（环境工程专业论文）紫茉莉对铅胁迫的响应及耐性研究.pdf

中南人学硕+ 学位论文 中文摘要 中文摘要 矿业废弃地的治理和植被恢复是我国面临的紧迫任务之一，也是 可持续发展战略优先关注的问题之一，而尾矿废弃地更是金属矿山最 常见、最难恢复的矿业废弃弃地，还存在潜在的环境风险。植物稳定 技术利用耐性植物的机械固定作用减轻风蚀和水蚀以及根系吸附和 根际沉淀作用实现尾矿的长期稳定，降低重金属的生物有效性，是一 种比较有前景的环境友好技术。在湖南湘潭和吉首等地矿区调查时发 现紫茉莉具有生长迅速、生物量大、适应性强等特点，是一种较为理 想修复重金属污染土壤的耐性植物。目前国内外关于紫茉莉在铅胁迫 下生理生态响应的研究较少，因此，开展紫茉莉铅胁迫下生理生态响 应和耐性机理的研究，将为其应用于重金属污染环境修复技术提供科 学依据，进而推动金属矿业废弃地植物稳定技术的商业化应用。 在大量野外调查的基础上，通过营养液培养实验，综合运用电感 耦合等离子体原子发射光谱仪、显微成像系统、透射电子显微镜技术、 傅里叶变换红外光谱分析技术等分析手段比较系统地研究不同浓度 铅胁迫条件下紫茉莉生物量和器官组织的变化、矿质元素的吸收和累 积、不同器官组织化学组分的变化规律，以期为铅污染场地植物稳定 提供理论依据。通过研究，取得以下主要结果： 1 紫茉莉不同器官组织对铅的吸收存在差异性，根系对铅的积累 最强，其次是叶、茎。随着生长介质中铅浓度水平的升高，根、茎和 叶组织铅含量呈增加态势。紫茉莉吸收的铅绝大部分都积累在植株的 根系部位，向地上部分转移量非常少，不同铅处理条件下茎叶的转移 系数均小于o 0 4 。这既可降低铅向植株地上部分( 茎、叶) 的迁移、 减轻铅对地上部分营养器官和生殖器官的毒害作用，又能将植株吸收 铅固定在根系部位，降低p b 的生物有效性。 2 不同铅处理条件下，紫茉莉根、茎和叶的大量营养元素含量 变化不大，并未随生长介质中铅浓度水平的升高呈明显降低，甚至部 分处理条件下出现一定程度的增加。c u 、m n 、z n 等微量元素在根、 茎和叶等器官的含量均呈现在较低铅处理浓度条件下逐渐升高，而 在较高浓度铅处理水平下呈下降趋势。在紫茉莉的整个生命周期内， 没有发现c a 、m g 、f e 等元素缺乏的现象，大量营养元素的稳态维持 可能是紫茉莉对铅胁迫具有较强耐性的一种反馈机制。 中南人学硕十学位论文 中文摘要 3 不同铅处理条件下，紫茉莉均能正常生长，即使在生长介质铅 含量高达到1 0 0 0g m o l l - 1 时，紫茉莉仍然能够完成整个生命周期， 生物量与对照植株相比没有显著差异。在2 0 0g m o l l d 铅胁迫条件下 紫茉莉的根部组织结构与对照相比无显著差异；当铅含量达到1 0 0 0 g m o l l 。1 时植株的根部疏导组织虽然出现了一定程度的减少，但是表 皮、皮层、中柱维管组织未发生明显变化，而叶片组织结构基本没有 受到影响。这表明紫茉莉有较强的铅耐性，使其有应用植物稳定技术 修复铅污染环境的潜力。 4 傅立叶变换红外光谱分析研究发现，紫茉莉根部某些羧酸、糖 类、蛋白质、氨基酸等物质含量出现波动，在中低浓度铅处理下升高， 在高浓度下下降，如在2 9 2 0c m 。1 处羧酸的峰高在2 0 0g m o l l 1 铅处 理前上升，在5 0 0g m o l l 。开始下降。这些物质能够螯合和络合重金 属，降低重金属在植物体内活性，可以明显增强植物对重金属的耐性。 在不同铅处理水平条件下，紫茉莉茎和叶中羧酸、糖类、蛋白质、氨 基酸等物质含量差异不显著，这可能是由于紫茉莉吸收的铅主要集中 在根系部位，向植株地上部分( 茎、叶) 转移少的缘故。 关键词：植物稳定，紫茉莉，铅，耐性 中南人学硕+ 学位论文a b s t r a c t a bs t r a c t e n v i r o n m e n t a lm a n a g e m e n ta n dr e h a b i l i t a t i o no fm i n ew a s t e l a n di s o n eo ft h e p r e s s i n gn e e d s t ob ea d d r e s s e df o rs o c i a la n de c o n o m i c d e v e l o p m e n tt ob eh e a l t h ya n ds u s t a i n a b l ei nc h i n a t a i l i n gw a s t e l a n d f r o mm e t a l l i f e r o u sm i n e so f t e np o s e st h ee x t r e m es t r e s s f u lc o n d i t i o n sa n d i st o u g h e rf o re c o l o g i c a lr e s t o r a t i o n a san e w l ye m e r g e de n v i r o n m e n t f r i e n d l yt e c h n o l o g y , p h y t o s t a b i l i