（生物化学与分子生物学专业论文）青稞β13葡聚糖酶的纯化、性质及抗体制备.pdf

四川大学硕士学位论文 青稞b - 1 ，3 葡聚糖酶的纯化、性质及抗体制备 生物化学与分子生物学专业蛋白质化学方向 研究生：黎柳君指导老师：杜林方教授 摘要 f i - 1 ，3 - 葡聚糖酶 e c3 2 1 3 9 1 存在于大多数高等植物中。按植物种类、生理 发育期或细胞定位的不同，认为存在一个同功酶家族，可按分子量、等电点、 蛋白一级结构、细胞定位、作用方式分为多种类型。b 1 ，3 葡聚糖酶在细胞分裂， 小孢子发生，胚发生等生理发育活动中起作用，且很有可能参与植物抵抗真菌 的防御反应，是一类重要的与病程相关的蛋白( p r 2 ) 青稞是我国青海、西藏 地区特有的高原耐寒作物，有报道认为青稞种子中含有较高的b - l , 3 葡聚糖酶。 本实验将萌发的青稞种子经醋酸钠缓冲液抽提，5 0 8 5 硫酸铵分级沉 淀，d e a e c e l l u l o s e5 2 ，c m s e p h a r o s e ( f a s tf l o w ) 离子交换层析和s e p h a d e x g 7 5 分子筛层析，得到具活性的b - 1 ，3 葡聚糖酶。s d s p a g e 检测显示分子量 2 7k d a 左右的主带( 9 5 ) 。以海带多糖为底物做酶学性质研究表明：纯化的 b - 1 ，3 葡聚糖酶最适反应温度3 5 c ，最适反应p h 值范围5 0 5 5 之间，k i n 为 o 5 9m g m l 。b - i ，3 葡聚糖酶是一种热敏感蛋白，随温度升高，酶活力下降。外 加c a 2 + 对酶有激活作用，激活作用不明显，这与m a n n e r sd j 等报道的一致； p b 2 对酶有抑制作用，且抑制效果明显。蛋白荧光光谱分析也表明金属离子可 能与酶分子的侧链基团作用，使酶分子中的 r r p 和如残基的微环境发生了改 变。 本文还将纯化的f l - 1 ，3 一葡聚糖酶对新西兰兔进行免疫制备抗血清，双向免 疫扩散测定效价为1 ：6 4 。免疫印迹分析表明：制备的兔抗青棵b - 1 ，3 葡聚糖酶 抗血清能对青稞和小麦种子粗酶液中的2 7k d a6 - 1 ，3 葡聚糖酶进行特异性检 测；另外，分别在青稞粗酶渡6 7k d a 处捡测到1 条微弱杂交带，小麦3 5k d a ， 6 7 k d a 处检测到2 条杂交带，推测可能是粗酶液中存在相应分子量的与此1 3 1 ，3 四川大学硕士学位论文 葡聚糖酶氨基酸序列相似的同功酶，从而导致免疫交叉反应。对萌发不同时期 的青稞、小麦种子8 - 1 ，3 一葡聚耱酶活性测定显示粗酶液活性均里上升趋势，且 青稞粗酶液活性远高于小麦，这可能与青稞本身的耐寒性有关抗血清在青稞 种子剖面的原位杂交认为在种子外种皮、珠孔胚乳和胚中b - 1 ，3 葡聚糖酶含量 较多，符合先前文献关于酶在种子萌发过程中定位的报道。 关键词1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶；青稞；纯化；抗血清；免疫印迹 2 ： 璺! ! ! 查兰堡兰竺垒茎一 p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f6 - 1 3 - g l u c a n a s ef r o m h i g h l a n db a r l e ya n dp r e p a r a t i o no f i t sa n t i b o d y s p e c i a l t y ：b i o c h e m i s t r y m o l e c u l a rb i o l o g y g r a d u a t es t u d e n t ：l il i u - j u n s u p e r v i s o rm e n w r ：d ul i n f a n g a b s t r a c t 。， t h e8 - 1 ，3 一g l u c a n 鹤e e c3 2 1 3 9 a r ea b u n d a n t ，h i g h l yr e g u l a t e de n z y m e s ， w i d e l yd i s t r i b u t e d i n s e e d p l a n ts p e c i e s t h e y a r ca b l et o c a t a l y s eh y d r o l y t i c c l e a v a g eo ft h e1 , 3 - 8 - d g h c o s i d i el i n k a g e si nb - 1 ，3 g l u c u n s t h eb - 1 ，3 。