丈学硕士学位论文胶原薄膜和胶原纤维等产品，在这些材料中扮演着举足轻重角色的又是胶原基复合可降解医用纤维，它可被用于手术缝合线、中空纤维管、医用敷料、牙周再生片、增强性网状织物以及手术后防止内脏器官粘连的医用纤维纸等等“4 一”1 。此外与之相关的人造血管、骨钉、夹板等也开始陆续进入医用领域。目前常用的临床血管导管为d a c r o n ( p 0 1 y e t h y l e n e t e r e p h t h a l a t e ) ，该产品尤其适用于胸腹部血液粘度商的血管手术。2 5 年临床应用证实，d a c r o n 管须具有一定孔径和渗透性，才能获得最佳术后修复效果。但问题是，为防止血液从导管的网眼中渗透出来，必须在手术中对导管进行预凝，为确保导管完全不漏，避免手术意外，必须对d a c r o n 反复预凝，从而增加了手术感染的危险性。预凝过程中，需要对d a c r o n 入造血管加压，但是高压过的d a c r o n 人造血管质她变硬，难于缝合，血液渗透倾向增高，影响手术效果。“，而胶原- - d a c r o n 复合体就可以解决以上问题：还有将交联过的胶原与糖胺聚糖结合，可以获得孔径和分子量适中的具有良好渗透压及强度的胶原- - g a g 复合物网络”。用它制成的材料可以促进皮肤损伤的修复，还可以应用于外周神经再生中。m s t o l 等人将聚甲基丙烯酸羟乙酯复合物植入作为骨缺损的修复，发现其中的胶原对新骨的形成可能有一定的刺激性1 ，将此复合物用于牙周病治疗，也取得了一些成功的结果，但仍需进一步确证和探讨m 。我国与国外相比，对于胶原基复合医用生物材料的研究不论是基础研究还是应用研究仍处于初级阶段，在胶原基复合医用纤维方面还剐刚起步。在1 9 9 0年，郭振友等人开始了( 即胶原与氨基葡聚糖及其它天然混合材料) 缝合线的研究，所研制的缝合线不仅保留了原有胶原缝线的可塑性好、成纤性能好、植入人体无不良反应、无毒性、能被人体吸收等特性，其强力也大大高于胶原缝线，特别是湿打结强力更为明显。在临床上已得到广泛应用：张其清等人用胶原和聚乙烯醇复合制得了手术缝合线，找到了成功的复合工艺条件，并在此基础上研制了复合膜、复合水凝胶等产品，已经或将要用于外科手术、g t r 术、抗癌药物控制释放和软组织修复等方面。此外，胶原还可与壳聚糖复合制成多种组织工程支架材料。顾其胜、蒋丽霞等人和上海长征医院、华山医院以胶原一壳聚糖复合材料制备了神经导管肺1 。试验证明，它具有良好的物理机械性能和生物相容性，并能有效地促进周围神经缺损的修复。2 i 世纪胶原基复合医用纤维将有望出现较大的发展。目前，无论是其产6婴型叁堂璺圭兰竺笙茎量还是质量、性能都远远不能满足市场需求，要应用于医学领域，还有许多工作要做。据预测，在今后一段时期内，胶原基复合医用纤维材料每年平均将以1 0 的速度递增，发达国家则更快。因此，我们必须抓住机遇，迎接挑战，集中精力开展胶原基复合医用纤维的基础研究与研究开发，在提高其性能的同时，不断拓展其应用范围。3 2 本课题的目的和意义胶原虽然以其优良的性质受到生物医学界的欢迎和重视，但胶原也和其它天然材料样，存在某些弊端，具有天然材料共有的弱点，在很多应用场合下，它都无法很好地满足机体对其性能多样性的要求。同时，由于人体功能的复杂性，随着生物材料在人体具体应用形式和场合的不同，对材料各项性能指标的要求也不尽相同。另外。即便是在某一特定的应用场合，对生物材料的性能要求也不是单一的，而是多样性能的综合平衡。