（植物病理学专业论文）植物青枯菌群体猝灭基因的功能研究及利用.pdf

摘要 植物细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌( r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ) 引起的一种世界性重大病害。 青枯菌的寄主范围非常广泛，涉及5 0 多个科的2 0 0 种植物，其中包括马铃薯、番茄、茄子、辣椒、 甘薯、花生、烟草、香蕉、桑树、桉树、油橄榄等许多重要的粮食、蔬菜及经济作物。 植物病原细菌毒性基冈的表达受群体感应( q u o r u m s e n s i n g ) 信号分子一a h l ( 酰基高丝氨酸 内酯，n - a c y lh o m o s e r i n el a c t o n e ) 的调控，降解细菌产生的a h l 信号分子，猝灭其群体感应，能 够降低细菌的致病力。 i 青枯菌a a c 基因的克隆及原核表达产物的功能分析 克隆了青枯菌的a a c ( a c u l e a c i naa c y l a s e ) 基因，构建了a a c 基因的原核表达载体，获得了 a a c 融合蛋白，证实了a a c 蛋白能够降解细菌的a h l 信号分子，猝灭细菌的群体感应，明显减 弱病菌的致病力。 2 青枯菌a a c 基因突变株的构建及其致病性分析 为明确a a c 基冈在青枯菌致病过程中的作用，构建了a a c 基因重组自杀质粒，并将其电转化 至青枯菌野生型菌株中，经过体内同源重组，获得了a a c 基因插入突变株。接种番茄的结果显示， a a c 突变株的致病性较野生型明显下降，证明了a a c 基因在青枯菌致病过程中起重要作用。 3 抗青枯病转a a c 基因烟草和番茄的培育 为进一步研究a a c 基冈的功能，构建- j a a c 基因高效植物表达载体p b l l 2 1 q 4 a - a a c ，转化至农 杆菌，应用叶盘法分别转化至烟草和番茄。经过愈伤诱导及卡那霉素( k a n ) 筛选，分别获得了 3 5 株转基因烟草和1 5 株转基因番茄。经过p c r 、r t - p c r 、s o u t h e r n 、e l i s a 检测，表明a a c 基冈已 经成功整合到转基因植株的基因组中，并得到正确的表达。接种青枯菌结果显示，转a a c 基因烟草 和番茄的抗病性明显的增强，提高2 2 9 个抗性级别，评价为中等抗病水平，表现为发病时间延迟， 病情指数的降低。证明将青枯菌群体猝灭基因导入植物，是提高植物对青枯病抗性的有效策略。 4 青枯菌毒性蛋白分泌系统g s p 蛋白互作分析 为验证群体感应调控下与青枯菌毒性蛋白分泌相关的i i 型分泌系统g s p 蛋白间的互作，将青 枯菌g s p c 、e 、m 、l 基因克隆至不同的原核表达载体中，表达成g s pc 、e 、m 、l 融合蛋白。 通过包涵体蛋白变复性研究，获得了具有活性的复性后蛋白质。蛋白质体外结合试验( p u l l d o w n ) 结果显示，g s p e 和g s p l ，g s p l 和g s p m 蛋白之间可发生相互作用。利用体外蛋白结合技术进一 步验证了g s p 蛋白互作的真实性。 关键词：青枯菌；a a c 基因；群体猝灭；a h l ：转基因植物；抗病性 a b s t r a c t b a c t e r i a lw i l tc a u s e db yr a l s t o n i as o l a n a c e a r u m , i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta n dw i d e s p r e a d b a c t e r i a ld i s e a s e so fp l a n t s 足s o l a n a c e a r u mi sad e v a s t a t i n gp l a n tp a t h o g e nw i t ha nu n u s u a l l yw i d eh o s t r a n g eo f 2 0 0s p e c i e i e si n5 0f a m i l i e s s o m eo fi t se c o n o m i c a h yi m p o r t a n th o s t s a g ep o t a t o ，t o m a t o ， e g g p l a n t ，c a p s i c u m ，p a p a y a ，p e a n u t ，t o b a c c o ，b a n a n a ，m u l b e r r y ，e u c a l y p t u s ，a n do l i v e a h i _ s ( n a c y lh o m o s e r i n el a c t o n e s ) ，q u o r u m - s e n s i n gs i g n a l sr e g u l a t ev i r u l e n c eg e n ee x p r e s s i o