（茶学专业论文）绿茶茶汤色泽的变化规律及其调控研究.pdf

摘要 随着社会经济的快速发展，茶饮料特别是纯茶饮料因具有显著的保健价值而倍受 广大消费者青睐，成为当今茶叶深加工的重点研发方向。然而，由于绿茶饮料在生产 和销售期间色泽极易发生褐变，在一定程度上影响了其产品的货架期和外观质量。本 研究从绿茶饮料的主要呈色物质如黄酮醇及其苷类、儿茶素的氧化产物等入手，对绿 茶茶汤常温贮藏期间色泽的变化规律和调控进行分析研究，旨在揭示绿茶饮料的色泽 褐变规律，并探索有效的调控技术。主要研究结果如下： 1 、建立了黄酮醇物质的h p l c 检测方法，即采用p h e n o m e l l e x e 1 8 ( 1 5 0 4 6 0 r a m ) 柱； 磷酸一甲醇流动相体系，a 相为0 2 磷酸溶液，b 相为1 0 0 甲醇；洗脱梯度为，0 , - - , 2 0r a i n b 相从5 5 降到2 0 ，2 0 , - - 一2 1 m i nb 相从2 0 升n 5 5 ；流速lm l r a i n 一；柱温2 5 ；检测 波长3 6 0n i t l ；进样量5ul ，此方法可对黄酮醇类物质进行有效分离。 利用上述的h p l c 检测方法，采取正交实验，对影响黄酮醇苷水解的条件进行了优 化，建立了黄酮醇苷的定量方法，即将5 m l 茶汤，置于1 5 m l 纯甲醇和5 m l 6 m o l l - , 盐酸 的水解溶液中，在7 5 下水解2 h ；利用h p l c 检测水解体系的槲皮素、山柰素和杨梅素 含量；利用公式黄酮醇苷( p g m l 。1 ) = 黄酮醇增加量芦丁水解率来计算茶汤中黄酮 醇苷的含量。 2 、利用黄酮醇及其苷的定量方法，对不同贮藏期间茶汤的黄酮醇类物质变化进 行了研究，并对茶汤色泽变化与黄酮醇及其苷类变化的相关性进行了研究，结果表明 茶汤贮藏过程中随着茶汤的红绿度( a ) 和黄蓝度( b ) 不断升高，杨梅素苷含量逐步下 降，它与茶汤的红绿度、黄蓝度的相关系数分别为0 9 8 2 1 料、0 8 8 2 6 * ，但与茶汤明 亮度( l ) 的相关性不显著；槲皮素和山柰素及其苷类与茶汤色泽变化关系不密切。 3 、本文采用体外模拟体系( 含与鲜叶比例相同的儿茶素标准品混合体系) ，进行 儿茶素的自动氧化和酶促氧化研究，并利用h p l c 鉴定氧化产物。结果发现，在常温 贮藏过程中，不含酶液的儿茶素模拟体系发生了自动氧化，其色泽从无色转变为淡黄 色；而含酶液的儿茶素模拟体系发生了酶促氧化，色泽变成红色；h p l c 检测显示了两 者产物的差异。 h p l c 检测发现，常温贮藏期间，绿茶茶汤中酯型儿茶素类明显下降，非酯型儿 茶素变化规律不明显，而没食子酸则明显上升；茶汤中茶褐素的含量略有增加，但没 有发现酶促氧化产物，由此推测，常温贮藏期间茶汤中发生了自动氧化和脱没食子化 反应。 4 、在绿茶茶汤贮藏初期，v c 可有效延缓杨梅素苷、槲皮素苷、山奈素苷，e g c g 、 e c g 、e g c 的氧化，稳定了茶汤汤色，但对绿茶茶汤长期贮藏的护色效果不够理想。 关键词：绿茶饮料；茶汤色泽；黄酮醇苷；儿茶素；自动氧化 i i i a b s t r a c t w i t ht h er a p i ds o c i o e c o n o m i cd e v e l o p m e n t ，t e ab e v e r a g ee s p e c i a l l y p u r et e a b e v e r a g ei sp r e f e r r e db yc o n s u m e r sw i t ht h e i rd i s t i n c t i v eh e a l t h c a r ef u n c t i o n t e a b e v e r a g eh a s b e c o m et h ei n t e r e s t e dr & df i e l d si nt e af u r t h e rp r o c e s s i n gi n d u s t r y h o w e v e r ，i ti sl i a b l et ou n d e r g ob r o w n i n gd u r i n gt h ep r o d u c t i o na n ds t o r a g eo fg r e e nt e a b e v e r a g e ，w h i c hs h o r t e n st h es h e l fl i f ea n da f f e c t st h ee x t e r n a la p p e a r a n c e a t t e m p t e dt o d i s s o l v et h i sp r o b l e m ，t h i sp a p e rf o c u so nt h ec o m p o n e n t sa sf l a v o n o l sg l y c o s i d e sa n d o x i d i z e dp r o d u c