（环境工程专业论文）磁性碳纳米管构建漆酶传感器及微生物固定技术的研究.pdf

硕十学位论文 摘要 生物传感器是利用生物有机成分( 如酶、抗体、核酸、细胞、微生物等) 作为敏感基 元对待检物质进行专一的识别，产生的信号经过信号传导器转变为可以输出并加以程序 化定量的电信号、光信号进而检测出待测物质的量的一项新技术。和传统的检测技术如 分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法等相比生物传感技术具有特异性好、灵敏度 高、响应快、操作简单、成本低、可以微型化的优点。本文以检测环境中痕量多环芳烃 的研究进展为例，综述了这个技术的主要原理。 运用各种新型材料来更稳定的发挥生物传感器的优良性能是生物传感器发展的一 个重要方向。本文考察了把新型碳纳米材料运用到生物传感器的构建上面。通过磁性碳 纳米管的顺磁性以及纳米粒子的独特性能使该生物传感器制作简单、重复利用性高、并 且响应时间短、选择性能和灵敏度也高。此外对基于碳糊电极检测铜绿假单胞菌的 1 6 s i 矾a ，和免疫传感器中抗原的制备进行了初步研究。 首先通过把碳纳米管溶解于甲苯胺蓝溶液中增加了碳纳米管的水溶性然后运用共 沉淀法在碱性的铁和亚铁溶液中搅拌生成了磁性碳纳米管。震动样品磁强计和场发射扫 描电镜用来表征了合成的磁性碳纳米管的磁性强度和表面形貌。循环伏安法表明基于磁 性碳纳米管和壳聚糖s i 0 2 溶胶制作的漆酶传感器和直接用壳聚糖s i 0 2 制作的漆酶传感 器相比前者的导电性能和电子转移能力大大提高。在室温下用该传感器检测邻苯二酚线 性范围是l 3 x 1 0 4 - 1 0 。7 m 。检测下限为l o 7 m 。经缓冲溶液清洗后可以多次重复利用。4 的湿润条件下保存2 0 天其响应电流为原来的9 4 。 在制作磁性碳纳米管固定漆酶的生物传感器的过程中，发现碳纳米管具有优越的性 能。尤其是其极大的比表面积在固定和吸附中具有广泛的应用，于是本文还初步探讨了 把碳纳米管用于微生物固定，来还原六价铬。 关键词：生物传感器；磁性碳纳米管；1 6 s r r n a ；铜绿假单胞菌；微生物固定； 多环芳烃；抗原 磁性碳纳米管构建漆酶传感器及微生物固定技术的研究 a b s t r a c t b i o s e n s o ri san e wa n a l y t i c a l t e c h n o l o g y i t u s e sb i o o r g a n i c - c o m p o u n d s ( s u c ha s e n z y m e ，a n t i b o d y , d n a ，c e l la n dm i c r o b e ) a sr e c e p t o r , b yh i g h l ys p e c i f i cr e a c t i o nw i t h s u b s t r a t e ，t h e nt h eb i o l o g i c a lr e s p o n s ei sc o n v e r t e dt oe l e c t r i c a ls i g n a l ，a n dp a s s e st oa m i c r o p r o c e s s o rs t a g ew h e r et h ed a t ai sp r o c e s s e d ，c o n v e a e dt oc o n c e n t r a t i o nu n i t sa n d o u t p u t t oa d i s p l a yd e v i c eo rd a t a s t o r e c o m p a r e d w i t ht r a d i t i o n a lm e t h o d s ( s p e c - t r o p h o t o m e t r y , h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , g a sc h r o m a t o g r a p h ya n ds oo n ) b i o s e n s o rh a sb e a e rs p e c i a , h i g hs e n s i t i v i t y , q u i c kr e s p o n s e ，l o wc o s ta n d e a s yt oo p e r a t i o n t h e e m e r g e n c eo fm o l e c u l a rp r i n t e dt e c h n o l o g yc a no f f s e tt h es h o r t c o m i n g so f l o n g t e r ma n dl o w y i e l do ft r a d i t i o n a la n t i b o d y - p r o d u c i n gm e t h o d s u s i n gk i n d so fn e wm a t