g h c u n a s e e x i s ta saf a m i l yo fm u l t i p l ei s o f o r m st h a td i f f e ri ns i z e ，i s o e l e c t r i cp o i n t , p r i m a r y s t r u c t u r e , c e l l u l a rl o c a l i z a t i o na n dp a t t e mo fr e g u l a t i o n t h e r ei ss t r o n ge n v i d e n c e t h a tt h e s ee n z y m ea r ei m p l i c a t e di n d i v e r s e p h y s i o l o g i c a la n dd e v e l o p m e n t a l p r o c e s s e si n t h eu n i n f e c t e dp l a n t , i n c l u d i n gc e l ld i v i s i o n , f e r t i l i z a t i o n ，e m b r y o g e n e m s ，s e e dg e r m i n a t i o n b - 1 , 3 噶l u c an a s e a r ca l s oi n d u c e di nr e s p o n s et ot h e i n f e c t i o no fp l a n t sw i t h p a t h o g e n s a n da r e t h e r e f o r e ，g r o u p e da m o n gt h e p a t h o g e n e s i s - r e l a t e d 口r ) p r o t e i n sa st h ep r 2f a m i l y i nt h i sp a p e r , am a j o ri s o f o r mo f8 1 ，3 - g l u c a n a s ef r o mh i g h l a n db a r l e ys e e d i n g s h a sb e e n p u r i f i e db yf r a c t i o n a lp r e c i p i t a t i o nw i t h5 0 一8 5 a n a m o n i u ms u l f a t e ， d e a e - c e l l u l o s e5 2a n dc m s e p h a r o s e ( f a s th o w ) i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y a n d s e p h a d e xg 7 5 t h em o l e c u l a rw e i g h to fb - 1 ，3 叫u c a n a s ew a se s t i m a t e d a b o u t2 7k d ab ys d s p a g e 1 3 - 1 ，3 g l u c a n a s eh a sp ho p t i m u mo f5 5 w i t h l 锄j n a r i a n dw a s s t a b l eu pt o4 0 c w i t hh m i n a r i n ，t h ee n z y m eh a dak mo f0 5 9 m g m la n dt e m p r e t u r eo p t i m u m o f3 5 。c w h e nt r e a t e dw i t hc a 2 + p b 2 + a td i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s a c t i v i t ya s s a ya n df l u o re s c e n c es p e c t r as h o wt h a tb 1 ，3 酉u c a n a s e 3 四j i l 大学硕士学位论文 w a sa c t i v a t e d i n a p p a r e n t l yb yc a “。b u tw a si n h i b i t e dm a r k e d l yb yp b 2 + b o t h e m i s s i o ni n t e n s i t yw e r cd e c r e a s e d ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h eb i n d i n gm e t a li o n s c h a n g e d t h em i c r o e n v i r o m e n to fa r o m a t i cr e s i d u e si n6 - 1 ，3 g l u c a n a s e i nh e a t s t a b i l i z a t i o n e x p e r i m e n t , t h i s k i n do f 8 - 1 3 - g l u c a n a s e w a si d e n t i f i e d 笛a h e a t s u s c e p