（环境工程专业论文）藻类荧光对重金属毒性响应规律的研究.pdf

摘要 摘要 废水环境效能的评价已成为社会的迫切需求，生物毒性作为水质生态评价的综 合指标，因能快速得出多种污染物共存下的生物效能受到广泛重视。生物毒性测试 不仅能较全面地反应废水中复合污染物的联合毒性作用，并能充分了解各种环境因 子( 如p h 值、温度、溶解度等) 对污染物毒性效应的具体影响，直观地反映出污染 水体对生物种群的综合毒性，是预测和控制化学物质污染的一种不可缺少的辅助手 段。叶绿素荧光被认为是研究光合作用的理想探针，藻类光合作用在其细胞代谢中 占有核心地位，利用微藻叶绿素荧光检测重金属毒性，具有快速、敏感的特点，在 水质安全评价上具有良好的应用前景。 本课题通过文献初筛三种微藻一斜生栅藻、蛋白核小球藻、铜绿微囊藻作为实 验供试藻。通过预实验确定四种典型重金属离子c d 2 + 、h 9 2 + 、c u 2 + 、z n 2 + 作为实验胁 迫因子，当供试藻生长到对数生长期o d 值在0 3 以上，将重金属溶液母液稀释成一 定浓度梯度后添加到藻培养液中进行胁迫实验。通过重金属对三种供试藻生长及光 合色素影响研究得出四种重金属对供试藻的毒性作用顺序，斜生栅藻为 h 9 2 + c d 2 + c u 2 + z n 2 + ：蛋白核小球藻为c d 2 + c u 2 + z n 2 + h 9 2 + ；铜绿微囊藻为 c u 2 + h 9 2 + z n 2 + c d 2 + 。并分析供试藻种对四种重金属离子的毒性耐受顺序，c d 2 + 为 铜绿微囊藻 斜生栅藻 蛋白核小球藻；h 9 2 + 为蛋白核小球藻 铜绿微囊藻 斜生栅藻； c u 2 + 为斜生栅藻 蛋白核小球藻 铜绿微囊藻；z n 2 + 为斜生栅藻 铜绿微囊藻 蛋白核 小球藻。 通过重金属胁迫供试藻荧光响应实验，研究了供试藻对四种典型重金属离子 c d 2 + 、h 9 2 + 、c t l 2 + 、z n 2 + 的荧光响应。实验结果表明，重金属对藻种的荧光性影响效 果显著，随着胁迫浓度和时间的延长藻光合作用受抑制明显，藻种荧光值与叶绿素 含量间有良好的正相关关系，荧光值呈现先上升再下降的趋势。荧光胁迫实验得到 的结果与藻生长抑制和光合色素的影响趋势基本一致，证明藻种的荧光值变化可以 反应重金属毒性，利用藻荧光响应特性检测重金属浓度胁迫是可行的。 在敏感藻确定实验中以2m i n 作为测试间隔，测定2 0m i n 藻种荧光值的变化。 以藻种荧光强度作为首要考虑条件，时间、重金属种类数及重金属响应效率作为分 析参考依据，最终确定荧光重金属敏感藻为斜生栅藻。并以h g c l 2 作为典型毒性代 表物质，分析了反应时间与h g c l 2 溶液浓度、斜生栅藻荧光变化差值间的线性关系， 确定1 6m i n 为测试的稳定时间，根据藻荧光差值与对应的h g c l 2 浓度初步建立了水 质毒性评价等级。 河北科技大学硕士学位论文 关键词叶绿素荧光：重金属毒物：生物毒性检测；斜生栅藻；蛋白核小球藻；铜 绿微囊藻； ab s t r a c t a b s t r a c t t h ee f f e c t i v e n e s se v a l u a t i o no fw a t e re n v i r o n m e n th a sb e c o m et h eu r g e n tn e e d so f s o c i e t y , b i o l o g i c a lt o x i c i t ya sw a t e re c o l o g i c a le v a l u a t i o ni n d e xo fp o l l u t a n t sc a l lq u i c k l y c o n c l u d e db yt h eb i o l o g i c a le f f i c i e n c yu n d e rt h ec o e x i s t e n c e b i o l o g i c a lt o x i c i t yt e s ti sa k i n do fi n d i s p e n s a b l ea s s i s t a n tm e t h o dw h i c hb eu s e dt op r e d i c t ea n dc o n t r o lc h e m i c a l p o l l u t i o n b e c a u s ei tc a l lr e s p o n s et h ej o i n tt o x i c i t yr o l eo fc o m p o u n dp o l l u t a n t si nw a s t e w a t e r c o m p r e h e n s i v e l y , a n d i tc a l ld e s c r i b et h e c o m p o s i t i v et o x i c i t y t ob i o l o g i c a l p o p u l a t i o nw h i c hd o n eb yt h ep o l l u t e