z a t i o ni sd e f i n e da st h eu s eo fm e t a l t o l e r a n tp l a n ts p e c i e st or e d u c et h em o b i l i t ya n db i o a v a i l a b i l i t yo fh e a v y m e t a l si nt h es u b s t r a t e se i t h e rb yi m m o b i l i z a t i o no rb yp r e v e n t i o no f m i g r a t i o n c o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a lm e t h o d s ，p h y t o s t a b i l i z a t i o ni s a c o s t - e f f e c t i v ea n de n v i r o n m e n t f r i e n d l yt e c h n o l o g y m i r a b i l i s j a l a p al i n n i sap l a n tf o u n di nx i a n g t a na n dj i s h o ut a i l i n gw a s t e l a n d t h e r ea r el e s s r e s e a r c h e so nt h et o x i c i t ya n dt h et o l e r a n c em a c h a n i s m so fm j a l a p at o l e a du pt on o w a n dt h i sw o u l dr e s t r a i ni t s a p p l i c a t i o no np h y t o s t a b i l i z a t i o n t oe l u c i d a t es y s t e m a t i c a l l yt h e c h a n g i n go fb i o m a s sa n do r g a n s t i s s u es t r u c t u r e ，t h eu p t a k ea n da c c u m u l a t i o no fm i n e r a le l e m e n t sa n dt h e a l t e r a t i o no fc h e m i s t r yc o m p o n e n t si nm 。j a l a p ao r g a n st od i f f e r e n tl e a d s t r e s s ，h y d r o p o n i ce x p e r i m e n tw e r ea p p l i e di nt h i ss t u d yb a s e do nal o to f f i e l ds u r v e yb ym e a n so fas e r i e so fi n s t r u m e n t a t i o n s ，s u c ha si n d u c t i v e l y c o u p l e dp l a s m ao p t i c a le m i s s i o ns p e c t r o s c o p y ( i c p o e s ) ，t r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) ，p a r a f f i n e m b e d d e dt i s s u es l i c ea n df o u r i e r t r a n s f o r mi n f r a r e d ( f t i r ) t h em a j o rr e s u l t so b t a i n e da r ea sf o l l o w s ： 1 t h ed i s t r i b u t i o no fl e a da m o n gr o o t s s t e m sa n dl e a v e si nm j a l a p ai sd i f f e r e n t t h ei c p o e sa n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h el e v e l so fp bi n r o o t s ，s t e m sa n dl e a v e so ft h ep l a n t si n c r e a s e dw h i l et h ec o n c e n t r a t i o no f p b 2 + i n c r e a s i n gi n t h ec u l t u r es o l u t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp b d i s t r i b u t i o ns e q u e n c ei s ：r o o t s l e a v e s s t e m s a n dm o s to fp bw a s a c c u m u l a t e di nr o o t s ，f e wp bw a st r a n s f e r r e di ns h o o t s ，m e a n w h i l et h e t r a n s l o c a t i o nf a c t o r 叶 茎( 表3 2 ) 。 