（环境工程专业论文）节杆菌w1苯酚水解酶基因及编码蛋白的研究.pdf

大连理工大学专业学位硕士学位论文 摘要 从某污水处理厂活性污泥中筛选到一株高效的苯酚降解菌，通过形态观察、生理生 化特性及1 6 sr r n a 序列分析，鉴定其为节杆菌a r t h r o b a c t e rs p w 1 ，其1 6 sr d n a 序列 的g e n b a n k 登陆号为e u 3 3 9 9 3 0 。在此基础上，通过分子生物学手段，对该菌株苯酚羟 化酶的编码基因以及编码蛋白的酶学特性进行了深入的研究。 论文以a r t h r o b a c t e rs p w 1 为研究对象，根据苯酚羟化酶的保守序列合成了一对引 物，以a r t h r o b a c t e rs p w 1 的基因组d n a 为模板，通过p c r 反应，扩增出6 8 5b p 的同 源序列。 根据扩增得到的a r t h r o b a c t e rs p w 1 苯酚羟化酶基因保守序列，采用染色体步移的 方法对其5 端及3 端的未知侧翼序列进行扩增，最终得到a r t h r o b a c t e rs p w 1 菌株的苯 酚羟化酶基因全长序列5 4 9 0b p ，其g e n b a n k 注册号为：f j 6 1 0 3 3 6 。通过分析可知， a r t h r o b a c t e rs p w i 菌株的苯酚羟化酶全基因序列中含有6 个开放阅读框，分别为： o r f l o r f 6 ，经过b l a s t 同源比对，推测其分别编码苯酚羟化酶的6 个亚基。 进一步使用p c r 的方法扩增得到苯酚羟化酶全长基因并成功地将其构建至 p e t 2 8 “+ ) v e c t o r ，转化后得到用于苯酚羟化酶蛋白表达的工程菌p e t 2 8 a ( + ) h y d r o x y l a s eb l 2 1 ( d e 3 ) 。在i p t g 诱导下，该工程菌可以稳定高效地表达苯酚羟化酶。 同时对苯酚羟化酶p h o 粗酶的活性进行了探讨，分别考察了p h 、温度、金属离子、n a d h 添加量、粗酶量、苯酚浓度对苯酚羟化酶p h o 粗酶活性的影响；并对苯酚羟化酶p h o 静止细胞对吲哚及其同系物的转化情况进行了探讨。 通过本论文的研究，成功的构建了苯酚羟化酶基因工程菌，为苯酚的高效生物降解 奠定了良好的基础。 关键词：苯酚羟化酶；节杆菌；染色体步移；工程菌构建；蛋白表达 节杆菌w i 苯酚水解酶基因及编码蛋白的研究 s t u d y o n p h e n o lh y d r o x y l a s eg e n e sa n d c h a r a c t e r i z a t i o no f e n e o d i n g p r o t e i nf r o ma r t h r o b a c t e rs p w 1 a b s t r a c t al l i g h e f f i c i e n tp h e n o l - d e g r a d i n gs t r a i na r t h r o b a c t e rs p w 1w a si s o l a t e df r o m a c t i v a t e ds l u d g e ，w h i c hw a si d e n t i f i e do nt h eb a s i so fp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s ta n d 16 sr r n as e q u e n c ea n a l y s i s t h e16 sr d n as e q u e n c eo fa r t h r o b a c t e rs p w1w a s s u b m i t t e dt og e n b a n k 谢mt h ea c c e s s i o nn u m b e re u 3 3 9 9 3 0 m e a n w h i l e ，p h e n o l h y d r o x y l a s eg e n ew a sc l o n e db ym o d e r nm o l e c u l a rb i o l o g i c a lt e c h n i q u e sa n dt h e nf u r t h e r s t u d i e dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fe n c o d i n gp r o t e i n i nt h i ss t u d y ，i tw a sd e s i g n e dt h a tt h es p e c i a lp r i m e sf r o mt h ec o n s e n s u ss e q u e n c eo f p h e n o lh y d r o x y l a s e ，a n d6 8 5b ph o