e r i a l st oi m p r o v et h ep e r f o r m a n c e so fb i o s e n s o ri sa ni m p o r t a n t p a r tf o rd e v e l o p i n gb i o s e n s o rt e c h n o l o g y i nt h i sp a p e r , m a g n e t i cc a r b o nn a n o t u b c sw a su s e d t of a b r i c a t eb i o s e n s o r b yt h ep a r a m a g n e t i s mo f m a g n e t i cc a r b o nn a n o t u b e sa n dt h es p e c i f i c p r o p e r t i e so fn a n o p a r t i c l c s ，t l l ep r e p a r e db i o s e n s o rw a se a s yt om a k ea n do p e r a t e i tc a n r e u s e ，w h a ti sm o r e ，i t sr e s p o n s et i m ei ss h o r ta n ds e n s i t i v i t ya n ds p e c i a li sg o o d b e s i d e s ，t h e g e n e - b i o s e n s o rf o r16 s r r n ao fp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aa n dt h es y n t h e s i z a t i o no fa n t i g e n a r ea l s od o n ei nt h i sp a p e r b yd i s s o l v e dm u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o p a r t i c l e si nt bs o l u t i o n , t oi n c r e a s et h e s o l u b i l i t y t h e nu n d e ra l k a l i n ec o n d i t i o n ，b yt h ea i do ff e r r i ca n df e r r o u ss o l u t i o n s ，m a g n e t i c c a r b o nn a n o p a r t i c l e sw a sm a d e s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p h s ( s e m ) a n d v i b r a t i n gs a m p l e m a g n e t o m e t e r ( v s m ) w e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z et h es u r f a c e t o p o g r a p h ya n dm a g n e t i s mo f m a g n e t i cc a r b o nn a n o p a r t i c l e s c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) s h o w e dt h a t m a g n e t i cc a r b o n n a n o p a r t i c l e sa n dc h i t o s a n s i l i c o nm o d i f i e dl a e e a s eb i o e n s o rh a da g o o de l e c t r i cc o n d u c t i v i t y c o m p a r e dw i t ho n l yc h i t o s a n s i l i c o nm o d i f i e dl a c c a s eb i o s e n s o r a tr o o mt e m p e r a t u r e , u s i n g t i m e c u r r e n tm e t h o d ，t h en o v e lb i o s e n s o r ( m m c n t l a c c a s e c sf i l mc a r b o np a s t ee l e c t r o d e ) s h o w e dal i n e a rr e s p o n s et oc a t e c h o lo v e rac o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m10 。