中南人学硕十学侮论文第三章锚胁迫卜紫莱莉对铅和其它矿质元素的吸收和积累 表3 2 不同p b 处理对紫茉莉体内p b 积累量的影响 t a b l e3 - 2e f f e c t so f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f p bo np ba c c u m u l a t i o ni nm 扣t a p a 大量研究表明p b 进入植物体后绝大部分积累在植物根部，只有少量向地上 部移动。这与本研究结果一致，由表3 2 看出，紫茉莉根部铅浓度随着p b 处理 浓度的升高而升高，并且在1 0 0 0p m o l l 。1 处理下达到最大值9 3 1 3 3m g k g - 1 。紫 茉莉茎叶中铅含量要远低于根系，并且随着p b 处理浓度的升高而增加。这可能 是由于铅在植物体地上部分和根系分配不同，将紫茉莉吸收的铅主要积累在根 系，减轻铅对植物地上部分营养器官和生殖器官的毒害，相关研究有待进一步开 展。 转移系数( t r a n s l o c a t i o nf a c t o r , t f ) 反映植物将重金属从地下向地上的运输 和分配情况，它是指植物地上部分某元素的含量与地下部分该元素含量的比值 1 3 1 】。重金属主要通过植物根系吸收然后在植物体内分配，转移系数越小，说明 根系中重金属所占比例越大，地上部分所占比例越小，重金属通过根系向茎叶的 迁移能力越小。大量研究表明 8 9 1 3 2 1 3 3 1 ，植物将大部分p b 积累在植物根部，减 少和阻止对地上部分运输，是植物减轻对地上部分各器官的毒害作用，增强植物 耐性重要机制之一。本研究支持这一观点。从表3 3 中看出，紫茉莉地上部分各 器官茎和叶的p b 转移系数没有明显的变化趋势，但是p b 处理下p b 转移系数均小 于0 0 4 。进入紫茉莉植物体内的p b 很可能因为吸附、沉淀和钝化作用积累在根部， 造成p b 向地上部分运输困难。这也证明了紫茉莉对p b 有极强的耐性。同时，表 中各浓度p b 处理间叶的转移系数均高于茎的转移系数，说明p b 在叶中的积累要 高于萃。 中南人学硕十学位论文第二章铅胁迫。卜紫茱莉对铅祠l 其它矿质元素的吸收和积累 表3 - 3 不同p b 处理下紫茉莉p b 的转移系数 t a b l e3 - 3t r a n s l o c a t i o nf a c t o ro f p bi nm j a l a p ao f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f p b 3 3 2 不同铅胁迫条件下紫茉莉对c u 、m n 、z n 的吸收和累积 1 4 0 1 2 0 1 0 0 鳖8 0 曼6 0 暑 u 4 0 2 0 02 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 0 p bc o n c e n t r a t i o n ( 1 j lt 0 0 1 l 。1 ) 图3 3 不同铅处理下紫茉莉中铜的含量 f i g 3 3e f f e c t so fd i f f e r e n tp bt r e a t m e n t so nt h ec o n c e n t r a t i o no fc ui n 肱和t a p a ( v e r t i c a lb a r sr e p r e s e n t - 1 - s t a n d a r de r r o r ) 铜、锰和锌是植物正常生长所必需的微量元素，是植物体内多种氧化酶的组 成成分。铜参与植物的呼吸作用，影响到作物对铁的利用，还与叶绿素形成有关。 铜可以提高叶绿素稳定性，避免叶绿素过早遭受破坏，这有利于叶片更好地进行 光合作用。缺铜能影响蛋白质的合成，使氨基酸的比例发生变化；缺铜可抑制光 合作用的活性，使叶片畸形和失绿；缺铜会抑制木质化，使叶、茎弯曲和畸形， 木质部导管干缩萎蔫；缺铜还会使繁殖器官的发育受到破坏。 c u 在紫茉莉根茎叶中的含量为根 叶 茎，浓度范围在1 6 5 1 1 8 2m g k g - 1 ， 紫茉莉根中c u 含量远高于茎叶，这表明c u 从地下部分向地上部分的移动性较低。 2 6 中南人学硕：f ：学位论文第三章铅胁迫。卜紫茱莉对锚和其它矿质元素的吸收和积累 同时c u 在紫茉莉各器官中的含量都呈现出在低p b 处理下升高，在中高度p b 处理 下呈现出下降的趋势( 图3 3 ) 。 