（运动人体科学专业论文）不同强度跑台运动对大鼠骨组织Ⅰ型胶原和mmp1表达的影响.pdf

y 1 7 3 1 螋 苏州大学学位论文使用授权声明 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所( 含万方数据电子出版社) 、 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属在年_ 月解密后适用本规定。 非涉密论文口 论文作者签名：盘墨达：苫 导二签名：纽昌 不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型胶原和m m p 1 表达的影响 中文摘要 中文摘要 研究目的：骨组织细胞外基质在维持正常骨组织结构与功能中起重要作用，i 型胶原是构成骨组织细胞外基质的重要蛋白质，m m p 1 是专门降解i 型胶原的胶 原酶。在运动医学领域，关于运动对骨组织i 型胶原、m m p 1 表达影响的研究尚 处于初探阶段。本研究对大鼠进行8 周不同强度跑台运动训练，从生物化学、分 子生物学等不同层次和角度，比较骨组织i 型胶原和m m p 1 在不同强度跑台运动 后的变化，探讨不同强度运动对骨组织i 型胶原和m m p 一1 表达的影响。 研究方法：本实验对3 0 只8 周龄雌性s d 大鼠进行随机分组，对照组( n _ 1 0 ) 、 中等强度运动组( n _ 1 0 ) 和大强度运动组( n = 1 0 ) ，中等强度运动组和大强度组分 别进行8 周不同运动强度的跑台耐力训练。测试方法与指标：免疫组化方法测 定骨i 型胶原和m m p 1 蛋白表达。r t - p c r 方法测定骨i 型胶原和m m p 一1 的 m r n a 表达。 研究结果： ( 1 ) 跑台运动对大鼠骨组织l 型胶原( c o l l a g e ni ，c o l - i ) 和m m p l m r n a 表达的影响。中等强度运动组大鼠骨组织c o l im r n a 表达水平高于对照组水平 ( p 0 0 5 ) ，而m m p 1 m r n a 表达水平有增高趋势，但是无统计学差异。大强度 运动组大鼠骨组织c o l im r n a 表达水平显著增加，显著高于对照组与中等强度运 动组( p o 0 5 ) ，同时m m p 1 m r n a 表达水平也显著增加，均显著高于对照组和中 等强度运动组。 ( 2 ) 跑台运动对大鼠骨组织c o l i 和m m p 1 蛋白表达的影响。中等强度 运动组大鼠骨组织c o l i 蛋白表达水平高于对照组水平( p o 0 5 ) ，而m m p 一1 蛋 白表达水平有增高趋势，但是无统计学差异。大强度运动组大鼠骨组织c o l i 蛋白表达水平显著下降，显著低于中等强度运动组( p o 0 5 ) ，但m m p l 蛋白表 达水平显著增加，均显著高于对照组和中等强度运动组。 研究结论：( 1 ) 不同强度跑台运动使i 型胶原的合成增加。( 2 ) 中等运动强度 有助于骨i 型胶原含量的增加，而大强度运动不利于骨i 型胶原含量的增加。( 3 ) 不同强度跑台运动后m m p 1 对i 型胶原的降解起重要作用，骨组织细胞外基质的降 解能力增加影响着骨组织的适应性变化。 关键词：跑台运动骨组织细胞外基质i 型胶原基质金属蛋白酶1 作者：赵秀斌 指导老师：张林 英文摘要不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型胶原和m m p 1 表达的影响 e f f e c to fd i f f e r e n ti n t e n s i t yt r e a d m i l le x e r c i s et o e x p r e s s i o no fc o l l a g e nia n dm m p - - 1 o fb o n et i s s u ei nr a t s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：b o n et i s s u ee x t r a c e l l u l a rm a t r i xi si m p o r t a n tf o rm a i n t a i n i n gt h e s t r u c t u r ea n df u n c t i o no fn o r m a lb o n et i s s u e c o l l a g e nii sa l li m p o r t a n tp r o t e i nt h a t c o n s t i t u t e dt h eb o n et i s s u ee x t r a c e l l u l a rm a t r i x m m p 一1i sac o l l a g e n a s et h a tm a i n l y d e g r a d e dc o l l a g e ni i nt h ed o m a i no fs p o r t sm e d i c i n e ，t h e r ea r