ni n a r a n g eo fp l a n ta n da n i m a l ( i n c l u d i n gh u m a n ) b a c t e r i a lp a t h o g e n s h o w e v e r , a h l - i n a c t i v a t i o na p p r o a c h c a na t t e n u a t et h ep l a n tp a t h o g e n i c i t yo fp a t h o g e n s 1 c l o n i n go faq u o r u m q u e n c h i n gg e n ef r o mr s o l a n a c e a r u ma n db i o a c t i v i t ya s s a yo fi t sf u s i o n p r o t e i ne x p r e s s e di ne c o i l t h e 兄s o l a n a c e a r u mp r o b a b l ea c u l e a c i naa c y l a s e 气c ) g e n ew a sc l o n e db yp c ra m p l i f i c a t i o na n d c o n s t r u c t e di n t ob a c t e r i a le x p r e s s i n gv e c t o la a c f u s i o np r o t e i nw a so b t a i n e di nec o l is y s t e m i tw a s o b s e r v e dt h a tr e c o m b i n a n te s c h e r i c h i ac o l ip r o d u c i n ga a cp r o t e i n sh a da h l - d e g r a d i n ga c t i v i t ya n d c o u l da t t e n u a t et h ep l a n tp a t h o g e n i c i t yo fp a t h o g e n 2 m u t a n tc o n s t r u c t i o no fr s o l a n a c e a r u ma a cg e n ea n de s t i m a t i o ni t sp a t h o g e n i c i t y t od e t e r m i n et h ef u n c t i o no fa a cg e n ei nb a c t e r i a lw i l td i s e a s ed e v e l o p m e n t ，as u i c i d ev e c t o ro fa a c g e n ew a sc o n s t r u c t e d a n di n t r o d u c e di n t ow i l d t y p e 兄s o l a n a c e a r u mb ye l e c t r o p o r a t i o n a f t e r h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，t h ea a cm u t a n t s w e r eg e n e r a t e da n di d e n t i f i e d t h er e s u l to fs o i li n o c u l a t i o n s h o w e dt h a tt h e 口n cm u t a n t sw e r em u c hl e s sv i r u l e n to nt o m a t ot h a nt h ew i l d t y p e ，w h i c hi n d i c a t e d t h a t t h ea a cg e n ei sav e r yi m p o r t a n tf a c t o ri nt h ep a t h o g e n e s i so fr s o l a n a c e a r u m 3 b r e e d i n gt r a n s g e n i ct o b a c c ow i t ha a cg e n ea g a i n s tb a c t e r i a lw i l t t of u r t h e ra n a l y s i so ft h ef u n c t i o no fa a cg e n e ，ap l a n th i g h - e f f i c i e n te x p r e s s i o np l a s m i do fa a cg e n e ， p b l l 2 1 q 4 a 哪口c w a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d a n dt h ep l a s m i