卫 1 2 0 0 昌 皇 窆8 0 0 4 0 0 02 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 0 p bc o n c e n t r a t i o n ( ut 0 0 1 l 1 ) 图3 _ 4 不同铅处理下紫茉莉中锰的含量 f i g 3 _ 4e f f e c t so fd i f f e r e n tp bt r e a t m e n t so nt h ec o n c e n t r a t i o no fm n i nm j a l a p a ( v e r t i c a lb a r sr e p r e s e n t4 - s t a n d a r de r r o r ) 锰的主要生理功能有：( 1 ) 放氧复合体组分；( 2 ) 酶的活化剂，如转磷酸基 酶，脱氢酶，硝酸还原酶，二肽酶；( 3 ) 叶绿素生物合成的必需因子。缺锰症状 首先出现在新梢叶，叶脉问黄化而呈淡绿色，仅与中肋及主要叶脉邻接部分仍保 持绿色而呈宽窄不一深绿色带。严重缺乏时，叶脉转为灰暗绿色，叶肉仍保持淡 绿色或转灰白，症状持续至生长后期仍不消失，出现长短不一线状褐斑，叶片变 薄，萎垂。由图3 4 看出，m n 在紫茉莉根茎叶中的含量为2 8 9 2 1 7 3 1 3m g k g - 1 ， 且m n 在紫茉莉根茎叶中的含量为根 叶 茎，大部分m n 集中在紫茉莉根部， 而且m n 在紫茉莉各器官中的含量都呈现出在中低浓度p b 处理下升高，在高浓 度p b 处理下下降的趋势。 植物中锌的主要生理作用：酶的组分，如色氨酸合成酶，碳酸酐酶。锌缺乏 症状首先出现于新稍叶片，症状因作物种类而略有不同。一般而言，中度至严重 缺乏时，叶片小而畸形，节间缩短呈小叶簇生状有些作物尚伴有叶片黄化症状， 叶脉间黄化而呈黄绿色，但与叶脉紧邻部分则保持绿色。从图3 5 可见，z n 在 紫茉莉根茎叶中的含量为根 叶 茎，浓度范围在5 8 4 3 2 0 6m g k g - 1 ，紫茉莉 根中z n 含量远高于茎叶，这表明z n 从地下部分向地上部分的移动性较低。同 时z n 在紫茉莉各器官中的含量都呈现出在低p b 处理下升高，在中高度p b 处理 下下降的趋势。 2 7 中南人学硕十学位论文第三章铅胁迫。卜紫菜莉对锚和其它矿质元素的吸收利积累 3 5 0 3 0 0 璧2 5 0 邑2 0 0 盘 n 1 5 0 1 0 0 5 0 02 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 0 p bc o n c e n t r a t i o n ( 1 j lt o o l l 1 ) 图3 5 不同铅处理下紫茉莉中锌的含量 f i g 3 5e f f e c t so f d i f f e r e n tp bt r e a t m e n t so nt h ec o n c e n t r a t i o no f z ni nm j a l a p a ( v e r t i c a lb a r sr e p r e s e n t4 - s t a n d a r de r r o r ) 3 3 3 不同浓度铅处理下紫茉莉体内c a 、m g 、f e 的含量 c a 是维持膜透性和细胞完整性的基本元素，以c a 2 + 的形式被植物吸收，是 植物细胞壁胞间层中果胶钙的组成成分，主要以草酸钙、柠檬酸钙等钙盐形式存 在，是许多生理生化反应过程的主要调控者，具有解毒和稳定生物膜的作用【1 3 4 】。 通常一般植物叶片中c a 含量约为2 - 5 0 9 k g ，皱叶是植物c a 缺乏的典型症状 1 3 5 】。但是从表3 4 看出，紫茉莉叶片中的c a 含量在各浓度梯度p b 胁迫下均保 持在2 0g k g 1 左右，在整个生长周期内均未出现c a 缺乏的现象。且植物各器 官中茎的c a 含量最低，而在中低浓度p b 胁迫下根中c a 含量最高，高浓度p b 胁迫下叶中c a 含量最高。 m g 是植物叶绿素的重要组成成分，植物体内的大部分m g 均存在于叶中。 通常一般植物叶片中m g 含量不低于1 5g k g l ，缺m g 会影响植物的正常发 育 1 3 5 。随着p b 浓度的增加，紫茉莉叶中m g 含量没有减少，相反有一定升高 的趋势。而茎和根中m g 含量变化趋势不明显。在整个生长周期内，植物各器官 中m g 含量都远高于缺m g 水平。紫茉莉各器官中m g 含量为：叶 茎 根。 中南人学硕l ：学位论文第二章铅胁迫卜紫菜莉对钟怫l 其它矿质元素的吸收和积累 f e 作为植物必需的营养元素，对于调节植物体渗透压、维持代谢平衡、物质 合成等生理生化过程中都有着重要作用。通常一般植物中f e 含量低于5 0g k 9 1 时认为该植物缺铁【1 3 6 1 。紫茉莉根中f e 含量最高。随着p b 浓度的增加，紫茉莉根 中f e 含量有明显减少，但都高于植物的缺铁阈值。而紫茉莉茎叶中f e 含量随p b 胁迫浓度的增加变化不明显，均高于植物的缺铁阈值。 3 4 讨论 p b 是植物生长的非必需元素，而且是一种毒性较强的重金属元素。