（果树学专业论文）“扎矮山定子”（Malus+baccata+Borkh）矮生机理的研究.pdf

沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本文以苹果属携有d w 矮生基因的植物“扎矮山定子”为试材，从 “扎矮山定予”对生长素的敏感性、生长素的代谢和极性运输三个方面对其 矮生机理进行了系统地研究，获得以下结果： 1 “扎矮山定子”的皱叶类型实生苗( d w 苗) 在不同剂量吲哚乙酸处 理后，株高、叶面积、最大节问长度均有所增加，与光叶类型实生茁( n o 苗) 和普通山定子实生苗( 3 # 苗) 生长变化一致。吲哚乙酸在低浓度下明显 促进生长，高浓度时显著抑制生长。d w 苗、n o 苗和3 撑苗的最适1 a a 浓度 约为1 0 5 摩尔升。低于此浓度为亚最适浓度，生长随浓度增加而加快，高于 此浓度为超最适浓度，生长随浓度的增加而下降，浓度高到一定程度后则抑 制生长。 2 d w 苗株高增加的幅度小于n o 苗和3 存苗，对生长素的敏感程度低于 n o 茁和3 捍苗。d w 苗在不同浓度处理中对吲哚乙酸的反应较迟缓。 3 d w 苗在离体条件下不表现其突变特征，其株高与n o 苗株高没有明 显不同。组培苗的最适i a a 浓度高于实生苗。这可能与光照条件等环境因素 有关。水分对于d w 基因的正常表达有重要影响，当培养基中的水分发生亏 缺时，d w 组培苗可表现出皱叶、矮化等突变表型。 4 “扎矮山定子”叶片中的i a a 氧化酶和过氧化物酶活性都要高于普通 山定子植株。枝条上各叶的酶活随着叶龄的增加而降低，顶端叶片 近顶端 叶片 中部叶片 基部叶片。此外，组培苗的i a a 氧化酶活性远远低于田问 苗的酶活。 5 赤霉素的主要生理作用是促进植株的伸长生长，但低浓度赤霉素的促 进伸长的作用不十分明显，甚至低于对照处理，只在高浓度时才表现出明显 的促进作用。n o 植株的i a a 氧化酶和过氧化物酶活性具有相同的变化规律， 酶活性随着g a 3 浓度的降低酶活逐渐增加。低浓度g a 3 使二者酶活增加； 高浓度g a 3 使酶活降低。这表明。g a 3 对植株的作用可能是通过调节i a a 氧化酶和过氧化物酶的活性还实现的。 6 “扎矮山定子”维管束发育不充分，仅木质部发育较好，韧皮部不发达， 韧皮组织明显偏少，与形成层界限不明显。正常植株的茎维管束木质部、韧 皮部和形成层发育良好，界限比较清晰。此外，d w 苗的向重力性反应下降， 摘要 d w 苗的胚根尖端朝向不规则，与重力方向不一致。而3 拌苗和n o 苗则有明 显的向重力性反应。 7 生长素极性运输抑制剂t i b a 可以诱导正常植株出现类似“扎矮山定 子”的表型。t i b a 可使n o 苗和3 撑茁的矮化和叶片的卷曲，而且t i b a 浓 度越大，株高抑制越明显。这是t 1 b a 对植物细胞生长素的输出载体非竞争 性抑制的结果。高浓度t i b a 可使n o 苗和3 # 苗的叶面积明显减少。此外， t i b a 可以使离体苗的不定芽分化有所延滞，且不定芽分化数随培养基中 t i b a 浓度的增加而逐渐减少，当浓度超过7 5 m g l “时，不定芽不分化。再 生叶片中出现小而卷曲的叶片，个别叶片表现出不对称生长。此外，平邑甜 茶组培苗( p 苗) 的顶端出现粉红色的瘤状物，n o 苗未出现这种现象。 8 “扎矮山定子”的d w 突变是多效性的，除对称性受到影响外，还表 现为叶脉发育异常，叶片形状扭曲，维管束发育不良，根的向地性减弱，对 生长素和赤霉素敏感性下降。“扎矮山定予”的表型与许多生长素极性运输 突变体很相似。d w 突变体的矮生、皱叶及具有瘤状突起的性状亦可在极性 运输抑制剂t 1 b a 处理普通山定予时诱导出来。可见，d w 突变极有可能发 生在生长素极性运输过程中。 此外，d w 突变体的矮化机制还可能是与内源i a a 的降解有关。“扎矮 山定子”的i a a 氧化酶活性明显高于正常植株，可能是赤霉素对i a a 氧化 酶活性调节的结果。高活性的i a a 氧化酶可使“扎矮山定子”内源i a a 含 量下降，导致其维管束发育不充分，造成极性运输i a a 的能力下降，影响正 常的营养调运，致使维管束的进一步的发育不良，从而导致树体矮化。 关键词：苹果属；“扎矮山定子”：d i r 基因；矮化突变；生长素 沈阳农业大学硕士学位论文 只l j吾 苹果是具有较高经济价值和栽培广泛、历史悠久的果树种类之一。在我 国，苹果是最大宗的水果，面积和产量分别占水果总面积和总产量的3 5 和 3 6 6 ，是日常生活当中十分重要消费品。 上个世纪三十年代以来，欧美各国为改进果树生产，发展了果树集约化 生产技术。苹果生产实现了稀植栽培向矮化密植栽培的转变，矮化密植已成 为当前苹果集约化栽培的主要方式，矮化密植主要依靠矮化砧木和矮生紧凑 型品种。 但是，由于苹果属植物的基因杂合性高、矮生性状通常由多基因控制、 实生后代无法稳定地保持其母本的优良性状，所以目前的苹果无性系矮化砧 木都不能利用种子进行繁殖，而只能采取扦插、压条、组织培养等方法进行 繁殖。于是，苹果的矮生砧木实生化的研究成为现代苹果砧木育种的一个重 要课题。