dw a st h e nt r a n s f o r m e d i n t o a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sa n dt h e ni n t r o d u c e di n t ol e a fd i s ko ft o b a c o oa n dt o m a t o u n d e rk a n a m y c i n s e l e c t i o np r e s s u r e ，3 5a n d1 5r e s i s t a n tr e g e n e r a t e dp l a n t so fn c 8 9a n d z h o n g s h u - 5 w e r eo b t a i n e d ， r e s p e c t i v e l v t h er e s u l t so fp c r ，r t p c r ，n o r t h e r n ，a n de l i s ai d e n t i f i c a t i o ni n d i c a t e d t h a tt h ea a c g e n ew a ss u c c e s s f u l l yi n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m e s o f t o b a c c oa n dt o m a t op l a n t sa n dt r a n s c r i b e dc o r r e c t l y t h er e s u i to fp l a n ti n o c u l a t i o ns h o w e dt h a tr a n s g e n i ct o b a c c oa n dt o m a t oe x p r e s s i n ga a c e x h i b i t s i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dr e s i s t a n c et or s o l a n a c e a r u mc o m p a r i n gt on o n t r a n s g e n i co n e s t h et r a n s g e n i c p l a n t sc o u l dd e l a yt h ew i l ts y m p t o md e v e l o p m e n ta n dm a k ed i s e a s ei n d e xr e d u c e d a l lo ft h e r e s u l t s t t i n d i c a t e dt h a tt h er e s i s t a n c eo fp l a n t sc o u l db ee n h a n c e db yi n t r o d u c i n ga a cg e n ei n t ot h eg e n o m i c 4 i n t e r a c t i o n sa n a l y s i sb e t w e e nt h eg s pp r o t e i n so f 町p e s e c r e t o r ys y s t e mi n 尼s o l a n a c e a r u m t oi d e n t i f i c a t i o nt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h eg s pp r o t e i n so ft y p ei is e c r e t o r ys y s t e mi n 兄 s o l a n a c e a r u mc o n t r o l l e db yt h eq u o r u m s e n s i n g ，t h eg s p c 、e 、m 、lg e n e sw e r ec l o n e di n t od i f f e r e n t b a c t e r i ae x p r e s s i o np l a s m i d s ，a n dt h ef u s i o np r o t e i n sw e r eo b t a i n e d a f t e rr e f o l d i n g ，t h er e f o l d e d p r o t e i n sw i t hb i o l o g i c a la c t i v i t yw e r eg a i n e d t h er e s u l t so fp u l l - d o w na s s a ys h o wt h a tg s p e - g s p l a n d g s p l - g s p mc a nb ei n t e r a c t ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ；a a cg e n e ；q u o r