m o l o g i c a lg e n e sw a sa m p l i f i e du s i n gg e n o m ed n a o f a r t h r o b a c t e rs p w 1 g e n o m ew a l k i n gw a sa d o p t e dt oa m p l i f y5 a n d3 f l a n k i n gs e q u e n c e t h ew h o l e s e q u e n c eo fp h e n o lh y d r o x y l a s e 诵t l l5 4 9 0b ps i z ew a sd e f i n e d ，w h i c hw a ss u b m i t t e dt o g e n b a n kw i t ht h ea c c e s s i o nn u m b e rf j 6 1 0 3 3 6 s i xo p e nr e a d i n gf r a m e s ，o r f l o r f 6 ， w e r ef o u n di nt h ep h e n o lh y d r o x y l a s ew h o l es e q u e n c eo fa r t h r o b a c t e rs p w1 ，w h i c hw e r e s u p p o s e dt oe n c o d e6p h e n o lh y d r o x y l a s es u b u n i t sb y b l a s t f u r t h e r , t h ew h o l es e q u e n c eo fp h e n o lh y d r o x y l a s ew a sa m p l i f i e da n dw a si n s e r t e di n t o p e t - 2 8 a ( + ) v e c t o rf o rc o n s t r u c t i o no fp h e n o lh y d r o x y l a s ce x p r e s s i o n - e n g i n e e r i n gb a c t e r i a p e t 2 8 a ( + ) - h y d r o x y l a s eb l 21 ( d e 3 ) t h ee x p r e s s i o no fp h e n o lh y d r o x y l a s ew a sh i g h e r e f f i c i e n c y a n ds t a b l ea f t e ri p t gi n d u c e d t h ec r u d ee n z y m ea c t i v i t yo fp h e n o l h y d r o x y l a s e ( p h o ) w a sd e t e c t e d s o m ea f f e c tf a c t o r ss u c ha sp h ，t e m p e r a t u r e ，m e t a li o n ， n a d ha d d i t i o nq u a n t i t i e s ，p h oc r u d ee n z y m eq u a n t i t i e s ，p h e n o lc o n c e n t r a t i o n ，e r e w a s s t u d i e d i na d d i t i o n ，t h et r a n s f e c t i o nb yi n d o l ea n di t sd e r i v e dg r o u po fp h o r e s t i n gc e l lw e r e a l s od e t e c t e d i nt h i s s t u d y ，p h e n o lh y d r o x y l a s ee x p r e s s i o m e n g i n e e r e d s t r a i nw a ss u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d ，w h i c hw i l lp r o v i d ea ni m p o r t a n ts u p p o r tf o rt h eb i o l o g i c a lt r e a t m e n to fp h e n o l i c w a s t e r k e yw o r d s ：p h e n o lh y d r o x y l a s e ；a r t h r o b o c t e rs p w 1 ；g e n o m i cw a l k i n g ；c o n s t r u c t i o n o fe n g i n e e r e ds t r a i n ；p r o t e i ne x p r e s s i o n 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 学位论文题目：聋蛰煎型! 