t i v ep r o t e i n t h ep u r i f i e d1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s ew a su s e dt oi m m u n i z et h er a b b i t t h ef i t e ro f r a b b i ta n t i b 一1 3 一g l u c a n a s es e r u mw a s1 ：6 4 t h es p e c i a l i z a t i o n so fr a b b i ta n t i 一 1 3 - 1 ，3 一g l u c a n a s es e r u mw a s i d e n t i f i e db yw e s t e r nb l o t a d d i t i o n a l l y , t h ea n t i s e r u m d e t e c t e df a i n t e rb a n d sa t3 5k d a 6 7k d aa r ep r e s e n ti ne x t r a c t sf r o mh i 曲l a l n db a r l y a n dw h e a ts e e d i ti si m p l i e dt h a t1 3 - 1 ，3 g l u c a n a s c sc o n s t i t u t eab r o a df a m i l yo f p r o t e i n s ，t h ed e g r e eo fs i m i l a r i t yi nt h e i ra m i n oa c i ds e q u e n c e sw i l ll e a dt od i f f e r e n t c r o s s r e a c t i v i t e s h o w e v e r , t h e i rs p a t i a la n dt e m p o r a lp r e s e n c ed o e sn o tm a t c hw i t h t h ea c c u m u l a t i o np a t t e r no f1 3 - 1 ，3 g l u c a n a s ea c t i v i t y a c t i v i t ya s s a yf o rd i f f e r e n t g e r m i n a t i o np e r i o ds h o wt h er e l a t i v ea c t i v i t yf r o mh i g h l a l n db a r l ye x t r a c t si sm u c h h i g h e rt h a nt h a tf r o mw h e a tm a y b ei td u et ot h ep r o p e r t yo fc h i l l i n e s s - r e s i s t a n to f h i g h l a l n db a r l y t h ew e s t e r n b l o ti ns i t us h o wt h a t1 3 - 1 ，3 g l u c a n a s ei sp r e s e n ti nl a r g e q u a n t i f i e si no u t e rc e l lw a l l so ft h ee n d o s p e r mo fs e e da n di ns e e dc o a t so fs p e c i e s i t a l s op r e s e n ta ss m a l le a l l o s i cd e p o s i t ss c a t t e r e dt h r o u g ht h es t a r c h ye n d o s p e r mo f c a r y o p s e s k e yw o r d sg - 1 ，3 g l u c a n a s e ；h i g h l a n db a r l e y ；p u r i f i c a t i o n ；a n t i - 1 3 1 ，3 g l u c a n a s e s e r u m ；w e s t e r nb l o t 4 四川大学硕士学位论文 前言 p l ，3 葡聚糖酶存在于大多数高等植物种子中( l e u b n e r - m e t z g e r 和m e i n s ， 1 9 8 9 ) ，按植物种类、生理发育期或细胞定位的不同，认为存在一个同功酶家族。 按分子量、等电点、蛋白一级结构、细胞定位、作用方式分为多种类型 ( l e u b n e r - m e t z g e r , 2 0 0 3 ) 。1 3 - l ，3 葡聚糖酶分为内切p - i ，3 葡聚糖酶( e c 3 2 1 6 或e c 3 2 1 3 9 ) ( 综述表1 ) 和外切6 - l ，3 葡聚糖酶( e c 3 2 1 5 8 ) 两种类型。