7m t o0 3 3x10 - 4m w i t had e t e c t i o nl i m i to f10 m a f t e rw a s h e dw i t hp b ss o l u t i o n i t c a l lr e u s em a n y t i m e s w h e ns t o r e di n4 f o r2 0d a y s ，i t sr e s p o n s ec u r r e n tw a s9 4 o f o r i g i n a l l y b e s i d ea p p l i c a t i o ni nb i o s e n s o r , n a n o - m a t e r i a l sa r ew i d e l yu s e di ne n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n i nt h i sp a p e r , w ei n v e s t i g a t e dt h ea p p l i c a i o no fc a r b o nn a n o p a r t i c l e st oi m m o b i l i z em i c r o b et o d e g r a d ec h r o m i u m a t l a s t ，t h e a p p l i c a t i o n o fc a r b o nn a n o t u b e s a e r u g i n o s a , t h e ni tw a su s e dt od e o x i d i z ec h r o m i u m i m m o b i l i z a t i o no f p s e u d o m o n a s k e yw o r d s ：b i o s e n s o r ；m a g n e t i cc a r b o nn a n o p a r t i c l e s ；16 s r r n a ；p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ；m i c r o b e - i m m o b i l i z a t i o n s ；p a h ；a n t i g e n i i 硕十学位论文 图表清单 图1 1 生物传感器的分类。2 图1 2 免疫技术检测p a h s 示意图6 图1 3 吸附固定法( 左) 和包埋固定法( 右) 示意图1 2 图1 4 共价键结合法( 左) 和交联固定法( 右) 示意图。1 2 图1 5p a h m w n t s 的溶解和组装成纳米生物层的过程【删1 3 图2 1 碳二亚胺法合成抗原示意图l8 图2 2 氟草烟化学结构1 9 图3 1 响应探针用量优化图。2 5 图3 2 铜绿假单胞菌r n a 电泳图2 6 图4 1 碳糊电极示意图。3 0 图4 2 甲苯胺蓝化学结构图3 1 图4 3 甲苯胺蓝处理过的碳纳米管的溶解性变化。3 l 图4 4 磁性碳纳米管的磁滞回线3 2 图4 5 普通碳纳米管和磁性碳纳米管的s e m 图3 2 图4 6 p h 值对邻苯二酚传感器响应电流的影响3 3 图4 7 不同修饰情况下工作电极的循环伏安扫描图3 4 图4 8 电化学检测示意图。3 5 图4 9 最佳条件传感器对邻苯二酚的标定曲线。3 5 图4 1 0 不同干扰物对传感器检测邻苯二酚的干扰3 6 图5 1 铜绿假单胞菌对不同浓度铬的还原效果4 0 图5 2 固定铜绿假单胞菌对铬的还原效果4 2 表1 1e l i s a 和免疫传感器的部分文章4 表1 2 生物传感器检测代表性环境有毒物质的总结表4 表2 1 紫外分光光度计的结果1 9 表3 1 各种探针的碱基序列2 3 表5 1 各种固定化方法的比较见下表3 7 表5 2 用于六价铬的吸附材料及其吸附能力【i l 3 8 表5 3 不同处理下铬浓度的变化4 0 表5 4 固定化条件的选择4 1 i i i 硕七学位论文 第1 章绪论 生物传感技术是利用生物有机成分( 如酶、抗体、核酸、细胞、微生物等) 作为敏感 基元，对待检物质进行专一的识别产生的信号经过信号传导器转变为可以输出并加以程 序化定量的电信号、光信号进而检测出待测物质的量的一项新技术。其检测依据是基于 免疫学、酶学、生物化学、生物工程学、环境科学等多种理论。传感技术涉及电化学、 压电学、光学、声学等多个领域。整个原理可简化为：分子识别一特定结合_ 信号传导 和放大。 生物传感器被广泛应用于医学、食品、环境、军事等领域。相比于传统的检测技术 ( 色谱、质谱分析仪、原子分光光度计、光谱分光光度计等) 生物传感器具有选择性好、 灵敏度高的特点。生物传感器发展至今，其研究的一个重要方面也是热点就是如何更稳 定的发挥和加强它的以上特点。 材料科学尤其是纳米科技的运用，为生物传感器的发展打开了无限的空间。各种研究 报道证明：纳米材料在提高生物传感器的选择性灵敏度方面有着积极的作用。