t so fc a t e c h i n si ng r e e nt e aw h i c hp l a yav i t a lr o l ei nt h ef o r m a t i o no ft e a b e v e r a g ec o l o r w i t ht h ei n v e s t i g a t i o no ft h eb e v e r a g ec o l o rv a r i a t i o na tt h er o o m t e m p e r a t u r es t o r a g e ，t h i sp a p e rw a sa t t e m p t e dt oe x p l o r ea ne f f i c i e n tt e c h n o l o g yt ok e e p t h ec o l o ro fg r e e nt e ab e v e r a g e t h em a j o rr e s u l t sa c q u i r e di nt h i sp a p e rw e r ea sf o l l o w s ： 1 ah p l cm e t h o da s s a y i n gf o rf l a v o n o li ng r e e nt e ai n f u s i o nh a sb e e na c h i e v e db y u s i n gt h em o b i l ep h a s es y s t e mo fp h o s p h a t e m e t h a n 0 1 t h ep r o t o c o lc o u l db ed e s c r i b e d a s f o l l o w i n g ：u s i n gp h e n o m e n e x c 18 ( 15 0 x 4 6 0 m m ) c o l u m n ，m o b i l ep h a s eaw a s p h o s p h a t e w a t e ri nr a t i oo f2 9 9 8 ( v v ) ，m o b i l ep h a s ebw a sm e t h y la l c o h o la n dp h a s eb d e c r e a s e dg r a d i e n t l yf r o m5 5 t o2 0 i ne a r l y2 0m i n u t e s ，t h e ni n c r e a s e dg r a d i e n t l yf r o m 2 0 t o5 5 f o rn e x tl m i n u t e s t h el i n e a rg r a d i e n te l u t i o nw i t ht h ef l o wr a t eo fl m l m i n 1 w a sd e t e c t e da tt h ew a v e l e n g t ho f3 6 0 n m t h eh y d r o l y z e df l a v o n o l sw e r ef u r t h e rs e p a r a t e d s u c c e s s f u l l yw i t ht h eh p l c m e t h o d w i t ht h eo r t h o g o n a ld e s i g n ，t h eo p t i m a lh y d r o l y t i cc o n d i t i o n so ff l a v o n o lg l y c o s i d e s i ng r e e nt e ai n f u s i o n ( 5 m l ) w e r ee x p l o r e db y2h o u r sh y d r o l y s i sa t7 5 i nt h eh y d r o l y t i c s o l u t i o no fm e t h y la l c o h o l ( 15 m l ) s u p p l e m e n t e dw i t h6m o l l h y d r o c h l o r i ca c i d ( 5 ml ) q u e r c e t i n ，m y r i c e t i na n dk a e m p f e r o lf r o mt h eh y d r o l y t i cs y s t e mo ft e ai n f u s i o nw e r e d e t e c t e db yu s i n gt h eh p l c 2 t h ec o r r e l a t i o n sb e t w e e nf l a v o n o la n di t sg l y c o s i d e sa n dc o l o ro ft e ai n f u s i o n d u r i n gs t o r a g ew