dw a t e ri n t u i t i v e t h ec h l o r o p h y l lf l u o r e s c e r c ei s c o n s i d e r e dt h eb e s tp r o b et or e s e a r c hp h o t o s y n t h e s i s t h ep h o t o s y n t h e s i so fm i c r o algaeoccupies t h ec o r es t a t u so fc e l lm e t a b o l i s ms ot h e r eh a v ep r o s p e c t st od e t e c t i o nt o x i c i t y w h i c hb e l o n d st oh e a v ym e t a l sb yc h l o r o p h y l lf l u o r e s c e n c e ，b e c a u s ei th a sa d v a n t a l e so f q u i c k l ya n ds e n s i t i v e l y a f b e rl i t e r a t u r er e t r i e v a l ，t h ea u t h o rs e l e c t e dt h r e es t r a i n sm i c r o a l g a ef o re x p e r i m e n t t h e r ea r es c e n e d e s m u so b l i q u u s , c h l o r e l l ap y r e n o i d o s a , m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a c d ”， h 9 2 + ，c u 2 + ，z n 2 + f o u rt y p e so ft y p i c a lm e t a l sf o rt h es t r e s st e s t i n g t h ec o n c e n t r a t i o no f m e t a l sd e s i g n e d 嬲0 0 0 4l x m o l l 一，0 0 1 i - t m o l l ，0 0 2p a n o l l 一，0 2 1p m o l l 一，2 0 9 p m o l l 1 ，2 0 9 肛m o l 。l 一w ec a na d ds o m eh e a v ym e t a ls o l u t i o nt ot h ec u l t u r es o l u t i o n w h e nt h et e s t i n gm i c o a l g a eg r o w t ht ol o g a r i t h m i cg r o w t h ，a n di t sv a l u eo fo dm o r et h a n 哆 f i r s t ，w ed ot h ee x p e r i m e n ta b o u tt h eg r o w t ha n dp h o t o s y n t h e t i cp i g m e n ti n n _ u e n c e o ft h r e es t r a i n sm i c r o a l g a eb yc d 2 + ，h 9 2 + ，c u 2 + ，z n 2 + f o u rt y p e so f t y p i c a lm e t a l ss t r e s s e d t h er e s u l t ss h o wt h a t ，t h e t o x i c i t y o ff o u rk i n d so fh e a v ym e t a l st ot h r e es t r a i n s m i c r o a l g a e a s f o l l o w s t h et o x i ce f f e c t st o s c e n e d e s m u s o b l i q u d s i s h 9 2 + c d 2 + c u 2 + z n 2 + ；t h et o x i ce f f e c t st oc h l o r e l l ap y r e n o i d o si sc d 2 + c u 2 + z n 2 + h 9 2 + ； t h et o x i ce f f e c t st om i c r o c y s t i sa e r u g i n o s ai sc u 2 + h 9 2 + z n 2 + c d 2 + i no r d e ro fp a i i e n c e w i t ht o x i c h e a v ym e t a l sb yt h r e e s t r a i n s m i c r o a l g a e a s f o l l o w s h 9 2 + ：c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a s c e n e d e s m u so b l i q u u s ；c u 2 + ：s c e n e d e s m u s o b l i q u u s c h l o r e l l ap y r e n o i d o s a m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ；z n 2 + ：s c e n e d e s m u so b l i q u u s m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a c h l o r e l l ap y r e n o i d o s a t h e nt h ea u t h o rd ot h ee x p e r i m e n ta b o u tt h ec h l o r o p h y l lf l u o r e s c e n c er e s p o n s ew i t h f o u rt y p e so ft y p i c a lm e t a l ss t r e s s e d g e tac o n c l u s i o n ：t h e r e s p o n s eo fc h l o r o p h y l l i i i 河北科技大学硕士学士论文 f l u o r e s c e n c es e xo fa l g a es t r i k i n gb ym e t a l ss t r e s s e d t h er e s u l t so fe x p e r i m e n ts h o w e d t h a tt h ef l u o r e s c e n c ea f f e c to fm i c r o a l g a eb yh e a v ym e t a ls i g n i f i c a n t l y p h o t o s y n t h e s i s r e s t r a i n e ds e r i o u s l yo na c c o u n to fp r o l o n g i n gs t r e s sc o n c e n t r a t i o na n dt i m e f l u o r e s c e n c e s t r e s se x p e r i m e n tr e s u l t so b t a i n e dw i t ha l g a eg r o w t hi n h i b i t i o na n dp h o t o s y n t h e t i c p i g m e n ti sb a s i c a l l yt h es a m ei n f l u e n c eo ft r e n d ，p r o o fb yf l u o r e s c e n c ev a l u ec h a n g e ，u s e t o x i ch e a v ym e t a l sr e s p o n s e sc a na l g a ef l u o r e s c e n c er e s p o n s ec h a r a c t e r i s t i c st e s t i n gh e a v y m e t a lc o n c e n t r a t i o ns t r e s si sf e a s i b l e t h ee x p e r i m e n to fd e t e r m i n i n gs e n s i t i v ea l g a et ot e s tt h ef l u o r e s c e n c ev a l u ec h a n g e i i l2 0m i n u t e sw i t ht w om i n u t e s 行e q u e n c y f i n a l l yd e t e r m i n e df l u o r e s c e n c eh e a v ym e t a l s e n s i t i v ea l g a ei ss c e n e d e s m u so b l i q u u s h g c l 2a sat y p i c a lt o x i c i t yr e p r e s e n t a t i v e m a t e r i a l ，a n a l y z e d t h ed i f f e r e n tt i m el i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e nh g c l 2 s o l u t i o n c o n c e n t r a t i o na n da l g a ef l u o r e s c e n c ev a l u ec h a n g e d e t e r m i n et h e16m i