当它在植 物体内积累到一定阈值，就会对植物产生一定的毒害作用，轻则使植物体内的代 谢过程发生紊乱，生长发育受到抑制，重则导致植物死亡。王慧忠等研究则指出， p b 可引起草坪植物根量减少，根冠膨大变黑、腐烂，导致植物地上部分生物量的 下降，叶片失绿明显，严重时逐渐枯萎、植物死亡【l3 7 】。因此，耐p b 植物是矿冶 p b 废弃地植物稳定技术的关键。而紫茉莉作为p b 的一种耐性植物，其耐p b $ j l 理 2 9 中南人学硕十学位论文第二章铅胁迫卜紫茱莉对铅和其它矿质元素的吸收利积累 的研究对于紫茉莉在尾矿废弃地的生态修复中的应用显得尤为重要。 江行玉等研究了芦苇在p b 胁迫下的生理反应和耐性机理，其结果显示根部比 地上部分积累较多的p b 是芦苇抗p b 胁迫的一种重要机制【8 9 1 。倪才英等在研究紫 云英对重金属胁迫的响应时指出，p b 被紫云英吸收后主要分布于紫云英根部1 1 3 引。 刘云国等在研究东方香蒲在矿山尾矿p b 污染植物修复技术指出，无论是尾矿地实 生还是营养液培养的东方香蒲，植物体内p b 大部分都存在于植物地下部分，p b 的转运系数都远小于l 【1 3 9 1 。本试验研究结果表明，紫茉莉各组织器官对p b 的吸收 存在差异性，根系对p b 的积累最强，其次是叶、茎。并且随着p b 处理浓度的升 高，各部分p b 浓度升高。但是紫茉莉吸收的p b 绝大部分都积累在根部，向地上 部分转移量非常少，各处理浓度下茎叶的转移系数都小于0 0 4 ，这有利于减囊j p b 对紫茉莉地上部分组织器官的毒害作用，提高紫茉莉对p b 的耐性。 c a 、m g 、f e 是植物必需的大量营养元素，它们的吸收，转运都反映着植物 的营养平衡和健康状态。这些元素的代谢可以作为研究植物对重会属耐性的机理 之一。曹福亮等在银杏对铅的污染生理响应和耐性研究中发现，铅胁迫对银杏各 器官中k 、c a 、m g 含量产生了显著的影响，银杏叶、茎中积累的p b 严重地抑制 了m g 的吸收。在根中则抑制k ，m g 的吸收，使生长代谢发生紊乱，发育受阻而导 致生物量增量的下降【1 3 4 1 。徐向华等在超积累植物商陆( 垂序商陆) 吸收累积锰 机理研究中指出，在高锰处理下，垂序商陆体内的c a 、m g 和f e 浓度显著降低， 但都维持在正常水平，垂序商陆对锰的超积累和耐性可能与其具有维持必需养分 元素浓度在正常范围内的能力有关【1 4 。在我们的研究中，紫茉莉无论是在中低 浓度，还是高浓度p b 胁迫下，c a 、m g 、f e 这些大量营养元素含量并没有出现明 显减少，有的甚至出现了一定的增加。在紫茉莉的整个生长周期内，都没有发生 c a 、m g 、f e 元素缺乏的现象。这些大量营养元素的稳态维持显示了紫茉莉对p b 胁迫具有较强的耐性。 同时，我们研究了p b 胁迫下紫茉莉对非大量元素c u 、m n 、z n 的吸收和 累积。c u 、m n 、z n 在紫茉莉各器官中的含量都呈现出在低p b 处理下升高，在 高度p b 处理下下降的趋势，且这些元素大部分都集中在紫茉莉根部，向地上部 分运输极少。c u 、m n 、z n 既是植物生长必需的微量营养元素，也是能影响植物 生长发育的重金属元素。，一些研究表明复合污染下有的重金属元素的吸收表现 为协| 一j 作用，有的则表现为拮抗作用。复合污染下紫茉莉的重金属的吸收和累积 机制有待于进一步研究。 因此，p b 胁迫下将大部分p b 截留在根部，极低的转运系数，极强的自我 调节养分平衡能力，是紫茉莉耐p b ，抵御p b 毒害的重要机制之一。在我们的研 究中，大量的铅进入了紫茉莉根部，有研究表明，植物对重会属的吸收和耐受性， 3 0 中南人学硕十学位论文第二章锚胁迫。卜紫莱莉对铅和其它矿质元素的吸收和积累 与重金属在植物体内各部位的分配以及与植物体内物质的结合状态等密切相关。 b r o w n 认为植物对铅的耐性主要是由于植物所吸收的大部分铅分布于细胞壁而 没有进入细胞内【1 4 1 1 ，以细胞壁为主体的非原生质体部分是植物中的“死组织”， 其生理代谢活动水平低。江行玉等用x 一衍射一电镜扫描技术测定了芦苇幼苗根皮 层细胞的细胞壁、细胞质、液泡以及细胞间隙中的铅含量1 8 9 1 ，结果表明用l o m m o l l p b 处理的芦苇幼苗根细胞的细胞壁、细胞质、液泡和细胞间隙中则积累 了大量的铅，其中细胞间隙中铅含量最高，细胞壁和液泡次之，细胞质中的最低。 铅在植物体内以6 种化学形态存在，这是根据不同提取剂按顺序提取来区分的， 不同提取态铅的溶解难易程度依次由低到高。那么进入紫茉莉根部铅的分布，以 及进入植物细胞的铅的化学形态，及其与紫茉莉耐性的关系有待于进一步研究。 3 l 中南人学硕十学位论文 第四章紫茱莉对铅胁迫的生理响应 4 1 引言 第四章紫茉莉对铅胁迫的生理响应 重金属进入植物体内后，可能损伤重要的组织、细胞和细胞器，从而影响植 物的j 下常生长，甚至导致植物死亡。目前发现的耐性植物或超富集植物大多生物 量小，且生长缓慢。有研究将这一特性解释为植物要利用大量能量，甚至牺牲部 分植物器官来抵御重金属的毒害。紫茉莉( m i r a b i l i s j a l a p al i n n ) 是一种优良的 重金属耐性植物，具有生长迅速、适应性强等特性。