苤硷坐逯叠醴圃显兰岛盈豆洎丝狂嚏 一 作者签名： 迫蓝煎日期：斗年l 月二过日 大连理工大学专业学位硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目：主茸菌业l 盎硷坐蟑血莹国亟鑫避弘筮砗爱 作者签名：龇 日期：逍年l 月二过日 导师签名：斗鬻吲二一 日期：年月日 大连理工大学专业学位硕士学位论文 引言 随着工农业的发展，其带来的对环境的负面影响已经成为越来越受人们关注的话 题。在我国，农业方面，全国受重金属污染的耕地多达2 0 0 0 万公顷以上，受农药和其 它化学品污染的农田约6 0 0 0 多万公顷。土壤环境质量直接关系到农产品的安全；工业 方面，化学工业、造纸工业、石油工业、制革工业、电镀工业、制药工业的污染物被随 意排放到水体、土壤等环境中，对环境造成了很大的破坏，成为健康的潜在“杀手”。在 此背景下，生物修复技术逐渐受到人们的关注。所谓生物修复技术，就是依靠真菌、细 菌甚至高等植物以及细胞游离酶的自然代谢过程，降解并且去除环境污染物的生物技 术，广义上的生物修复包括植物修复、动物修复、微生物修复和细胞游离酶修复四大主 要类型。 芳香类化合物广泛存在于自然环境中，具有很强的毒性和致癌、致畸和致突变作用， 一般都有较好的脂溶性，可以在人体和动物的脂肪组织内积蓄，从而造成长期的危害。 苯酚是芳香类化合物的一种，被广泛地用于生产或制造炸药、肥料、焦炭、照明气、灯 黑、涂料、除涂剂、橡胶、石棉品、木材防腐剂、合成树脂、纺织物、药品、药物制剂、 香水、酚醛塑料和其它塑料，以及聚合物的中间体，同时也可在石油、制革、造纸、肥 皂、玩具、墨水、农药、香料、染料等行业中使用。苯酚在医药上可用作消毒剂、杀虫 剂、止痒剂等。在实验室中，苯酚也作溶剂、试剂使用。 对于苯酚生物修复的研究，国外起步较早，尤其是微生物修复的研究。到目前为止， 已经有许多苯酚降解菌株得到了分离和研究。目前已分离和鉴定的苯酚降解菌有：根瘤 菌( r h i z o b i a ) 、藻类( a g a lo e h o r m a o n a s ) 、酵母菌( y e a s tt r i c h o s p o r o n ) 、醋酸钙不动杆菌 似c a l c o a c e t i c u s ) 、假单胞菌( p s e u d o m o n a s s p ) 、真养产碱菌似l c a l i g e n e se u t r o p h u s ) 、反硝 化菌( d e n i t r i f y i n gb a c e t r i a ) 和r a s t o n i ae u t r o p h a 等苯酚降解茵。国外许多科学家对苯酚降 解菌的功能特性和遗传机理进行了大量而深入的研究。由于我国工业化进程较晚，对于 环境生物学的研究起步也较晚，目前国内对于苯酚降解的研究基本上处于起步阶段。 由于传统的微生物修复存在着进化速度慢，修复能力弱等缺点，因此传统的微生物 修复发展比较缓慢。结合现在常用的基因工程菌构建的方法，恰好可以避开这样的缺点。 采用分子生物学的方法构建得到的基因工程菌，能够提高微生物的进化速度，增强其降 解能力。例如我们可以通过对降解酶的基因进行改造，提高基因表达的稳定性，或者对 酶的结构进行改造，提高酶的活性及底物广谱性。另外我们可以将不同的降解基因克隆 到同一菌株中，得到多降解途径的菌株，达到更好的降解效果。如果我们选择一些对重 节杆菌w i 苯酚水解酶基因及编码蛋白的研究 金属、极端环境具有更好适应性的菌株作为基因工程菌的宿主菌，还能够提高其生存能 力。 苯酚降解的关键基因是苯酚羟化酶基因，本研究的主要目的是对实验室分离得到的 苯酚降解菌株a r t h r o b a c t e rs p w i 中的苯酚羟化酶基因进行研究，将其构建至表达载体 中，并转化得到基因工程菌，这种工程菌可以通过诱导的方法表达苯酚羟化酶。本论文 同时对表达得到的苯酚羟化酶粗酶提取液进行了最适反应条件的探讨。 大连理工大学专业学位硕士学位论文 1 文献综述 1 1 苯酚的性质及污染现状 1 1 1 苯酚的物理化学性质 苯酚( c 6 h 6 0 ，p h o h ) ，又名石炭酸、羟基苯，是最简单的酚类有机物，一种弱酸， 有毒。苯酚熔点为4 0 5 ，沸点为1 8 1 7 。c ，常温下为一种无色或白色的晶体，有特殊 气味。苯酚密度比水大，微溶于冷水，可在水中形成白色混浊液。苯酚易溶于6 5 以上 的热水，并易溶于醇、醚等有机溶剂。苯酚分子由一个羟基直接连在苯环上构成。根据 苯的凯库勒式，这个羟基是连在双键上的，为烯醇式结构。但由于苯环的稳定性，这样 的结构几乎不会转化为酮式结构。酚羟基的氧原子采用s p 2 杂化，提供l 对孤电子与苯 环的6 个碳原子共同形成离域7 【键。大兀键加强了烯醇的酸性，羟基的推电子效应又加 强了o h 键的极性，因此苯酚中羟基的氢可以电离出来。