例如用于人体组织的修复材料，理想的组织修复材料随着人体新组织的长出，应逐溺被人体吸收，直至完全被新组织所替代。在这一过程中，修复材料的降解速度要适应于机体对材料机械力学性能的要求。对于缺损的硬组织来说，修复材料需要承受一定的载荷。因此就要求材料具有一定的起始强度和韧性，而且其强度随降解过程的衰减要与新组织的形成速度相匹配；对于受损软组织来说，修复材料也需在一定的降解周期内保持适当的强度，从而可以将生物力学的刺激传递给活细胞，引导新组织在机体材料内的定向生长。由此可见，在很多应用场合下，单一组分或结构的材料无法很好地满足机体对材料性能多样性的要求。因此，就需要通过多种材料的复合，以综合多种组分或结构的性能优势，形成复合材料，更好地实现对人体受损组织的修复作用。有鉴于此，复合生物材料也就应运而生了。胶原基复合生物材料是其中应用最为广泛的复合材料之一，它可以多种形式存在，例如胶原复合膜、胶原复合水凝胶、胶原复合纤维等。高性能的胶原基复合纤维因其易于构建成具有复杂构型的细胞支架，因而必将在组织工程中具有特殊的地位。综上所述，胶原基复合纤维确实具有单一组分或结构的材料所无法比拟的性能优势。通过选择具有生物活性、不同降解特性或力学性能的高分子材料进行复合、改变组分之间的配比，就有可能得到降解速率可调、力学性能有所改7些型查兰堡主兰堡丝奎善的胶原基新材料，即改善胶原基材料的力学性能与生物学性能。另外，胶原基复合纤维材料还可集中多种组分的性能优点，弃其各自不足之处，其研究与开发对国民经济和社会发展有着重要意义；也将大大促进我国化纤、纺织工业、医学、药学、生物学的发展：其发展和进步将会为组织工程材料提供性能更为优越的新材料，将在整个生命科学发展过程中起到举足轻重的作用。大量研究资料表明，以往胶原基生物材料的研制所采用的胶原原料一般较多地是选取牛腱、鼠尾腱等。而它们的资源有限、提取难度大、周期长、成本高。针对这一问题，正确地选择提取胶原蛋白的原料，寻求科学、经济、合理、可行的制造胶原基复合医用纤维的纺丝液的优化工艺，是科技工作者面临的一项重大课题。本课题充分利用我国丰富的猪皮资源，价廉物美，从中水解提取胶原蛋白，并与高分子化合物共混，研制出高附加值、有应用前景的胶原基复合医用纤维纺丝液，避免了化学改性引入外加试剂产生的负面影响。该课题的研究结果不仅可以丰富胶原蛋白的应用基础理论，而且也为胶原蛋白改性制备复合医用纤维材料提供了研究思路、方法和实验数据，具有重要的理论意义和实际应用价值。四川大学硕士学位论文第二部分皮胶原的提取与纯化1 引言1 1 胶原的提取方法从正常的生物基质中提取胶原均需要一定的条件。如果不能满足这一条件，它将很快地失去生物学活性。因此，在胶原蛋白的特性研究中，确定其提取的工艺条件是一个关键问题“7 。在已有的研究中，有关胶原提取的资料尽管很多，但是其水解提取的工艺还有待于进一步的完善和优化。胶原的提取与纯化的目标是：( 1 ) 尽量使胶原提取的产率、纯度更高：( 2 ) 使所提取的胶原能满足不同应用领域的要求。迄今为止，胶原的提取方法主要有以下四种，即：酸法、碱法、盐法、酶法。碱法由于它容易造成肽键水鳃，因此得到的水解产物分子量比较低，若比较严重的话，还会产生d l 型氨基酸消旋混合物，即旋光性化合物。因为不对称碳原子经过对称状态的中间阶段，发生了消旋现象，并转变为d 型和l 型的等摩尔混合物，其中d 型氨基酸若高过l 型氨基酸，则会抑制l 型氨基酸的吸收，而有些d 型氨基酸是有毒的，有的甚至有致癌、致畸和致突变作用。