本研究通过不同浓度铅胁迫 下紫茉莉生物量变化规律，各植物器官组织变化和发育情况，以及不同组织器官 化学组分变化的f t i r 研究，探讨紫茉莉耐铅机理以及耐铅能力。 4 2 材料与方法 4 2 1 研究材料 地。 试验植物为紫茉莉，种子采自湖南省吉首市花垣县铅锌矿周围的矿业废弃 4 2 2 营养液培养 将尾矿废弃地采集紫茉莉种子播种于装有洗净细砂的花盆中育苗。待幼苗萌 发两周后，选取生长一致的紫茉莉幼苗，将根部用去离子水洗净，移入装有2 0l 完全0 5h o a g l a n d 营养液的外壁不透光的塑料盆中。设定6 个处理，p b 的浓度 分别为0 、5 0 、1 0 0 、2 0 0 、5 0 0 、1 0 0 01 t m o l l 一。p b 以硝酸p b 的形式加入，每 个处理设三个重复。每4 d 换一次营养液，保持p h 值在5 5 左右，保持连续通气。 植物在3 5 d 后收获，用去离子水洗净，称重，分别取根、茎、叶三部分于1 0 5 杀青3 0m i n ，然后于7 5 烘箱中干燥4 8h ，用万能粉碎机粉碎，过2 0 0 目筛。 4 2 3 植物样品石蜡切片 ( 1 ) 材料的杀死和固定 选取各处理梯度的紫茉莉根、叶的相同部位，用刀片将根切成o 5c l t i 的小 3 2 中南大学硕士学位论文第四章紫茉莉对铅胁迫的生理响应 段，叶片切成含中脉的lc m 0 5c m 的小块，放入f a a 固定液中，固定2 4h 。 ( 2 ) 脱水、透明和浸蜡 材料经7 0 乙醇、8 0 乙醇、9 0 乙醇、9 5 乙醇、1 0 0 乙醇、1 0 0 乙醇、 1 2 乙醇+ l 2 二甲苯、纯二甲苯、纯二甲苯，其中在7 0 至9 5 乙醇中各1 5k 1 0 0 乙醇1h ，乙醇和二甲苯混和液lh ，纯二甲苯3 0m i n ，换完第二次二甲苯 后，可加入少许石蜡，3 7 过夜，第二天换入纯石蜡中，于6 0 烘箱中浸蜡， 每隔2 h 换一次石蜡，换3 次后待包埋。 ( 3 ) 包埋 将熔融的石蜡倒入预先叠好的小纸盒中，加热解剖针沿纸盒的边缘轻轻移 动，以除去石蜡中的气泡，然后将材料所需的切面放好，材料间有一定的距离， 待材料表面凝固一薄层时，将纸盒放入冷水中，待表面全部凝固后，将纸盒全部 压入水中。等石蜡全部凝固后，将纸盒从水中捞出。 ( 4 ) 切片、粘片 选取要切的材料，用刀片将蜡块修成梯形，粘于载蜡器上，用手摇切片机切 成厚约为1 3g r n 的蜡片，用蛋白甘油粘在载玻片上，3 8 * c - 4 0 的恒温台展片， 然后在酒精灯上稍微来回略过烘片。 ( 5 ) 脱蜡，复水 将固定有材料的载玻片放入二甲苯中脱蜡4 0m i n ，再经过乙醇和二甲苯混和 液lh ，1 0 0 乙醇1h ，其中在7 0 至9 5 乙醇中各1 5l l 纯二甲苯，1 2 乙醇+ 1 2 二甲苯，1 0 0 乙醇，9 5 乙醇，9 0 乙醇，8 0 乙醇，7 0 乙醇，纯净水逐级复 水。 ( 6 ) 染色、封固 将装片在染色槽内用番红染色，洗净后用固绿在染色，透明装片。于3 8 烘箱内烘片，制成永久装片。 ( 7 ) 显微镜观察、拍照。 用显微摄像系统对植物石蜡切片其进行观察和拍照。 4 2 4 植物样品傅里叶变换红外光谱分析 红外光谱广泛应用于有机化合物的定性鉴定和结构分析以及定量分析。因为 红外吸收带的波长位置与吸收强度反映了分子结构上的特点，故可以用来鉴定未 知物的结构组成或确定其化学基团；而吸收谱带的吸收强度与分子组成或其化学 基团的含量有关，故可以进行定量分析和纯度鉴定。 将1g 试样与1 0 0g 纯k b r 研细均匀，制于模具中，压成透明薄片，压力 3 3 中南人学硕士学位论文第四尊紫茉莉对钳胁迫的生理响应 2 6 m p a ，在相同条件卜，应用f r i r 仪( 美国n i c o l e t 公司n e x u s6 7 0 ，光谱范罔 4 0 0 0 4 0 0c m ，分辨率1c m 。) 测定紫茉釉各组织器官光谱信息。 4 25 数据处理 实验数据采：| j s p s s ( v 1 30 ) 和m i c r o s o f te x c e l2 0 0 3 进行分析，井采用 o r i g i n ( 70 ) 进行红外光谱数据图谱处理。 4 3 结果与分析 43l 铅胁迫对紫茉莉生物量的影响 从外观看( 网4 - 1 ) ，在不同浓度p b 处理的生k 介质中，紫茉莉均能j e 常 生长，各处理问植物生物帚变化不人。专生长介质巾铅供应水平返到1 0 0 0 p m o ll1 时，紫茉莉叶片微卷，世仍能完成整个牛命周期( 开花、结果) ，这i 叮 能是因为在高浓度p b 的胁迫r ，大量p b 被植物吸收后富集在根部的一种反馈 机制。由图4 2 可见，小h 浓度p b 处理条什下，紫茉莉牛物量差片性不显著， 这表明紫菜耥对定浓度p b 胁迫有较强的耐性。 