苯酚是一种常见的化学品，是 生产某些树脂、杀菌剂、防腐剂，以及药物( 如阿司匹林) 的重要原料【1 】。 oh 图1 1 苯酚的化学结构 f i g 1 1 c h e m i c a ls t r u c t u r eo fp h e n o l 1 1 2 苯酚的来源及危害 芳香类化合物广泛存在于自然环境，具有很大的毒性和致癌、致突变作用，一般都 有较好的脂溶性，可以在人体和动物的脂肪组织内积蓄，从而造成长期的危害。酚类化 合物是芳烃的含羟基衍生物，根据其挥发性分挥发性酚和不挥发性酚。自然界中存在的 酚类化合物大部分是植物生命活动的结果，植物体内所含的酚称内源性酚，其余称外源 性酚。酚类化合物都具有特殊的芳香气味，均呈弱酸性，在环境中易被氧化。酚类化合 节杆菌、苯酚水解酶基因及编码蛋白的研究 物的毒性以苯酚为最大，通常含酚废水中又以苯酚和甲酚的含量最高。目前环境监测常 以苯酚和甲酚等挥发性酚作为污染指标。环境中的酚污染主要指酚类化合物对水体的污 染，含酚废水是当今世界上危害大、污染范围广的工业废水之一，是环境中水污染的重 要来源。在许多工业领域诸如煤气、焦化、炼油、冶金、机械制造、玻璃、石油化工、 木材纤维、化学有机合成工业、塑料、医药、农药、油漆等工业排出的废水中均含有酚。 这些废水若不经过处理便直接排放，灌溉农田等，将会污染大气、水、土壤和食品。酚 是一种中等强度的化学毒物，可与细胞原浆中的蛋白质发生化学反应，低浓度时使细胞 变性，高浓度时使蛋白质凝固。酚类化合物可经皮肤粘膜、呼吸道及消化道进入体内， 低浓度可引起蓄积性慢性中毒，高浓度可引起急性中毒以致昏迷死亡。一般来讲，酚进 入人体后，机体能够通过自身的解毒功能使之转化为无毒物质而排出体外，只有当摄入 量超过解毒功能时，才会有蓄积而导致慢性中毒，表现为头晕、头痛、精神不安、食欲 不振、呕吐、腹泻等症状。 1 1 3 苯酚的污染现状 由于酚的用途极为广泛，预防其污染的工作也很困难。在生产和使用酚的工厂，必 须建立严格的操作制度，谨防酚的外泻。含酚废水通常污染水源和土壤，能使鱼虾死亡， 抑制农作物的生长，对人的皮肤粘膜有腐蚀性，可以作用于中枢神经而对人类的健康造 成严重威胁。含酚有机物的毒性还在于其只能被少数的微生物分解，因此，在国内外相 继把苯酚列入有毒污染物名单，制定了严格的含酚废水的排放标准，规定饮用水的含挥 发性酚的浓度为0 0 0 1m g l ，水源水体中含酚的最高容许浓度为0 0 0 2m g l 1 2 1 。 酚类的主要污染特征如下：比较稳定，不易被微生物分解；有害于人类健康； 某些条件下，好氧微生物也能够对其进行分解。酚类排入水体后严重影响水质及水产 品质量。除了工业废水外，粪便和含氮有机物在分解过程中也产生少量酚类化合物，所 以城市中排出的大量粪便污水也是水体中酚污染物的重要来源。苯酚对各种细胞有直接 损害，它可以通过皮肤的接触而吸入，或经口腔浸入生物体内，与细胞原浆中的蛋白质 接触形成不溶性蛋白而使细胞失去活性，尤其对神经系统有较大的亲和力，使神经系统 发生病变。高浓度的酚可使蛋白质凝固及引起组织坏死、损伤，对皮肤和粘膜有强烈的 腐蚀作用。长期饮用被苯酚污染的水源，会出现慢性中毒，产生头痛、头晕、疲劳、失 眠、耳鸣、白血球下降等症状。水体中酚浓度低时能够影响鱼类的回游繁殖。当水体中 酚浓度为0 1 - , o 2m g l 时鱼肉会有酚味，浓度过高还会引起鱼类大量死亡，甚至绝迹。 酚类对水生生物和一些农作物的生理功能有影响，含酚量 1 0 0m g l 的水若用于灌溉， 必将导致农作物的减产和枯死，低浓度含酚废水灌溉农田还会使农作物中含有酚类物 大连理工大学专业学位硕士学位论文 质，不能食用。酚类物质属耗氧性污染物，大量排入水环境后，会使好氧微生物大量繁 殖，并大量消耗水中的溶解氧，导致鱼类等水生生物因缺氧而死亡。当水中溶解的氧耗 尽后，这类污染物则在水中厌氧性微生物作用下继续转化，先发酵成脂肪酸等中间产物， 继而进一步转化为甲烷、水和二氧化碳等稳定性物质，同时放出硫化氢、硫醇、粪臭素、 氨等具恶臭的气体，使水变黑、发臭，从而导致水环境质量进一步恶化。为此，美国环 保署已经将苯酚列入优先污染物和6 5 种有毒污染物名单中，我国也把苯酚列入中国环 境优先污染物黑名单之中【3 巧j 。 1 2 苯酚污染物生物修复的研究进展 1 2 1苯酚污染物的降解方法 随着人们对苯酚污染现状以及其危害性的深入认识以及水处理技术的发展，人们不 断的形成和改进多种苯酚处理技术。目前，对于废水中的苯酚类物质的处理方法主要有 三大类：物理法、化学法、生物法。伴随着技术的不断发展，各种处理方法之间相互渗 透，以达到更好的处理效果。其中物理法主要包括溶剂萃取法、吸附法、乳状液膜法、 离子交换法等 6 - 1 0 1 。化学法主要包括化学氧化法和化学沉淀法f 1 1 1 4 1 。与物理方法、化学 方法相比，生物法具有经济、高效的优点，更重要的是可以实现无害化，无二次污染， 处理量大，是目前应用最广的废水处理技术，也是我国苯酚无害化处理的主要方法。该 法对较低浓度的苯酚处理效果较好。一般，废水中的含酚量浓度在5 - 5 0 0 m g l 时，适于 用生物法处理。 