所以，若想保留胶原的三股螺旋结构，用此提取方法是不可行的。显然，此法不适合用于生物医用材料的胶原蛋白的提取。盐法常用来提取胶原的中性盐主要有：t r i s h c l ( 盐酸一三羟甲基胺基甲烷) 、氯化钠、柠檬酸盐等。在中性条件下，当盐的浓度达到一定量时，胶原就会溶解在其中 但是，胶原的溶解和分级受中性盐效应影响，其影响机制比较复杂：有的盐可提高胶原的稳定性，而有的则可降低其构象稳定性，从而对提取天然胶原很不利。总的说来，盐法提取胶原的工艺不易稳定，且提取的胶原分子结构不及酶溶胶原合适。所以。在本论文中，也不考虑用此方法。酸法主要采用低离子浓度酸性条件破坏分子间盐键和s c h i f f 碱，而引起纤维膨胀、溶解，但其溶解量很少。作为溶剂使用的酸主要有醋酸、柠檬酸、甲酸等。用酸法提取的胶原最大程度地保持了其三股螺旋结构，适用于作医用生物材料及原料，但提取产率比较低( 和酶法相比) 。酶法用胃蛋白酶可使胶原溶解，且具有水解反应快、无环境污染、提取的水解胶原蛋白纯度高、水溶性好、理化性质稳定等特点；同时，胃蛋白酶还可以催化水解胶原的端肽非螺旋区，而对螺旋区无作用但引起a l 和0 2 链展开，q婴业查堂堡主兰堡笙兰这样溶解的胶原仍有完整的三股螺旋结构，更降低了胶原的抗原性，适用于作为医用生物材料及原料。在机体发生过程中构建组织时，由于胶原中蛋白多糖及糖蛋白的特异亲和性( 机制尚不十分清楚) ，而致其不溶解。另外，随着年龄的增长，胶原分子问及其与其它成分之间也会形成共价键架桥，这种“架桥”的存在，也会阻碍胶原的提取。研究表明，这些共价键架桥大多位于胶原分子n 端和c 端的非胶原( 尾肽) 部分，易被胶原酶切断。若在酸性条件下，以胃蛋白酶处理胶原，不仅只对胶原肽链的末端非螺旋区水解，而且可促使被切断部分尾肽的胶原分子( 无尾肽胶原) 变为可溶，因此这是一种较为理想的胶原提取方法。1 2 本部分的研究思路及内容如前所述，用碱法和盐法提取的胶原都不适用于作为生物医用材料及原料，而酸法和酶法两者各有其自己的优点。本部分首先对这两种方法分别进行实验研究，获得了这两种方法在不同工艺条件下的胶原溶出率、分子量及其分布等有关数据资料。其次，通过对上述有关数据资料的分析比较，得出酸解法、酶解法提取胶原的最佳工艺条件。再次，采用两者的最佳工艺水解提取胶原，对它们的溶出率、提取的胶原样品进行分析、表征，最后得出水解提取胶原的最佳定型工艺条件。在此基础上，我们迸一步对提取的胶原进行精制纯化，通过对胶原的结构表征得出提取胶原的纯度，并与标准i 型胶原进行比较，判断并验证所提取的胶原样品是否为i 型胶原；同时用c o 。超临界处理器对生皮进行预处理，通过对处理过的生皮进行油脂分析，得出c 0 2 超临界处理器纯化生皮的最佳工艺条件( 根据脱脂效率) ，再对经过c q 超临界处理器处理过的猪皮进行常规纯化，用最佳定型工艺从中提取胶原、纯化、分析( 其操作过程同上) ，对从经过两种不同方法处理过的皮中提取的胶原样品进行分析对比，得出了用c 0 2 超临界处理器纯化生皮是一种比较理想的纯化手段，不会影响皮胶原的三股螺旋结构。