粒径在 1 1 0 0 n m 之间的纳米材料广泛用于构建生物传感器。此范围内的粒子有着独特的化学性 质和物理性质如表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等。各种纳米材 料应用于生物传感器后，提高了生物传感器的检测性能，并促发了新型的生物传感器。 与传统的生物传感器相比较，基于纳米技术的新型生物传感器已呈现出更优越的性能。 具有了亚微米尺寸的换能器、探针或者纳米微系统纳米生物传感器的化学和物理性质 对生物分子或者细胞的检测灵敏度大幅提高，检测的时间也得以缩短，并且可以实现高 效的在线分析。 生物传感器具有特异性强、效率高、灵敏度高等特点。基于抗原抗体的免疫识别 用于生物传感器能特异的检测出待测物质。交叉率极低。特异性通常能达到9 9 。由于 生物传感器都是以生物化学反应为基础，因此效率高。基于碱基互补配对的基因生物传 感器灵敏到能识别单个的错配碱基。虽然在重现性及多次使用方面生物传感器还存在一 些需要改进的地方，但是生物传感器的以上几大优点促使了科研人员对它的研究越来越 多，推动生物传感器不断的向前发展。 生物传感器种类繁多，可以从不同角度进行分类。一般从以下3 个角度来进行分类i l j ： 传感器输出信号的产生方式生物传感器中分子识别元件上的敏感物质生物传感 器的信号转化装置。如图1 所示： 磁性碳纳米管构建漆酶传感器及微生物固定技术的研究 图1 1 生物传感器的分类 目前生物传感器在医学、环境和食品领域有着广泛的应用。运用生物传感器来检 测环境中的有害物质有力的促进了环境生物技术的新发展。各种类型的生物传感器检环 境各种物质都有报道。虽然因为检测物质的不同，其制作有差异，但是其基本原理是相 同的，因此，通过综述其在环境中的应用，并以检测环境中痕量多环芳烃为例，和传统 的检测方法来对比，认识其优异性能以及存在的问题。 多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 作为一类优先污染物，广泛存在 于环境中。一方面是各种矿物燃料( 煤、石油、天然气等) 、木材、纸以及其他含碳氢化 合物的不完全燃烧或者是在还原条件下热解形成的。另一来源是火山活动和自然界植 物、微生物的合成。据报道【2 j ：燃烧的香烟中就能检测到3 0 0 种以上的p a h s 。他们数 量多、分布广、具有低水溶性、高亲脂性、辛醇水分配系数高、难以降解、在环境中 有一定残留水平的特点。随着苯环数量的增加其脂溶性增强水溶性变小在环境中存在的 时间延长毒性变大潜在危害也越大。作为一类持久性有机污染物多环芳烃类化合物有较 强的致突变致癌和致畸的三致作用。目前在人类已经发现的5 0 0 多种致癌作用的化合物 中有2 0 0 多种为p a h s 及其衍生物【3 】。并且它们容易通过食物、水、空气等介质进入人 体对人体健康产生很大危害。因此面对这些普遍存在危害大的物质如何突破传统方法效 率低检测设备要求高的局限建立一种高效准确的监测和检测多环芳烃的方法变得尤为 重要生物传感技术的出现顺应了这种要求并且为多环芳烃的检测打开了一个新的方向。 1 1 传统检测方法 传统的检测环境样品中的p a h s 主要包括样品的预处理和测定两个基本过程。样品 的预处理目的是浓缩待测样品同时尽可能的除去其他干扰物质。其处理效果直接关系着 测定结果的准确度和精确度。常用的预处理方法有液液萃取固相萃取和超声波辅助萃 取等【4 羽。 2 硕士学位论文 液液萃取是依据p a h s 在不同有机溶剂中的溶解度不同来进行的此方法原理简单但是 需要大量的超纯溶剂多步转移费时费力重复性差。固相萃取的优点是快速简单无溶剂乳 化的现象操作也安全缺点是固相萃取柱的直径小因而限制了流量的增大。利用超声波能 强化溶剂的萃取效果的原理而发展的超声波萃取法也很常用。虽然该方法快速、省溶剂 但是对仪器设备和操作人员要求高因而限制了它的广泛应用。 目前p a h s 的常规检测方法为高效液相色谱法( h p l c ) 【7 j 。但是面对p a h s 的同分异构体 如：如苯并【a 】葸、苯并【k 】荧葸、苯并【b 】荧葸、苯并【j 】荧葸等此方法显得有些不足。 气相色谱法( g c ) 也是常用的方法之一。该方法对轻p a h s 分析有优势而在分析重p a h s 时就通常情况下填充柱气相色谱用于分析轻p a h s ( 分子量小于3 0 0 ) 。在分离重p a i l s 时 就需要高分辨率的色谱柱。色质联用法( g c m s ) 可以对待测物质提供准确的定性和定量 分析对于气体中p a h s 检测限可达p g m 3 t 8 】但是仪器设备复杂昂贵而且只能分析具有挥 发性和热稳定性的物质。此外核磁共振色谱法、傅立叶红外转换法等也被用来检测多环 芳烃。 以上这些方法有其各自的优点但是也存在一些共同的缺点。主要是所用的设备昂贵 操作过程繁琐样品常常需要繁杂、冗长的萃取、提纯、浓缩、色谱分离等步骤耗费时间 而且试剂用量大、费用高。尤其是在分析生物样品时这类方法更显得有些不足。生物传 感技术的出现和应用给多环芳烃的分析和检测带来了广阔的前景。 1 2 生物传感技术应用于环境中及痕量p a h s 的检测 生物传感技术在环境领域有着广泛的应用。