由于苹果属植物生长周期长、自交亲和力差、基因型复杂、种子繁 殖在保持矮化性状方面存在不足等自然属性的存在，致使近些年来对这方面 的研究一直没有突破性的进展，此外，优良的矮化资源的匮乏、在矮化砧育 种思路上无刨新的突破也成为苹果属矮生砧术实生化研究的瓶颈。 一、优良矮生种质资源一“扎矮山定子” “扎矮山定予”是内蒙古呼伦贝尔盟农业科学研究所于1 9 7 6 年从该所 果树原始材料圃2 0 0 株3 4 年生的山定子中发现的一株矮生山定子，并编 号为“扎矮7 6 ”( 孟庆炎，1 9 9 1 ；孟庆炎，1 9 9 7 ) 。这是我国首次发现的极抗 寒矮生种质，经过多年观察，其矮生遗传性状稳定，可与来源不同的苹果品 种杂交，传递其矮化性状。利用“扎矮山定子”作母本和父本，与g m 2 5 6 、 大秋、m 9 、普通山定子等杂交，f l 代实生苗表现为分离，出现两种类型， 即一类是普通型植株，一类是矮生型植株，中间无过渡性植株出现。矮生型 植株极矮，节间短，叶片多为近圆形，多皱褶，叶缘锯齿大，呈丛状；普通 型植株，植株高，节间长，叶片纺锤型，平展，叶缘锯齿小。“扎矮山定子” 自然杂交实生苗后代也表现为高株与矮株l ：1 分离。 前言 从杂交试验结果看出，“扎矮山定子”植株的高矮为一对性状，在f 1 代 分离的表现型与亲本相同，未表现双亲的过渡中间类型性状。一般认为，树 性的矮化和乔化在遗传上是一个非常复杂的数量性状，而“扎矮山定子”的矮 生性状则为主基因控制的质量性状。因此，“扎矮山定子”的发现对矮生砧木 的育种工作具有重要的实际意义。 沈阳农业大学园艺学院对这一珍贵的抗寒矮生资源进行了系统的、多方 面的研究( 董文轩，1 9 9 5 ；张开春，1 9 9 7 ；毕晓颖，2 0 0 0 ；乔志新，2 0 0 3 ) ， 认为“扎矮山定子”的矮生性状是显性主基因d w 控制，其基因型为d w d w 杂 合体。“扎矮山定子”与普通山定子相比，其吲哚乙酸( i n d o l e - 3 一a c e t i ca c i d ， i a a ) 含量低，约为普通山定子的1 7 o 7 2 1 ，赤霉素( g i b b e r e l l i n s ，g a s ) 含量是普通山定子的1 5 5 9 2 1 4 3 。 由于苹果的基因型复杂，关于d w 基因致矮机理的研究进展比较缓慢。 尽管经过了多年的研究，目前仍未找到该突变基因，对于“扎矮山定子”的 致矮机理仍未充分理解。 二、植物激素吲哚乙酸的研究进展 “扎矮山定子”的吲哚乙酸含量是普通山定子的1 7 0 7 2 1 ，表明d w 基因致矮机理与吲哚乙酸有密切的关系。对“扎矮山定子”进行关于吲哚乙 酸的研究是探索其矮生机理的重要途径。在各种植物激素当中，生长素吲哚 乙酸是研究历史最长( f w w e n t ，1 9 2 6 ) ，农业上的应用最广，经济效益最 大的一种非常重要的植物激素，分子式为c l o h 9 0 2 n ，分子量为1 7 5 1 9 ( r k 6 9 l ，1 9 3 4 ) 。 吲哚乙酸的生理作用主要为促进伸长生长，促进根的生长和不定根的 形成( r e e drc ，e t a l1 9 9 8 ) ，对养分起调运的作用，还有促进开花( m a r i k o0 ，e t 日，1 9 9 9 ) 、引起顶端优势、诱导雌花分化、维管束的形成、根的向地性生长 ( m u l l e ra ，e la l1 9 9 8 ) 、茎叶的向光性生长、促进光和产物的运输、叶片的 扩大和气孔的开放等生理作用。生长素对植物生长发育有多种影响：其在植 物体内合成、代谢、运输、作用机理及调节等方面的知识，与其它植物激素 相比，已较为丰富，但仍缺乏完整的结论。 沈阳农业大学硕士掌位论文 ( 一) 吲哚乙酸代谢的研究 1 吲哚乙酸的合成代谢 植物体内生长素存在多种合成途径，颇为复杂。吲哚乙酸的合成途径主 要有二：一条是色胺( t a m ) 途径，另一条是吲哚丙酮酸( i p y a ) 途径，最 后合成i a a ；还有一条是由吲哚乙醛肟( i n d o l e 。3 一a c e t a l d o x i m e ) 经中间产物 吲哚乙腈( i a n ) 合成i a a 的系统( 李宗霆，周燮1 9 9 6 ) 。 高等植物中都含有与上述合成系统有关系的酶系，如加入中间产物，便 很快转变成i a a 。近年来对于生长素合成途径的研究已表明，除原先认为的 色氨酸途径外，也有不依赖色氨酸为底物的合成途径。 吲哚乙酸在植物体内可以与多种代谢物形成无活性的结合物，即结合态 的i a a ( b o u n da u x i n ) ，结合态的i a a 可由相应的酶促催化释放出有活性的 i a a ，即游离态的i a a ( f r e ea u x i no 植物通过这些过程调节体内的活性生长 素的含量。 2 羁i 哚乙酸的降解代谢 生长素吲哚乙酸的降解有两条途径，即酶氧化降解和光氧化降解。酶氧 化降解是i 从的主要降解过程，催化降解的酶是吲哚乙酸氧化酶( i a a o x i d a s e ) ，它是一种含f e 的血红蛋白。i a a 的酶促氧化包括释放c 0 2 和消耗 等摩尔的0 2 。