从微生物的代谢形式出发，生物法可分为好氧生物处理法和厌氧生物处理法两大 类。好氧生物处理法是在有氧条件下，利用好氧微生物的作用来去除废水中的有机物。 厌氧生物法是在断绝供氧的情况下，利用厌氧微生物的生命活动过程，使废水中的有机 物转化成较简单的有机物和无机物的处理过程，也称厌氧消化或厌氧发酵法。在工程上 称为废水的厌氧生物处理l l 睨o j 。 ( 1 ) 好氧生物降解 苯酚的生物处理以好氧处理法为主，传统的好氧处理法主要是活性污泥法，此外还 有生物膜法以及生物流化床处理含酚废水的方法。 活性污泥法是当前使用最广泛的生物处理法。其基本原理是利用活性污泥巨大的吸 附能力，使废水中的酚类物质被吸附在上面，形成大量微生物凝合在一起的菌胶团。在 废水中有足够溶解氧的条件下，活性污泥以酚类物质为食料进行新陈代谢，获得能量并 不断生长繁殖，去除酚类物质，净化废水。这一过程是由物理化学和生物化学共同作用 来完成的。物理化学作用是利用活性污泥对污水中酚等物质的吸附能力，使污水得到净 一5 一 节杆菌w i 苯酚水解酶基因及编码蛋白的研究 化。生物化学作用是在有氧气的条件下，好氧菌在其新陈代谢过程中，借助其体内外酶 的作用把有害物质氧化分解为无害物质。生物脱酚系统由预处理、生化曝气和污泥脱水 三部分组成。其具有设备简单、处理效果好、受气候条件影响小等优点。但是活性污泥 法本身还有一些难以克服的缺点，如：反应池微生物浓度低，废水滞留时间长，导 致生物反应池容积大，占地多；对有毒、难降解有机物的处理能力低；运行中产 生大量剩余污泥：不易管理，常发生污泥膨胀：处理效果还不够稳定。 生物膜法是利用生物滤池中附着在过滤介质表面上的微生物粘膜来处理废水的方 法。在处理废水过程中，当废水流过生物滤池时，过滤介质吸附废水中的酚等有机物， 使微生物在过滤介质表面很快繁殖起来，这些微生物进一步吸附悬浮状胶体或溶解性物 质，逐渐形成了生物膜。生物膜能吸附废水中的酚等有机物，并在有氧存在的条件下， 通过生物氧化作用使废水中的有机物质分解，废水经处理后可以排放或作污水灌溉。 生物接触氧化法又称a s f f 法，该法兼有生物膜法和活性污泥法的优点。自1 9 8 0 年以来，在我国得到较为广泛的应用，在染料废水的处理中已取得良好的效益。本法采 用人工曝气，填料完全浸没在污水中的手段，使微生物以固定生物膜的形态附着于填料 表面，与所需净化的污水相接触，从而对水中有机污染物进行降解与转化。采用多段 a s f f 法处理含酚废水，酚的去除率可以达到9 9 9 9 。 生物流化床以砂、焦炭、活性炭等颗粒材料为载体，水流由下向上流动，使载体处 于流化状态。在载体表面生长、附着生物膜，由于载体颗粒小，总表面积大，因此具有 较大的生物量。同时，载体处于流化状态，污水从其下部、左右侧流过，增加了和载体 上的生物相接触的机会，从而强化了传质过程。生物流化床可使反应器内生物膜保持高 密度状态，在向反应器内曝气的同时使空气和生物膜保持良好接触，从而提高处理效率。 该法兼具活性污泥法和生物膜法的优点，是一种污水生物处理新技术。在生物流化床处 理含酚废水过程中，脱氢酶活性越高，酚的去除负荷越大。反应器处理含酚废水的高效 性取决于反应器中载体表面生物膜量及其生化活性。三相流化床生物反应器是将生物技 术、化工技术及水处理技术有机结合的一种新型生化处理装置，它结构简单，流体混合 性能良好，生物浓度高，传热传质效果好。由于生物膜颗粒的剧烈运动及碰撞，生物膜 表面不断更新，因而具有单位体积负荷大、反应时间短、处理能力大、运行成本低、操 作方便等优点。该装置可在节省曝气池、降低设备制作与运行费用的基础上，在高负荷 条件下处理大量的含酚废水。并且丝状菌在此系统中不易交联成团，从而避免产生污泥 膨胀和丝状菌堵塞的现象。在生物流化床法处理含酚废水过程中，脱氢酶活性越高，酚 的去除负荷越大，反应器处理含酚废水的高效性取决于反应器中载体表面生物膜量及其 生化活性。 一6 一 大连理工大学专业学位硕士学位论文 ( 2 ) 厌氧生物降解 厌氧生物处理法是指在无分子氧存在时，在厌氧微生物包括兼性微生物的作用，将 废水中的各种复杂有机物分解转化成甲烷和二氧化碳等物质的过程，通常也称为厌氧消 化。它与好氧过程的根本区别在于不以分子态氧作为受氢体，而以化合态氧、碳、硫、 氮等物质作为受氢体1 2 1 1 。 厌氧生物处理主要是依靠三大类微生物，即水解产酸菌、产氢产乙酸菌和产甲烷菌 的联合作用才能得以完成，因而可粗略地将厌氧消化过程划分为三个连续的阶段，即水 解酸化阶段、产氢产乙酸阶段和产甲烷阶段。 第一阶段为水解酸化阶段。该过程是在水解产酸菌的作用下实现的。复杂的大分子、 不溶性有机物先在细胞外酶的作用下水解为小分子、溶解性有机物，然后渗入细胞体内， 分解产生挥发性有机酸、醇类、酸类等。这个阶段主要产生高级脂肪酸。由于简单碳水 化合物的分解产酸作用要比含氮有机物的分解产氨作用迅速，故蛋白质的分解在碳水化 合物分解后产生。 第二阶段为产氢产乙酸阶段。该过程是在产氢产乙酸菌的作用下，使第一阶段产生 的各种有机酸被分解转化成乙酸和氢气，在降解有机酸时还生成c 0 2 。 第三阶段为产甲烷阶段。产甲烷菌将乙酸、乙酸盐、c 0 2 和h 2 等转化为甲烷。