en o tm a n yr e s e a r c h e s a b o u tt h ee f f e c ta n do fe x e r c i s et oc o l l a g e nia n dm m p - 1 i nt h i se x p e r i m e n t ，w e i n v e s t i g a t et h ee f f e c ta n dm e c h a n i s mo fc o l l a g e nia d a p t a t i o nt od i f f e r e n te x e r c i s e t h r o u g ht h ea d a p t a t i o nt o8w e e k st r e a d m i l le x e r c i s eb yb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a r b i o l o g yt e c h n i q u e s m e t h o d s ：8 - w e e k - a g es db i gf e m a l er a t s ( 3 0 ) w e r eg r o u p e dr a n d o m l yi n t o3 g r o u p si nt h i se x p e r i m e n t ，t h ec o n t r o lg r o u p ( n 2 1o ) ，t h em e d i u mi n t e n s i t ye x e r c i s e g r o u p ( n = 1o ) a n d t h eg r e a ti n t e n s i t ye x e r c i s eg r o u p ( n - - 10 ) ，t h em e d i u mi n t e n s i t y e x e r c i s eg r o u pa n dt h eg r e a ti n t e n s i t yg r o u pw e r et r a i n e ds e p a r a t e l y8w e e k s t e s t m e t h o d sa n dt a r g e t s ：t h ee x p r e s s i o no fp r o t e i nc o l l a g e nia n dm m p - 1w i t h i m m u n i t yh i s t o c h e m i s t r ym e t h o d t h ee x p r e s s i o no fc o l l a g e nia n dm m p 1i nm r n a w e r ea n a l y z e db yr t - p c rt e c h n i q u e r e s u l t s ：( 1 ) e x p r e s s i o ni n f l u e n c eo fc o l ia n dm m p - l m r n ai nr a t sb o n e t i s s u e 0 3 m e d i u mi n t e n s i t ye x e r c i s eg r o u pe x p r e s s i o nc o l - i m r n aw a sh i g h e rt h a n t h ec o n t r o lg r o u p si nr a tb o n et i s s u e ( p o 0 5 ) ，b u tt h em m p - lm r n a e x p r e s s i o nl e v e l h a dt e n d e n c yo fe n h a n c ea n dn o n - s t a t i s t i c sd i f f e r e n c e g r e a ti n t e n s i t ye x e r c i s e g r o u pi nr a tb o n et i s s u ee x p r e s s i o no fc o l i m r n ao b v i o u s l yi n c r e a s e d ，a n dw a s h i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p sa n dt h em e d i u mi n t e n s i t ye x e r c i s eg r o u p s i i 不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型堕堕塑坚坚! ：! 