e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e d n e s s ( a ) a n dy e l l o w n e s s ( b ) i n c r e a s e da st h ed e c r e a s eo fm y r i c e t i ng l y c o s i d e si ng r e e nt e ai n f u s i o n ，w h i c hs u g g e s t e d t h a tm y r i c e t i ng l y c o s i d e sh a v eas i g n i f i c a n tr e l a t i o nt ot h er e d n e s s ( a ) a n dy e l l o w n e s s ( b 1o f g r e e nt e ai n f u s i o nw i t h 一0 9 8 21 幸幸a n d 一0 8 8 2 6 幸o ft h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s r e s p e c t i v e l y t h ec o r r e l a t i o n sb e t w e e nt h ec o l o ro ft e ai n f u s i o na n dq u e r c e t i n ，m y n c e t i n ，k a e m p f e r o l a n dt h e i rg l y c o s i d e sw e r en o tr e m a r k a b l e 3 s i m u l a t e dm o d e li nv i t r oo fc a t e c h i n si ng r e e nt e ai n f u s i o nc o m p a r a t i v e l ys t u d i e d i v o na u t o o x i d a t i o na n de n z y m a t i co x i d i z e do fc a t e c h i n sa n dd e t e c t e d t h e i ro x i d i z e d p r o d u c t su s i n gh p l c a sar e s u l t ，t h em o d e lo ft h es t a n d a r ds o l u t i o no fc a t e c h i n sa tr o o m t e m p e r a t u r es t o r a g e c a t e c h i n su n d e r w e n ta u t o - o x i d a t i o na n dt h es o l u t i o nc o l o rv a r i e d f r o mc o l o r l e s si n t ol i g h ty e l l o w h o w e v e r , t h em o d e lo ft h es t a n d a r ds o l u t i o no f c a t e c h i n s w i t hp o l y p h e n o lo x i d a s e ，c a t e c h i n su n d e r w e n te n z y m a t i co x i d a t i o na n dt h es o l u t i o nc o l o r v a r i e df r o mc o l o r l e s si n t or e d i s hb r o w n t h ea u t o o x i d a t i o np r o d u c t so fc a t e c h i n sw e r e d i f f e r e n tf r o mt h e i re n z y m a t i co x i d i z e dp r o d u c t st o o d u r i n gt h es t o r a g eo fg r e e nt e ai n f u s i o na tr o o mt e m p e r a m r e ，c a t e c h i ne s t e r si nt e a i n f u s i o n sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw h i l eg a l l i ca c i da n dt h e a b r o w n i n s ( t b s ) i n c r e a s e d g r a d u a l l y h o w e v e r , e n z y m a t i co x i d i z e dp r o d u c t sw e r en o tf o u n d i ti s s u p p o s e dt h