此 过程利用由两组产甲烷菌生理上的不同来完成，一组把氢和二氧化碳转化成甲烷；另一 组从乙酸或乙酸盐脱羧产生甲烷，前者约占总量的1 3 ，后者约占2 3 。 虽然厌氧消化过程可分为以上三个阶段，但是在厌氧反应器中，三个阶段是同时进 行的，并保持某种程度的动态平衡，这种动态平衡一旦被p h 、温度、有机负荷等外加 因素所破坏，则首先将使产甲烷阶段受到抑制，其结果会导致低级脂肪酸的积累和厌氧 进程的异常变化，严重时甚至会使整个厌氧消化过程受到破坏。 1 2 2 苯酚污染物的生物降解 化合物的可生物降解性是指通过微生物的活动使有机物分解的特性。大体包括三种 不同程度的生物降解：初步降解，即指母体有机物的一部分结构发生了变化，原有 分子的完整性已经改变，但其对环境的危害尚未去除，其分解产物仍对环境质量或生物 体健康有不良影响；环境可接受的生物降解，即母体有机物虽然还没有被彻底降解， 但已被降解到对环境无害的程度，从保护环境不受损害的目的出发，这种程度的降解是 可以接受的；最终( 完全) 降解，即母体有机物已完全无机矿化，在好氧条件下，有机 物彻底氧化分解的最终产物是二氧化碳和水。 一7 一 节杆菌w i 苯酚水解酶基因及编码蛋白的研究 不同化学结构的芳香族化合物的生物降解性不同，同时取代基团的类型、数目及位 置等，均会对芳香化合物的生物降解性产生影响。对于苯环上含有不同取代基的化合物， 其生物降解性会有差异。例如，甲基、羟基和羧基的取代使苯环上的电子密度增加，较 易进行亲电子反应，容易被氧化，改善了其生物降解性；氨基和硝基的引入则产生了相 反的结果。因此，甲苯和苯甲酸的平均降解速率高于苯，而苯胺的平均降解速率大大低 于苯，硝基苯则低于苯的降解速度两个数量级。单个取代基团芳香化合物降解性由易变 难的顺序是：苯酚一苯甲酸- 甲苯一苯_ 苯胺_ 硝基苯。 自然界存在着多种可降解芳香化合物的微生物。不同来源的芳香化合物进入生物圈 后，将由担负不同降解功能的微生物分解。迄今为止，能够降解芳香化合物的微生物有 7 0 多个属、2 0 0 余种，其中细菌和真菌占据主要位置田讲】。从代谢方式来看，呈现出降 解途径的多样性和复杂性。芳香化合物微生物代谢包括好氧代谢和厌氧代谢，在厌氧条 件下，芳香族化合物的降解与好氧氧化机制有着本质的区别。大量研究表明，许多兼性 细菌能利用不同结构的芳香族化合物，如芳香烃、酚、芳香酸、卤代、硝基代和氨基代 芳香族化合物等。在好氧条件下，芳香族化合物在芳环羟化双加氧酶作用下，发生顺式 加双羟基反应，随后在环断裂酶的作用下，通过间位或邻位裂解途径开环降解。 综上，微生物降解或转化芳烃化合物的研究已取得喜人的研究成果，但各类微生物 菌株距离实用阶段还有很多难题需要解决。关键在于：对芳烃降解菌或转化菌的酶 活性及作用机制进行深入研究，提高酶的降解或转化活力；合理应用现代生物技术 ( 转基因技术) ，改造或构建高效基因工程菌，从而提高芳香化合物的降解或转化速率； 加大力度实现芳烃降解菌的工业化、资源化及产业化应用，变害为利，向着“循环 经济的目标迈进。总之，继承传统培养方法的优点，同时借助现代分子遗传技术分离、 鉴定编码芳烃的降解基因，并探明相关降解基因的表达调控机制，构建高效、新型芳香 化合物降解基因工程菌剂，设计简洁合理的芳香化合物处理工艺将有着更为广泛的应用 前景。 1 2 3 苯酚污染物生物降解的微生物资源 对于苯酚降解的研究，国外起步较早。到目前为止，已经有许多苯酚降解菌株得到 了分离和研究 2 5 1 。苯酚类污染物在水体和土壤中的生物转化或生物降解，不仅可发生在 几种细菌中，同时真菌、酵母、高等植物以及某些藻类等也可能降解这些物质。在自然 环境中存在着大量的可以代谢芳香化合物的微生物，其中大多数是细菌，许多研究发现 假单胞菌和不动杆菌对具有苯环结构的各类化合物有一定的降解作用。革兰氏阳性的芽 孢杆菌能代谢多种苯类化合物，大肠杆菌能降解羟基苯乙酸，革兰氏阴性的产碱杆菌、 大连理工大学专业学位硕士学位论文 黄杆菌等也有氧化苯环的功能，从含苯类化合物的工业排水污泥积泥中分离得到脂肪芽 孢杆菌等，可以利用苯酚和甲酚等作为碳源而生长。目前己分离和鉴定的苯酚降解菌包 括，根瘤菌( r h i z o b i a ) 、藻类( a g a lo c h o r m a o n a s ) 、酵母菌( y e a s tt r i c h o s p o r o n ) 、醋酸钙不 动杆菌口c a l c o a c e t i c u s ) 、假单胞菌( p s e u d o m o n a s s p ) 、真养产碱菌似l c a l i g e v i e se u t r o p h u s ) 、 反硝化菌( d e n i t r i f y i n gb a c e t r i a ) 和r a s t o n i ae u t r o p h a 等苯酚降解菌【2 6 3 0 。国外许多科学家 对苯酚降解菌的功能特性和遗传机理进行了大量而深入的研究。 由于我国工业化进程较晚，对于环境生物学的研究起步也较晚。目前国内对于苯酚 降解的研究基本上处于起步阶段。