壅姿竺墅堕 耋垄塑 二_ 二_ 二二二二一一 c o n e l u s i o n ：( 1 ) c o l l a g e n ii n c r e a s e df o rd i f f e r e n ti n t e n s i t yt r e a d m i l le x e r c i s e ( 2 ) t h en l e d i u mi n t e n s i t ye x e r c i s ew a sh e l p f u lt ob o n ec o l l a g e n ic o n t e n t ，b u tt h eg r e a t i n t e n s i t ye x e r c i s ed i d n o tf a v o rt h eb o n ec o l l a g e nic o n t e n t ( 3 ) m m p - 1w i t hd i f f e r e n t i n t e n s i t vt r e a d m i l le x e r c i s ec o u l dp l a y t h ei n f l u e n t i a lr o l ei nd e g r a d i n gc o l l a g e ni ， d e g e n e r a t i o na b i l i t yo fb o n et i s s u e e x t r a c e l l u l a rm a t r i xc o u l da f f e c tt h eb o n et i s s u e a d a p t a t i o nt oe x e r c i s e k e yw o r d s ：t r e a d m i l le x e r c i s e b o n et i s s u e e x t r a e e l l u l a rm a t r i xc o l - i m m p 1 i i i w r i t t e nb yz h a ox i u b i n s u p e r v i s e db yz h a n g l i n 目录 1 序言1 1 1 选题依据1 1 2 文献综述：运动对骨组织细胞外基质研究进展2 1 2 1 骨概述2 1 2 2 运动对骨的影响5 1 2 3 基质金属蛋白酶( m m p ) 与运动8 1 2 4i 型胶原与m m p 1 1 1 2 材料与方法1 3 2 1 实验动物1 3 2 2 分组与运动方案1 3 2 3 样品采集1 4 2 4 检测指标与方法1 4 2 5 数据统计：18 3 实验结果1 9 3 1r n a 的质量、纯度的检测1 9 3 2 不同强度运动后大鼠胫骨骨组织c o l - i 和m m p i m r n a 的表达1 9 3 3 不同强度运动后大鼠胫骨骨组织c o l i 和m m p 1 蛋白的表达2 0 4 分析与讨论2 3 4 1 跑台运动对大鼠胫骨骨组织c o l i 的影响2 3 4 2 跑台运动对大鼠胫骨骨组织m m p 一1 的影响2 4 5 结论2 7 6 参考文献”2 8 攻读学位期间公开发表的论文3 3 中英文缩略词3 4 致谢”3 5 r 不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型胶原和m m p 1 表达的影响1 序言 1 序言 1 1 选题依据 骨组织在整个生命活动过程中都具有新陈代谢的活性，骨组织代谢的过程往 往通过破骨细胞与成骨细胞的活性、骨基质、骨矿物质以及骨代谢生化标志物的 变化来反映。 以前的研究比较重视钙平衡和激素变化对骨代谢的影响，但是，近年来，随 着研究的进一步深入，研究人员逐渐认识到骨的有机成分在骨代谢方面同样起着 重要的作用。 近年来，由于生物化学、分子生物学和细胞生物技术的发展，人们对骨胶原 的兴趣日益浓厚。目前已发现有2 7 种不同类型胶原。其中i 型胶原蛋白主要存在 于动物的皮肤和骨中。i 型胶原蛋白的结构决定它在骨骼与结缔组织中发挥作用的 主要方式是形成和保持骨架的完整性。胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子 结构非常稳定。 基质金属蛋白酶1 ( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n 1 ，m m p 1 ) 是一种间质胶原酶，主 要降解i 、i i 型胶原，是维持骨胶原代谢平衡的重要因素。研究表明，m m p 1m r n a 表达增强时，表现为表达m m p 1m r n a 的破骨细胞数量增多。说明破骨细胞活性 增强，使骨基质降解增加，胶原蛋白合成降低f l 】。 骨组织细胞外基质在维持正常骨组织结构与功能中起重要作用，i 型胶原是构 成骨组织细胞外基质的重要蛋白质，m m p 1 是专门降解i 型胶原的胶原酶。国内 外在基础和临床医学领域已有许多涉及i 型胶原、m m p 1 基因表达的研究，i 型胶 原用于治疗骨质疏松的理论研究也取得了一定进展。但运动医学领域关于运动对 骨i 型胶原、m m p 1 表达影响的研究尚处于初探阶段，实验报道甚少。 本课题对运动大鼠骨组织采用r t - p c r 技术、免疫组化方法，观察大鼠骨组织 i 型胶原、m m p 1 表达情况，研究不同负荷运动训练对大鼠骨组织i 型胶原、m m p 1 表达的影响，以期为更好的研究不同强度运动后骨组织的适应性机制提供实验和 理论依据。 