a t c a t e c h i ne s t e r sh a v ed e g a l l a t e dt o s i m p l e c a t e c h i n sa n dc a t e c h i n sh a v eu n d e r 、v e n t e n z y m a t i co x i d a t i o nd u r i n gt h es t o r a g eo fg r e e nt e ai n f u s i o n 4 t h ec o l o ro fg r e e nt e ai n f u s i o nc a nb es t a b i l i z e d a tt h ei n i t i a ls t o r a g ew i t ht h e s u p p l e m e n to fa s c o r b i ca c i d ( v c ) ，w h i c hl e dt ot h em i n i m a lc h a n g e so ft h eg l y c o s i d e so f m y r i c e t i n ，q u e r c e t i na n dk a e m p f e r o la n dc a t e c h i n sa se g c g , e c ga n de g c 、i t hm e e l o n g a t i o no f t e ai n f u s i o n ss t o r a g e ，t h ec o l o rc h a n g e sw e r es i m i l a rt ot h o s ew i t h o u tt h ev c s u p p l e m e n t t h ep r o t e c t i v em e t h o do f t h ec o l o ro f t e a b e v e r a g ei ss t i l lu n d e re x p l o r a f i o n k e yw o r d s ：g r e e nt e ai n f u s i o n ；i n f u s i o n c o l o r ；f l a v o n o lg l y c o s i d e ；c a t e c h i n ； a u t o o x i d a t i o n v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：帆 巧年钿压 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：鼻 第一导师签名： 抵汩州其c b 帆冲年月彩日 1 文献综述 绿茶茶汤存在大量的呈色物质，正是这些呈色物质构成了绿茶特征汤色黄绿色。 其中可能存在的主要呈色物质有叶绿素、类胡萝卜素、黄酮醇苷、儿茶素的氧化产物 等。在绿茶茶汤贮藏期间，上述呈色物质的变化是影响茶汤色泽品质的重要因素，也 是调控茶汤色泽变化、延长绿茶饮料货架期的主要技术难点。 1 1 茶汤中叶绿素变化的研究进展 叶绿素分为叶绿素a 和 绿度的主要因子是叶绿素和 图1 叶绿素a 、b 的分子结构式 茶多酚。潘顺顺1 ( 2 0 0 7 ) 曾 f i g 1c h e m i c a ls t r u c t u r e so f c h l o r o p h y l la 、b 对绿茶饮料色素物质组成进行研究，结果表明叶绿素a 、b 以及脱镁叶绿素a 对绿茶 饮料的“绿色 色泽有显著贡献，叶黄素和p 胡萝卜素则对绿茶饮料的“黄色 色泽 有贡献，但在绿茶饮料高温杀菌过程中叶绿素已经出现大部分的降解，而叶黄素和p 胡萝卜素则较为稳定。 因此，如何在绿茶饮料加工过程中保持叶绿素的稳定性是调控绿茶饮料色泽的措 施之一。在加热或弱酸性条件下，叶绿素性质极不稳定，叶绿素分子中的镁离子会被 氢离子取代而形成灰褐色至黑褐色的脱镁叶绿素，从而造成茶汤色泽劣变。高新蕾h 1 、 宁井铭啼1 、潘顺顺b 1 等将z n c l 2 加入茶汤，能较好保持绿茶汤色的黄绿色，但添加离 子的安全性值得探讨。戴前颖旧1 ( 2 0 0 9 ) 在茶汤浸提时添加i b - c d ，发现能够得到较 高绿度的茶汤，并能较好地维持茶汤色泽，同时从包埋和增溶的角度探讨了d c d 稳 定绿茶汤色的机理。 1 2 茶汤中儿茶素氧化研究进展 儿茶素属于类黄酮中的黄烷醇类化合物，是茶汤中多酚类物质的主体成分哺1 。绿 茶茶汤中含有多种儿茶素类物质，主要包括e g c 、( + ) c 、e c 、e g c g 、e c g 等。按照茶 饮料国家标准规定，绿茶饮料。刀中儿茶素总含量 1 5 0 0m g k g 。 在绿茶饮料加工和贮藏过程中，儿茶素类可能出现几种变化。一是儿茶素类的异 构化陋1 。绿茶茶汤在杀菌工序中，随着温度的升高，儿茶素类不断从外界环境吸收热 能，使自身分子空间结构发生差向异构化，即e g c g 、e g c 、e c 等酯型儿茶素差向异构 化成为g c g 、g c 、+ c 等非酯型儿茶素；二是儿茶素的脱没食子化。