i a a 氧化酶的活性部位需要两个辅助因子，即m n 2 和一元酚 化合物，邻二酚则起抑制作用。植物体内天然的i a a 氧化酶辅助因子有对 香豆酸、4 羟苯甲酸和堪菲醇等；抑制剂有咖啡酸、绿原酸、儿茶酚和栎精 等。i a a 氧化酶在植物体内分布与生长速度有关。i a a 的光氧化产物和酶氧 化产物相同，都为亚甲基氧代吲哚( 及其衍生物) 和碍i 哚醛。i a a 的光氧化 过程需要相对较大的光剂量。水溶液中的i a a 光照后分解速度加快。这种情 况表明，在自然条件下很可能是植物体内的色素吸收光能促进了i a a 的氧化 ( 王忠，2 0 0 0 ) 。 ( 二) 吲哚乙酸的生理特点 1 促进生长 生长素对生长的重要作用，没有生长素就没有生长( fw w e n t ，1 9 2 6 ) 。 吲哚乙酸最明显的效应就是在外用时可促进茎切段和胚芽鞘切段的伸长生 长，其原因主要是促进了细胞的伸长。生长素对生长的作用有三个特点： 前言 ( 1 ) 双重作用 吲哚乙酸在低浓度下可促进生长，而高浓度时则抑制生长。吲哚乙酸对 任何一种器官促进生长时都有一个最适浓度，低于这个最适浓度称亚最适浓 度，这时生长随浓度增加而加快，高于这个最适浓度是称超最适浓度，这时 生长效应随浓度的增加而下降。当浓度高到一定程度后则抑制生长，可能是 高浓度吲哚乙酸可诱导乙烯产生的结果。 ( 2 ) 不同器官对吲哚乙酸的敏感性不同 根对吲哚乙酸的最适浓度大约为1 0 。o m o l l - 1 ，茎的最适浓度为2 1 0 4 m o l l ，而芽的最适浓度处于根与茎之间，最适浓度为1 0 一m o l l 。由于根 对吲哚乙酸十分敏感，所以浓度稍高就会引起抑制作用。不同时期和生理状 态的细胞对吲哚乙酸的反应也不同，幼嫩细胞对吲哚乙酸反应灵敏，而老的 细胞的敏感性下降。高度木质化和其它分化程度很高的细胞对吲哚乙酸都不 敏感。 ( 3 ) 吲哚乙酸对离体器官和整株效应有别 吲哚乙酸对整株植物作用效果不如对离体器官的作用效果显著。 2 吲哚乙酸的极性运输 ( 1 ) 吲哚乙酸极性运输的特点 高等植物的生长发育受激素的广泛调控，其中以吲哚乙酸的作用尤为独 特，因为吲哚乙酸在植物组织内的浓度梯度是由极性运输来维持的，而正是 激素在植物组织内的含量决定了该组织的发育命运。吲哚乙酸的极性运输是 指吲哚乙酸在植物体内由形态学的一端向形态学的另一端单向运输的现象 ( 李宗霆，周燮1 9 9 6 ) 。二十世纪三十年代末，禾谷类植物中的吲哚乙酸的 极性运输得到证实，后来发现所有高等植物的茎和根中都存在吲哚乙酸的极 性运输。目前己知的植物激素中只有吲哚乙酸具有极性运输这一特征，吲哚 乙酸的极性运输与植物花的发育、胚胎的形态建成以及维管的分化等生理现 象有密切联系。 吲哚乙酸的极性运输只局限于胚芽鞘、幼茎及幼根的薄壁细胞之间，运 输距离短，速率小，每小时仅约5 2 0 毫米，其方向由细胞内吲哚乙酸载体 的分布等因素所控制。维管系统中的吲哚乙酸运输速率大，距离远，其方向 由水势梯度差异等因素所控制。吲哚乙酸的极性运输也与扩散不同，其速率 约比扩散速率大1 0 倍。极性运输是吲哚乙酸所特有的一种从细胞到细胞的 6 沈阳农业大学硕士学位论义 主动运输。它需要消耗能量，并且可以维持吲哚乙酸的逆浓度梯度运输。缺 氧、低温或2 , 4 二硝基苯酚、碘乙酸等呼吸抑制剂可以阻止吲哚乙酸的极性 运输。就运输部位而言，虽然在胚芽鞘中似乎所有细胞都具有吲哚乙酸的极 性运输能力，但在大多数组织中，极性运输仅局限于某些特定细胞。但可以 肯定的是，在中央维管组织中存在着一股从茎端到根尖的吲哚乙酸极性运输 的主流，在双子叶植物的茎中极性运输主要是通过围绕维管束的已经延伸的 薄壁细胞进行的。在根的不同组织中存在着两种截然不同的运输方式：在中 柱细胞中由根基向根尖的向顶式运输和表皮细胞中由根尖向根基的向基式 运输。 ( 2 ) 吲哚乙酸的极性运输机理假说 吲哚乙酸极性运输的化学渗透偶联学说是在二十世纪7 0 年代中期由 r u b e r y 等和r a v e n 分别独立提出的。其基本观点是：在酸性的细胞壁中，吲 哚乙酸以弱酸的形式经载体协同运输或自由扩散的方式进入细胞；一旦进入 中性细胞质，吲哚乙酸主要以离子的形式存在并在细胞中大量积累：离子形 式的吲哚乙酸通过分布于细胞基部的离子载体顺浓度梯度输出细胞，正是由 于输出载体在细胞中的极性分布决定了吲哚乙酸的极性运输；吲哚乙酸的极 性运输所需要的能量是由跨膜质子电位提供的。该学说提出后，得到了普遍 认同。尤其令人注意的是最近从吲哚乙酸极性运输突变体中克隆的一些基 因，从分子水平上为吲哚乙酸的极性运输的化学渗透偶联学说提供了新的证 据。 ( 3 ) 吲哚乙酸极性运输的输入载体和输出载体 对吲哚乙酸作用机理的研究已成为科研领域的热点，与吲哚乙酸有关的 一些突变体( 见前言表1 ) 也被广泛用于吲哚乙酸极性运输机理的研究工作。 吲哚乙酸进入和运出细胞分别由输入载体和输出载体介导( 许智宏1 9 9 8 ， 倪为民等2 0 0 0 ) 。 吲哚乙酸的输入载体由a u x i 基因编码( m a r c h a n t ，e ta l1 9 9 9 ) ；i a a 输 入受质膜外h + 浓度控制，p h 5 是有利于i a a 输入的酸度。