l 序言不同强度跑台运动对大鼠骨组织l 型胶原和m m p 1 表达的影响 1 2 文献综述：运动对骨组织细胞外基质研究进展 1 2 1 骨概述 1 2 1 1 骨的结构 骨是人体的重要器官，具有一定的弹性和韧性，骨与骨之间通过关节、关节 囊、韧带和肌肉连接在一起，作为人体的支架，负荷重量及作为运动的杠杆，保 护内脏器官，维持某些血管的特定形态和保护某些神经免遭压迫。人体全身共有 2 0 6 块骨，成年人的骨约占体重的2 0 。骨按外形主要分为长骨、短骨、扁骨及不 规则骨等【2 】。 骨由骨膜、骨质、骨髓等组织构成，骨组织中有丰富的血管供应骨质、骨膜 和骨髓腔内的细胞营养。骨膜由结缔组织构成，包裹除关节面以外的整个骨。骨 膜中分布着丰富的神经和血管，对骨的营养、新生和感觉有重要的作用。骨质是 骨的主要成分，包括骨密质和骨松质两种，骨密质由若干层紧密排列的骨板构成。 骨松质由许多针状、片状的骨小梁构成。骨髓填充于骨髓腔和骨松质间隙内【3 】。 1 2 1 2 骨的组成 骨组织由骨细胞和细胞间质组成。骨细胞使骨具有韧性，骨间质使骨具有刚 性。骨细胞包括骨原细胞、成骨细胞、骨细胞和破骨细胞。骨原细胞又叫前成骨 细胞，分布于骨小梁、骨膜内层、哈佛管内壁及毛细血管外周，具有增生分化的 能力。成骨细胞来源于骨原细胞，不再进行细胞分裂，但有很强的蛋白合成能力， 常分布在骨的发育和生长的进行面。其主要功能是合成并分泌类骨质和无定型基 质，并参与类骨质的钙化。成骨细胞还参与类骨质的矿化过程。成骨细胞在成骨 过程中一旦被周围骨基质所包埋即成为骨细胞。骨细胞可保持骨的完整性，作为 骨存活的标志。破骨细胞的主要功能是参与骨吸收。甲状旁腺激素、破骨细胞激 活因子均可促进破骨细胞的形成，并可加强骨吸收，而降钙素则能减弱破骨细胞 的活动【4 】。 细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，e c m ) 是由动物细胞合成并分泌到胞外、 分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖和蛋白、或蛋白聚糖。这 些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生 理活动。构成细胞外基质的大分子种类繁多，可大致归纳为四大类：胶原、非胶原 糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、以及弹性蛋白。 骨基质即骨的细胞外基质，分为有机质和无机质。有机质包括大量的骨胶原 2 不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型胶原和m m p 1 表达的影响1 序言 纤维和少量无定形基质。骨胶原纤维占有机质的9 0 ，主要由i 型胶原蛋白组成； 骨中的无机质又称骨盐，有2 0 多种，约占骨组织干重的6 5 ，其主要成分为：磷酸 钙( 8 4 ) 、碳酸钙( 1 0 ) 、柠棣酸钙( 2 ) 、磷酸氢钠( 2 ) 。它们以结晶的羟 基磷灰石和无定形的胶体磷酸钙的形式分布于有机质中。其主要功能是作为骨细 胞生长分化的外环境，为矿物质沉积作用和骨转换提供场所；同时还能调节骨细 胞的发育、功能及矿化速率、范围等；同时骨细胞又可改变基质的组成，从而导 致细胞表型改变【4 】。 1 2 1 3 胶原( c o l l a g e n ，c o l ) 骨基质富含胶原纤维，占骨有机质的9 0 ，其中i 型胶原纤维( c o l l a g e ni ， c o l i ) 占骨胶原的9 7 以上。软骨胶原是i i 型胶原。胶原纤维是组成骨构架和维 持骨的力学强度的基质蛋白 5 1 。 ( 1 ) 胶原的结构 胶原的基本构成单位是原胶原，每个原胶原蛋白分子由3 条a 肽链组成，每 条肽链有1 0 0 0 个左右氨基酸残基。相对分子质量介于9 5 0 0 0 1 0 0 0 0 之间，所以， 一个胶原分子的相对分子质量大约为3 0 万。肽链呈现一种特殊左手螺旋，螺距为 0 9 5 n m ，每一螺圈含有3 3 个氨基酸残基，第一残基沿轴向距离为0 2 9 n m 。三条仅 肽链则以平行、右手螺旋形式缠绕成“草绳状”三股螺旋结构。肽链中每3 个氨 基酸残基就有一个要经过此三股螺旋中央区，而此处空间十分狭窄，只有甘氨酸 适合于此位置，而且3 条0 肽链是交错排列的，因而使3 条a 肽链中g l y 、x 、y 残基位于同一水平上。肽链可用( g l y x y ) n 来表示，x 和y 可以是任意氨基酸， 但脯氨酸和4 羟脯氨酸残基通常出现在x 和y 位置，促进分子内交联的形成。分 子的稳定和质量大部分取决于分子内和分子键的交联。胶原分子内和分子间有三 种交联：醇醛缩合交联；醛胺缩合( 席夫碱) 交联；醇醛组氨酸交联。 