茶汤呈现弱酸性的 环境中，带有没食子酰基或没食子基的儿茶素如e g c g ，受到氧、光照的影响，没食子 酰基断裂，没食子从儿茶素的分子结构中脱离，贮藏期间的茶汤检测出大量的g a ；三 是儿茶素类的聚合氧化。儿茶素在高温、湿热、有氧的条件下，发生自身的氧化聚合 反应生成橙黄色的氧化产物，在茶汤贮藏过程，儿茶素发生聚合反应时还会随机聚合 茶汤中氨基酸、蛋白质等形成大分子量的有色物质一1 ，主要途径为“儿茶素一邻醌一大 分子聚合物 ，可能是绿茶茶汤褐变的因素之一。 综上所述，在绿茶加工过程中，儿茶素可能发生异构化、分解、氧化聚合、氧化 脱没食子作用。虽然儿茶素类物质的水溶液呈无色，但是它们的氧化产物呈现褐黄色， 并对茶汤色泽产生影响。已经有许多资料报道了茶汤色泽劣变过程中儿茶素的变化， 孙其富呻1 ( 2 0 0 4 ) 研究茶饮料灭菌过程中，发现随着灭菌温度提高，儿茶素总量在不 断的减少，酯型儿茶素向非酯型儿茶素转化；z h e n g y uc h e n n 叫( 2 0 0 1 ) 发现龙井茶 汤在1 2 0 老化过程中，儿茶素类物质发生明显的异构化：潘顺顺口1 ( 2 0 0 7 ) 研究结 果表明在7 5 c 贮藏过程中，鲜绿茶汁的表儿茶素类物质e g c g 、e c g 、e c 、e g c 呈下降趋 势，而非表儿茶素g c g 、g c 呈现上升趋势，即出现了异构化现象并伴随茶汤的褐变； q i ny a nz h u 1 ( 1 9 9 7 ) 研究发现龙井茶汤中儿茶素在p h 8 时极不稳定，容易降解， 8 p h 4 时随着碱性的增加，茶汤稳定性降低，在p h 4 相对比较稳定；宁井铭悔1 ( 2 0 0 4 ) 也发现在p h5 0 以下，绿茶茶汤色能维持较好的稳定性；林亲录2 1 ( 1 9 9 4 ) 认为绿茶 饮料褐化与氢原子发生转移有关，由儿茶素脱氢逐步聚合成为茶褐素是导致绿茶茶汤 褐变的主要原因。 抗氧化剂可以显著延缓儿茶素的氧化，在绿茶茶汤中添加l 一抗坏血酸、半胱氨酸 和亚硫酸钠，对茶多酚的氧化具有显著防护作用h t1 2 1 ；在茶汤提取过程中加入抗坏血 酸和b 一环状糊精以及葡萄糖氧化酶等添加剂，可有效防止茶汤氧化，并能在一定时 期内保持茶汤色泽明亮淡黄绿拍1 4 - 1 6 o 在贮藏期间绿茶饮料中儿茶素类物质不稳定，是否有儿茶素的氧化产物存在，其 2 氧化产物是否对贮藏期间的绿茶饮料色泽有影响，还少有报道，有待进一步研究。 1 3 茶汤中黄酮醇苷的研究进展 虽然黄酮醇类化合物在茶叶中含量较少( 约占干物重的3 4 ) ，但是仍然被认 为是构成绿茶汤色的重要组分。绿茶干茶中的黄酮醇多以糖苷形态存在【9 】，主要包括 槲皮素、山柰素和杨梅素的苷类物质( 图2 ) ，目前已经在茶鲜叶、绿茶和红茶中至少 发现有1 4 种糖苷存在。糖苷中的糖分子包括葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和果 糖；糖苷有单糖苷、二糖苷和三糖苷。 s u s a n n es c h a r b e r t 刀( 2 0 0 4 ) 利用聚酰胺( s c6m a t e r i a l ) 层析柱、半制备h p l c 、 酮类物质对红茶的收敛性起 主要作用，构成了滋味物质 杨梅素：r 1 = r 2 = o h 的主体。他们的工作改变了 槲皮素：r i = 0 h , r 2 ：h 人们对茶叶中黄酮类化合物 山亲酚：r i = r 2 ：h 的看法，即黄酮类化合物不 仅是茶汤汤色也是茶汤收敛 图2 茶叶中黄酮醇的主要结构式 性的主要组分。 f i g 2c h e m i c a ls t r u c t u r e so ff a r n i l i a rf l a v o n o l si ng r e e nt e a 由于茶叶中黄酮醇类化 合物种类较多，分离难度较大，有关它们的定性和定量仍缺乏较好的方法，。 q n r a m m a m 衄，1 4 且 i s l ( 1 9 8 7 ) 研究了茶叶中黄酮类物质的分离纯化，通过不同的有机 溶剂提取、不同的柱层析，分离得到含柚皮素、双氢山柰素、槲皮素，山柰素等多种 黄酮类物质组分，为研究茶叶中的黄酮类物质提取分离，纯化，研究奠定了坚实基础。 随着分离纯化技术不断的提高，这种比较繁琐方法，分离纯化耗资大，收益小，不适 合现代对分离纯化的要求。 目前对茶叶中黄酮类化合物总量的定量方法主要有三氯化铝法、硼酸柠檬酸比色 法【l9 1 ，这两种方法利用邻苯二羟基结构在碱性环境下与铝离子形成络合物，进行茶叶 中黄酮类化合物总量的测定 2 u 】。但是，仅对茶汤中总黄酮含量进行分析，难以有效区 分黄酮、黄酮醇、黄酮醇苷、异黄酮等组分。而先将黄酮醇苷进行水解，再利用h p l c 检测游离的槲皮素、杨梅素和山柰素，是目前检测黄酮醇苷的新思路之一。 黄酮醇苷可以在酸和糖苷酶的作用下，醇苷键断裂而生成游离黄酮醇( 如槲皮素、 杨梅素、山柰素等) 和一系列的糖( 图3 ) 。