n u t e sf o rt e s t i n g t h es t a b l et i m e ，a c c o r d i n gt ot h ea l g a ef l u o r e s c e n c ev a l u ef o rt h ed i f f e r e n c ea n d c o r r e s p o n d i n gh g c l 2 c o n c e n t r a t i o n i n i t i a l l y e s t a b l i s h e daw a t e r q u a l i t yt o x i c i t y a s s e s s m e n tl e v e 】 k e yw o r d sc h l o r o p h y l lf l u o r e s c e n c e ；h e a v ym e t a lt o x i c a n t s ；b i o t o x i c i t yd e t e c t i o n ； s c e n e d e s m u so b l i q u u s ；c h l o r e l l ap y r e n o i d o s a ；m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ； i v 第1 章绪论 1 1 研究背景 第1 章绪论 随着社会经济的快速发展，工业化程度越来越大，重金属污染物向环境的排放 量日趋增加。这些污染物质主要来源于电镀、采矿、冶金、石油等多种工业行业产 生的废水，是对生态环境危害极大的一类污染物。所谓重金属是指密度浓度4 o 以上 约6 0 种元素或密度5 0 之上的4 5 种元素。砷、硒是非金属，但它的毒性及某些性质 与重金属相似，所以将砷、硒列入重金属污染物的范围内。环境污染方面所指的重 金属主要是指生物毒性显著的汞、镉、铅、铬以及类金属金属砷，还包括具有毒性 的重金属锌、铜、钴、镍、锡等污染物。自然界中的重金属一般不易消失，它可以 通过食物链而被富集，不能被微生物降解，相反的，其长期蓄积性强，可能由于生 物放大效应而使某些重金属协同转换为毒性更大的金属有机化合物。 汞是一种毒性较大的重金属离子是水体污染的重要来源。水体中的汞主要来源 于食盐电解、化工、农药等工业废水。有机汞因为具有很强的脂溶性容易透过细胞 膜进入机体而比无机汞的毒性更大。无机汞进入生物体内，通过食物链的浓缩被人 类食用就会引起中毒。日本的“水俣病”就是人们吃了甲基汞富集的鱼类所导致的。 自然水域中汞含量很小，通常不超过0 1 “g l 一，是我国实施的总量控制指标。人们 饮用含汞5 0m g l 的水2l 就会中毒死亡。有研究显示，较低的浓度下汞就降低藻类 的固氮酶的活性，诱使藻类细胞形态发生畸变。 镉是剧毒性物质，它可以协同体内的其他毒物使毒性增大。主要来源于电镀、 冶炼、染料等工业废水。它通常以正二的价态存在于自然界中，当水中镉的含量为 o 1m g l 一时，会抑制地表水的自净作用：当农溉水中c d 2 + 浓度为0 0 0 7m g l 叫时会 造成轻度污染，浓度达到0 0 4m g l j 时土壤和稻米的受污染情况明显【2 1 。镉作为我国 排放总量控制指标，国家标准限值为：废水中的最高允许排放量为：o 1m g l 。1p j 。 镉具有肾毒性，对白细胞也产生毒性，是机体抗细菌感染的能力下降；1 9 9 3 年国际 抗癌联盟将镉定为i a 级致癌物，当镉中毒时肾脏对钙、磷的重吸收率下降，对维生 素d 代谢异制引。 铜主要来源于金属矿石的开采，冶炼和金属加工、机器制造、有机合成及其他 工业废水中，是一种常见的环境污染物【5 1 。与其他重金属不同的是铜、锌具有双重作 用，它们是机体生长代谢所必须的微量营养元素高浓度的铜是一种应用广泛的藻类 生长抑制剂，如硫酸铜、络合铜广泛运用于杀藻剂的研究。铜对植物的光合作用有 很强的抑制作用，它能抑制p s i i 的电子传递，抑制光合磷酸化和非光合磷酸化过程， 河北科技大学硕士学士论文 抑制r u b p 羟化酶的活性等【6 j 。 根据重金属毒性及其对生物和人体的危害，概括重金属有如下的特点【_ 7 】： 1 ) 微量的重金属便能产生毒性效应，自然水体中一般重金属的毒性范围是1 1 0 m g l 一，汞、镉等毒性较强的重金属毒性范围更小一般在o 0 1 0 0 0 1m g l 。以上； 2 ) 自然水体中的某些重金属可在微生物富集作用下转化为毒性更强的有机重金 属，如汞的甲基化； 3 ) 重金属进入水生生态系统后不能被水生生物降解，蓄积性更强，随着生物链 的放大作用逐级放大，当这些污染物质经过长期积累并达到很高浓度时，破坏生态 环境的物种组成及其群落结构【4 】。当污染累积到一定程度后不仅会影响水生生物的正 常的生理代谢、生命活动，更严重的是会直接或间接地威胁人类的社会生产、生活。 如2 0 0 5 年1 1 月松花江苯类污染事件，2 0 0 5 年1 2 月广东北江韶关段镉污染事件等近 年来水污染突发事故频发，都严重影响了周边城市生产和社会生活。