h + 与i a a 有伴同 输入现象，进一步研究表明吲哚乙酸可能以2 h + i a a 一协同运输的方式进入 细胞。拟南芥a u x l 突变体根的生长对吲哚乙酸的敏感性下降，并丧失根的 向地性反应。b e n n e t t 等从拟南芥基因组中分离到了a n 基因，该基因编码 的蛋白产物具有多个穿膜伸展螺旋，与植物中的氨基酸通透酶同源，具有运 前吝 输氨基酸类似物的能力。i a a 在结构上与色氨酸类似，因而a u x l 蛋白具有 运输吲哚乙酸的能力。 输出载体则至少有两部分组成，一部分是对n p a ( n 一氨甲酰苯甲酸萘酯) 和t i b a ( 三碘苯甲酸) 等哼i 哚乙酸极性运输抑制剂敏感的调节哑基，另一 部分则是介导吲哚乙酸运输的催化亚基( m o r r i s ，e ta l1 9 9 1 ：m u d a y ，2 0 0 0 ) 。 编码调节亚基的基因还没有被克隆；催化亚基则由p z 基因家族编码，其蛋 白含有跨膜区域，定位于细胞质膜( g i i l w e i l e r ，e l a l1 9 9 8 ；p a l m e 和g a l w e i l e r ， 1 9 9 9 ) 。人们普遍认为，吲哚乙酸输出载体在质膜上的不对称分布导致了吲 哚乙酸的极性 前言寰i i a a 突变体 p r e f a e e t a h i eli a a 巾u r n n t s 突变体形态和生理变化 对吲哚己酸不敏感，叶呈深绿色，无根 原生质的分裂和生长不需要吲哚己酸 对吲哚乙酸、脱落酸和细胞分裂素都不敏感，脱落酸含量降低升源脱落酸可改正形态 上的变化。 对吲哚己酸不敏感，根和茎向地性反应减弱，叶卷曲并呈深绿色，无侧根。 对吲哚乙酸不敏感，根向地性反应减弱 对吲哚乙酸、乙烯和细胞分裂素都不敏感根向地性反应迟缓。 对吲睬乙酸、乙烯和细胞分裂素都不敏感，茎生长受抑制。顶端优势减弱根向地件反 应迟缓 对叼i 哚乙酸、脱落酸和细胞分裂素都不敏感，根和茎的向地性反应受抑制，无根毛顶 端优势增强 对吲哚己酸不敏感，根向地性减弱。 对吲哚乙酸不敏感，茎生长受抑制 对细胞分裂豢不敏感，无显著性形态变化 运输。p i n l 在膜上的极性定位就是对这一模型的支持。已有的试验证据表 明，吲哚乙酸输出载体的不对称分布可能是通过高尔基小泡的局部定位分泌 实现的，高尔基生成的小泡及其与肌动蛋白细胞骨架相互作用所产生的蛋白 质分泌作用，可能调控着输出蛋白复合物的局部定位。而吲哚乙酸输出载体 的一个亚单位与肌动蛋白细胞骨架之间的一种连接( 物) 可能维系着这种定 胖胁 ：塞 黼即瓶哪垂萋耐 刊 神 州吖州 扰州农业丈字坝士学位论卫 位分布。 通过用吲哚乙酸极性运输抑制剂处理植物材料可揭示吲哚乙酸在控制 维管束发育方面的重要作用。在维管束发育异常的组织中也观察到了其吲哚 乙酸极性运输的能力发生了变化( c a r l a n d 和m c h a l e ，1 9 9 6 ；p r z e m e c k ，e ta l 1 9 9 6 ) 。拟南芥的p i n i 突变是多效性的，除胚胎两侧对称受到影响外，还表 现为叶脉发育异常，叶片形状扭曲( p o z z i ，e t a l 2 0 0 1 ) 。陆地棉，突变体表型 与拟南芥吲哚乙酸极性运输能力下降的突变体很相似( 朱勇清等，2 0 0 3 ) ， 且与手l 矮山定子”的表型极为相似。这对于从吲哚乙酸水平揭示d w 基因试 材致矮机理提供了有益的启示。 三、本研究的目的与意义 随着果树集约化生产技术的不断发展，对矮化砧木的需求也不断增加。 但由于苹果属植物的基因杂合性高、矮生性状通常由多基因控制、实生后代 无法稳定地保持其母本的优良性状等原因，目前的苹果无性系矮化砧木只能 采取扦插、压条、组织培养等方法进行繁殖。于是，培育能够利用种子繁殖 的矮生砧木己成为现代苹果砧木研究的重要内容。近些年来对这方面的研究 一直没有突破性的进展，优良的矮化资源的匮乏、以及在矮化砧育种思路上 无创新的突破阻碍了苹果属矮生砧木实生化的研究。 “扎矮山定子”是我国首次发现的极抗寒矮生种质，其矮生性状由显性单 基因控制，其矮生遗传性状稳定，可与来源不同的苹果品种杂交，传递其矮 化性状，是一个优良的矮生种质资源。但其存在嫁接亲和性差、后代出现分 离的缺点。为了更好的了解、改造并利用这一矮生资源，仍要对其进行详尽 的研究。尽管经过多年探索，我们在其生物学性状方面已经积累了许多宝贵 的材料，其矮化机理的研究也得了一些有意义的成果。但要明确阐明“扎矮 山定子”的矮生机理，以往工作还是远远不够的。 本文以植物激素吲哚乙酸作为研究重点，从吲哚乙酸的代谢、极性运输 过程和材料本身对吲哚乙酸的敏感性三个方面，对含有d w 基因的“扎矮山 定子”试材进行系统的研究，从而进一步揭示“扎矮山定子”的矮生机理。 9 材料与方法 一、试验材料的培养 材料与方法 ( 一) 实生苗的培养方法 试验用的3 # 普通山定子、“扎矮山定子”母株( 1 9 9 2 年由扎兰屯引入枝 条的高接树) 等三份资源的自然受粉果实采自沈阳农业大学果树育种基地 ( 2 0 0 3 年1 0 月1 同) 。