h e r t o g n 钔( 1 9 9 3 ) 采用不同盐酸浓度和水 解时间，对绿茶、红 茶、青茶的茶汤进行 水解，考察槲皮素苷 和杨梅素苷在茶汤中 的含量。山奈素苷也 是茶汤中主要黄酮醇 苷之一，未对茶汤中 的山奈素苷进行分 析，但其实验思路为 茶汤中黄酮醇苷的定 量分析提供了较好的 实践。 王华夫啪1 ( 2 0 0 0 ) 进一步对绿 茶中的黄酮醇水解做 了研究，从不同水解 时间、盐酸浓度、溶 h o h o r 1 r 1 0 h r 2 +r 3 o h r 2 图3 黄酮醇苷水解过程 f i g 3 t h eh y & o l y z ep r o c e s so ff l a v o n o l 酉y e o s i a e 剂等入手对黄酮醇苷水解的影响因素进行分析，得到2h 之内杨梅素苷和槲皮素苷水 解量最大，山奈素苷在3h 内水解量最大，盐酸浓度选择6 m o l l 1 ，溶剂采用6 0 的 乙醇。此实验体系更适用于干茶，杨梅素回收率较小，经过实验分析使用盐酸的离子 浓度过小，没有达到茶汤水解所要达到要求。 卢俊邦陋( 2 0 0 6 ) 采用不同盐酸的浓度、水解时间、溶剂的种类对绿茶干茶提取 水解进行单因素优化实验，优化了水解条件。 为进一步分析黄酮物质对茶汤汤色的影响，对茶汤中为数不多的黄酮醇苷进行分 析、定量和调控就成为了关键。 1 4 茶汤中其他呈色物质的研究 类胡萝卜素是一类具有黄色到橙红色的多种有色物质，是茶叶中重要的脂溶性色 素，茶叶中已发现的类胡萝卜素有数十种，分为胡萝卜素类和叶黄素类。1 3 胡萝卜 素是茶叶中胡萝卜素类的主要组成成分，茶叶中约含o 6 5 1 m g , g - 1 ，老叶中含量比嫩 叶高数倍；叶黄素类( x a n m o p l l r l l s ) 为黄色色素，在茶叶中的含量约为o 1 0 7 m g , g - 1 ，随 4 茶叶新梢成熟度的提高含量增加四1 。 花青素又称花色素，在茶叶中花青素占干物质的0 0 1 1 0 ，对茶汤、干茶色泽 均有较大影响。内含较高花青素的紫色芽叶制成的绿茶，品质较低，汤色发褐，滋味 苦涩。 1 5 绿茶汤色检测方法的研究 随着科技发展迅速的进步，应用在茶叶色泽检测技术也得到日新月异的发展，如 计算机视觉定量口2 j ，近红外线光谱( n t r s ) 模型瞄驯，电脑测定茶叶色泽的方法乜4 | ，对于绿 茶汤色运用最常用的方法为感官评审法乜5 1 和分光光度计法晗5 1 ( 4 2 0 r i m ) 。感官审评是 利用审评人员主观判断对茶叶汤色进行评价，由于个人的喜好以及外界环境的不同， 容易对评价结果产生较大差异；分光光度计法是在一定波长下的光线通过不同茶汤色 泽所得到吸光度，对茶汤汤色进行评价。茶汤色泽是多种呈色物质构成的复合型颜色， 单一波长通过茶汤所得出的吸光度，不能全面的评价茶汤。目前，色差计对茶汤进行 定量分析日益受到重视，其基本原理是等色差表色系即亨特l a b 颜色表示法。l 表示 亮度；a 为正值表示红的程度，负值表示绿的程度；b 为正值表示黄的程度，负值表示 蓝的程度。陆建良啪1 等将之运用于绿茶茶汤，并指出绿茶茶汤明度l 值大，其感官得 分也高，a 、b 值与感官汤色评分呈极显著负相关，绿茶汤色越绿其汤色评分越高，茶 汤黄色的程度越低，感官得分越高。李立祥( 2 0 0 5 ) 绿茶汤色的表述可以应用色差 的衍生指标色相( a * b 幸) 进行表征，茶叶汤色的a * b 枣能够反映茶汤色泽8 0 以上。 应用色差的p 和衍生指标色相( a * b 宰) 进行表征，茶叶汤色能够被反映9 5 以上。 因此绿茶汤色可以应用色差计测定的p 和色相指标( a 宰b 幸) 表述，结合感官审评在 贮藏过程中记录绿茶茶汤色泽变化。 2 引言 随着我国经济的飞速发展，生活水平不断地提高以及生活节奏的加快，人们对茶 叶产品的要求在保持传统风味的基础上，向方便化、液态化、保健化方向发展，即生 产茶水饮料已成为必然发展趋势之一。这是适应国际市场以及从深度、广度开发消费 市场的所要做出的抉择。适应西方国家的消费需要则需开发茶饮料，开发年轻族群则 要改变传统产品的包装与饮用方式啪1 。 为进一步规范我国茶饮料市场，茶饮料的国家标准于2 0 0 8 年1 1 月开始实施，从 新规范茶饮料定义，茶饮料( 茶汤) 是以茶叶的水提取液或其浓缩液、茶粉等为原料， 经加工制成，保持原有茶汁风味的液体饮料，可添加少量的食糖和( 或) 甜味剂h 1 还对茶饮料中的主要内含物质进行了规定，要求茶多酚的含量须3 0 0 m g k g ，其中绿 茶茶多酚含量须5 0 0 m g k g ，对于碳酸类茶饮料，仅要求茶多酚l o o m g k g 。 目前液体茶饮料主要有两类，一是通过调味的混合型液态茶饮料，该类产品除茶 叶可溶性成分外，还佐以各种果汁、糖、酸等辅料，产品茶味不突出，但具有茶叶特 有的解渴、提神等功效；二是纯茶型茶饮料( 茶汤) ，该类产品不添加其他辅料，保 持茶叶原有的色、香、味。国内外的茶饮料的发展已经历了传统热水冲泡一固体速溶 茶一果汁茶软饮料一纯茶汁一保健茶饮料的五个发展阶段。我国尚处于第二、三个阶段 正向第四阶段发展1 。