u m q u e n c h i n g ；a h l ( n a c y lh o m o s e r i n el a c t o n e ) ； t r a n s g e n i cp l a n t s ；d i s e a s er e s i s t a n c e i i i 英文缩略表 英文缩写 a h l a m p c a c a r b c f u c h l 6 b a d d h 2 0 d e p c d i g d m s o ec o i l e u s a e p s g m g s p g s t - t a g 6 x h i s - t a g 姒 i p t g k a n k b k d a l b m s a n a a n b 0 d 英文全称 n - a c y lh o m o s e f i n el a c t o n e ) a m i n o b e n z y lp e n i c i l l i n h i g h l yp o l y m e r i z e dc y c l o a m y l o s e c a r b e n i c i u i n c o l o n yf o r m i n gu n i t s c h l o r a m p h e n i c o l 6 - b e n z y l a m i n o - p u r i n e d i s t m e dt w i c ew a t e r d i e t h y p y r o c a r b o n a t e d i g o x i g e n i n d e m e t h y ls u l f o x i d e e s c h e r i c h i ac o l i e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y e x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e g e n t a m i c i n 中文名称 酰基高丝氨酸内酯 氨苄青霉素 高聚合环状淀粉 羧苄青霉素 菌落数 氯霉素 6 苄氨基嘌呤 双重蒸馏水 焦碳酸二乙酯 地高辛 二甲基亚砜 大肠埃希氏菌 酶联免疫吸附试验 胞外多糖 庆大霉素 g e n e r a l s e c r e 。r ) ，p a t h w a y t r a n s m e m b r a 鹏 一般分泌途径跨膜蛋白 p r o t e i n g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s et a g s i x h i s - t a g i n d o l ea c e t i ca c i d i s o p r o p y l - 1 一t h i o - p g a l a c t o p y r a n o s i d e k a n a m y c i n k i l o - b a s e k i l o d a l t o n l u r i a b e r t a n im e d i u m m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m a - n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d n u t r i t i o ns o l u t i o n o p t i c a ld e n s i t y i 谷胱甘肽转移酶标签 6 个组氨酸标签 吲哚乙酸 异丙基- b d - 硫代半乳糖苷 卡那霉素 千碱基 千道尔顿 l b 培养基 m s 培养基 仅荼乙酸 营养培养基 光密度 o h h l p c r p b s q q 0 s r p m r t - p c r s d s s d s p a g e s s c s t f t e ( p h 8 0 ) t e m e d t r l z o l 1 r 2 s 耵s s x g a l z t n - 3 - o x o - h e x a n o y l l - h o m o s e r i n e l a c t o n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n q u o r u m q u e n c h i n g q u o r u m - s e n s i n g r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s d s p o l y a c r y l a m i d e g e le c t r o p h o r e s i s s o d i u mc h l o r i d ea n ds o d i u mc i t r a t es o l u t i o n s t r e p t o m y c i n s - e d t a n a c lb u f f e r