酶传感器、免疫传感器、d n a 传感器 等各种传感器被用来检测环境中的有害有机物、重金属、病原微生物等。z h a n g 等 9 1 用 f e 3 0 4 - s i 0 2 核壳磁性纳米颗粒和磁性碳糊电极制作了漆酶生物传感器来检测堆肥样品 中的对苯二酚。其检测下限可达1 5 1 0 一m o u l 。t a n g t l 0 】等利用伴刀豆蛋白a 与糖蛋白 的特异性吸附将辣根过氧化物酶层层吸附( 该实验中为四层) 在玻碳电极表面制作了测定 苯肼的可逆抑制型酶传感器。从酶联免疫技术基础发展的免疫生物传感器广泛用于除草 剂、杀虫剂的检测【u 。1 3 1 。而以核酸分子杂交为基础的d n a 生物传感器可以用来测定d n a 的浓度或者是识别部分碱基的排列顺序确定微生物的种属这是一般生物传感器所不具 备的特征。 正因为这些生物传感器的应用和不断发展该技术也逐渐成熟基于该技术来检测环境中 的多环芳烃的传感器也不断出现并且生物传感器的应用给p a h s 的检测开辟了一个新的 方向下面将重点介绍。 1 2 1 免疫传感器和分子印迹技术 免疫生物传感器用于环境中污染物的检测，是基于抗原抗体之间的特异性反应来进 行的。近年来免疫传感器不断发展，各种农药、抗生素、有机有毒物质、环境中的代表 性污染被用做半抗原，在此基础上合成相应的抗体用于免疫传感器。下面几个表简单的 列出了免疫传感器和e l i s a 的应用及科研人员和科研机构对免疫传感器的研究【1 4 1 。 磁性碳纳米管构建漆酶传感器及微生物固定技术的研究 表1 1e l i s a 和免疫传感器的部分文章 1 9 8 0 2 0 0 4 年e l i s a 和免疫传感器的文章 关键词 发表 作者 作者l 作者2 作者3 研究 机构 机构l 黄曲霉毒素+抗生素 7 5 9 c h uf s1 6 s a n t e l l ar m1 2 g r o o p m a nj d9 2 5 5 8 4 0 3 3 6 3 m a r t l b a u e re8 s t a n k e r l h 8 e l i s ai m m u n o a s s a y 莠去津d i o x i n * 4 3 8 9 7 1 h o c k b 4 1 u s l e b e re8h a m m o c kb d2 7 1 0 1 23 0 8 9 9 3 1 2 h a m r a o c k b d1 0 g e e s j8 ( 3 ) 6 1 4 4 内分泌干 扰物 3 3 1 4 5 h o c k b3 ( 1 5 ) 2 5 5 u s d aa r s2 0j o h nh o p k i n su n i v1 4 t e c hu n i vm u n i c h4 2u n i vc a l i fd a v i su n i v 1 6 b 盯g e n3 机构2 u n i vw i s c o n s i n1 8 u n i vm u n i c h1 4c s i c2 8u n i vc a l i fu n i v b e r g e n6( 7 ) 2 机构3 c o l u m b i au n i v1 2h a r v a r du n i vl1d a v i s2 8c s i c5 作者 作者1 作者2 作者3 研究机 构 机构l 4 l3 71 3 38 941 5 64 1 4 ( 9 ) 1 c a d d e l l a1 a r u k w e a 4 5 ( 5 ) l c o o p e r k ml e l l i o t c tl 2 q u e e n su n i v b e l f a s tl f r a n e k m 4 g o k s o y r a 4 5 6 g o k s o y r al o f r a n e k m 9 m a s c i n im 6 1 6 8 ( 5 ) 2 7 u se p a1 2u n i vc a l i f d a v i s4 机构2v e ts c id i v1 m o s c o wl o m o n o - s o vs tu n i v4u n i vb e r g e n1 0 h u n ga c a ds c i2 机构3 o d e n s e u n i v 4v e t r e s i n s t 9 ( 5 ) l v e t r e s i n s t 4 4 硕十学位论文 作者 作者 作者 5 7 n i k o l e l i sd p6 k r u l lu j3 3 1 3 s t e r n e s j oa6 c r a u d i n v 4 作者 m a r a g o sc m 3m a s c i n ig u s t a v s s o ne 4 m3 研究机2 21 0 9 构 2 8 3 n i k o l e l i sd p7 s k l a d a lp 6 4 44 l ( 4 4 ) 1 h o c kb2k i l nb w 2 g a u g l i t zg5h o c k s e i f e r tm2 b5 1 1 2 1 71 7 机构u n i va t h e n s6s w e d i s hu n i v a g r u n i va t h e n s7 k y u s h uu n i v s u n g k y u n w a nu n i v s c i622 机构u n i vt o r o n t o3b i a c o r ea b4 m a s a r y ku n i v6( 1 6 ) 1( 1 6 ) 1 塑纽塑型兰2 垒垒墨兰：望翌i ：! 