内 切型以随机形式作用，作用于纤维素的非结晶区，将其切开，产生大量的非还 原端；夕 切型作用于以b 1 ，3 糖苷键连接起来的多聚糖的非还原端，顺序切割 葡萄糖残基，唯的水解产物是葡萄糖单体( r a e h e lck 等，1 9 9 9 ) 。 辛 己知的b 葡聚糖酶大多数是内切酶，据说它们在进化中促进细胞生长和分 裂细胞有机物。大量证据表明阻葡聚糖酶参与非感染植物的各种生理发育过程， 包括细胞分裂( s c h e r p 等，2 0 0 1 ) ，花粉形成和花粉管的生长( w o na l l 等，1 9 9 2 ； b u e c i a g l i a 和s m i t h , 1 9 9 4 ) ，受精( o d 等，1 9 9 0 ) ，胚胎发生( h e l l e b o i d 等，2 0 0 0 ) ， 种子发育( b u c h n e r 等，2 0 0 2 ) ，储藏物质的运输( h 呖和f i n c he r , 1 9 9 5 ；h r m o v a 和 f i n c h e r , 2 0 0 1 ) ，芽休眠( k r a b e l 等，1 9 9 3 ；r i l i l l e 等，2 0 0 1 ) ，植物对伤害，冷胁迫， 紫外，臭氧( l e u b n e r - m e t z g e r 和m e i n s ，1 9 9 9 ) 的反应等。争1 ，3 葡聚糖酶的表达 在植物种子萌发，休眠和防御反应中具有重要作用。厚厚的1 3 葡聚穗层是葫芦 科种子特有的半透性种皮结构组成成分，在发芽过程中被降解。在休眠和茄类 物种中，珠孔胚乳和种皮同样是种子萌发的物理障碍，胚乳的降解是种子萌发 的前提。b 1 ，3 葡聚糖酶在烟草，番茄等茄类种子珠孔胚乳中的诱导先于胚根的 穿出。b 1 ，3 葡聚糖酶的诱导和聚集与植物激素和环境因子联系紧密。比如，它 们均被赤霉素( g a ) 增强，而放脱落酸( a b a ) 抑制。 人们对b 葡聚糖酶研究最大的兴趣在于它在植物防御反应中所扮演的角 色。争葡聚糖酶在植物被病原菌侵染的防御反应中被诱导，因此它又被划归到 与病原相关蛋白家族p r - 2 中。p r 蛋白是有植物寄主基因编码的，在病理或相 关条件下诱导产生的蛋白质，与植物系统获得性抗性( s y s t e m i ca c q u i r e d 四川大学硕士学位论文 r e s i s t a n c e s a r ) 和系统诱导性抗性( i n d u c e ds y s t e m i cr e s i s t a n c e , i s r ) 密切相 关。根据蛋白质之间氨基酸序列的相似程度，目前已发现的p r 蛋白可分为1 1 类，b - i ，3 葡聚糖酶属于p r - 2 家族b 1 ，3 葡聚塘是许多植物病原真菌细胞壁的 主要成分病原物的侵染诱导植物6 - 1 ，3 葡聚糖酶活性的提高或者产生新的 b - 1 。3 葡聚糖酶同功酶。b - 1 ，3 葡聚糖酶能催化8 - l ，3 葡聚糖多聚体的水解，从 而抑制真菌的生长和增殖。体外抑菌实验表明，葡聚糖酶对许多真菌菌丝生长 有抑制作用。 农业生产上，人们对植物抗性基因和病原菌无毒基因的分离和克隆、对病 原菌代谢过程中产生的酶的抑制剂及抗菌蛋白的研究一直是热点问题。在抗真 菌蛋白中研究最多的是几丁质酶和葡聚糖酶。将外源b 1 ，3 葡聚糖酶基因导入 植物，可提高植物的抗真菌病害能力。人们认为b 1 ，3 葡聚糖酶不仅是参与调 节种子休眠和萌发以应对环境和激素改变的关键物质，而且能帮助种子抵御病 原物。葡聚糖酶制剂不会引起有机体突变，也不会引起人工培养的人淋巴细胞 染色体失常，对人体是安全的。因此，研究1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶的抗真菌机理具有 重要的现实意义。 对6 - 1 ，3 葡聚糖酶的研究一直是一个热点，截至2 0 0 6 年4 月，在e x p a s y ( e x p e r tp r o t e i na n a l y s i ss y s t e m ) 注册的内切b 1 ，3 葡聚糖酶达4 8 个( 综述表 1 ) 。本文选择我国西藏、青海地区特有的高原作物青稞种子为材料，分离纯化 出一种b 1 ，3 葡聚糖酶，并借助s d s p a g e 荧光光谱等方法对其酶学基本性质 和抗真菌活性等进行研究，对b 1 ，3 葡聚糖酶的后续研究提供可靠的参考价值。 此外，将纯化的b i ，3 葡聚糖酶对新西兰兔进行免疫制备抗血清，采用双向免 疫扩散法对效价进行测定；利用w e s t e r nb l o t 对抗血清进行特异性鉴定。制备 的抗血清为从分子水平上研究b 1 ，3 葡聚糖酶在植物生理活动中的可能作用和 在细胞中的定位等奠定了基础。 四川大学硕士学位论文 第一章青稞中b l ，3 一葡聚糖酶纯化及酶学性质研究 1 、材料与方法 1 1 供试植物材料 青稞( h o r d e n mv u l g a t e , v a tn u d u 帆如d 丘印种子采自西藏地区；取健康饱 满青稞种子经o 0 2 硝酸汞消毒，用水冲洗后置于湿润纱布上于2 0 下萌发。 