n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e s o l u t i o n sf o ri s o l a t i n gt o t a lr n a t y p ei is e c r e t i o ns y s t e m ， t y p ei l ls e c r e t i o ns y s t e m 5 - b r o m o - 4 c h l o m - 3 i n d o l y l - 3 - d - g l a c t o s i d e 6 ( 4 一h y d r o x y 一3 - m e t h y l b u t 一2 一e n y l a m i n o ) p u r i n e n - 3 氧己酰一l 高丝氨酸内酯 聚合酶链反应 磷酸盐缓冲液 群体猝灭 群体感应 转分钟 逆转录聚合酶链反应 十二烷基磺酸钠 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 氯化钠和柠檬酸钠溶液 链霉素 i r i s e d t a - n a c i 缓冲液 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 用于纯化总r n a 的溶液 i i 型分泌系统 i 型分泌系统 5 溴4 氯3 吲哚b d 一半乳糖苷 昏反式4 羟基3 甲基丁2 烯基氨基 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：2 0 0 8 年0 6 月0 3 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名： 导师签名： 多学 涉圾 时间：2 0 0 8 年0 6 月0 3 日 时间：2 0 0 8 年0 6 月0 3 日 中同农q p 学院博 学位论文第一帝绪论 第一章绪论 1 1 植物细菌性青枯病 1 1 1 植物细菌性青枯病的危害 植物细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌( 学名r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ( s m i t h ) y a b u u c h ie ta l ( 1 9 9 5 ) ，同义名b u r k h o l d e r i as o l a n a c e a r u m ( s m i t h ) y a b u u c h ie ta l ( 1 9 9 2 ) ，p s e u d o m o n a s s o l a n a c e a r u m ( s m i t h ) s m i t he ta l ( 1 8 9 6 ) ，简称青枯菌) 引起的一种世界性分布的重大病害，寄主 范围涉及5 0 多个科的2 0 0 多种植物( s a l a n o u b a te ta 1 ，2 0 0 2 ) ，其中包括许多与人类生活关系密切 的重要粮食、蔬菜作物、经济植物，如马铃薯、番茄甘薯、木薯、烟草、茄、辣椒、花生、香 蕉、桑树、橡胶、桉树、油橄榄等( h a y w a r d ，2 0 0 0 ：g e n i n s ，e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 全球气候变暖使得青枯病发生地区不断扩大，世界范围内的青桔病日趋严重。例如，在巴西 的一些地区，由于青枯病的蔓延而不能种植番茄、辣椒；如果不采用健康种薯，马铃薯青枯病造 成的产量损失将超过5 0 。青枯病使巴眄当地的重要经济树种桉树的死亡率高达2 5 3 0 ( p r i o re t a 1 ，1 9 9 8 ) 。在美国东南部，烟草青枯病在1 9 9 6 年曾给南、北卡罗莱纳州造成2 1 8 0 万美元的直接 经济损失。在2 0 0 3 和2 0 0 4 年美国和危地马拉发生了严重的天竺葵青枯病，造成了数百万美元的 损失( s w a n s o ne ta l ，2 0 0 5 ) 。在我国，2 0 世纪5 0 年代末期植物细菌性青枯病只在烟草、番茄、 辣椒等少数作物上为害，分布范围也仅限于长江流域及其以南地区。但到了8 0 年代，此病已在 1 7 个省( 市、自治区) 的2 0 多种栽培植物上发生，分布地域向北延伸至内蒙、宁夏等省区( h e e ta 1 ，1 9 8 3 ；何礼远等，1 9 9 5 ) 。例如，烟草青枯病是威胁烟草生产的一大毁灭性病害，此病在中 国南方烟区普遍发生，其中以福建、湖南、四川、贵州及广西危害最为严重，并有逐渐扩展的趋 势，山东烟区也有发生，目前该病造成的损失已居各类侵染性病害第四位( 朱贤朝等，2 0 0 2 ) 。 马铃薯青枯病是仅次于马铃薯晚疫病的第二大病害，该病在四川、湖北的一些地区引起相当重大 的损失。番茄青枯病在南方一些地区也引起相当重大的损失。青枯菌导致的姜瘟至今仍是生姜生 产的最大障碍；桑青枯病在广东发病已十分普遍，个别桑园发病率高达8 0 ：木麻黄青枯病已使 我国广东沿海的一些防护林带遭剑毁灭；花生青枯病一般造成1 0 2 0 的减产，严重时高达5 0 ， 甚至绝产( 梁成罡，2 0 0 1 ) 。 