尘垒盟垒g ! 兰【尘! 关键词 呋喃唑酮 发表1 作者3 作者a b u z u h r i al 作者 作者 研究机构 机构 机构 机构 关键词 d i a b n l s c h u h m a n nwl 2 a r a ba m e l u n i vl r u h r u n i v b o c h u m l 生物传感器和 硝基呋喃 l 3 m e r i n o ml n u n e z - v e r g a r al j1 s q u e l l aj a1 l 壬基苯酚 7 3 0 ( 5 ) 2 p c b 2 5 7 0 m a s c i n i m 4 b a r c c l o d 3 m a r c o m 咿3 l l2 6 u n i v c h i l e a r i a k e n a t ic o i lu n i vf l o r e n c e4 t e c h n o l2 n a g a s a k iu n i v2 c s i c3 生物传感器和 发表 2 9 作者9 7 u n i v c a l i f s u r f a r r a n t * 1 2 5 3 8 3 a z i n e s i m a z i n e 6 7 2 0 2 苯氧乙酸 o 2 1 2 堡垄：!e l 宝! 墨! 竺垒z坚! 盘2 兰y 鲤量i 巴璺!鉴! ：! ! ：q ! ! 鳘竖【1 2 21 5 磁性碳纳米管构建漆酶传感器及微生物固定技术的研究 作者2 作者3 研究机构 机构l 机构2 t h o m p s o nr b 7 m a l i w a l b p5 3 4 h u n f7 r e s h e t i l o va n7 1 2 2 u n i vm a r y l a n d7 u n i v - p c r p i g n a n2 r u s s i a na c a ds c i9u s n11 2 d u b l i nc i t y u n i v l r u s s i a na c a ds c il u n i v - m a n c h e s - t e r9 g c o c c n t e r si n cx a v i e ru n i vl 6 机构3 ( 3 ) 3 s o k a u n i v1 n a n j i n gu n i v8 l u n du n i v 4 u n i vn e w c a s t l eu p o nu n i va t h e n s4 此表中括号内的数字表示作者或者机构的数，旁边的数字代表该作者或者机构发表的与 此相关的论文。以上表格通过查询数据库d a t a b a s ew e bo f s c i e n c e 总结了1 9 8 0 2 0 0 4 年的 有关免疫试验方面的检测方法包括e l i s a 、i m m u n o a s s a y 、和生物传感器( b i o s e n s o r ) 。作 为新生的技术，生物传感器由于其优越的性能发展越来越快【1 5 1 。 制作免疫传感器，用于环境中有毒有害物质的检测，关键技术是抗体的制作和固定。 对于制作成功的抗体，其固定和酶固定的方法原则相似。因此其重点就转移到抗体的制 作了。相对分子量低于1 0 0 0 道尔顿的物质不具有免疫原性。多环芳烃本身不具备诱导 产生抗体的能力，必须与蛋白质结合才可以诱导针对小分子物质的抗体应答。通常p a h s 免疫传感器第一步是合成人工抗原。常用的载体蛋白有牛血清蛋i 刍( b s a ) 钥孔血蓝蛋白 ( k l h ) 和卵白蛋白( o qi t 6 1 。目前针对p a l - i s 的载体蛋白几乎都是b s a 。因为它的物化 性质稳定不易变性价廉易得而且b s a 的赖氨酸含量高自由氨基多可以提供多个交联基 团。在不同p h 和离子强度下b s a 均有较大的溶解度因而其适用范围大【1 。7 1 。p a h s 的水 溶性很差如常温下苯并【a 】芘在水中的溶解度为0 0 0 4 0 0 1 2 m g l 但是在有机溶剂下其溶 解度大大提高。b s a 在含有有机溶剂如吡啶、d m f 等情况下均可以和半抗原进行偶联 且在偶联后任可以保持可溶状态。 免疫生物传感技术用于检测环境中的p a h s 研究较早【1 8 】。和酶生物传感器及基因生 物传感器相比，检测p a i l s 的免疫传感器具有检测限低检测种类多制作简单等特点。