1 2 仪器与试剂 1 2 1 仪器 最 a m e r s h a mp l m r m c i am i n iv e 电泳仪；a m e r s h a mp h a r m e i a a k t a f p l c ( 快速 液相层析系统) ；e p p e n d o r fc e n t r i f u g e5 8 0 4 r 冷冻离心机；h i t a c h if 4 5 0 0 荧 光分光光度计；u v - 2 4 0 紫外一可见光光度计；全自动数码成像及分析系统( 美 国s y s n g e n e 公司的g e n e g e n i u s 系统) 。 1 2 2 主要试剂 d e a e c e l l u l o s e5 2w h a t m a n 公可 c m - s e 曲a r o s e ( f a s tf l o w ) w h a t m a n 公司 s e p h a d e xg 一7 5 w h a t m a n 公司 苯甲基磺酰氟( p m s f ) e m e r c k 公司 海带多糖( l a m i n a r i n )s i g m a 公司 丙稀酰胺( a c r ) ，甲叉双丙稀酰胺( b i s ) s i g m a 公司 标准分子量蛋白 a m e r s h a mp h a r m c i a 公司 考马斯亮蓝r 一2 5 0 ，g 一2 5 0f l u k a 公司 2 ，3 ，5 - - t r i p h e n y l t e t r a z o l i u mc h l o r i d e a e r s h a r ap h a r m c i a 公司 其他试剂为国产分析纯试剂。 7 1 3 实验方法 1 3 18 - i , 3 - 葡聚糖酶的分离纯化 1 3 i ib - i ，3 葡聚糖酶粗酶液的提取 种子以1 ：3 5 ( w v ) 加入冰冷的匀浆缓冲液a1 5 0n u n o l l 醋酸钠，1 0 m m o l le d t a ，5m m o l l b 巯基乙醇，1 0m m o l l 苯甲基磺酰氟( p m s f ) ，p h 5 o 】，捣碎，静置4 0m i n ，离心( 1 50 0 0 x g ，2 0m i n ) ，上清液为租酶液。 1 3 1 2b - 1 ，3 葡聚糖酶离子交换层析 粗酶液用5 0 0 h 8 5 饱和硫酸铵分级沉淀，1 50 0 0 x g 离心4 5m i n ，沉淀用 缓冲液b ( 5 0 m m o l l i r i s h c i ，i o m m o l l e d t a ，5 m m o l l b - 巯基乙醇，p h 8 0 ) 溶解，并对缓冲液b 透析过夜。已透析的酶液经预先用缓冲液b 平衡好的 d e a e - 5 2 离子交换柱( 2e m x 8e r a ) 吸附，收集穿透峰( 活性峰) ，对缓冲液c ( 2 0 m m o l l 醋酸钠，1 0 m m o i l e d t a ，5 m m o l l b - 巯基乙醇，p h 5 0 ) 透析过夜， 浓缩后上预先用缓冲液c 平衡好的c m s c p h a r o s cf a s tf l o w 离子交换柱( 2 c r u x 8c m ) 。先用缓冲液c 洗脱至a m o 0 0 5 ，再换用0 - 0 5m o l l n a c l 溶液进 行线性梯度洗脱，收集活性组分。 1 3 1 3b - 1 ，3 葡聚糖酶分子筛层析 冷冻干燥浓缩活性组分，旅于缓冲液d ( 1 0 0m m o l ln a c i ，2 0m m o l l 醋 酸钠，1 0m m o l l b 一巯基乙醇，p h7 0 ) 预先平衡好的葡聚糖凝胶 s c p h a d e xg - 7 5 柱( 1 2c r a x 6 0c m ) 】，流速1 8m l h 一，并收集活性组分，得到4 1m gb - 1 ，3 - 葡聚 糖酶。 以上步骤均在4 c 度下操作。 1 3 2f t 1 3 葡聚糖酶纯度鉴定及分子量测定 s d s - p a g e 参照l a e m m l i 系统( l a e m m l i1 9 7 0 ) ，分离胶和浓缩胶浓度分别 为t 5 和6 ，凝胶厚度0 7 5m m 。样品经样品处理液( 5 s d s ，2 b - 巯基乙 8 四川大学硕士学位论文 醇，1 0 的甘油，5 0m m o l l t r i s - h c l ，p h6 8 ) 8 0 。c 水浴l o m i n 后上样，电泳 胶板用考马斯亮蓝r - 2 5 0 染色。标准蛋白为a m e r s h a mp h a r m e i a 公司的小分子 量标准蛋白 以标准蛋白的相对迁移率( r f ) 为横坐标，相应标准蛋白分子量( h 缸) 的 对数为纵坐标，绘制标准曲线，计算b 一1 ，3 - 葡聚糖酶的分子量。 