1 囤4 _ l 不同浓度p b 处理对紫菜莉生长的影响 f i g 4 一ie f f e c t s o f d i f f o a t n m l b o f p b t h e g r o w t h o f m d a p a 中南大学硕士学位论文 第四章紫茉莉对铅胁迫的生理响应 p b 5 0p b1 0 0p b 2 0 0p b 5 0 0p b10 0 0 处理浓度邮l l 1 图牛2 不同浓度p b 处理对紫茉莉生物量的影响 f i g 4 - 2e f f e c t so fd i f f e r e n te o n e e n u a t i o n so fp bo nt h eb i o m a s so f m j a l a p a 4 3 2 铅胁迫对紫茉莉生长发育的影响 紫茉莉根横切由外及里依次为表皮、皮层( 外皮层、皮层薄壁细胞和内皮层) 、 中柱维管组织( 中柱鞘、初生木质部、初生韧皮部和薄壁细胞) 。当生长介质铅 供应水平为2 0 0g m o l l - 1 时，紫茉莉根表皮细胞形状较为细小统一，排列紧密， 与皮层细胞分界明显；皮层薄壁细胞排列紧密，没有出现破裂的现象。与对照植 株石蜡切片相比，未出现明显差异，但是p b 胁迫条件下的根部疏导组织出现了 一定的减少。1 0 0 0l a m o l l jp b 胁迫的根切片的表皮细胞形状依然规则，排列紧 密；皮层细胞形状较为规范，与中柱维管组织分界明显可见；中柱鞘细胞未发生 破裂，变形。与对照和2 0 0l m a o l l 1p b 胁迫的根部相比，根部疏导组织出现了明 显的减少。但是导管没有出现变形、破裂的现象。 紫茉莉叶的内部结构由表皮，叶肉组织和叶脉组成。叶表皮分为上表皮和下 表皮；叶肉细胞由近腹面的栅栏组织叶肉细胞和近背面的海绵组织细胞组成，它 们都是含有叶绿体的薄壁细胞；叶脉实际上是叶的维管束，常伴有细胞壁增厚的 厚角细胞或厚壁细胞，以加强叶片的支持力量，叶的维管束与茎的维管束相连。 3 5 2 o 8 6 4 2 o l 1 赢蓊 中南大学硕士学位论文 第叫章紫菜莉对铅胁迫的生理响应 - 嘲，一 阁4 0 不同铅浓度处理下紫莱莉根细胞鳍构空化 f i g 3e f f e c t so f d i f f e r e n tp b n m i o r o o t o r m j a l a p a a ，br l $ f f - ：c ，d p b 2 0 0 p m o l l l 赴4 ；e p b l 0 0 0 o il + 处4 ( a ，b ，c ，d ，e 放大4 0 倍】 鬻蠢 妒 1勇一a。_研薄= ：霸 声 中南大学硕士学位论文 第章紫茉莉对铅胁迫的牛卑响底 图4 4 不同铅浓度赴理下紫菜莉叶细胞结构变化 f i g 4 - 4 e f f a ；t so f d i f f 啪n t p bc o n c e n t r a t i o n so i l l c a f c c n o f m j a t a p a a 对照样叶中脉，b 对照样叶内；cp b2 0 0 岬o l r l 赴理叶中脉；dp b 2 0 0 岬o ll 。处理叶 岛：ep b l 0 0 0g r n o ll 1 处理叶t p 脉：fp b l 0 0 0 m n o l 【j 1 处理叶肉 ( a ，c ，e 放丸1 0 倍；b ，d , f 放大4 0 倍) 与对照植株相比，2 0 0p m o ll 。和1 0 0 0 姗o i l 。p b 胁迫f 紫茉莉的叫组织结 构没= f ：明显差别。n j _ 的表皮层为层细胞，排列紧密，自规则，细胞摹本为妊方 形。口 脉处维符束横前面钗基本丰当，术质部导管分化程j ! 没有明显筹异，导管 密度和数日基本相同。叶 的海绵组织年丌栅栏组织细胞排列紧密，有规则。而且， 栅栏组织和海绵组织厚度的比例基奉没有变化。这切说明，在本试验中，即使 中南大学硕士学位论文第四章紫茉莉对铅胁迫的生理响应 在1 0 0 0l a m o l l 1 高浓度铅胁迫下，紫茉莉叶片组织细胞结构基本没有受到影响。 这也是紫茉莉能够耐铅，并能在铅胁迫下正常生长的原因之一。 4 3 3 铅胁迫对紫茉莉生理响应的傅里叶变换红外光谱分析 1 ) 紫茉莉根的f t i r 分析 w a v en u m b e r e m 1 图4 5 紫茉莉根的f t i r 图谱 f i g 4 5a b s o r p t i o nf t i rs p e c t r ai nt h er o o t so f m j a l a p a a ：c o n l r o l ；b ：5 0l a m o l l - 1 ；e ：10 0l a n o l l 1 ；d ：2 0 0l a m o l l - 1 ；e ：5 0 0l a n o l l - 1 ；f ：10 0 0p m o l 1 图4 5 中3 4 2 0e m 以的自由羟基的伸缩振动峰主要反映的是根中碳水化合物 ( 纤维素、半纤维素、多糖) 【1 4 2 1 ，由图4 - 6 中看出，在中低浓度p b 处理下，该峰的 吸光度上升，在2 0 0 9 m o l l 。1 处理下达到最高，随着处理浓度的继续提高，该峰吸 光度下降。这说明在低浓度p b 促进了紫茉莉根部碳水化合物的分泌，高低浓度p b 则抑制了碳水化合物的分泌，同时随着p b 浓度的继续升高，根外表皮细胞壁的羟 基吸附结合p b 2 + ，使细胞壁表面的氢键减弱。 