胶原蛋白的氨基酸组成有如下特点：甘氨酸几乎占总氨基酸残基的1 3 ，即 每隔两个其他氨基酸残基( x ，y ) 即有一个甘氨酸，故其肽链可用( g l y x - y ) n 来表示；含有较多在其他蛋白质中少见的羟脯氨酸和羟赖氨酸残基，也有较多 脯氨酸和赖氨酸，如脯氨酸和4 羟脯氨酸( 4 一h y d r o x y r p o l i n e ，h y p ) ，同时还含有 少量3 一羟脯氨酸( 3 - h y d r o x y r p o l i n e ) 和5 - 羟赖氨酸( 5 - h y d r o x y l y s i n e ，h y l ) ，羟脯 氨酸残基可通过形成分子内氢键稳定胶原蛋白分子；羟脯氨酸是胶原蛋白中的特 异性氨基酸，而在其它蛋白中不存在，在胶原蛋白中含量稳定，因此，不同组织 1 序言不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型胶原和m m p - 1 表达的影响 中h y p 含量可作为衡量胶原代谢的重要指标【6 】。胶原蛋白分子中缺乏色氨酸， 所以在营养上为不完全蛋白质。胶原分子中芳香氨基酸和半胱氨基酸含量也较少。 根据胶原蛋白中原胶原的亚基构成和氨基酸组成不同，可将胶原蛋白分为多 种类型。目前已发现有2 7 种不同类型的胶原，按照被发现的先后顺序分别称为i 型胶原、i i 型胶原、i i i 型胶原等。 i 型胶原占骨有机质的9 0 ，肽链组成为2 个0 【1 ( i ) 和一个睨( i ) ，展p a l ( i ) 2 睨( i ) 。它的一级结构测定表明，a l ( i ) 肽链由1 0 1 4 个氨基酸残基组成，相对 分子质量约9 7 0 0 0 。肽链的9 6 由g l y x y 重复顺序组成。g l y 约占1 3 ，x 常为 脯氨酸残基，y 常为羟脯氨酸残基。肽链的n 末端和c 末端不含重复的g l y x 。y ， 不形成左手螺旋。i 型胶原分子非螺旋区的重要特征是a 1 肽链n 末端第9 位是赖 氨酸残基，c 末端的1 6 位也是赖氨酸残基。n 末端和c 末端的非g l y x - y 区的1 5 2 0 个氨基酸残基，在胶原的生物合成及合成后肽链间形成交联的过程中起重要作用。 i 型胶原蛋白的前体即i 型原胶原蛋白，比i 型胶原蛋白在结构上多2 个末端 前肽结构( c 前肽和n 前肽) 。i 型原胶原蛋白具有胶原蛋白家族中所有原胶原蛋 白的典型特征：首先含有一段具有( g l y x y ) n 重复序列的三聚体结构，在n 端 与c 端的2 个前肽形成非螺旋的结构域( n c 结构域) ，位于( g l y x y ) n 重复序 列两侧，n c 结构域再进一步形成球状结构，由2 条仅l 链与1 条睨链交互缠绕所 形成。胶原三聚体有很高的抗拉强度。i 型原胶原蛋白分泌到胞外基质中后，经过 蛋白酶的剪切除去c 前肽与n 前肽，就形成了成熟的胶原蛋白。成熟的胶原蛋白 能自我组装成高度有序的结构一胶原纤维【| 7 1 。结构决定性质，性质决定用途，i 型 胶原蛋白的结构决定它在骨骼与结缔组织中发挥作用的主要方式是形成和保持骨 架的完整性。 ( 2 ) i 型胶原的代谢及其功能 胶原从合成到成熟经历不同的阶段：氨基酸一前胶原一原胶原一胶原。前胶原 是三螺旋结构的大分子，在氨基和羧基末端各有一段非螺旋形的尾肽( t a i l p e p t i d e ) ，分别为i 型前胶原羧基末端前肽( c a r b o x y t e r m i n a lp r o p e p t i d eo ft y p e1 p r o e o l l a g e n ，p i c p ) 及i 型前胶原氨基末端前肽( a m i n o - t e r m i n a lp r o p e pt i d eo f t y p e 1p r o c o l l a g e n ，p i n p ) 。前胶原分子切去两端的p i c p 及p i n p 变为原胶原分子，后 者在三螺旋结构基础上形成胶原交联：吡啉啶及脱氧吡啉啶，以及氨基末端交联 ( n t x ) ，羧基末端交联( i c t p ) ，它们呈螺旋状位于距末端9 0 个残基处并呈对称 4 不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型胶原和m m p 1 表达的影响l 序言 性排列【引。交联的形成有助于骨胶原纤维的稳定和韧性。 i 型骨胶原分子作为蛋白质主要由成骨细胞合成并受基因组调控，羟化酶( 脯 氨酰羟化酶，赖氨酰羟化酶) 、t c 和氧对于前胶原自细胞排出起关键的作用。当前 胶原分子被分泌到细胞外，首先被特异的内肽酶切除两端的尾肽p i n p 、p i c p 形成 原胶原分子，后者在细胞外基质经过脱氨基及醛胺缩合在原胶原分子侧链之间形 成稳定的二价交联( e r o s s l i n k ) ，以及肽端形成三价结构d p y ( 又称为赖氨酸毗啉 啶，l p ) 和p y ( 又称为羟赖氨酸吡啉啶h p ) ，脱氨基在交联过程中是唯一必要的酶 解步骤，在此过程中赖氨酰氧化酶具有重要的作用。骨中主要的胶原交联是吡啉啶 + 交联及脱氧毗啉啶( p y d 、d p d ) 交联。被切下的p i c p 进入血循环，在肝内皮细 胞清除，而p i n p 也可被肝内皮细胞清除或直接沉积于骨组织或进入血循环并最后 陷入基质中。 在骨形成过程中，i 型胶原出现于成骨细胞前体细胞的增殖期，先于碱性磷酸 酶表达，形成的胶原框架为基质矿化奠定基础。