采后的果实浸泡在水中2 0 天左右，使果肉软化，用 清水将果柄、果皮、果肉冲掉，然后用手轻搓剩下的种子，去除种子外的革 质化覆盖物( 子房内壁) ，将种子放在铺有滤纸的培养皿中阴干：精选出饱 满的种子进行试验。 2 0 0 4 年3 月3 0 日，对种子进行了层积处理：将种子用0 5 k m n 0 4 溶 液浸泡1 2 小时，然后用清水冲洗干净，放在铺有潮湿滤纸的培养皿中，涂 布均匀，盖上培养皿并留有缝隙，便于空气流动，在4 。c 冰箱中层积。一个 月后，种子开始大量萌发，将种子小心播种在2 0 0 孔穴盘当中，每孔一粒种 子，基质为草炭土，用喷壶喷水保证每孔的水分充足。1 2 天后种子萌发， 2 0 天左右对幼苗进行移栽，选择生长势致的幼苗移植到上口直径为1 0 厘 米的塑料小盆中。大约一周之后，幼苗进入稳定生长状态。此时，所获材料 按资源特点可分为三类：3 榉普通山定子实生苗( 3 拌苗) 、“扎矮山定子”自然 授粉后代中的光叶普通型实生苗( n o 苗) 、皱叶矮生型实生苗( d w 苗) 。 ( 二) 二倍体组培苗的培养方法 “扎矮山定子”自然授粉后代中的皱叶矮生型d w 苗和光叶普通型n o 苗的组培苗是齑接通过成熟的种胚培养获得的。具体方法为：对“扎矮山定 子”自然授粉的种予进行层积处理，待种子具备萌芽生长能力而又未长出胚 根时将种子用清水冲洗l 小时以上，用7 0 酒精消毒3 5 s ，倒出多余酒精， 直接加入0 1 h g c l 2 振荡灭菌1 0 m i n ，残余酒精可增强h g c l 2 的杀菌效果， 无菌水冲洗4 5 遍，再使用2 5m g m l 。头孢曲松钠溶液浸泡1 1 5 h 的效果 更好，最后接入m s 培养基当中。种子萌发后，选择生长势比较一致的n o 1 0 些堕垦些查堂塑兰些堡兰 苗和d w 茁进行扩繁培养。在m s + 6 一b a 0 9m g l + i b a 0 3m g l 。( 培养基中 附加激素的含量单位均为m g l ；以下相同) ：m s + 6 b a 0 8 + i b a 0 4 条件下， 两种试材均可以达到稳定的扩繁。 ( 三) 其它类型组培苗的获得 除d w 和n o 组培苗外，我们对平邑甜茶( p 苗) 、“扎矮山定子”与平 邑甜茶杂交的矮生后代优系( 含d w 基因) h 苗，即9 3 一1 0 ( 1 0 撑苗) 和9 3 2 4 ( 2 4 # 苗) 等顶芽及腋芽进行了离体培养。3 月底、4 月初在田间选用腋芽饱 满的枝条，剪成1 5 厘米大小的茎段( 每个茎段的一端带有一个腋芽) ，剥去 茎段外表皮及少许芽鳞片后，流水冲洗3 0 r a i n ，7 0 酒精消毒3 5 s ，倒出多余 酒精，直接加入0 1 h g c l 2 振荡灭菌1 0 m i n ，残余酒精可增强h g c l 2 的杀菌 效果，无菌水冲洗4 5 遍，再使用2 5 m g m l 。的头孢曲松钠溶液浸泡l 1 5 h 。 将经头孢曲松钠溶液浸泡后的无菌腋芽从茎段上取下，直接接种至培养基 m s 上，大约l 周左右选择萌发良好的腋芽转接在培养基 m s + 6 一b a l 0 + n a a 0 1 ；m s + 6 一b a l 0 + n a a 0 2 上，4 周后不定芽分化。在培 养基m s + 6 - b a l 0 + n a a 0 i 上不定芽分化效果较好。将丛生芽切成含2 3 个芽的小块，接种到培养基m s + 6 b a 0 9 + i b a 0 3 ：m s + 6 一b a 0 8 + i b a 0 4 卜， 丛生芽得到大量增殖。每2 0 d 继代一次，其中培养基m s + 6 一b a 0 9 + i b a 0 3 的新芽分化更好。此时，所获的离体材料按资源特点可分为四类：“扎矮山 定子”自然授粉后代中的光叶普通型组培苗( n o 苗) 、皱叶矮生型组培苗 ( d w 苗) 、“扎矮山定子”与平邑甜茶杂交的矮生后代优系( h 苗) 及平邑 甜茶组培苗( p 苗) 。此四类组培苗在适合的培养条件下得到了稳定高效的扩 繁，为后续试验提供了大量的试材。 ( 四) 其它试验材料的获得 沈阳农业大学园艺学院对“扎矮山定子”进行了多年的、系统的、多方 面的研究，获得了大量具有d w 基因的皱叶矮生型杂种。在沈阳农业大学果 树育种基地中，除1 0 年生的普通山定予、“扎矮山定子”母株及平邑甜茶外， 还有一年生和两年生的光叶普通型组培下地苗( n o 苗) 、皱叶矮生型组培f 地苗( d w 苗) 等几种试材供于取样，丰富了试验所需试材。 材料与方法 二、试验方法 ( 一) 外源吲哚乙酸对植物生长影响的研究方法 1 光促进吲哚乙酸分解的研究 ( 1 ) 试验试剂 吲哚乙酸试剂。 ( 2 ) 试验设计 将浓度为o 0 1 m 0 1 l “i a a 溶液分成3 0 份，每份1 0m l ，置于1 0 0m l 容 量瓶当中，以透明塑料膜封口，4 c 避光保存。将3 0 瓶i a a 溶液分别每隔一 天将一瓶i a a 溶液置于光照强度为1 5 0 0 2 0 0 0 1 x 的光照条件下，使其充分 见光，每日光照时间为1 6 h ，温度控制在( 2 4 土2 ) 范围内。 ( 3 ) 测定指标 本试验于2 0 0 4 年4 月2 7 日开始进行，当分解到第3 0 天即5 月2 7 日时， 已有3 0 瓶i a a 溶液经过光照，对所有3 0 瓶当中的i a a 溶液分别进行i a a 残留量的测定。由于l a a 与s a l k o w s k i 试剂能够发生反应，形成有色产物( 张 诚良等，1 9 9 8 ) ，通过对红色反应液在5 3 0n n l 处进行比色分析，即可成对i a a 残留量的测定。本试验设计属于创新的试验方法。 2 不同类型实生苗吲哚乙酸的敏感性比较 ( 1 ) 试验材料 本试验使用的材料为以下三类：3 拌山定子实生苗( 3 撑茁) 、“扎矮山定子” 自然授粉后代中的光叶普通型实生苗( n o 苗) 、皱叶矮生型实生苗( d w 苗) 。 ( 2 ) 试验设计 选择5 个吲哚乙酸的处理浓度，由高到低分别为：2 x 1 0 一、1 0 一、1 0 、 1 0 、1 0 9m o l l ，对照用蒸馏水代替吲哚乙酸。吲哚乙酸母液浓度分别1 0 、 5 1 0 一、5 1 0 、5 x 1 0 4 、5 1 0 。9m o l l 。对三类试材分别进行5 个吲哚乙酸 处理、1 个对照处理，每个处理1 0 次重复，所用幼苗总计1 8 0 株，其长势应 保证致。 ( 3 ) 调查指标 2 0 0 4 年6 月7 目，对每株幼苗进行第一次形态指标的调查，调查指标包 括：株高、最大节间长度、叶片数、叶面积( 基部向上数第1 5 片叶子) ， 沈阳农业大学硕士学位论文 进行记录，每隔一周调查一次。完成第一次形态指标调查后，立即用不同浓 度的吲哚乙酸母液4 0 m l 对幼苗进行处理。 ( 4 ) 注意事项 在操作过程中，不同浓度的吲哚乙酸水溶液应避免光线的直射，采用遮 光效果好的黑纸包裹，进行处理的具体时间选择在光线较弱的傍晚。在操作 过程中，不要将溶液滴在植株上，否则植株局部的生长会出现异常，如个别 的叶片面积异常增大等的情况，影响试验结果。处理完毕后，加上遮阳网， 减少吲哚乙酸因见光而引起的分解。 3 不同类型组培苗吲哚乙酸的敏感性比较及处理方法 ( 1 ) 含不同浓度吲哚乙酸的培养基的制备 不同浓度吲哚乙酸无菌液的配制 吲哚乙酸是一种见光遇热极易分解的植物内源激素。在组织培养当中， 培养基都需经过高温高压灭菌，对于需要添加i a a 的培养基来说，不能使用 常规的灭菌方法。为了解决上述问题，我们设计了一种适合于i a a 的非高温 高压的灭菌方法。具体方法如下：先用少量7 0 酒精溶解已称好的i a a 粉 末，用无菌水定容后，再通过无菌滤膜过滤2 次，以达到双重灭菌的效果， 使用时用蒸馏水逐级稀释成不同的浓度即可。为保证整个操作都在无菌条件 下进行，试验过程中所使用的器皿都需要事先灭菌，全部操作都在超净工作 台中进行。配制好的溶液要在暗处低温保存在棕色瓶内。 高温高压灭菌前后培养基体积变化 培养基经过高温高压灭菌后都会有部分损失，灭菌前后体积发生变化， 见表2 2 。在试验整个过程中，我们均选择体积为3 0m 1 的培养基。培养基 经过高温高压灭菌后，原有的3 0m l 体积损失了约1m l 。只要加入1m l 吲哚 乙酸无菌液即可恢复到原有体积。 表2 - 2 高温高压灭菌前后培养基体积变化( m i ) t a h i e2 - 2m e d i u mv o l u m e sb e f o r ea n da f t e ra u t o c l a v e 高压灭菌前培养基的体积 m e d i u mv o l u m e sb e f o r ea u t o c l a v e 高压灭蘸后培养基的体积 m e d i u mv o l u m e sa f t e ra u t o c l a v e 2 0 3 0 4 0 1 9 4 2 9 1 3 8 6 材料与方珐 ( 2 ) 试验材料 本试验以光叶普通型组培苗( n o 苗) 和皱叶矮生型组培苗( d w 苗) 、 平邑甜茶组培苗( p 苗) 和“扎矮山定子”与平邑甜茶杂交的矮生后代( h 苗) 优系9 3 1 0 ( 1 0 撑茁) 两组组培苗为试材。每组试材中均含有一个含d w 基因 试材( d w 苗、h 苗) 和一个与其进行比较的不含该基因的试材( n o 苗、p 苗) 。 ( 3 ) 试验设计 在本试验使用的培养基中吲哚乙酸的最终浓度由高到低分别为：2 l o 、 1 0 。、l o 一、1 0 、1 0 母m o l ，设1 组对照，用无菌水代替吲哚乙酸。此浓 度梯度同处理实生苗的浓度梯度，详见表2 1 。为保证每组试材受相同环境 因子的作用，可将二者共同培养在同一三角瓶中。每个三角瓶中每种组培苗 使用三株，共6 株；同一浓度处理重复1 0 瓶，共6 0 瓶；所需n o 苗、d w 苗、p 茁、h 苗( 9 3 1 0 苗) 分别为1 8 0 株，组培苗的长势应保持一致。整 个试验所需空白m s 培养基6 0 瓶，为了防止因污染而影响试验进程，在实 际操作中共制备了1 2 0 瓶m s 培养基。向m s 培养基添加不同浓度l r a a 无菌 溶液的操作应在超净工作台上进行。操作之前，所使用的器皿都要严格消毒， 以降低污染率。