茶饮料最早出现于1 9 7 2 年的日本，从此开始向亚太地区以及 欧美地区广泛传播m 1 ，日本是目前茶饮料最大的生产国，1 9 9 7 年日本茶饮料销售量 为3 7 9 4 万吨，其中绿茶饮料1 0 1 1 万吨，2 0 0 1 年日本绿茶饮料的市场增长率为 2 0 一3 0 ，2 0 0 3 年，日本茶饮料 消费量为5 0 0 万 吨，占整个饮料 市场的3 0 口。 在韩国，茶饮料 的市场份额直 逼碳酸和果汁 饮料，据2 0 0 7 年饮料行业6 月 发表的信息， 2 0 0 4 年茶饮料 的销售额为6 0 0 图4 茶饮料偏好调查图 f i g 4i n v e s t i g a t i o no i lt h ep r e f e r e n c eo f t e ad r i n k s 6 亿韩元，0 5 年为1 0 0 0 亿韩元，到0 6 年迅速增长到1 9 0 0 亿韩元。在欧美国家，茶饮 料也走进了更多家庭。我国国内茶饮料市场起步于1 9 9 3 年，直到2 0 0 1 年才进入高速 发展期。据统计从1 9 9 7 年的年产不足2 0 万吨，到2 0 0 2 年茶饮料产量已经达到3 0 0 万吨b 刳，2 0 0 8 年全年饮料产销量将达6 0 0 0 万吨，同比增长1 7 左右b 引。茶饮料市场 前景如此火爆，主要归因于茶饮料中具有低能量、低脂肪、低糖、消暑解渴的保健功 能和市场战略运用十分成功，这是促进人们对茶以及茶产品健康消费和市场发展的基 础。 在国家对茶饮料市场的重视下，消费者对茶饮料也有自身的偏好。2 0 0 7 年在北 京在校大学生茶饮料消费调查嘲1 中，数据显示超过半数的消费者更偏好绿茶饮料( 图 4 ) 。目前，绿茶是我国茶叶产量和消费量最大的茶类，为开发绿茶饮料的原料基础， 以及中国消费对绿茶和绿茶饮料的偏好为绿茶饮料铺平了广阔的市场b 5 。驯，但在绿茶 饮料生产和贮藏方面遇到技术难题，而绿茶饮料褐变问题尤为突出，以至于绿茶纯茶 饮料开发成为目前研究的热点。 2 1 研究目的及意义 茶饮料是未来茶叶液态化发展的重要趋势，将会以低能量、低脂肪、低糖：营养、 保健功效及消暑解渴等功能，逐步发展成为日常生活中主要饮料之一。近几年来，国 内市场上销售的茶饮料以绿茶、红茶、乌龙茶、茉莉花茶居多，而且多为茶味或调味 饮料，茶味淡薄，纯茶饮料有所增长，但比例仍较小。由于纯绿茶饮料的成分多，内 含物丰富，在贮藏期间茶汤浓度越大，汤色劣变就越严重。纯绿茶饮料的色泽变化直 接影响了消费者购买欲和制约绿茶饮料发展。在目前的市场上充斥着大量以低浓度或 以绿色p e t 瓶掩盖绿茶饮料褐变的现实，虽然以回避的态度暂时解决了这个问题，但 是长期采用这种“方法”会造成对消费者心理和市场致命的打击。延长纯绿茶饮料的 货架期，保持茶汤色泽黄绿明亮，加速茶饮料市场化发展，已经成为茶叶科技工作者 研究的焦点问题。为了解决茶饮料褐变的问题，本研究从茶汤的呈色物质入手，主要 对黄酮醇及其苷和儿茶素氧化产物对绿茶色泽影响以及v c 对茶汤的调控作用进行研 究，继续研究绿茶饮料的褐变原理并进行调控，为进一步扩大纯绿茶饮料的生产提供 主要的理论基础和试验依据。 2 2 研究内容 2 2 1 研究绿茶茶汤贮藏期间，茶汤色泽变化规律及黄酮醇苷、儿茶素等呈色物质对 茶汤色泽的影响。 2 2 2 研究维生素c 对绿茶茶汤色泽褐变的主要因素物质的调控作用及相关性分析。 7 3 材料与方法 3 1 材料、试剂与仪器 试验材料六安瓜片购自安徽省六安瓜片茶业股份有限公司。 主要药品和试剂：槲皮素( q u e r c e t i n ) 、山柰素( k a e m p f e r 0 1 ) 购自中国药品生 物制品检定所( 纯度分别为9 7 3 、9 5 1 ) ，芦丁( r u t i n ) 、杨梅素( m y r i c e t i n ) 购自 成都曼思特生物科技有限公司( 纯度分别为9 9 、9 8 ) 。没食子酸( g a l l i ca c i d ，g a ) ， 表儿茶素( e p i c a t e c h i n ，e c ) ，儿茶素( c a t e c h i n s ，c ) ，表没食子儿茶素没食子酸酯 ( e p i g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e ，e g c g ) ，表没食子儿茶素( e p i g a l l o c a t e c h i n ，e g c ) 、表儿茶素 没食子酸酯( e p i c a t e c h i ng a l l a t e ，e c g ) 和没食子儿茶素没食子酸酯( g a l l o c a t e c h i n g a l l a t e ，g c g ) ( 纯度均为9 9 9 ) 等儿茶素标准品购于美国s i g m a 公司。磷酸、甲 醇、乙酸、乙腈( 色谱分析级) 购于美国t e d i a 公司。其它分析用试剂均为分析纯。 