骨胶原的合成与分解是动态过程， 新的胶原不断合成，旧的胶原不断分解。由于胶原纤维上存在着广泛的共价交联， 其结构稳定，不能被普通的蛋白水解酶水解。只有胶原酶才能对胶原的降解起关 键作用。体内存在特殊的胶原酶能专一地作用于原胶原分子的一定部位，使其断 裂变性，然后才可进一步被其他蛋白酶水解。胶原酶在胶原n 端1 4 处切断原胶 原，切断后的碎片可自动变性，经细胞外非特异性蛋白酶及肽酶水解或被细胞吞 噬后由溶酶体进一步分解，形成小分子寡肽或游离氨基酸 9 1 。 韩志岩f l o 】等通过w i s t a r 新生鼠成骨细胞原代培养及苦味酸天狼猩红染色【l l 】技 术对大鼠骨组织进行切片染色，结果表明，骨胶原在骨基质矿化过程中具有重要 作用。i 型胶原之间相互交联结构，形成骨基质框架，骨胶原纤维间空隙区域间距 离为0 5 r i m ，这与羟基磷灰石钙离子之间的距离是f 致的，因此骨胶原为骨基质钙 化提供了结构场所，也为促进矿化的物质提供功能发挥区，为骨基质矿化奠定了 基础。i 型胶原蛋白的结构决定它在骨骼与结缔组织中起到了保持骨架完整性的重 要作用。胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并且具有低免疫 原性和良好的生物相容性。 1 2 2 运动对骨的影响 骨能够敏锐地感知运动的刺激并对刺激的反应做出精细地调节，骨组织调节 运动刺激的这种能力在临床医学治疗中具有重要的意义，通过运动负荷作用在骨 不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型胶原和m m p - i 表达的影响 牵张力，不仅直接引起骨细胞的变形，而且还使细胞受到由于骨 组织间液流动所产生的剪切应力的作用，通过这种液体流动效应， 产生流动电势，最后，在对这些机械力和电势能的应答反应中，骨细胞膜产生更 进一步的变形【1 2 】，从而对运动刺激做出反应。虽然骨细胞和成骨细胞对运动刺激 都敏感，但骨细胞被认为是骨组织中主要的力感觉细胞，成骨细胞则被认为是效 应细胞【1 3 】。运动可以调节骨代谢，外力刺激引起骨骼形变，诱导骨间隙液体的运 动，导致细胞活动方式发生改变，促进骨内血液循环，增加营养和代谢转运，同 时引起骨组织产生负压电位而易于结合阳性钙离子，促进骨形成，抑制骨溶解【14 1 ， 运动还可以通过神经、内分泌调节机制，影响机体钙的平衡。同时，运动还可以 使血中雌激素等性激素水平升高，活性维生素d 增加，刺激肠道钙的吸收及利用。 1 2 2 1 运动对骨代谢的影响 运动对骨代谢的影响具有正反两方面的效应，即改善骨质的促进效应和破坏 骨质的抑制效应【1 5 珈】。骨是人体的支持结构，是完成各种形式运动的前提和基础。 持续长期的过量运动，有可能使骨组织产生由骨代谢异常改变而导致的骨量降低、 骨微细结构改变、骨质量及骨生物力学性能降低、甚至骨折【2 1 1 。 正常骨代谢周期，其骨吸收和骨形成维持在一种动态平衡状态。骨形成过程 主要包括骨基质合成和矿化两个方面，骨吸收是骨基质不断降解的过程。正常的 骨重建有赖于两者间的动态平衡，以维持机体骨量的稳定。破骨细胞的骨吸收活 动和成骨细胞的骨形成活动相互偶联，不断进行着骨重建。一旦偶联被打破，平 衡失调，破骨细胞的骨吸收活动相对增强或成骨细胞的骨形成活动相对减弱，骨 吸收大于骨形成就发生骨质丢失。 研究表明：适宜的运动使骨骼所受应力刺激增加，进而促进骨塑建或重建， 促进骨形成增加和骨矿物质沉淀，促进骨强度增加和骨量的积累。另一方面，运 动可直接增加骨的机械负荷运动，增加对成骨细胞活性的刺激，促进骨形成和骨 重建，提高骨量储备。此外，运动时肌肉的收缩和舒张作用，对骨膜起摩擦作用，这 也有利于改善骨组织的血液供应，促进骨营养物的吸收，对骨形成与骨重建有益。 运动与骨密度成正比。运动量减少，肌肉及骨骼的附属组织中血液循环及营 养降低，骨骼肌的收缩功能下降，骨质代谢率下降，骨吸收增高。m a g u s s o n 等【2 2 】 认为运动量减少直接影响全身的激素水平的调节以及各种营养、维生素、微量元 素的吸收及代谢。作用在骨细胞有效机应力可引起骨组织产生形状变化，导致骨 6 不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型胶原和m m p 1 表达的影响l 序言 组织内d n a 和骨胶原合成的增加，从而使骨重量增加。反之，当机应力减少时， 骨的重量随着应力的减少而出现废用性下降。k e l l y 等【2 3 j 认为适度的运动可以明显 增加人体的骨密度，调节人体的骨代谢，使骨质总量适度增加。 1 2 2 2 运动对骨形态结构的影响 骨小梁的形态结构、吸收表面、成骨和破骨细胞的数量、形态以及骨胶原的 密度和排列，能够反映运动对于骨的影响效应【2 4 1 。章晓霜等1 2 5 1 通过去卵巢并结合 不同强度运动方式干扰，观察运动对骨形态结构的影响发现：骨质疏松、中等强 度运动、高强度运动3 组大鼠比较，骨质疏松组大鼠椎体骨小梁明显减少、间距 增大、骨吸收孔明显，髓腔扩大，说明骨的立体网状结构受损。高倍镜下，骨小梁 表面可见较多的骨吸收陷窝及胶原断裂后形成的颗粒状骨吸收面，提示骨胶原发 生了逐层降解，正常结构变得疏松、断裂，并可见微骨折。