我国菌种资源丰富，许多苯酚降解细菌己经得到了分 离和初步的研究。潘利华等【3 l 】从某印染厂下水道的污泥中分离得到一株能高效降解苯酚 的菌株，经初步鉴定为微球菌属。沈锡辉等【3 2 j 分离得到一株能以苯酚、苯甲酸、对甲酚、 萘为唯一碳源和能源生长，并同时具有可降解单环和双环芳烃能力的细菌菌株，经过生 理生化、1 6 s r r n a 基因序列分析等方法，鉴定为红球菌n p a n s 菌株( r h o d o c o c c u s s p s t l a l np n a n 5 ) 。徐玉泉等【3 3 】从我国东北某炼油厂工业分离得到一株高效降解苯酚的菌 株p 胍a 2 ，经1 6 s r r n a 基因序列分析鉴定为醋酸钙不动杆菌( a c i n e t o b a c t e r c a l c o a c e f i c u s ) 。顾立锋等删从化工厂污泥中分离到一株酵母菌，初步鉴定为德氏酵母属 ( d e b a r y o m y c e ss p ) ，命名为g b 。该菌株可以在0 - - 2 0 n a 2 s 0 4 环境中生长，并能以苯酚 为唯一碳源和能源。 国内外学者已经分离出多种能够高效降解苯酚的好氧微生物资源，见表1 1 。 一9 一 节杆菌w i 苯酚水解酶基因及编码蛋白的研究 表1 1已见报道的苯酚降解的微生物资源 t a b l e1 1t h er e p o r t e dm i c r o b es o u r c eo f p h e n o ld e g r a d a t i o n 降解菌株研究者 p s e u d o m o n a ss p s t r a i ne s t l0 0 1 l s ) i k i v i s a a rm ah a b i c h tj k & h e i n a r ua l p s e u d o m o n a sp u t i d ap w w o 3 6 1 p s e u d o m o n a sp u t i d ap 3 5 x 3 7 1 p s e u d o m o n 笛s t u t z e r io x if 3 s l t r i e h o s p o r o nc u t a n e u p g c o m a m o n a st e s t o s t e r o n er 5 4 0 l h e r m o p h i l i cb a c ，i l l u st h e r m o g l u c o s i d a s i u sa7 | 4 1 j a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u sp h e a - 2 1 4 2 1 a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c c t i c u sn c i b 8 2 5 0 1 4 3 i r a l s t o n i ae u t r o p h as t r a i ne 21 4 4 1 c 0 m a m o n 舔t e s t o s t e r o n et a 4 4l 【4 5 l h o l t e l a ，m a r q u e ss ，m o h l e r1 。 j a k u b z i ku & t i m m i sk n n g lc ，s h i n g l e rv ，s z ec c ，& p o h c l f a b i ol g a r e n g h i ，d a v i d eb ， e n r i c ag 。g u i d os 。& p a o l ab n e u j a h rh y & v a r g aj m m a k it 。s h i g e a k i h 。& k a z u y aw f i o n am d ，u l r i k ek 。 m i c h a e lp br u d o l fm x u y q ，c h e n m ，z h a n g w ，l i n m b e g g sj d ，c o o ka m ，f e w s o nc a h i n os ，w a t a n a b ek ，& t a k a h a s h i n a r a jh ，a k a h i ms ，o h i s h it ， m a e d a m & k u d o t 1 2 4 苯酚污染物生物降解的基因研究进展 苯酚降解的关键基因是苯酚羟化酶基因，苯酚羟化酶基因编码苯酚降解途径的第一 个酶，负责将苯酚转化为邻苯二酚，邻苯二酚进一步开环裂解为三羧酸( t c a ) 产物( 如图 2 1 所示) ，从而进入物质和能量代谢。邻苯二酚的进一步降解具有不同的途径和酶系统： 邻苯二酚2 ，3 - - 双力【i 氧酶( c 2 3 0 ，间位裂解) ，或邻苯二酚l ，2 一双加氧酶( c 1 2 0 ，邻位 裂解) 。