制备好的培养基立即存放在暗处，温度与培养室温度相同， 一一周左右观察培养基是否污染，选择来污染的培养基进行试验。 寰2 - 1 无蕾吲嘛乙奠溶液的浓度处理( t o n i l - i ) t j h i e2 - lt r e a t m e n to f s “r j l ei a as o l u t i o n s 2 0 0 4 年6 月1 7 日，将两组组培苗按要求转接在含不同浓度 a a 的培养 基当中，组培苗的大小应保证一致，且去掉全部的叶片( 使试材保持齐整， 叶片数为0 ，增加的叶片数可作为描述生长量的指标) 。上述组培苗均经过 m s 培养基1 5 天的空白培养，以消除原有激素对组培苗生长的影响。空白培 沈阳农业大学硕 学位论文 养之后的组培苗转接在含 a a 的培养基的过程应在弱光下进行，在瓶上对两 种苗做上明显的区分标记及编号，进行暗培养，时间为5 天( 试材暗培养7 天以上即出现黄花现象) ，之后转为弱光培养5 天，再进行正常光照条件下 的培养。 ( 4 ) 调查指标 暗培养前，对每瓶苗进行第一次形态指标的测定，测定指标包括：株高、 叶片数( 第一次调查时叶片数为0 ) 进行记录，以后每隔一周测定一次。 ( 二) 植株内源吲哚乙酸降解代谢的研究方法 1 不同类型植株l 从氧化酶及过氧化物酶活性分析 ( 1 ) 试验材料 本试验使用的材料为以下三组：3 # 山定子植株( 3 拌植株) 和“扎矮山定 子”母株( d w 植株) 、平邑甜茶植株( p 植株) 和“扎矮山定子”与平邑甜茶杂 交的矮生后代( h 植株) 优系9 3 1 0 ( 1 0 # 植株) 以及光叶普通型组培苗( n o 苗) 和皱叶矮生型组培苗( d w 苗) 。 ( 2 ) i 从氧化酶活性测定方法 根据t a n g 和b a n n e r ( 1 9 4 7 ) 及张诚良( 1 9 9 0 ) 的方法，稍作修改。 酶液制备：取o 2 9 新鲜叶片，加5m lo 1m 0 1 l 。1p h 6 磷酸缓冲液。样品 在冰浴的研钵中匀浆，再加2m l 同样磷酸缓冲液洗涤两次，1 5 0 0r m i n 。离 心1 5r a i n ，上清夜即为粗酶液。 酶反应：取粗酶液2 m l 、m n c l 2 溶液l m l 、2 , 4 d c p 溶液l m l 、i a a 溶液 2 m l 混合成反应混合液，对照中粗酶液由2m lp h 6 磷酸缓冲液代替。在3 0 。c 恒温水浴，黑暗条件下，保温3 0m i n 。 显色反应：取2m l 反应混合液，加入4m ls a l k o w s k i 试剂，摇匀，在同 样的条件下保温3 0m i n ，进行显色。 o d 值测定：将显色后成红色的反应液在5 3 0n l n 处比色。o d 值越小， 酶活性越大；o d 值越大，酶活性越小。 以上反应中所用试剂浓度如下：m n c l 2 溶液0 0 1 m 0 1 l 、2 ，4 d c p 溶液 0 0 1 m 0 1 l 、i a a 溶液o 0 1 t 0 0 1 l 、s a l k o w s k i 试剂( f e c l 3 0 5 m 0 1 l 一+ h c l 0 4 3 5 3 6 、。 塑整量查堕 ( 3 ) 过氧化物酶活性测定方法 酶活性测定方法参照刘文燕等( 1 9 8 4 ) 的方法，略加改动。 酶液制备：取o 2 9 新鲜叶片，加5m lo 1m 0 1 l 。p h 6 磷酸缓冲液。样品 在冰浴的研钵中匀浆，再加2m l 同样磷酸缓冲液洗涤两次，1 5 0 0r m i n 离心 1 5r a i n ，上清夜即为粗酶液。 反应系统：每支试管中加入2 0m l 愈创木酚溶液、2 0 0 1 t l 粗酶液，混匀， 在3 0 恒温水浴中保温5r a i n ，使其达到平衡。 o d 值测定：在加入2 0 0 “l3 0 h 2 0 2 lr a i n 后比色，此时红色产生，波 长选择在4 3 0 啪处。o d 值越大，酶活性越大；o d 值越小，酶活性越小。 以上反应中所用试剂浓度如下：愈创木酚溶液( 2 5 0m l0 1t 0 0 1 l “p h 6 磷酸缓冲液+ 0 7 4m l 愈创木酚) 2 赤霉素g a 。对光叶普通型实生苗( n o 苗) 的l 从氧化酶影响的 研究方法 ( 1 ) 试验材料 本试验以光叶普通型实生苗( n o 苗) 为试材。 ( 2 ) 试验设计 将事先层积好的种子播在每孔5 0m l 的穴盘当中，种子萌发出第一片真 叶时即表现出明显的光叶普通型和皱叶矮生型的特征，选取整齐的光时普通 型幼苗5 0 株，分为4 组处理( o a 一1 、g a 2 、g a 3 、g a 4 ) 和1 组对照 囊2 - 3 土施g a 3 溶液的处理( r a g l 。1 ) t a b l e 2 - 3 s o i la p p l i c a t i o n t r e a t m e n t so f g a 3s o l u t i o n s ( c k ) ，每组各1 0 株。本试验使用五个g a 浓度梯度，浓度由低到高分别为 沈阳农业大学硕士学位论文 0 0 5 、o 1 、0 2 、0 4m g l ，在对照当中，蒸馏水代替赤霉素( 见表2 3 ) 。 ( 3 ) 调查和测定指标 2 0 0 4 年6 月2 4 日进行了处理，并在处理之前进行第一次形态指标的调 查，调查指标包括：株高、叶面积，每隔1 0 天测定一次，并记录。最后， 对不同的处理进行i a a 氧化酶和过氧化物酶活力的测定。 ( 三) 有关植株内源吲哚乙酸极性运输的研究方法 1 吲哚乙酸极性运输抑制剂t i b a 对不同类型实生苗影响的研究及 处理方法 ( 1 ) 试验材料 本试验所使用的试材为光叶型山定子实生苗( n o 苗) 、3 # 普通山定子实 生苗( 3 撑苗) 。 ( 2 ) 试验设计 首先选择长势齐整的n o 苗和3 拌苗各5 0 株，各分为4 个处理和一个对 照。t 1 b a ( 三碘苯甲酸) 是一种吲哚乙酸极性运输的抑制剂，t i b a 不溶于 水，但溶于乙醇。在配置t i b a 的母液时，先用少量乙醇溶解，后加入适量 体积的蒸馏水。t i b a 是一种致癌物质操作时应注意保护。试验过程中使 用的四个t i b a 浓度梯度分别为：2 5 、5 0 、7 5 、1 0m g l ，对照使用蒸馏 水代替t 1 b a ( 表2 - 4 ) 。 表2 - 4 土拯t i b a 溶液的处理( m g l 1 t a b l e2 - 4s o i la p p l i c a t i o nt r e a t m e n t so f t i b as o l u t i o n s 材料与方法 ( 3 ) 调查和测定指标 2 0 0 4 年6 月1 7 日进行处理，处理之前进行第一次形态指标的调查，调 查指标包括：株高、叶面积，每隔1 0 天测定一次，并记录。最后，对不司 的处理进行i a a 氧化酶及过氧化物酶活力的测定。 2 吲哚乙酸极性运输抑制剂t l b a 对不同类型组培苗影响的研究 及处理方法 ( 1 ) 试验材料 本试验所使用的试材为光叶型山定子组培苗( n o 苗) 、平邑甜茶组培苗 ( p 苗) 。 ( 2 ) 试验设计 由于t i b a 不存在类似于吲哚乙酸的不耐高温高压、见光易分解的缺点， 可直接按表2 5 的处理进行培养基的配制。 衰2 - 5 t i b a 溶液的处理( r a g l ) 1 a b l e2 5t n a t m 帅t so f t i b as o l u t i o n s 袤中的培养基均为加入0 5 m g b a 的m s 堵养基 首先选择长势齐整的经空白培养的n o 苗和p 苗各7 2 株，分别分为5 个处理和一个对照。试验过程中使用的五个t 1 b a 浓度梯度分别为：1 2 5 、 2 5 、5 0 、7 5 、1 0m g l ，对照中不含t i b a 。 ( 3 ) 调查指标 2 0 0 4 年6 月1 3 日进行转接，转接后立即进行第一次形态指标的调查， 调查指标包括：株高、分枝数，每隔l o 天测定一次，并记录。 沈阳农业大学硕士学位论文 ( 四) 茎解剖 1 试验材料 以“扎矮山定子”母株、3 # 普通山定子的枝条为试材。 2 材料的采后处理 取两类材料的茎段、茎尖生长点，放入青霉素小瓶中，以f a a 固定液 ( 福尔马林5 m l 、醋酸5 m l 、7 0 乙醇9 0 m 1 ) 固定，真空泵中抽气2 4h 。 固定2 4h 以后转入7 0 的乙醇中，4 1 2 保存，备用。 3 石蜡切片制作 将保存于7 0 乙醇中的材料以7 0 、8 5 、9 5 、1 0 0 、1 0 0 的乙醇 依次脱水，每级约一个小时( 时间的长短视材料的大小而定) 。1 2 无水乙醇 + l 2 二甲苯过度到纯二甲苯透明，然后换纯二甲苯2 次，每次间隔均lh ( 在 二甲苯中浸泡的时间不可过长，否则材料容易变硬，影响制片的效果) 。将 浸在二甲苯中的、透明后的材料放于3 5 的恒温箱中保温2h 左右，不断加 入蜡屑，直至不能溶解。放入6 5 * ( 2 恒温箱中浸蜡1 2h ，然后换蜡3 次，每次 间隔lh 。包埋，以a o - 8 2 0 型切片机切片，切片的厚度1 0 1 3 微米。以粘片 剂( 明胶lg 、蒸馏水1 0 0m l 、石碳酸2 9 、甘油1 5 m 1 ) 将蜡带粘于载玻片上。 将粘有蜡带的载玻片置于4 0 。c 恒温箱中烘4 天。然后在纯二甲苯中脱蜡2 次，每次1h 。番红固绿对染( 染色步骤：l 2 无水乙醇+ 1 ，2 二甲苯1 5m i n 、 1 0 0 乙醇一9 5 一8 5 一7 0 乙醇各5r a i n ，番红( 7 0 乙醇) 1 2 - - 2 4h ，7 0 乙醇一8 5 一9 5 乙醇，固绿( 9 5 乙醇) 对染1 0s ，9 5 乙醇一1 0 0 乙醇 一1 0 0 乙醇各5s ，1 2 无水乙醇+ l 2 ：二甲苯5 5m i n ，纯二甲苯各两次，每 次1 0m i n ) ，加拿大树胶封片。 4 观测项目 在o l y m p u sb h 2 型显微镜明视野下，观察茎横切面维管束分化状况及 茎尖生长点的形态，并摄影。 材科与万j 去 ( 五) 种子萌发试验 1 试验材料 以“扎矮山定子”与3 # 普通山定子的种子为试验材料。 2 试验设计