1 3 3p - 1 , 3 葡聚糖酶的酶学基本性质测定 1 3 3 1 口1 ，3 葡聚糖酶最适反应p h 采用p h 3 5 - - 5 5 的乙酸钠一乙酸缓冲系统和p h 6 0 7 0 的p b s ( 磷酸氢二 钠一磷酸二氢钠) 缓冲系统。分别测量b l ，3 一葡聚糖酶在p h3 5 ，4 0 ，4 5 ， 5 0 ，5 5 ，6 0 ，6 5 ，7 0 时的酶活力。 1 3 3 2b 1 ，3 葡聚糖酶最适反应温度 o 1 ( w v ) 海带多糖( s i g m a 公司) 作为反应底物，酶溶液在测活缓冲液 ( 5 0m m o l l 醋酸钠p h5 5 ) 中2 5 c ，3 5 。c ，4 5 c ，5 5 c ，6 5 c 温浴2h ， d n s 法测定反应生成的还原糖量。 1 3 3 38 一l ，3 一葡聚糖酶热稳定性 酶溶液分别在i o * c ，2 0 c ，3 0 * c ，4 0 。c ，5 0 。c ，6 0 ，7 0 c 预处理4 0r a i n ， 4 c 静置1 5r a i n 后按1 3 4 标准法测定酶活力 1 3 3 4 b 1 ，3 - 葡聚糖酶酶动力学常数k m 值的测定 单底物酶促反应初速度( 级反应阶段) 对底物浓度在固定酶浓度下呈线 性关系。酶浓度o 2m g m l 1 不变的情况下，改变底物在整个反应体系中的浓度， 3 5 。c 温浴1 0r a i n ，d n s 法测定反应生成的还原糖量。以底物浓度的倒数为横坐 标，相应的不同底物浓度下酶活力倒数为纵坐标，绘制标准曲线( l i n e w e a v e r - - b u r k 作图法) ，计算k m 值。 9 四j l f 大学硕士学位论文 1 3 3 5 c a 2 + ，p b 2 + 对1 3 - 1 ，3 萄聚糖酶活性和内源荧光光谱的影响 酶溶液与不同浓度c a 2 + ，p b “离子相互作用1 5r a i n ，按1 3 4 标准法测定 酶活力，以及测定以2 7 8l u l l ，2 9 5 n m 为波长光激发的内源荧光光谱。 1 3 46 - 1 , 3 葡聚糖酶抑菌活性研究 将供试病原菌水稻稻瘟病菌( p y r i c u t a r i ao r y z a ec a r ) 接种p d a 平板，2 7 c 保温培养2 - 3 天。然后在水稻稻瘟病菌菌落周围均匀地放置3 个牛津杯，分别 加入粗酶液，纯化的1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶溶液，对照液( 5 0m m o l l 醋酸钠p h5 5 ) 各2 0 0 # l , 继续培养3 - - 5 天，观察抑菌情况。 1 3 5 & l 3 葡聚糖酶活力测定 o 1 ( w v ) 海带多糖( s i g m a 公司1 作为反应底物，酶溶液在测活缓冲液 ( 5 0m m o l l 醋酸钠p h5 5 ) e ea s c 温浴2h ，d n s 法( w o o d 和b h a t1 9 8 8 ) 测 定反应生成的还原糖量。1 个单位的1 3 - i ，3 葡聚糖酶活力定义为i m i n 水解生成 1 m m o l 还原糖m o l m i n - i m g i ) 。 1 3 6f l - l 3 葡聚糖酶浓度测定 蛋白质浓度测定按b r a d f o r d 法( b r a d f o r d1 9 7 6 ) ，以牛血清白蛋白( b s a ) 为 标准。 2 、结果与分析 2 1b - 1 ，3 葡聚糖酶分离纯化 2 1 1 d e a e c e l l u l o s e5 2 ，c m s e p h a r o s ef f a s tn o w ) 离子交换层析 青稞种子匀浆液经5 0 8 5 硫酸铵分级沉淀，透析后，进行d e a e - 纤维 素5 2 阴离子交换层析，酶总活力的6 3 出现在穿透峰中，将其收集并用于 c m s e p h a r o s e ( f a s tf i d w ) 阳离子交换层析，洗脱时出现3 个明显的蛋白洗脱峰 四川大学硕士学位论文 ( 如图1 - 1 ) ，活性测定分析表明：峰i 具较强1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶活性，此时洗脱 的盐离子浓度大约为0 2m o l l ；而峰和峰i i i 均无酶活性。合并峰i 中具较 强酶活性的8 1 5 管 n 盯 n 0 0 i：= ： 0 寿 0 0 2 o 们 0 o 笛 n o ，51 1 0 1 0 n 0 5 n 051 01 52 02 s3 0 3 5 柏 f r a c t i o nn o 围1 - ic m - s e p h a r o s e ( f a s tf l o w ) 梯度洗脱曲线 f g 1 l e l u t i o ap r o f i l eo fb - l g l u c a u a s ea c t i v i i yo l lc m - s e p h a r o s e ( f a s tf l o w ) c o l u m n p r o t e i n sw e r ee l