中等强度运动组椎体 骨小梁数目较骨质疏松组稍多，骨小梁表面有较多的颗粒状骨吸收面。大强度运 动组骨小梁数目较骨质疏松组差异不明显，出现微骨折。证明，中等强度运动对 骨质的恢复具有积极有效的改善促进作用。高丽等【2 6 】报道，运动性动情周期抑制 大鼠经不同强度的跑台运动后，其腰椎松质骨的显微结构表现为：低强度运动组 骨小梁饱满、规则；大强度耐力运动组骨小梁数目变少，纤细，形态结构完整性 较差，髓腔大小差异明显。表明，大强度跑台运动使大鼠骨小梁结构受到破坏。 为了弄清骨结构受损的实质，通过迸一步透射电镜观察发现，大强度耐力运动后 雌性大鼠骨细胞、破骨细胞及成骨细胞的超微结构均发生显著变化，表现为：骨 细胞的核异染色质边聚，呈星月形小体，核膜模糊，内质网肿胀，基质中出现空泡 化，一些细胞呈现细胞核锯齿状、核膜皱缩等早期凋亡状改变；成骨细胞内质网 肿胀；破骨细胞出现线粒体嵴模糊，核异染色质边聚等变化，表明大强度跑台运 动使大鼠的骨细胞、成骨细胞、破骨细胞的结构受损。 1 2 2 3 运动对i 型胶原的影响 研究表明：低运动强度可以促进骨胶原形成，大强度运动可使胶原部分纤维 断裂，使胶原纤维应力松弛量降低，松弛速度变缓。 运动对骨骼产生了机械应力，导致了骨组织的特异性变形，使骨细胞、破骨 细胞、成骨细胞均受到刺激。这种机械应力导致d n a 合成增加，继而d n a 的表 达产物胶原蛋白的合成增加。这样就提高了骨质的水平，此时的骨形成率要大于 不运动时的骨形成率。李敏【2 7 】等通过对急性跑台运动大鼠跟腱采用e l i s a 法测定 7 1 序言不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型胶原和m m p 1 表达的影响 p i n p 含量，实时荧光定量p c r 法测定前胶原i a l m r n a 表达水平。结果显示：急 性跑台运动可加快跟腱中i 型胶原原胶原分子的形成，从而加快了胶原纤维形成。 胡静【2 8 】等通过f l e x e r c e l l 细胞体外拉伸力学装置对人成骨细胞m g 6 3 进行牵张加 载实验，用生化方法和r t - p c r 反应检测细胞受张力刺激6 、1 2 、2 4 和4 8 h 后的 a l p 活性和i 型胶原m r n a 的表达变化。结果显示：i 型胶原m r n a 的表达在张 力作用后6 。1 2 h 减弱，2 4 h 后表达升高，4 8 h 最高。提示机械张力影响i 型胶原的 合成。张培珍【2 9 】等将1 2 月龄雄性小鼠分为3 0 m i n 组、6 0 m i n 组、6 0 m i n + 负重组、 实验对照组及安静对照组，观察不同负荷游泳运动对老龄雄性小鼠腰椎骨、股骨 胶原含量( h o p ) 的影响。结果发现：经8 周游泳训练后，6 0 m i n 组及6 0 m i n + 负 重组小鼠的股骨h o p 含量显著高于同月龄对照组( p o 0 1 ) ；而3 0 m i n 组小鼠股骨 h o p 含量及3 个运动组小鼠椎骨h o p 含量与同月龄对照组比较，差异无显著性意 义。表明为期8 周的适当负荷游泳运动可以促进老龄雄性小鼠股骨胶原含量增加。 同时6 0 r a i n + 负重组小鼠股骨h o p 含量显著高于6 0 m i n 组( p o 0 5 ) ，表明为期8 周，每天6 0 m i n 的负重游泳训练可促进股骨h o p 含量增加，其作用较单纯的不负 重游泳运动明显，提示老龄雄性小鼠股骨胶原含量的增加与较大的运动负荷有关。 h o w a r d 等【5 4 】采用体外培养人牙周膜成纤维细胞的方法，检测机械力对牙周膜细胞 e c m 蛋白合成的影响，发现当给细胞施加5 的形变张力、频率为3 0 次m i n 、作 用2 4 h 后，牙周膜细胞合成i 型胶原的量显著增加。当机械力增加到1 0 形变率时， i 型胶原合成量与非施力组无显著差别，表明人牙周膜细胞对不同大小的机械力具 有不同的反应，机械力调节人牙周膜细胞e c m 蛋白的合成。 1 2 3 基质金属蛋白酶( m m p ) 与运动 1 2 3 1 基质金属蛋白酶的基本特征 m m p 是由多种锌离子依赖性酶组成的能降解细胞外基质蛋白的酶系家族，因 其需c a 抖、z n + + 等金属离子作为辅助因子而得名。到目前为止已发现和纯化的 m m p s 至少有2 0 种，已证实m m p s 在几乎机体各种组织的发育和修复、肿瘤发生 发展、炎症反应等过程中发挥着重要的作用。 基质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n ，m m p ) 是一族锌离子依赖性内肽酶， 广泛存在于各种结缔组织中【3 0 】，由1 7 种锌离予依赖性酶组成，在细胞外基质的生 理性和病理性降解过程中起重要作用。