我国的地表饮 用水源地主要为湖泊、河流、水库，但经检验这些水源都遭到不同程度的污染! ，如： 徐小清的研究结果表明，由于沿长江城市和工厂“三废”的排放使长江三峡库区江段 的重金属元素含量严重超标。而由于各重金属成分特性所造成的毒性、遗传毒性、 雌激素效应等生物效应都给废水水质评价带来了一定的困难。 1 2 毒性物质检测方法的研究进展 ! 有毒物质进入水生生态系统后不被水生生物降解，而通过食物链的生物放大对 高营养级的生物甚至人类造成危害，严重威胁人类健康和生命安全。我国对于毒性 物质的检测起步很早，最早采用特定物质分析法【8 】等理化方法。这种方法发展早、方 法完善，但不能直接和全面反映各种有毒物质对水体的综合影响。目前一般用做对 毒性成分的深度分析。 生物毒性是指外源化学物质与机体接触或进入体内的易感部位后，能引起损害 作用的相对能力( 包括致癌、致突变、致畸、损害器官或免疫系统和母体毒性等方面) 或简称为损伤生物体的能力。生物毒性作为水质污染的基础指标之一对水生生物和 水体生态平衡有着重要意义，是国际普遍应用的综合性监测指标。它能正确的反映 出水体的污染负荷与生物学效应的关系，直观地反映污染水体对生物种群的综合毒 性，是预测和控制化学物质污染的一种不可缺少的辅助手段，因此该项指标已越来 越得到世界范围的重视。 水生生物急性毒性实验即是测定高浓度污染物在短时期( 一般不超过几天) 内对 水生生物所产生的明显毒害作用，用以评价污染物毒性的实验方法，作为理化分析 方法的补充，是水质评价的新手段t 9 1 1 1 。生物毒性检测方法是由单指标生物毒性实验 发展起来的，但是水体中的生物种类繁多，仅凭一种水生生物对毒性的反应来评价 2 第1 章绪论 整个水体并不客观，因此鉴于单指标生物毒性实验的不足，到7 0 年代后又发展了利 用同一营养级的几种生物同时对某个环境样品或污染物进行多指标生物测试 ( m u l t i s p e c i e sb i o a s s a y ) 。2 0 世纪9 0 年代细胞生物学和分子生物学快速发展，近年来 对生物毒性的研究更加趋向于微观。在急性毒性分析方面，新的检测手段不断建立， 其指示生物包括细菌、鱼、无脊椎动物和藻类等。 1 2 1 发光细菌毒性检测实验 自1 6 7 2 年r b o y l e 观察到发光的菌体所发出的光易被化学物质抑制后，许多科 学家开始对细菌的发光效应进行大量的研究，直到2 0 世纪8 0 年代国外科学家首次 从海洋鱼类体表成功分离出一种发光菌。通过研究他们认识到发光细菌在毒性检测 方面具有巨大的优势，由此一套完整的生物发光毒性检测技术( l b t ) 被逐步的建立 起来。我国在这方面的起步也比较早，8 0 年代中期，中科院南京土壤所、南京大学 便开始引用推广此项技术。由于发光菌检测时间短、灵敏度高得到广泛认可，方法 得以迅速普及，我国于1 9 9 5 年将其列为环境毒性检测的标准方法( g b t 1 5 4 4 1 1 9 9 5 ) 。 发光菌体内的荧光素酶会催化荧光素发生氧化反应，是菌体正常发光，但当有毒性 物质存在时，发光菌的荧光素酶受到毒性物质的抑制而使发光强度减弱。由于这种 减弱程度与毒性物质的浓度成一定的线性关系，可以根据这个原理来测定污染物或 者废水的毒性1 1 2 】。该方法适合各种有毒化合物如废水、沥出液( 土壤、固体废物等) 、 化工原料、土壤、海洋中受污染区域的生物毒性的测定。可广泛应用于质检、环境 监测、水产养殖等领域，在实验室被广泛应用于各种物质毒性的测定。 发光菌法虽然具有灵敏度高、相关性好、反应速度快等优点，但其再现性欠佳【l 引， 细胞发光强度本底差异大，检测期间发光自然变化幅度较宽的问题，并且由于发光 菌的培养条件等限制，方法只能在实验室内进行。林志芬1 1 4 j 等研究了培养时间、培 养世代、培养温度等条件对测定值的影响，并通过引入校正因子改进了测试方法， 使实验数据的标准偏差降低，提高了实验的重现性。发光菌法中广泛使用的明亮发 光杆菌是一种海洋生物，在测试过程需要3 n a c i 以维持细菌正常生存，这对海洋 污染的毒性测试比较合适，对于淡水体系样品测试会导致样品中一些有毒物质毒性 大小发生变化。1 9 8 5 年，中国学者从青海湟鱼体表分离出了一种淡水型发光菌一青 海孤菌，该菌具有在淡水体系中能正常发光的特点，更适用于淡水环境样品的生物 毒性测试。童中华等利用该菌对印染废水中的1 4 种染料进行了毒性检测，结果表明， 发光菌比化学参数能更准确地反映废水的生物毒性。马梅等将淡水发光菌与明亮发 光杆菌测试结果进行了平行对比，结果表明，淡水发光菌对重金属的毒性检测具有 更高的灵敏度。 3 河北科技大学硕士学士论文 1 2 2 藻类毒物检测方法 在水生毒理学研究中，藻类因其个体小、繁殖快、对毒物敏感、在较短时间内 可得到化学物质对其世代及种群水平的影响并可直接观察细胞水平上的中毒症状等 特点，得到广泛的应用。藻类生物测定( a l g a lb i o a s s a y ) - - 般用于有毒化学品的环境毒 性测试，到目前为止，已经成为一种比较成熟的测试系统。