u t e dw i t hal i n e a rg r a d i e n to f0t o0 5mn a c i p r o t e i nc o l l t e n i w a s m o n i t o r e db yu va b s o r b a n c ea t2 8 0r i m , t h eg l u c a n s ea c t i v i t y ( 一) w a sa s s a y e di nt h ep r e s e n c eo f l a m i n a r i nb ym e a u r e i n gt h ei n c r e a s ei na b s o r b a n c ea t5 2 0r i m 2 1 2 s e p h a d e xg - 7 5 分子筛层析 上述酶液浓缩至1 5m l 经s e p h a d e xg 一7 5 分子筛层析后测定酶活性，8 一 1 3 管具较大酶活性，电泳结果显示9 一1 1 管为谱带单一活性组分。 2 1 3 纯化的b - 1 , 3 葡聚糖酶的纯度分析 不同纯化阶段的样品用s d s p a g e 检测后发现粗酶液经c m - s e p h a r o s e ( f a s tf l o w ) 离子交换层析后，大部分杂蛋白被吸收，洗脱峰中杂蛋白种类明显 减少，再经s e p h a d e xg 一7 5 去除分子量小的杂蛋白后，全自动数码成像及分析 系统( 美国s y s n g e n e 公司的g e n e g e n i u s 系统) 定量分析纯度9 5 ( 图1 3 ) 。 1 1 四川大学硕 学位论文 08住1 e2 勰弛 f r a c t i o nn o o 1 6 o 1 4 n 1 2 i o 1 0 i o 0 0 6 o o o 0 2 o 图1 - 2 s e p h a d e xg 一7 5 分子筛层析洗脱曲线 ， f i g 1 - 2e l u t i o np r o f i l eo f 8 - 1 , 3 - g l u c a b a 辨a c t i v i t yo ns e p h a d e xg - 7 5c o l u m n t h eg ! i u c a n a s ea c t i v i t yw a se l u t e da t2 7k d a ( f r a c t i o nn o 9 1 1 ) p r o t e i nc o n t e n t ( _ 枷d g l u c a n a s em i v i t y ( - - ) w e r em e a t u r e da sd e s c r i b e di nf i g 1 1 图1 - 3 纯化的b 1 3 葡聚糖酶s d s p a g e 分析 f i g 1 - 3s d s - p a g eo fs a m p l et a k e ua tv a r i o u ss t a g e sd u r i n gt h ep u r i f i t i o no f8 t , 3 - g l u e a na s e 四川大学硕士学位论文 l a n el , f r a c t i o n f r o m5 0 - - 8 5 ( n h ) 2 s 0 4 ；l a n e2 ，f r a c t i o nn o t b o u n d t o d 队e - c e l l u l o s e ； l a n e3 , p e a kif r o mc m - s e p h a r o s ef a s tf l o w ( f i g l 1 ) ；l a n e4 ，p u r i f i e dp l ，3 掣u e a n a s ef r o m s e p h a d e xg 一7 5 ：l a n emw c t h em o l e c u l a rm a s sr e f e r e n c ep r o t e i n s l a n ela n d2w e r el o a d e d w i t h2 0g gp r o t e i n s ，l a n e3a n d4w e r el o a d e dw i t h1 0l a gp r o t e i n s 2 2 1 3 - 1 ，3 一葡聚糖酶的酶学性质研究 2 2 1 p - 1 , 3 葡聚糖酶最适反应p h 在不同p h 缓冲体系中( 乙酸钠一乙酸和磷酸氢二钠一磷酸二氢钠) 测定 酶活力，实验表b s - 青稞p - 1 ，3 葡聚糖酶活力在p h4 5 - - 6 0 时较稳定，p h5 5 时最大，反应最适p h 为5 0 - - 5 5 ；p h 低于4 0 或高于6 5 时酶活力降低十分明 显( 图1 - 4 ) 。 邑 釜 三 譬 害 焉 星 3 0 3 54 04 s5 05 56 。