主要仪器：w a t e r s 6 0 0 紫外检测器高效液相色谱仪( 美国w a t e r s 公司) 、日本 s h i m a d z u l c - 2 0 a d 高效液相色谱仪；s p d 6 a v 可调波长紫外检测器( 日本岛津公司) ； l c - s o l u t i o n 色谱工作站、b e c k m a nc e n t r i f u g e 高速离心机( 美国b e c k m a n 公司) 、 u v - 2 8 0 0 型紫外可见分光光度计( 上海尤尼柯仪器有限公司) 、m i n o l t ac m 一3 5 0 0 d 型色 彩色差计仪( 日本柯尼卡美能达公司) 、s e n c ox m t f 6 0 0 0 恒温水浴锅( 上海申生科 技有限公司) 、t b 2 1 4d e n v e r 电子天平( 北京赛多利斯仪器系统有限公司) 、p 8 1 0p h 计( 德国s a r t o r i u s 公司) 、k q 5 0 0 d e 数控超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司) 。 3 2 实验方法 3 2 1 茶汤的制备及其贮藏 茶叶粉碎后，过1 0 0 目筛网，作为供试茶样。供试茶样按照1g ：1 0 0m l 茶水比， 于8 5 水浴中提取1 5m i n ，提取期间搅拌3 次。茶汤冷却后分别用定量滤纸和0 8b m 纤维素膜抽滤口7 j 。将制备好的茶汤，分装于1 0 0m l 培养瓶中，分别采用7 5 0w 微波 杀菌3m i n m l ，杀菌后迅速冷却，将冷却后的茶汤放置在常温环境下贮藏，分别于0 d 、 2 d 、4 d 、6 d 、1 0 d 、1 4 d 取样检测。 3 2 2 贮藏期间茶汤色泽变化的测定 采用m i n o l t ac m 3 5 0 0 d 型色彩色差仪对茶汤色度值l 、a 、b 进行测定。其中l 代 表明度；a 代表红绿色度，正值时表示红色程度，负值时表示绿色程度；b 代表黄蓝色 度，正值时表示黄色程度，负值时表示蓝色程度。 3 2 3 贮藏期间茶汤黄酮醇类变化的测定 3 2 3 1 黄酮醇苷的水解 采用l 9 ( 3 4 ) 正交设计，对茶汤水解的时间、温度、甲醇浓度和盐酸浓度等四个因 素进行考察( 表3 1 _ ) 。吸取茶汤5m l 于圆底烧瓶中，加入不同浓度的盐酸5m l ，甲醇 1 5m l ，置于不同温度下水解若干小时。水解完毕冷却后，将茶汤转移至2 5m l 容量 瓶中，并用5 0 甲醇( 本文使用百分浓度为体积分数) 定容至刻度。溶液经0 4 5 岬微孔 滤膜过滤，利用h p l c 检测茶汤中槲皮素、山奈素、杨梅素的含量。并据此对水解条 件进行优化。 在优化的水解条件下，将已知浓度的芦丁添加到茶汤中，以不添加芦丁的茶汤为 对照，比较水解后槲皮素的增加量，并按下列公式计算芦丁的水解转化率： 芦丁一隔声笔淼鬻舢 注：槲皮素的分子量为3 0 2 2 4 ，芦】的分子量为6 10 5 1 。 在优化的水解条件下，将已知浓度的槲皮素、山柰素、杨梅素添加到茶汤中，以 不添加的茶汤为对照，比较水解前后茶汤中槲皮素、山柰素、杨梅素的含量变化，并 按照下列公式计算它们的加标回收率。 加标回收率( ) = 【( 加标试样测定值对照测定值) 力口标量】1 0 0 在优化的水解条件下，将同一茶汤重复水解多次，比较水解前后槲皮素、山柰素、 杨梅素的变化，并按照下列公式计算水解方法的精密度： 精密度( ) = ( 样品标准差样品平均值) 1 0 0 表3 1 茶汤水解因素与水平 t a b l e3 - 1t h el e v e l so f h y d r o l y s i sf a c t o ri nt e ai n f u s i o n 3 2 3 2 茶汤黄酮醇苷的定量方法 将茶汤置于3 2 3 1 的优化水解条件下水解，水解完毕冷却后，将茶汤转移至2 5m l 容量瓶中，并用5 0 甲醇( 本文使用百分浓度为体积分数) 定容。溶液经0 4 5g r n 微孔滤 9 膜过滤，利用h p l c 检测茶汤中槲皮素、山柰素、杨梅素的含量。 黄酮醇苷含量( i t g ：m l 以) = 黄酮醇增加量芦丁水解率 3 2 3 3 黄酮醇的h p l c 检测方法 参照文献b 9 j ，将h p l c 检测条件修改为：美国w a t e r s6 0 0e 高效液相色谱仪( 2 4 8 7 可见紫外检测器) ，色谱柱为p h e n o m e n e x - c 18 ( 15 0 4 6 0m m ) ，流动相a 相为0 2 磷酸 水溶液，b 相为1 0 0 甲醇，洗脱梯度为：2 0 m i n 内b 相从5 5 降到2 0 ，2 0 - 2 1m i nb 相从2 0 回升到5 5 ，2 1 - 3 6m i nb 相保持5 5 不变，流速l m l m i n - 1 ，柱温2 5 ，检 测波长3 6 0n n l ，进样量5 1 t l 。 准确称取杨梅素、槲皮素、山柰素和芦丁标准物各0 o l g ( 精确到0 0 0 0 1 ) ，溶于 甲醇中，然后转移至2 5m l 容量瓶中，即得浓度为0 4m g m l - 1 的标准物质储备液，将 此储备液于4 下保存，三个月之内稳定。各取上述标准物质储备液1m