藻类生物测试最早是在 1 9 6 7 年美国提出的“暂行藻类测试程序”( p r o v i s i o n a la l g a la s s a yp r o c e d u r e ，简称 p a a p ) ，而后修改成a a b t ( 藻类测试玻璃瓶法，a l g a la s s a yb o t t l et e s t ) 1 5 】美国公 共卫生协会等三组织1 9 7 5 年将a a b t 定为通用标准方法【l6 1 。o e c d ( 美国经济合作 与发展组织) 于1 9 8 1 年提出“藻类生长抑制实验方法”( a l g ag r o w t hi n h i b i t i o nt e s t ， a g i t ) 1 。7 1 。1 9 8 2 1 9 8 4 年间，国际化标准组织( i s o ) 提出了借助藻类判断化学品毒性的 d r a f t 方法。而o e c d 的藻类生长抑制实验是目前最常用的一种方法，o e c d 建议采 用单细胞微藻作为实验藻种。1 9 9 3 年中国国家环境保护局编写了水生生物检测手 册，制定了详细的环境监测技术规矧1 8 】。2 0 0 4 年欧盟公布了国际标准水质用单 细胞藻进行淡水藻类生长抑制性实验( i s 0 8 6 9 2 ：2 0 0 4 ) 【l 州并取代了e n 2 8 6 9 2 ：1 9 9 3 。 这些标准和规范应用至今，在评价水环境中有毒有物的生态风险等方面发挥着重要 作用。 当藻类暴露给毒物之后，藻类受毒物影响：生长速率下降，内含物变粗，细胞 畸变或分裂受阻，酶活性丧失，代谢迟缓甚至停止。依据藻类的这些反应并结合藻 类生长量的变化，即可对被试毒物的毒性强弱及其环境效应做出较为客观的综合性 评价【2 0 1 。以藻生物量作为测试指标，多是对藻批量培养后观察藻生物量数量上的变 化。藻生物量包括：细胞数、光密度、干重等，目前常用的方法有藻类的生长抑制 实验、藻类细胞形态及超微结构的变化、生物标志物检测、藻类种群群落的变化、 遗传物质的损伤等，它们都是以2 4 9 6h 的e c 5 0 的值作为结果的表达。尽管实验 结果准确可靠，但是实验工作量较大，测试周期长。 水体中的环境毒素均能直接或间接抑制单细胞类的光合作用，其中多数除草剂 就是通过抑制光合作用来达到除草目的【捌。而污染物对藻类荧光光合率影响敏感， 藻类荧光强度被认为是理想的生物毒性探针【2 3 1 。水质毒性分析荧光仪【2 4 】是以单细胞 藻为指示生物，利用水质毒性对其光合活性的抑制，以藻荧光量的变化为参比的生 物毒性检测技术。利用这种方法检测生物毒性大大提高了检验的灵敏度，而且检验 快速，适用于现场检验，具有广泛的应用前景。但由于缺乏藻类对不同化合物的毒 性资料以及不同藻类对毒性化合物的灵敏度资料而使该项技术还没有得到推广。 1 2 2 1 藻类检测方法的优缺点 利用藻类监测水体污染的优越性主要表现在：1 ) 综合反映环境污染对生态系统的 4 第1 章绪论 影响；2 ) 直接观察污染物对生命系统的危害：3 ) 口- - j 早期发现环境污染：4 ) 能监测长期 的影响。但藻类监测也存在着一些问题：1 ) 传统的藻类监测耗时较长，同时要求监测 人员具有相当广泛的专业知识；2 ) 藻类监测更多的是一种定性的描述，难以进行定量 的评价和制定相应的水质标准；3 ) 缺乏藻种对不同化合物的毒性资料。 1 2 3 其他检测方法 由于鱼类对水环境的变化敏感，水蚤繁殖能力强，同时对多种有毒物质敏感的 特点这两种指示物在生物毒性实验中应用较早，技术较为成熟1 2 。水蚤也是国际 上普遍采用的标准毒性实验生物【6 ，2 8 。2 9 】。近年来，一些学者发现采用生物生理或行为 上的变化( 如捕食行为、趋光行为及代谢过程等) 作为毒性测试指标可以缩短实验时 间，提高灵敏度。德国b b e 公司研发的大型蚤水质毒性检测仪【3 0 】以发光蚤中的各项 生理行为参数，算出水质毒性数据，实现连续在线监测，在2 0 0 2 年冬季奥运会得到 很好的应用。 生物传感器法( 如：酶传感器【3 l 】、微生物传感器【3 2 】、d n a 传感器【3 3 。3 5 】和免疫传 感器等) 、a m e s 实验( 该方法已被确立为i s o 标准体系中用于监测环境水的生物遗传 毒性的标准方法) 等多种微生物检测技术己被建立，都对重金属等有毒物质响应高， 检测时间短、操作简便。表1 1 将五种毒性检测实验进行了综合比较。 5 河北科技大学硕十学士论文 1 3 重金属毒性与藻类荧光性 1 3 1 重金属对藻类的影响 藻类是一群具有叶绿素的，可以进行自养生活的低等植物。藻类作为初级生 产者，可以通过光合作用和自身合成的有机物质为其他浮游植物提供氧气和食物， 在水生生态系统和水生食物链中占据十分重要地位。由于其形体小、比表面积大， 繁殖快，易于培养，对环境毒物敏感，在较短时间内可获得环境诱变物对其世代及 种群水平的影响，常被用作急性毒性实验的测试生物。近年来，由于人类活动以及 工业化程度的加快，使得化石燃料焚烧、采矿、冶炼等1 37 】工业行业向地表水排放的 废水中重金属含量增加。 微量的重金属即可产生毒性效应，排入到水中的重金属被藻类吸收后将影响 藻类d n a 、r n a 、蛋白质合成及酶活性【3 8 l ，引起藻类生理代谢功能紊乱，减少细 胞色素，抑制光合作用，导致细胞畸变，组织坏死【3 9 1 ，甚至使藻类中毒死亡，改变 6 第1 章绪论 天然环境中藻类的种类组成【4 们。