0四川大学硕+ 学位论文2 实验部分2 1 实验试剂和仪器2 1 1 试剂丙酮a r盐酸a r冰醋酸a r氯化钠a r异丙酮a r醋酸钠a r氯胺ta r柠檬酸a i 硫酸铜a r高氯酸a r胃蛋白酶b r酒石酸钾a r氢氧化钠a ri 型胶原b r柠檬酸三钠a r对二甲氨基苯甲醛a r2 12 实验仪器酸度计离心机透析袋电子天平磁力搅拌器可见分光光度计真空冷冻干燥机差示扫描量热仪傅立叶红外光谱仪p h s 一3 bl g l 0 - 2 4 ad 2 l m mf a l 0 0 47 8 一l7 2 2 ad z f - 6 0 2 1 型0 s c 2 0 0 0p cm a g n ai r 5 6 0成都市联合化工试剂研究所成都市联合化工试剂研究所重庆北碚精细化工厂上海有机化工试剂研究所上海有机化工试剂研究所成都科龙化工试剂厂中国余山化工厂成都科龙化工试剂厂成都科龙化工试剂厂天津市东方化工厂苏州东吴医用生制品厂天津市英钟霸州市化工厂成都市金城化工试剂厂s i g m a 公司成都市联合化工试剂研究所天津市新纯化学试剂研究所上海雷磁仪器厂北京医用离心机厂华美生物工程公司上海精密科天平有限公司江苏省金坛市医疗仪器厂上海精密科学仪器有限公司上海一恒科技有限公司德国耐池n i c o l e t u s a四川大学硕士学位论文同立氨基酸分析仪8 3 5 5 0 型日本日立公司2 2 实验内容与方法2 2 1 原材料的预处理方法l ：将从市场上购买回来的新鲜猪皮，按一定规格进行分害4 ，取其臀部。反复进行清洗，然后去肉、脱毛、脱脂等纯化处理。再将猪皮切成体积为l ll c m 3 大小的小皮块，用蒸馏水清洗干净，低温晾干到半透明、称重，从中提取的胶原记为样品l 。方法2 ：另取猪皮臀部经过蒸馏水清洗后在一定条件下用实验室自制的c 魄超临界处理器处理后，再进行与方法1 同样的操作，从中提取的胶原记为样品2 ，为下面的水解提取胶原作准备。2 2 1 1c 0 ：超i 临界处理器纯化生皮将已清洗干净的新鲜猪皮臀部剪成1 0 l o c m 2 大小的皮块，放入c 0 2 超临界处理器的反应釜中，盖好盖子，将其它相应仪器连接好，然后按表2 2 中相对应的条件开始反应。根据文献资料和本实验室前期的研究工作，考察温度、时间、压力、转速四个主要因素对c o z 超临界处理器纯化生皮的影响，设计了如表2 1 所示的因素水平表。表2 - i因素水平表儿( 4 3 ) 根据表2 1 的因素水平表，设计并安排了如下的正交实验，实验结果如表2 1 1 。四川大学硕上学位论文表2 - 20 0 2 超临界处理器纯化猪皮的正交实验安排2 2 2 猪皮胶原提取工艺的优化2 2 2 1 酸解法提取工艺的优化1 醋酸水解实验在对文献分析和本实验室前期研究工作的基础上”1 ，用醋酸水解提取胶原。根据对目标产物的相对分子量要求以及p h 值、温度、时间对皮胶原水解的影响，优化水解工艺条件。! 望二! 里童查兰壅坠! 竺! j墅! !堕塑! !些144 01 521 45 02 。0j 丝塑! ：!根据表2 - - 3 的因素水平表，安排了如下的正交实验，实验结果如表2 1 2 和图2 1 。的啪啪册瑚瑚瑚册一5一 2筋姗 2踮瑚强筋瑚一弛s弛弘25蚰们一四川i 大学硕士学位论文表2 - 4醋酸水解正交实验安排l23456442 41 42 42 45 02 06 02 54 02 54 02 05 01 56 02 071 46 01 5844 01 5一一! ! 旦! ：12 柠檬酸水解实验根据文献资料和醋酸水解实验的结果，对柠檬酸水解实验设计了如表2 5 所示的因素水平表。表2 - 5 因素水平表b ( 3 3 ) _ _ _ - _ - - _ - ，- _ _ h - - - - - - _ _ - - 一塑堡! 里堕塑! !鲤144 01 521 45 02 032 46 02 5由表2 5 的因素水平表设计了如表2 6 所示的正交实验，实验结果如表1 3 和图2 2 所示。