1 v i m p s 是一组蛋白酶的统称，各组成员在 功能和结构上具有下列共同性：可降解细胞外基质成分；除间质溶素3 直接 8 不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型胶原和m m p 1 表达的影响1 序言 以活性形式分泌至细胞外，其余成员均以酶原的形式分泌至细胞外，并在适当条 件下被激活而发挥生物作用；在p h 为中性时发挥作用：可以被特异性组织型 基质金属蛋白酶抑制因子( t i s s u ei n h i b i t o ro f m a t r i xm e t a u o p r o t e i n s ，t i m p ) 所抑制； 各种m m p s 的氨基酸序列中具有一些高度同源序列，形成几个共同的调解区：a 、 活性前区，多为8 0 个氨基酸片断，具有信号肽作用，当其被外源酶切除后，酶原 被激活；b 、催化基团：约1 7 0 个氨基酸，相当保守为h e x g h ，是锌离子结合部 位；c 、与细胞外基质蛋白同源序列区域；d 、c 末端区，主要为血红蛋白结合序列。 m m p 的氨基酸序列检测表明，同组内的各酶间约有7 0 的相似性，不同组间 的酶约有5 0 的相似性【3 1 1 。除了m m p 7 分子相对较小以外，每个胶原酶或间质 溶素均由五个结构域组成：信号肽域；前肽域，内含有一个半胱氨酸残基， 对m m p 酶原形式的维持起重要作用，在活化后此残基即被水解；催化域，包含 锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要；富含脯氨酸的铰链区，用于 连接催化域和c o o h 末端域；血红素结合蛋白样或纤维结合素样的c o o h 末端 域，可能和底物的特异性有关【3 2 】；其中酶催化域和前肽域具有高度保守性。明胶 酶也有以上五个结构域，但在它们的催化域内有三个纤维结合素i i 型重复序列， 这些序列使明胶酶更易于和底物结合【3 玉3 4 1 。m t - m m p 不仅有其它m m p 所共有的 五个结构域，还有一个独特的跨膜域，从而使m t - m m p 固定于细胞膜上【3 5 】。 1 2 - 3 2 基质金属蛋白酶的分类 m m p 是细胞外基质降解过程中必不可少的酶，几乎能降解细胞外基质的所有 成分【3 酊，根据它们的结构和底物特异性将m m p 分为四组：间质胶原酶 ( c o l l a g e n a s e ) ：主要包括m m p 1 、m m p 8 、m m p 1 3 ，主要作用于i 、i i 、i i i 型 胶原；明胶酶( g e l a t i n a s e ) ：主要包括m m p 2 及m m p 9 ，主要作用于型胶 原与变性胶原及弹力蛋白；基质分解素( s t r o m e l y s i n ) ：主要包括m m p 3 ， m m p 1 0 ，m m p 1 1 及m m p 7 ，主要作用于蛋白多糖等；膜型基质金属蛋白 ( m e m b r a n e - t y p em a t r i xm e t a l l o p r o t e i n ，m t - m m p ) 含m t - m m p l 及m t - m m p 2 ，位 子细胞的表面，主要与m m p 2 的激活有关。其中，又将间质胶原酶、明胶酶和基 质分解素统称为经典型m m p ，而将m t - m m p 称为新型m m p 。经典型m m p 以无 活性的酶原形式合成，需经进一步反应活化暴露其活性部位而具有生物活性。新 型m m p 则以活性形式合成，除降解细胞外基质外，还在经典型m m p 的活化中发 挥作用1 3 9 。 9 l 序言不同强度跑台运动对大鼠骨组织i 型胶原和m m p 1 表达的影响 1 2 3 3 基质金属蛋白酶的功能 细胞外基质的降解主要依靠丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋 白酶和基质金属蛋白酶等四类蛋白水解酶，其中m m p s 最为重要，能降解几乎细 胞外基质的所有成分，包括天然和变性的不同种类的胶原【4 们。m m p s 是一个分泌 型跨膜蛋白家族，包括胶原酶、明胶酶和基质溶解素，它们协同作用，分解e c m 的每一种成分，在生理条件下能消化e c m 和基底膜【4 i 】。一种m m p 可以直接降解 某一种或几种e c m ，也可以通过激活其他类型的m m p s 而发挥作用。m m p s 家族 成员结构彼此不同，主要表现于附加区域的出现或缺失，从而具有不同的生物学 行为，例如基质粘合剂，基质特异性，细胞表面定位，抑制粘合剂等。已证实m m p s 在机体各种组织的发育和修复、细胞迁移、血管生成、肿瘤发生发展浸润和转移、 炎症反应等病生理过程中发挥着重要作用。 1 2 3 4 基质金属蛋白酶的调节 m m p s 由多种细胞以酶原的形式合成分泌，在体内的表达、激活以及对底物 的分解过程均受到严格的调节。包括基因的活化、转录、m r n a 的稳定性能、翻 译、蛋白酶的分泌、酶原的激活、特异性抑制因子以及活性酶的降解和清除。其 中关键的环节是转录水平、酶原激活和t i m p s 的调节三个水平【3 引。 ( 1 ) 转录水平 多数m m p s 基因转录受内源性生长因子和细胞因子调节。对胶原酶、基质溶 解素1 等转录起诱导作用的有i l 1 ，t n f ，p d g f ，