既 可以直接利用抗原和抗体的结合反应引起的电信号或光信号的变化来进行检测也可以 使用用标记型传感器【1 9 】。其原理可用图2 简易表示。 光信号荧光检测 么印r a m 质量信号- q c m 信 号 检测 亡 检测 电赢 图1 2 免疫技术检测p a h s 示意图 6 目标物浓度 p i 8 脚 叫的 盯 0 2f l 萨d 4 圣 o o 硕士学位论文 f 山u - i c h t 2 0 】等将牛血清蛋白与己二酸双酰胼( a d i p i ca c i dd i h y d r a z i d e ) 交联后再与菲9 甲 醛( p h e n a n t h r e n e 9 c a r b o x a l d e h y d e ) 交联制备出用于免疫测定多环芳烃的抗原。 1 2 1 1 阵列型生物传感器 多环芳烃类物质在环境中通常是多种物质共同存在这就要求生物传感器能同时检 测多个样品并且尽可能减少免疫应答中的交叉反应。阵列型免疫生物传感器的出现满足 了这个要求。因为此类传感器结合了生物芯片阵列化的优点并且抗原抗体反应使得检 测的特异性也高。p a t r i c i af e r n a n d e z c a l v o 2 i 】实验小组运用多阵列竞争型免疫传感器测 定了不同分子量的p a h s 。通过把抗原捕获探针固定在载体上面当定量的抗体和不同浓 度的抗原物质反应后再和抗原捕获探针发生竞争反应。以抗体为示踪剂上面结合了荧光 素标记的蛋白质检测时荧光强度越高说明待测物质浓度越低留下足够的抗体和捕获探 针结合。该方法对小分子量的p a h s 萘( n a p h t h a l e n e ) 、对羟基苯酚( 4 p h e n y l p h e n 0 1 ) 和4 叔丁基苯酚( 4 - t e r t b u t y l p h e n 0 1 ) 的检测范围为0 1 0 5 m g l 。其优点是可以同时测定多个样 品。 1 2 1 2 非标记型生物传感器 基于表面等离子体共振免疫传感( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e 简称s p r i m m u n o s e n s o r ) 器来测定多环芳烃的报道也很多。o o b ikv e n g a t a j a l a b a t h y 2 2 j 构造了一个 高灵敏度的s p r 免疫传感器来检测苯并【a 】芘( b e n z o 【a 】p y r e n e 简称s a p ) 和2 一羟基联苯 ( 2 - h y d r o x y b i p h e n y 简称r m a ) 。把和b s a 偶联的b a p 、h b p 通过物理吸附作用固定在金 表面传感器芯片上不同浓度的抗原抗体结合物以流动式进样经过传感器表面。抗原抗 体分子的相互作用导致传感器表面折射率的变化从而引起共振角的变化进而反映出待 检测物质的浓度。该s p r 传感器对b a p 和h b p 检测范围分别是o 1 3 0 0 “g l 和o 1 - 1 0 0 0 p g l 。并且用胃蛋白酶溶液( p e p s i ns o l u t i o n ) 可以洗掉结合在金表面传感器的抗体使该传 感器在符合检测要求的范围类重复使用5 0 次。类似的还有利用物理吸附把抗原b a p b s a 固定在金膜传感芯片上使用s p r 作为信号传感器。其检测的线性范围为0 0 1 1 0 0 0 g l 并且不受h b p 的影响【2 3 1 。另外一种非标记型的免疫传感器一压电晶体传感器也被用来 检测p a h s 。其原理是利用石英表面负载质量的变化a m 与频率偏移f 的关系作为定 量检测的基础。文献 2 4 1 中先用硫辛酸( t h i o c t i ca c i d ) 修饰金膜石英晶体清洗干燥后再浸 入溶解有n 羟基丁二酰亚胺( n h y d r o x y s u c c i n i m i d e ) 和1 乙基3 - ( 3 二甲基氨丙基) 一碳化 二亚胺( e d c ) 的二甲基甲酰胺( d ) 溶液中4h 。经过处理的石英晶体在p b s t 缓冲溶 液下固定b a p b s a 抗原。采用竞争式免疫测定来检测b a p 。这类免疫传感器的特点是 其信号传导装置的灵敏度高抗干扰性强抗原抗体反应引起的微小变化都能被反映出 来。通过合适的进样装置该类免疫传感器有望用于空气中多环芳烃的实时、自动监测。 1 2 1 3 标记型生物传感器 在标记型生物传感器中常采用酶、荧光物质和金属离子来标记抗原或抗体。文献 【2 5 2 8 】对此有仔细报道。f a h n r i c h 等【2 9 】使用酶标记的一次性的丝网印刷电极制作了测定 7 磁性碳纳米管构建漆酶传感器及微生物固定技术的研究 菲( p h e n a n t h r e n e ) 的免疫传感器。