植物细菌性青枯病分布范围越来越广，侵染的植物种类越来越多，但一直没有找到有效控制 的方法，造成这种状况的主要原因在于：( 1 ) 植物细菌性青枯病遗传背景独特，菌系分化复杂， 小种、变种多，常规方法难以进行准确的诊断，可随着栽种材料远距离传播。( 2 ) 青枯病属土 1 中厨农业科学院博十学位论文第一节绪论 传病害，病原菌可在土壤及植物残体中长期存活，并可在某些非寄主植物上繁殖而不发病，具有 较好的隐蔽性及持久性，采取轮作、间作等传统方法无法解决根本问题，而且一些轮作作物反而 成为青枯菌病原的载体和庇护所；青枯菌甚至可在长期共进化过程中侵染原来的非寄主植物使之 发病。( 3 ) 青枯病的侵染及致病机制尚未完全明确，尽管已知青枯菌既能从植物根部伤口侵入， 也能直接侵入，但如何识别进入植物根部并到达维管束的机制仍在探索之中。 ( 4 ) 青枯菌定殖 在植物的木质部输导组织中，使罹病植株难以得剑治疗。( 5 ) 自然界中尚未找剑对青枯病免疫 性的抗源种质材料，这可能主要是由于青枯菌适应性强，变种、小种变异多，寄土植物难以发展 起有效的抗病性，因而传统的杂交育种方法在青枯病防治中难以取得理想效果。 1 1 2 青枯菌的致病过程 青枯菌可以在土壤中长期存活，是一种土壤习居菌。在自然条件下，青枯菌通过伤口或次生 根生长产生的自然裂口侵入寄主植物根部。青枯菌首先吸附到植物根部的表面，尤其是在根伸长 区域或次生根出现的位点，然后形成聚集体或微菌落( v a s s ee t a l ，1 9 9 5 ；a r a u d r a z o ue t a l ，1 9 9 8 ) 。 关于青枯菌如何最初的识别并吸附到植物根部的机制仍然未知。但是，菌体的运动性、型菌毛 和脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e s ，l p s ) 都能影响上述过程( a r a u d r a z o ue t a l ，1 9 9 8 ；k a n ge t a l ，2 0 0 2 ； s e q u e i r ae ta 1 ，1 9 8 5 ；t a n s k e r s t e ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。青枯菌进入了感病植株后，能够在4 h 内侵入根皮 层细胞的间隙。2 天至3 天后，青枯菌在根部的内皮层和维管束细胞间隙定殖( v a s s e e t a l ，1 9 9 5 ； d e n n y , 2 0 0 6 ) 。随后，青枯菌进入木质部并且扩散至植物上部，细菌浓度能够达到1 0 9c f u 克植 物组织，从而导致寄主植物快速萎蔫或者保持潜伏侵染( h u a n g e t a l ，2 0 0 0 ；m c g a r v e y e t a l ，1 9 9 9 ； s w a n s o ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 。关丁青枯菌移动至植物顶部的机制至今未知，但是可以确定，细菌1 1 1 分 泌系统和通过i i 型分泌系统产生的胞外多糖( e x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e ，e p s ) 是必须的( e t c h e b a r e ta 1 ，1 9 9 8 1s a i l ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 。青枯菌在木质部成功定殖以后，大量的细菌从根部溢出，在根的 表面形成菌脓。菌脓的形成为细菌返同至土壤及再侵染提供了机会( h a y w a r d ，1 9 9 1 ；s w a n s o n e t a l ， 2 0 0 4 ) 。 1 1 3 青枯菌的毒性因子及分泌 1 1 3 1 胞外多糖 青枯菌在培养基上和植物体内可产生大量的粘性物质，而这些粘性物质的重要成分就是胞外 多糖。青枯菌胞外多糖分子是多种化学物质组成的一种复合物，其中最主要的化学成分是氮乙酰 半乳糖醛酰胺( c o p l i ne ta 1 ，1 9 9 0 ) 。通过离子交换层析柱分析表明，青枯菌的胞外多糖分为4 2 中用农业科学院博十学位论文第一章绪论 部分，这4 部分通过非常复杂的相互作用形成了具有功能活性的胞外多糖大分子。组成胞外多糖 的第一部分是一种分子量大于1 0 6d a 的高分子物质，简称e p s i ，其含量可占总体胞外多糖的4 0 ， 其主要的化学成分是由氮乙酰半乳糖醛酰胺、2 - 氮- 2 一脱氧l 广半乳糖醛酸和2 氮乙酰4 一氮2 ，4 ，6 - 三脱氧- d 葡萄糖分子相互交联形成的三聚体，并以此为单位进一步形成多聚体，是一种酸性多糖。 研究发现e p s l 的合成受到一个1 8k b 的e p s 操纵元的控制，其中至少包含9 个与e p s l 合成及输出有 关的基因，这个操纵元的前半部分已经进行了测序( d e n n y e t a l ，1 9 9 1 ；h u a n g e t a l ，1 9 9 5 ) 。