关于重金属与藻类的关系，早在3 0 年代就已经开 始，而对于重金属对藻类毒性的研究直到5 0 年代才起步。从6 0 年代到现在，随着 实验技术的发展，使得重金属与藻类相互作用的毒理学研究取得飞速的发展。大量 研究表明，一般的，重金属对藻类的毒性作用为：h g c d c u z n p b c r 。 表卜2 重金属对不同藻的影响 t a b i - 2t h ea f f e c to fd i f f e r e n tt y p e so fh e a v ym e t a lt od i f f e r e n ta l g a es p e c i e s 垒垦堕鏖( 翌生：1 2墅堕堡壅 夔耋 l 几乎停止生长 小形月牙藻 1 0 完全停止生长 ； c u 2 + i 3抑制生长 ! 钝顶螺旋藻 4致死 l l 6抑制生长 ! 钝顶螺旋藻 c d 2 +9 致死 1 1 2 2 6 8 8叶绿紊含量减少，光合放氧抑制椭圆小球藻 9 0 39 6 h 半数抑制湛江叉鞭金藻 p b 2 + 8 8 39 6 h 半数抑制球等鞭金藻 h 9 2 + 邳0 2生长受到抑制叶绿素a 含量降低绿色巴夫藻 n i ” 2 3 4 7 6生长受到显抑制，光合作用受阻，细胞膜透性增加 纤维藻 1 3 2 藻类的荧光特性 1 3 2 1 藻类荧光原理i 浮游植物光合系统由外围天线色素或光捕获复合物、内部天线色素和反应中心 组成，光合作用所需光能基本都是通过天线色素吸收的，外部天线色素将捕获的绝 大部分能量直接或间接地传递给内部天线色素叶绿素a 。当光被叶绿素分子吸收后， 叶绿素分子由基态( 低能态) 跃迁到激发态( 高能态) 。激发态很不稳定，会释放能量回 到基态。激发态分子释放能量的方式有3 种：进行光合作用( 光化学反应) 、发出荧光 和以热的形式耗散掉。根据热力学第一定律和爱因斯坦能量方程，叶绿素荧光、光 合作用能量转换和非辐射能量耗散( 即热耗散) 三者之间具有互补的关系【4 2 1 。也就是 说，叶绿素荧光荧光产量的降低有可能是由光合作用的增加或热耗散的增加引起的。 藻类属于单细胞植物，其生长利用光合作用固定能量，因此光合作用在藻类的 细胞代谢中居于核心地位。藻类在受到极低浓度( 1 0 “o ) 的某些环境污染物刺激时，其 光合作用电子传递过程受到抑制，光合活性明显下降，导致藻液荧光产量的改变p j 。 7 河北科技大学硕士学士论文 ；麟n n 入 ， 光化学反直 p h o t o c h e m i s t r y 热 h e a t 图1 一l藻光合系统p s l l 能量传递模型 f i g i ie n e r g yt r a n s f e rm o d e lo fp s i i ， 1 3 2 2 藻类荧光影响原因 不同的毒物对藻类的毒害作用不同，重金属将影响藻类d n a 、r n a 、蛋白质合 成及酶活性【4 3 1 ，引起藻类生理代谢功能紊乱，减少细胞色素，抑制光合作用，导致 细胞畸变，组织坏死【4 4 1 ，甚至使藻类中毒死亡，改变天然环境中藻类的种类组成【4 5 1 。 对于藻类荧光性的改变主要是影响藻的光合作用，即毒物通过阻断光合作用的 电子传递链导致叶绿素的荧光强度增高，增加的幅度与污染物浓度相关。主要表现 为：毒物进入藻体内损伤藻细胞中的捕光色素蛋白复合体，降低藻捕光能力；光合 器吸收的光能减少，光合电子传递链的活性降低，叶绿素的合成受到抑制，以至类 胡萝卜素与叶绿素的比例失调；叶绿素a 含量降低，光合作用效率降低抑制p s i i 的 电子传输并降低p si i 活性【4 6 1 。有的甚至会破坏类囊体片层结构、s o d 和p o d 活性 下降等。 1 4 课题来源 由于我国水资源短缺情况加剧，人们对水资源使用、管理概念认识的逐渐深入， 水资源的持续有效合理利用、饮用水的安全已成为制约社会发展和进步的重要因素。 地表水源作为一个开放的体系具有面积大容易受外界因素影响等特点，经济社会的 发展和环境污染的加剧一些不确定因素对地表水资源水质安全构成威胁，本课题来 源于河北省2 0 1 0 攻关课题“地表水饮用水源的水质安全监控预警综合技术研究 - 生 物毒性藻类快速检测系统。地表水源和外界环境因素关系复杂、范围大，环境污染 和不良生产方式造成的地表水水源问题已时有发生，如太湖蓝藻事件严重影响了周 边城市生产和社会生活。传统的水质监控方法和技术已不能满足用水安全的要求， 开发地表水饮用水源地水质安全监控预警综合技术提前预警水源水质变化、分析成 8 第1 章绪论 因，尽早采取响应措施减少损失，已成为社会发展进步的迫切需求，具有广阔的应 用前景。 1 5 课题意义 随着工业化发展，越来越多的重金属排向水体，给水环境造成了极大地压力。 同时由于重金属共存时产生的联合作用也给水质环境效能评价带来许多困难。新的 生物毒性检测方法虽然在不断建立，包括细菌类、鱼类、无脊椎动物类、藻类等作 为指示生物，鱼类等方法测试时间长，操作复杂，不能到达快速检测的需要。发光 细菌法的菌种昂贵、不易保存，重现差，不适宜在线监测。微量的重金属即可抑制 藻类的生长，破坏藻细胞内含物、降低酶的活性、影响整个生物链的正常代谢。