3 8 ou口四o10na乓 中南人学硕十学位论文 第四章紫菜莉对钳胁迫的生理响应 一- 一3 4 2 0c m 。1 p bc o n c e n t r a t i o n i lm o i i ，l 图4 - 6 紫茉莉根在3 4 2 0 、2 9 2 0 、1 6 1 0 、1 3 8 0 、1 0 6 0 锄j 特征峰处峰高的变化 f i g 4 6t h eb a n dh e i g h tc h a n g e so f 3 4 3 0 、2 9 2 0 、1 6 1 0 、1 3 8 0a n d1 0 6 0 啪一1 i nt h er o o t so f m j a t a p a 2 9 2 0c m 。附近足羧酸o h 与甲基伸缩振动重叠峰，主要来自于维生素和各种 膜及细胞壁的组织等成分。由图4 6 中看出，该处峰也呈现在中低浓度p b 处理下 吸光度上升，处理浓度继续提高吸光度下降的趋势。这可能是在中低浓度p b 的胁 迫下，紫茉莉的根部由于耐性机制不断分泌有机酸螫合p b ，导致羧酸谱带上升， 但当p b 的处理浓度继续升高，p b 对紫茉莉的毒害加深，有可能导致植物的一系 列生理生化过程失调，影响了植物的耐性机制，导致有机酸分泌减少，同时有机 酸不断螯合p b 2 + ，造成羧酸o h 的减少，峰值下降。 1 6 5 5c m 1 5 9 0c m o 附近n h 酰胺的弯曲振动峰是蛋白质的特征红外光谱。 该处峰的吸光度也呈现随p b 处理浓度升高先升高后降低的趋势。氨基酸，多肽和 蛋白质类物质同样是紫茉莉根部响应p b 胁迫的根系分泌物。中低浓度下p b 束l j 激 了这类物质的合成和分泌，用以络合p b ，减轻重金属p b 对植物的毒性，高浓度 p b 的则抑制了该类物质的合成。 图4 5 中1 0 6 0c l n 。1 附近的峰是醇，醚基，酯基或酚的c o 基团的伸缩振动峰， 该峰在中低浓度p b 处理下上升可能是低p b 促进该类物质的合成，也可能是由于 化学吸附羟基与p b 2 + 作用，导致c o 峰强度增加。当处理浓度继续升高，该类物 质的根部运输受到影响，峰高降低【1 4 3 1 4 4 1 4 5 1 。 2 ) 紫茉莉茎的f t i r 分析 3 9 中南人学硕十学位论文 第四章紫茱莉对铅胁迫的生理响应 o u 置 矗 五 k o 五 5 0 010 0 015 0 02 0 0 02 5 0 03 0 0 03 5 0 04 0 0 0 w a v en 啪b e i - ，c m 1 图4 7 紫茉莉茎的f t i r 图谱 f i g 4 7a b s o r p t i o n 丌i rs p e c t r ai nt h es t e m so f m j a l a p a a ：c o n t r o l ；b ：5 0p m o l l 。l ；c ：10 0p m o l l 1 ；d ：2 0 0l a m o l l 。1 ；e ：5 0 0g m o l l - 1 ；f ：10 0 0l u n o l l 1 一- 一3 4 2 0 c m 。1 一一2 9 2 0c m - 1 p bc o n c e n t r a t i o i l um 0 1 l 。l 图4 - 8 紫茉莉茎在3 4 2 0 、2 9 2 0 、1 6 3 0 、1 3 8 0 、1 0 6 0c n l 。1 特征峰处峰高的变化 f i g 4 8t h eb a n dh e i g h tc h a n g e so f 3 4 3 0 、2 9 2 0 、1 6 1 0 、1 3 8 0a n d1 0 6 0c m 。1 i nt h es t e m so fm j a l a p a 对于紫茉莉茎的红外光谱图，图4 7 0 71 0 6 0c l r l j 附近的峰是醇，醚基，酯基 或酚的c o 基团的伸缩振动峰，1 3 8 0c m 。1 附近的峰是为含油脂化合物的甲基 f e d c b a 。葺矗五u-量一qii弓茸矗宙 中南人学硕十学位论文 第四章紫莱莉对钳胁迫的生理响应 c h 的变形振动峰，在1 6 3 0c n l 。1 附近的峰是氨基酸，多肽和蛋白质类物质n h 酰胺的弯曲振动峰该处，2 9 2 0c l t i 1 附近的峰是植物体内有机酸类物质的羧酸 o h 的伸缩振动峰，在3 4 2 0c n l 以附近的峰代表紫茉莉茎中碳水化合物( 纤维素、 半纤维素、多糖类物质) 分子间氢键。一h 自由羟基的伸缩振动峰。由图4 8 中可以 看出，除3 4 2 0c n l 1 处峰值出现了不规则变化外，其余几处峰均无明显变化，标 明在p b 的处理浓度不断增高的情况下，紫茉莉茎中这几类有机物成分没有明显变 化。这也说明，在一定浓度范围的外部p b 的胁迫下，紫茉莉茎中的生理生化过程 受影响程度较小，表现出紫茉莉作为一种p b 的耐性植物的特性。这与我们在水培 实验中得出在p b 的处理浓度不断增高的情况下紫茉莉茎中p b 浓度变化不显著的 结论相同。这也表明，p b 在紫茉莉茎中的运输和积累受到了阻碍。 3 ) 紫茉莉叶的f t i r 分析 w a v en u m b e “c m 。1