采用 转座子插入诱变法，得蛰j t e p s 操纵元失活的无e p s l 青枯菌突变株，以此突变菌株对番茄进行致 病性测定，发现致病力明显降低( d e n n y e t a l ，1 9 9 0 ；1 9 9 1 ；k a oe t a l ，1 9 9 2 ；m c g a r v e y e t a l ，1 9 9 9 ； s a f l ee t a l ，1 9 9 7 ) 。青枯菌的胞外多糖作为重要的毒性因子，其可能的作用是：1 ) 青枯菌在植物 导管产生的胞外多糖直接阻碍水分的运输，造成植株萎蔫；2 ) 为病菌提供了保护，避开了植物 组织中的有毒分子；3 ) 胞外多糖覆盖了青枯菌表面的植物细胞识别基团如脂多糖，从而防止由 于与植物细胞结合而可能发生的寄主应答反应如过敏性坏死反应等( s e q u e i r a ，1 9 9 2 ；d e n n y , 1 9 9 5 ) 。 1 1 3 2 胞外蛋白 植物青枯菌在培养条件下，可以产生多种分泌于细菌体外的蛋白质，简称胞外蛋白 ( e x t r a c e l l u l a rp r o t e i n s ，e x p s ) 。针对这些胞外蛋白研究最多是细胞壁降解酶( c e l lw a l ld e g r a d i n g e n z y m e s ，c w d e s ) ，包括果胶酶和纤维素酶。其中果胶酶包括一种内切聚半乳糖醛酸酶( p e h a ) ， 2 种外切聚半乳糖醛酸酶( p e h b 和p e h c ) 和另一种果胶甲酯酶( p m e ) 。纤维素酶包括一种内切 葡聚糖酶( e 9 1 ) 和一种外切切葡聚糖酶( c h b a ) ( a l l e ne t a l ，1 9 9 1 ；h u a n g e t a l ，1 9 9 7 ；s a i l e e t a l ， 1 9 9 7 ；t a n s k e r s t e ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。每种细胞壁降解酶对于青枯菌致病性的作用是可以叠加的，而且 没有哪一种细胞壁降解酶对于病害发展是必需的，此外，这些细胞壁降解酶的作用因菌株不同而 异( d e n n y , 2 0 0 6 ) 。例如在青枯k 6 0 菌株( 1 号小种) 中，p e h a 和p e h b 对于病菌的定殖和导致 番茄青枯病症状是必需的，而非p m e 或p e h c 。p e h a b 叔突变体比两者的单突变体的致病力要弱。 有趣的是，p e 徊怒三突变体的致病力反而比p e h a 偈双突变体稍强一些。这可能是因为p e h c 能够降解一种植物防卫反应的激发子，从而使病菌免受植物的防卫反应( g o n z a l e ze ta 1 2 0 0 3 ) 。 然而，在青枯菌g m i1 0 0 0 ( 1 号小种) ，b e g l 和c h b a 突变体能够延迟病害发展并降低病害严重 的，而非果胶酶( l i ue t a l ，2 0 0 5 ) 突变体致病性不变。除了p e h c 是由双精氨酸转运系统分泌的， 其他5 种细胞壁降解酶都是由i l 型分泌系统分泌至胞外的( g o n z a l e ze ta l 。2 0 0 7 ) 。 3 中同农业科学院博 学位论文第一帝绪论 1 1 3 3 青枯菌毒性因子的分泌 胞外分泌的成分对青枯菌的生存及其致病性都是极其重要的，细菌体内产生的胞外酶及胞外 多糖是如何分泌到胞外的? 多年研究发现青枯菌中主要有两种胞外分泌途径，臣p i i i 型分泌途径 和i i 型分泌途径。 青枯菌的i i i 型分泌系统 青枯菌的i 型分泌系统( t y p eh is e c r e t i o ns y s t e m ，t r s s ) 是由一个含有2 0 多个基因的h r p 基因 簇构成的，而该基因簇具有5 个转录单位，编码2 0 多种多肽( h u e c k 。1 9 9 8 ) 。细菌的t i s s 在植物 和动物细菌病原中相当保守，该系统对于细菌搬运效应蛋白分子直接进入植物细胞，促进病原细 菌获得营养或抑制寄主防御反应起着作用( m u d g e t te ta 1 ，1 9 9 8 ) ，其中任一基因的钝化都会导 致病原细菌失去致病能力和在植物体内的增殖，以及引起植物过敏性防御反应的能力( b o u c h e r e t a 1 ，1 9 9 2 ) 。因此，鉴定这些效应蛋白以及明确其在寄主细胞中的作用模式，对于了解该菌的致 病机制及设计更有效的抗病策略显得特别重要。目前，已经鉴定了1 4 个口计基因编码的效应蛋白， 它们均通过1 t r s s 系统进入寄主植物细胞，一般认为，a v r 基冈产物决定了病原寄主范围( s c h e l ， 2 0 0 0 ) 。目前，有9 个青枯菌的t i s s 效应蛋白已在g m i1 0 0 0 q , 种鉴定出来，通过融合系统检测的 具有毒性基因产物有v o p p 2 幂h r i p a 、b 、g 、t ( g e n i na n db o u c h e r ，2 0 0 4 ) 。