而 传统的藻类生长抑制、酶活性、细胞结构变化等检测方法，虽然能检测出毒性结果， 但需要的测量时间较长，大大降低了生物监测的时效性。随着叶绿素荧光技术的发 展，利用叶绿素荧光变化作为生物毒性的研究探针，为探索解决废水环境效能快速 综合评价和水质预警这一复杂科学问题的新途径。 藻类荧光测试法与传统法比较具有以下特点：1 ) 低等藻类普遍存在，价格便宜， 容易培养，制备简单，方便保存，并且复苏后的藻种性能稳定；2 ) 操作简单，可实现 性强，不易受时间、空间的限制。因此，这种基于藻本底稳定荧光量改变来检测水 质毒性的藻类荧光检测方法在毒性检测方面具有广阔的应用前景。 1 6 研究内容 课题采用藻类荧光作为生物毒性的探针，实验、探索解决废水环境效能快速综 合评价和水质预警这一复杂科学问题的新途径。通过实验研究生物毒性对典型敏感 藻类荧光的影响规律、探索污染物对藻类荧光影响机理，初步建立藻类荧光生物毒 性检测方法体系，实现废水生物毒性的快速评价。藻类荧光为毒性表征因子，以 h g c l 2 为生物毒性代表物，通过荧光响应实验筛选生物毒性敏感藻。研究重金属对 敏感藻荧光作用的变化规律，初步建立生物毒性藻类荧光快速检测方法，并用标准 藻类生长抑制法与新建立的方法进行对比，丰富废水环境效能快速综合评价和水质 预警方法体系。 主要研究内容为： 1 ) 初筛实验供实藻； 敏感藻的选择确定是建立藻类荧光测实的技术关键。适合于毒性检测的敏感藻 需满足以下条件，供试藻荧光性对毒性响应敏感性强；供试藻生长周期短、易于培 养，荧光响应稳定。查阅有关藻类和藻类毒性实验研究文献，研究分析，并参考其 9 河北科技大学硕士学士论文 他毒性检测法敏感藻的筛选，选择常见、易培养、对水环境中毒性物质敏感的藻类 作为实验的供试藻。 2 ) 藻生长抑制和光合色素影响标准方法研究重金属对供实藻影响规律； 3 ) 研究藻荧光性对重金属毒性响应； 4 ) 验证藻荧光性作为重金属检测指标的可行性： 将重金属毒性的藻类荧光响应结果与藻类生长抑制标准方法的实验结果进行比 较，确定荧光性的可行性。 5 ) 筛选对h g c l 2 毒性荧光响应显著的供试藻为敏感藻，并深入研究敏感藻荧光 性对h g c l 2 毒性的响应规律，初步建立荧光检测方法。 分析重金属毒性对藻生长及荧光特性的综合影响，确定一种毒性荧光敏感藻， 并利用其对h g c l 2 的毒性响应建立胁迫浓度与荧光值响应值间回归方程，优化藻荧 光最佳响应时间，初步建立藻荧光水质检测方法。 1 0 第2 章前期研究 第2 章前期研究 因藻类对毒性物质反应敏感，易培养，繁殖快，能够反应水体的综合影响，近 年来利用藻类进行水体监测应用广泛。但是微藻的种类繁多，其生理结构、环境和 生长周期存在着较大差异，其对重金属的毒性响应不同，重金属的结构、水环境p f i 值、温度等因素都会影响藻类对重金属的吸附及耐受能力。敏感藻的确定是藻类荧 光检测方法的技术关键，因此筛选适宜的实验供实藻是课题的基础关键。本部分为 课题的前期准备预实验内容，主要筛选出适用于本课题研究的公供实藻种，了解其 生长特性，采用适宜的培养条件，对其进行扩大、同步培养；比较藻种生物萤的几 种常用指标的准确性、可操作性，确定实验藻种的表示指标；依据我国水质标准的 要求选定典型的有代表性的重金属作为实验材料，并对其胁迫浓度进行设计。i 2 1 仪器与材料! 2 1 1主要仪器 ： 实验所用的主要仪器详见表2 1 。 表2 1 实验仪器列表 t a b 2 - il i s to fe x p e r i m e n t a li n s t r u m e n t s 仪器名称生产，家 2 1 2 实验试剂 实验所用试剂详见表2 - 2 。 河北科技大学硕士学位论文 2 2 供试藻的选择依据 藻类对环境中的许多毒物比水生动物更为敏感，是最常使用的环境检测指示物 种之一。阅读大量文献后发现，不同藻类对毒性反应敏感不同。藻类的种类组成依 赖于不同种的敏感性，若一藻种对某种毒物比较敏感，当这一水体被毒物污染时， 较敏感的藻种首先受到影响，进而消失，利用水体中藻类的组成，可以预测水体受 污染的程度【4 7 。 敏感藻的选择确定是建立藻类荧光测试的技术关键。适合于毒性检测的敏感藻 基本要求：供试藻荧光性对毒性响应敏感性强；供试藻生长周期短、易于培养，荧 光响应稳定。查阅有关藻类和藻类毒性研究文献，分析前人的实验资料，从中筛选 出几种常见的、易于生长培养的、对于毒性荧光响应较为敏感的藻类作为实验的供 试藻。在藻类毒性测试实验中，国际经合组织( o e c d ) 标准方法将斜生栅藻 ( s c e n e d e s m u so b l i q u u s ) 歹l j 为环境监测的实验藻种；中国国家环保局推荐使用蛋白核小 球藻( c h l o r e l l a p y r e n o i d o s ac h i c k ) 作为实验藻种( 苯胺苯酚引言) ：欧盟的自动藻类生物 检测系统( f l u o x ) 使用铜绿微囊藻( m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ) 为指示生物对莱茵河的水质 1 2 第2 章前期研究 进行连续监测，检测效果理想。因此，本实验选择这三种对毒性物质响