06 57 o7 5 p h 图1 4 争l ，3 一葡聚糖酶最适反应p h r i g 1 4o p t i m u mp hf o ri m j g l u c a n a s ea c t i v i t yo fb a r l e y t h ep r o t e i nw a si n c u b a t e da tt h ei n d i c a t e dp hv a l u e su n d e rt h ec o n d i t i o n sd e s c r i b e di n “e x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e s ”a b s o r b a n c eo f m cc o l o r e dp r o d u c tw a sm e a s u r e da t5 2 0l l m 加 0 四川大学硕士学位论文 2 2 2 p i 3 - 葡聚糖酶最适反应温度 在不同反应温度下测定酶活力，实验表明：青稞p i ，3 - 葡聚糖酶活力随温 度升高而增强，最适反应温度3 5 。c ；当反应温度超过4 5 c 酶活力逐渐下降， 反应温度超过5 5 。c 时，酶活力迅速下降，6 5 。c 时几乎尚失酶活力( 图1 - 5 ) 。 2 0加5 06 07 0 t e r n p e r a t u r e i c ) 图l 5 争l ，3 葡聚耱酶最适反应温度 f i g 1 - 5o p t i m u mt e t n p e r a t u g ef o rp - i , 3 - g l u c a n a s ea c t i v i t yo fb a r l e y t h ep r o t e i nw a si n c u b a t e da tt h ei n d i c a t e dt e m p e r a t u ea n da s s a y e da si nf 嘻i - 4 2 2 3 p 一1 , 3 一葡聚糖酶热稳定性 酶溶液在不同温度下预处理4 0 m i n ，然后测定酶活力，实验表明：青稞争l ，3 一 葡聚糖酶对热较敏感，酶在1 0 。c ，2 0 ，3 0 c 时酶活力较稳定，超过4 0 c 酶 活力迅速下降，6 0 。c 时酶活力只有原来的1 3 ( 图1 6 ) 。 2 2 4 p 一1 , 3 - 葡聚糖酶米氏常数k m 值 对p 1 ，3 葡聚糖酶用乙酸一乙酸纳缓冲液配置不同浓度的底物海带多塘溶 液并使其倒数1 ，【s 】依次为0 2 5 ，0 5 ，1 ，1 5 ，2 ，2 5m g m l 的海带多糖溶液 将1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶与不同浓度的海带多糖溶液在3 7 c 下测定酶活力，为了更精 1 4 o 零一参l_u日ol_pi口配 四j i i 大学硕士学位论文 1 02 03 04 05 06 07 0 t e m p e r a t u r e ( c ) 图1 - 6 3 - 1 , 3 - 葡聚耱酶的热稳定性 r i g 1 - 6t h e r m a l s t a b i l i t yo f t h e 1 , 3 - g l u c a n a s e a l i q u o t s o f t h e e n z y m e w c r e h e a t e d o r 4 0 r a i n 越t l l e 姗l p e 豫眦i n d i c 趾e & q u e n c h e dc o l d i ni c e , a n da s s a y e d i nf i g l - 4 确地测定反应初速度，反应时间为1 0 分钟。采用双倒数作图法( l i n e w e a v e r b u r k ) 来测定对b 1 ，3 葡聚糖酶的k m 。以海带多檐溶液浓度的倒数l s 为 横坐标，反应速度的倒数l ，v 为纵坐标作图，绘出直线并外推至与横坐标相交， 在横坐标轴的截距为1 k i n ( 图1 7 ) 一般来说，底物浓度对酶促反应表现特 殊的饱和现象，如果所有其他参数，包括酶的浓度在实验中保持不变，而底物 的初始浓度在一个宽广范围内变化，则在低底物浓度时，随着底物浓度增加， 反应速度随之急剧增加，接近正比关系，符合一级反应；当底物浓度较高时， 反应速度随底物浓度增加而缓慢的增加，而不成正比；当底物浓度很高时，反 应速度与底物浓度几乎无关，达到最大反应速度。对p l ，3 葡聚糖酶来说，在 给定酶浓度下，在低底物浓度时，酶反应能很好的满足米氏方程，表观米氏常 数k i n 为2 2 x 1 0 4 m o l l ( 图1 7 ) 。 o xv参illo可o，；eio芷 四f f 大学硕士学位论文 0 7 r 2 = 0 9 8 0 6 6 一， i 。 争 一 l l s ( m 1 m g ) 图1 71 3 - 1 3 - 葡聚糖酶k m 的测定 f i g 1 - 7 l i n e w e a v e r - b u r k p l o f f o r t h e h y d r o l y s 缸o f l a m i n i a r i n b y i 3 一g l u e a n a s e t h e