2 0 0 4 年，a l i s o n 等在 烟草青枯病研究中，又发现了一+ a v r a 基冈及其同源变异系列，在能够引起青枯病的小种中，均 含有a v r a 基因的7 6 0b p 保守侧翼序列，而在非毒性小种中，这一侧翼序列为9 6 0b p ，序列分析发 现，它们分别在7 6 0b p 序列的3 个位点插入了1 7 0b p 反向重复( r o b e r t s o ne t a l ，2 0 0 4 ) 。然而，在 茄科植物中与这些效应蛋白相互作用的对应冈子研究还十分有限。 青枯菌的i i 型分泌系统 尽管t i s s 对细菌的致病性贡献最大，但研究发现当 印基因缺失后，细菌仍然具有侵染和系 统定殖维管束的能力。植物病原细菌通过( t y p ei is e c r e t i o ns y s t e m ，t 2 s ) 分泌降解植物细胞壁的 酶及多种毒性因子，破坏寄主细胞，导致组织坏死。因此，t 2 s 在细菌的致病过程中同样具有举 足轻重的作用( g e n i ne ta 1 ，2 0 0 2 ；2 0 0 4 ) 。t 2 s 广泛存在于革兰氏阴性细菌中，包括人类、动物 和植物病原细菌。它是革兰氏阴性菌中的常规代谢途径，向细胞外分泌各种蛋白，包括胞外酶、 蛋白酶、毒素和毒性因子，这些胞外蛋白毒性因子通常破坏寄主细胞，引起组织坏死和病害( c h i a l e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。t 2 s 主要以分泌途径转膜蛋白( g e n e r a ls e c r e t o r yp a t h w a yt r a n s m e m b r a n ep r o t e i n ，g s p ) 基因簇为中心，主要涉及1 2 1 5 种蛋白，通过二步转移将蛋白从细胞内运输到细胞外( j o h n s o ne t a l ， 2 0 0 6 ) ，见图1 - 1 。 4 i d l a s m 图i l 霍乱弧茁( m r w 抽。k m r ) ( ，s p 白装置模型 f 】* p r o p o s e d m o d e l f o r t h e ( i s p m a g h i n c r yo f i i b r i o 。抽k r 胛 o m ，o ul e r h n ei m m b ( j o h n s o ne t a l2 0 0 6 ) 占枯漪通过1 2 s 5 ) 泌帕多种胞外卤r ? 蛋1 7 l ，足导敛寄 枷物甚蔫的r e 盅岗素，w 此t 2 s 时r 研，t 像苛十, l i 菌这样【 根部位染，分泌胞外出r l 酶降解细胞1 书，j j 产- 牛人 女胞外多捌：造成维管柬l 章的病击尤为荸耍，足h 前围际r 研究植物躺原细荫致墒机制的模式系统之( s c h c l l ，2 0 0 0 ) 。 占竹莳( j m l l 【) i ) 【l 甜株 l 田日【q - l i 型分泌系统1 2 个g ，牡引构成，“敛病岛”蟛式存在丁摹因纰 r “3 3 4 3 1 0 4 3 3 5 5 4 0 6b p 讯特。& 。茚口牮骨弛丸茚p c 、g s p g 、舻p h 、g s p i 、g s pj 、掣p k 、野pl 、 g s p m 、g s p n 、g s p d 、g s p e q i g s pf ，其中，g 印c 足负链，如下旧l - 2 。12 个琏 小) y l 4 0 7b p 到2 4 1 7b d 小* ， 3 1 3 t 4 8 5 3 7 2 1 4 图i - 2 青枯苗g m il o o o 菌株聊基目的排列 f i g i - 2r a n k “ “。1 i n m h j m m g m i i 0 0 0s t r a i n k 3 n g 等( 1 9 9 4 ) 利丌 转伟r in 5 诱蜚我i f 枯阿3 呼小利一p 0 4 【荫株，获得了【q 际l 第一例 占梢躺菌胞外蛋l j 输川功能缺必突变株，突变林计束越失胞外蚩门，粜脞o ir 怖酶( p m e ) 、害巢 、r 乳糖凸莘酸酶( p g ) 股内源葡聚糖酶( e g ) 的成和跨过细苗内脱的能力，但这衅蚩r 【小能跨 过外腆。究蹙林埘屿铃辑和番茄机株的致苎能力大 降低，表州胞外篮f 1 质泌在肯帖苗的敦病 过托一1 起若1 分眄要的作川( k a n ge t a l ，1 9 9 4 ；何礼远，1 9 9 5 ) 。采丛w 文阼j 补法，从i 桔病 巾目科学r 瞎i 化盹 * 章绪论 莳中筛选到了n r 恢复突受浒株胞外虽白质输和致嫡功能的基凶克降( 7 3k h ) ，井洲定rd n a 序列1 刘娩利等，1 9 9 9 ，2 0 0 0 ) 。7 3k b 、片段与青枯曲g m i1 0 0 0 菌株基崮组序列比较发现，该 h 段jt 2 s 某冈簇同源，批涵盖了6 个g s p k 、l ，m 、n 、d 和e 的编码榧。在g e n b a n k ! 册 ，我i q3 号小种p 0 4 1 莳株的6 个g s p 丝w ( f e n ge l a l 2 0 0 4 ) 。 张杨( 2 0 0 6 ) 分刈