其中以邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶开环裂解，并将苯酚氧化降解至t c a 中间产物 的途径称为m e t a - - p a t h w a y ，假单胞菌等主要通过这个途径降解苯酚。通过邻位裂解用 邻苯二酚1 ，2 一双加氧酶将苯酚氧化降解成2 ，4 一己二烯酸，并到琥珀酸和乙酰c o a 的途径称之为o r t h o p a t h w a y ，如醋酸不动杆菌等即以此途径降解苯酚i 侧。苯酚由苯酚羟 化酶催化后形成邻苯二酚，邻苯二酚是许多芳香族化合物代谢的必经途径，因此我们仅 需要克隆芳香烃代谢的关键基因，就有可能构建成降解广谱，对环境适应力更强，降解 能力更高的基因工程菌株 3 6 - 4 2 。 大连理工大学专业学位硕士学位论文 6 - 2 。 琥珀曩、乙e - c , o - a 3 o 图1 2 苯酚降解的代谢途径 f i g 1 2p a t h w a yo fp h e n o ld e g r a d a t i o n 4 5 附注： 1 ) 苯酚；2 ) 邻苯二酚；3 ) 2 羟基粘糠半醛；4 ) 2 羟基粘酸：5 ) 4 氧代乙二酸( a l p h a - 酮基乙二酸) ； 6 ) 2 氧代戊烯酸；7 ) 乙二酸；8 ) 内脂：9 ) b a t e 酮基乙二酸； h o ：苯酚羟化酶；c 2 3 0 ：邻苯二酚- 2 ，3 双加氧酶；c 1 2 0 ：邻苯二酚1 ，2 双加氧酶；h m s d ：2 羟 基粘糠酸羟化酶；4 - o t ：4 - 氧化丁烯酸交位酶；4 - o d ：4 氧化丁烯酸脱羧酶；t e ：顺，顺粘糠酸内 酯酶。 卜舞 一蛾 一 蚣 。e 扣 汐卜扩l 驴 t爵两 i l l乙 节杆菌w i 苯酚水解酶基因及编码蛋白的研究 1 2 5 基因工程菌的研究进展 由于工业化合物在自然界中存在的时间同生物进化过程相比是短暂的，在某些情况 下，这个阶段还不足以使生物进化产生相应的降解酶，或形成与酶催化位点相关的功能 基因。生物圈中污染物不断积累，致使对生态系统不利的情况加重。对于这些难降解的 污染物，仅靠自然界中的微生物有时是不够的，需要对微生物及其酶系进行改造。 随着分子生物学及遗传学的迅速发展，对酶进行某些基因工作操作，从而促进酶和 微生物更好的服务于环境生物技术是有很大的可能性的。现在主要采用的方法包括：运 用遗传工程的手段将降解多种污染物的降解基因转入到一种微生物细胞中，使其具有广 谱降解能力；或者增加细胞内降解基因的拷贝数来增加降解酶的数量，以提高其降解污 染物的能力。 目前成功的例子有：瑞士的k u l l a 分离到两株分别含有两种可降解偶氮染料的假单胞 菌，应用质粒转化技术获得了含有两种质粒，可同时降解两种染料的脱色工程菌。 可以说工程茵的构建前景是肯定的。优化微生物进行生物降解的能力，加速对新的 生物活性物质的研究，并应用他们去减少污染，是减少和消除环境污染的一个最有希望 的途径。酶的改造也是构建降解芳香烃混合物的工程菌的重要途径，酶类的遗传修饰通 常是改良酶的性状，或改变整个代谢途径。最近十几年来迅速发展的蛋白质工程和代谢 途径工程为在细胞中改造关键酶或改造代谢途径，以提高酶的催化速率、扩大底物利用 范畴、使细胞在低底物浓度下仍能进行代谢和提高酶在降解有机污染物过程中稳定性等 提供了条件。通过向微生物中引入编码新酶活力的基因，结合改造细胞中已存在的遗传 物质，构建降解芳香烃混合物的工程菌是现阶段环境污染降解最可行的方法之一。 1 3 本论文的研究内容及意义 近几年来，生物修复逐渐成为环境科学研究的一个热点。特别是分子生物学的发展， 使许多与有机物降解、重金属抗性有关的基因得到克隆。随着对芳香烃类化合物微生物 降解研究的不断深入，人们已经不满足于从微生物的整体水平上对其降解现象加以探 讨，而希望从微生物的遗传学机理方面对芳香烃的降解现象加以研究，尤其是从微生物 中的芳香烃降解的本质一芳香烃降解基因及其编码的降解酶水平上对芳香烃的降解机 理加以阐释，希望这些基础性的研究工作能对芳香烃的降解机理有新的发现，进而推动 新的处理工艺的发展。另一方面，更希望这些基础性的研究能为开发新的微生物基因资 源，构建高效的芳香烃污染物降解基因工程菌带来新的曙光。目前己经有越来越多的芳 香烃污染物降解基因被克隆分离出来，人们正逐个对这些降解基因序列、组成、结构、 功能、表达以及调控等进行全面的研究。尤其，从经过驯化或特殊生物中分离得到的一 大连理工大学专业学位硕士学位论文 些能高效降解这些难降解芳香烃化合物的微生物中克隆降解基因，进而研究基因的结 构、功能等具有尤其重要的意义。同时由于苯酚水解酶是编码苯酚降解途径的第一个酶， 是整个降解过程中的关键酶，提高苯酚水解酶活性将对生物修复系统的修复能力有很大 促进作用。 本论文以本实验室从某污水处理厂活性污泥样品中分离得到一株高效苯酚降解菌 株a r t h r o b a c t e rs p w 1 为研究对割4 7 1 ，该菌株属于放线菌门、放线菌纲、放线菌亚纲、 放线菌目、微球菌亚目、微球菌科、节杆菌属，其1 6 sr d n a 序列的g e n b a n k 登陆序列 号为e u 3 3 9 9 3 0 。通过分子