4四川大学硕士学位论文表2 - 6 柠檬酸水解正交实验安排l234562 ( 5 0 )3 ( 2 4 )72 ( 5 0 )2 ( 1 4 )3 ( 2 5 )83 ( 6 0 )2 ( 1 4 )1 ( 1 5 )兰一! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ：! 12 2 2 2 酶解法提取工艺的优化1 以醋酸一柠檬酸三钠为缓冲体系的酶解实验对以醋酸一柠檬酸三钠为缓冲体系的酶解胶原实验设计了如下的四因素三水平的正交实验，其中酶用量是以干皮的重量为计算基础。墨兰! 垦耋查室! ! ! ! ! ! !塑型!堕囹尘堕墼旦量生根据以上的因素水平表设计了如表2 - - 8 所示的正交实验，实验结果如表21 4 和图2 3 。1 5眩旺汜23213)孔mood；(33)如明加3l2l3四川大学硕上学位论文表2 - 8酶溶解正交实验安排1 21 21 21 81 81 8l52 02 52 02 51 5o 51 01 51 5o 51 02 42 51 081 42 41 51 5一!坠翌! ：! ：12 盐酸一醋酸钠为缓冲体系的酶解实验根据文献资料和上面的实验结果，对以盐酸一醋酸钠为缓冲体系的酶解实验设计了如表2 - - 9 所示的因素水平表。表2 - 9 因素水平表( 4 3 ) 一里堕! 兰堕塑尘些鳖旦量垡141 81 50 521 42 42 01 032 43 02 51 5根据表2 - - 9 的因素水平表安排了如表2 - - 1 0 所示的正交实验，实验结果如表2 - - 1 5 和图2 4 所示。64h 烈4m 孔41234567四川大学硕士学位论文表2 - 1 0i l l i 解法正交实验安排2 2 2 3 酸解法优化工艺与酶解法优化工艺的比较i - 用酸解法和酶解法的最佳工艺条件水解方法l 处理过的猪皮，根据产率和分子量及分布来选择最佳工艺条件，实验结果如表2 - - 1 6 和图2 5 ( 图2 。5中的1 和2 ) 。2 用酶解法的最佳工艺水解方法l 、2 处理过的猪皮，实验结果如表2 - - 1 7 。2 2 2 4 羟脯氨酸含量测定羟脯氨酸是胶原的特征氨基酸，可根据羟脯氨酸在胶原中的含量比较恒定的特点来估算胶原的含量，如软骨中羟脯氨酸约占软骨胶原的1 0 c 。i ，皮肤中的羟腩氨酸约占皮肤胶原总量的1 4 。“。因此以羟脯氨酸含量测定值换算成胶原含量，即测定每一次实验的溶出液中的羟脯氨酸含量( 根据其溶出液的吸光度值从标准曲线中得出羟脯氨酸的含量) ，再与原生皮重相比较，就可得出胶原的实际溶出率，羟脯氨酸含量测定的具体过程以及标准曲线见附录l 。2 2 3 水解猪皮胶原的纯化提取生物医用材料用的胶原蛋白，纯度是一个很重要的指标，所以粗提胶原必须经过多次纯化。先将粗提胶原用常温灭菌双蒸馏水作短时间洗涤，用5o555001)一吼lllnlll吼一5o50551)一l22互曩l蔓ll 一心地垃埔掩他弘驭m 一4m丝4h 孔4h盟一婴型盔兰堡主兰堡堡壅0 5 m o l l 的醋酸溶解，再离心分离，以除去不溶物，再用0 5 m o l l 的氢氧化钠调p h 值到7 5 8 0 。量出其体积，按c ( n a c l ) = 2 5 m o l l 加入氯化钠，放入冰箱于4 。c ，用电磁搅拌器搅拌l h ，然后放置1 2 h ，让它沉淀，然后以8 0 0 0 r m i n的转速离心1 5 m