用碱性磷酸酶标记的抗体和没有标记的抗体与固定在丝 网印刷电极上的抗原竞争反应采用了三种竞争模式：间接同暴露竞争法( i n d i r e c t c o e x p o s u r ec o m p e t i t i o na s s a y ) 、间接竞争法( i n d i r e c tc o m p e t i t i 0 1 1a s s a y ) 和间接置换法 ( i n d i r e c td i s p l a c e m e n ta s s a y ) 来检测碱性磷酸酶作用的底物为磷酸对氨基苯( p - a m i n o p h e n y lp h o s p h a t e ) 。其中效果最好的是间接同暴露竞争法其检测的最低限为0 8 “g l 。 l i u 3 0 l 等制作了高灵敏度的h r p 标记的生物传感器检测苯酚类物质。目前关于荧光和金 属离子标记的p a h s 免疫传感器还没有报道。首先是因为用生物传感器来检测多环芳烃 的研究本身就处于新兴阶段其标记物质集中在常用的酶上。另外这两种物质和抗原或抗 体的结合方法不如酶结合方法简单实验的可操作性要差些。但是用荧光物质或者是金属 离子标记的生物传感器具有检测限低灵敏度高重现性好的特点 2 5 ，2 8 】。和酶标相比用荧 光物质和金属离子标记不用担心标记物容易失活的问题也不容易引起抗体活性的改变。 这是检测多环芳烃的免疫传感器的发展方向之一。 1 2 1 4 分子印迹技术 前面总结的免疫传感器，他们的抗体都是通过动物免疫获得的。用动物免疫的方法 制作抗体，方法较简单但是周期较长，并且成功率难以保证。分子印迹技术的出现给抗 体的制作提供了另外一种选择。分子印迹聚合物是由一定模板指导合成的，有着高度的 亲和性和选择性。对不同的模板分子有着特定的结合位点，故可以作为传感器的分子识 别元件。通常为了获得最大的响应和最小的干扰或便于重复使用，一般将m m 传感器 的识别元件以膜或粉末形式通过适当的方式固定在转换器表面。分子印迹聚合物作为敏 感材料与生物敏感材料相比具有耐高温、高压、酸、碱和有机溶剂，不易被生物降解破 坏，可多次使用，稳定性好、寿命长、易于保存等优点。也被称为“塑料抗体”或“人工 抗体”1 3 l 朋j 。分子印迹技术有以下几大特点：预定性( p r e d e t e r m i n a t i o n ) 即它可以根据不 同的目的制备不同的m i p s 以满足各种不同的需要；识别性( r e c o g n i t i o n ) 即m i p s 是按 照模板分子定做的可特定地识别印迹分子；实用性( p r a c t i c i b i l i t y ) 耳p 它可以与天然的生 物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比拟，但由于它是由化学合成 的方法制备的，因此又有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能力，从而表现出 高度的稳定性和长的使用寿命。与生物识别元件相比分子印迹聚合物具有专一性强稳定 性好不需使用动物可大规模生产等优点。正因为分子印迹技术的优点使它在生物传感器 方面有了不少应用。 目前用分子印迹技术膜传感器测定的对象有氨基酸衍生物、吗啡、除草剂、有机溶 剂、神经毒剂水解产物、金属离子等。将分子印迹聚合物作为传感器的敏感部件然后通 过各种电、热、光、质等手段转换成可测信号可定量分析各种小分子有机化合物。g r a h a m 等j 利用分子印迹固溶胶技术建立了荧光探针传感器在显微镜下可根据荧光点数目检 测滴滴涕( d d t ) 的含量响应时间为6 0s 用完后用丙酮冲洗可反复使用。d h a m 等【3 4 】采用 分子印迹改性的悬汞滴电极选择性测定血清中的肌氨酸酐。由三聚氰胺和四氯苯醌制得 肌氨酸酐印迹聚合物避免了高度交联的网状系统使传感器的性能得到很大改善。l u o 等 p 刈以m i p s 为识别原件制作了新型厚度剪切模式声波传感器对除草剂阿特拉津进行检测 8 硕士学位论文 检出限为2 f m o f l 。考察了功能单体对传感器响应的影响优化了酸度和负载量该方法集 生物受体和印迹聚合物的优点于一身适用于集合传感器。 在农药检测方面l i a n g 等人【3 6 】将合成的分子印迹聚合物涂覆在压电体声波传感器 的电极上用于检测溶液中痕量二氯苯氧基乙酸( 2 4 d a ) 。在2 0 1 0 5 0 1 0qm o l l 的浓度范围内传感器与二氯苯氧基乙酸浓度具有对数响应关系最低检测限为1 0 1 0 。 7 m o l 1 ，加标回收率为9 3 2 1 0 8 7 j e n k i n s 等人利用分子印迹聚合物为敏感材料制 成的光纤传感器对水中农药进行了检测其最低检出限为o 0 ln g l 在lp g l l 嵋l 范围内有良好的线性关系响应时间为1 5m i n 。g o n g 等人p7 j 以氰戊菊酯( f e n v a l e r a t e 一 种高效广谱的菊酯类杀虫剂) 为模板分子以2 硫醇基苯骈咪唑为功能单体采用电聚合方 法在金电极上合成分子印迹聚合物膜并以十二碳硫醇( n - d o d e c a n e t h i 0 1 ) 消除聚合物膜上 的