（环境工程专业论文）色谱柱评价方法发展.pdf

硕士论文色谱柱评价方法发展 ab s t r 8 c t 5 议 me l h od s e v al u a t in g s t r o ng for e v a l u at i n gr e v e r se dp h as e( rl，)col u . mands i xm e t h o d s exc h ange ( s a x )c o l u m narec o m p a r e d .a d v anta g e s d i s a d v an1 a g e s o f th e sem e t h o dsare o b t a i n e dby c o m p ar e dsys t e ms t a b i l i ty、deadt i m e 、 thco旧ic aipl ates 、韶 y m m et ryand ana l y si s t 而e ， w hi chare benefittop r o d u c e r and 理 犯 r n e wm e th 0 d s for eval uati ng rp ands a xare d eve lo pedb a s e don the com p ariso n re se arch . tothe iu， col u m n ， the mine ndedc 0 m posi ti onofthe mobile p h as eis 90% m e t h 田 l o landl o% b u ffer ， w b e re the b u ffercom pos i t i o ni s2 0n u n o l/l pot ass i um 户o s p h a t e adjust e dtop h7 .0士0 1 ， 助dt h e s ampl e i s 切 ra c i l ， to l uene andamitrip t y l i ne. ur a c i li su s e das an i ndi c a 1 o ro ft h ev o i d v o l u 幻 n e .t o l u e n ei sause fulma r k er for 目 c ul atio n o f c o l umne ffic i e n c y ( th e o r e l i c alp l at e s ， 殉 明d h y d ro p ho玩 l ity o f the p a c ki ng. a ln l 们 p ty l in e i s a b as i c (p ka = 9 .4 ) p h a rm即 euti c ald ru g ( anti d e p re s s ant) u se d fo r c o l unm c h aj 旧 c 抚 ri zati o nto th e s a xcol u ln n ， the re c o m m e n d edc o m pos i t i o n o f the m o b i 1 e p h as e i s 5 0 nun o l/l potass i um p hosph at e ， 阴d th e s amp l e i n c l u des ade n o s in e 、 c m p 、 a m p 、 u m p 朋dgmp.ad e n o s i ne i su sedas an i ndi c a t o ro f t he v o i dv o l u 们 n e . gmpi sau seful mark e r fo r c a l c u l at i o n o f c o 1 u n 1 n e ffic i e n c y ( th core t i c a l p l a te s ， 均. k e 州o r d s :c o l u nm e x c h ang e ( h p l c ) e v a l u a t i o n ，rev e r s e d p h a s ec o l u m n ，s tron g c o l u mn， h i gh p e 而rmanc el i q u i dc hr o m atogr a p hy 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本 学 位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人己经发表或 公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使 用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做 出的贡献均 己在论文 中作 了明确的说 明。 研 究 生 签名 : 燕俊兰2 ” 2 年 了 月万日 学位论 文 使用 授权 声 明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可 以借阅或 上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并 授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部 内容。对于保密 论文，按保密的有关规定和程序处理。 研 究生 签 名:建傲兰 泌 了年 了月乡日 硕士论文色谱柱评价方法发展 1绪论 1 . 1概述 色谱法是分析化学的重要组成部分之一， 是科学进步和生产发展的重要保障。 早 期的液相色谱法是采用大内径玻璃管柱在室温和常压下利用液位差输送流动相， 称为 经典 液相色谱法。 高 效液相色谱法 ( hi ghped b rman c e li quidc hrom a t o g r a p h y ， h p l c) 在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入气相色谱理论而迅速发展起来。由 于高效液相色谱法具有分离效能高、 选择性好、 灵敏度高、分析速度快等特点，已经 广泛应用于石油化工、生物化学、临床医学、食品卫生、 环境监测、医药工业、商品 检验等领域的分离分析川 。 色谱法， 利用物质在两相中吸附或分配系数的微小差异而达到分离目的。 一般而 言， 色谱过程中不同组分在相对运动、 互不相溶的两相间交换， 其中相对静止的乙格 被称为固定相，而另一个相对运动的相被称为流动相。不同组分在两相间的吸附、 分 配、 离子交换、 亲和力或分子尺寸等性质存在微小差异，经过在两相间连续的质量交 换， 这种微小差别被叠加、 放大， 最终得到分离121 。因此分离的必要条件是不同组分 性质上的微小差别: 而充分条件是性质上存在微小差别的组分在两相间进行上千次甚 至上百万次的质量交换。高效液相色谱方法就是基于样品分子在固定相 ( 即柱填料) 和流动相之间的特殊相互作用而实现分离的。 该技术的实施除了具备专用的高压输液 系 统和高 灵 敏检测系统等设 备之外， 最关 键的 还需要有高效分离 柱13) . 因 此， 色谱柱 研究始终在高效液相色谱中占有十分重要的地位。 h p l c 应用初期， 主要填料是10 ” m的 无定型 硅胶颗粒。 70年代后期， 发展了 反 相液相色谱。 80年代， h p l c广泛应用于 化合物分离，主要填料是5 10 “ m球形硅 胶。 90年代早期，出现了 粒径为5 卜 m的高纯硅胶， 即所谓的b型硅胶， 并成为行业 填料的标准。 90年代后期， 为了满足快速分离的需求，发展了3 p m或3. 5 林 m的球形 硅胶，其作用和性能逐渐获得了人们的认同并被接受。21 世纪早期，为适应超快速 的分离要 求， 粒径小于2 拜 m的 填料出 现， 整体柱、 无机和有 机杂化硅胶出 现。目 前， 市场上主 流的 分析用hplc 硅胶基质填料为b型 硅胶141 。 据19 97年统计，已 有6 00 多种新型反相固定相进入市场，至 2002 年化学键合固定相的总数已达 1000 种以上 15 刃 。随着装柱方法不断改进，色谱柱性能差异明显;市场上缺乏一个统一的、合理 的评价方法评定其性能; 加之色谱柱属于消耗品， 无论是自己装填的还是购买的色谱 柱， 使用之前、 使用期间或放置一段时间 后都有必要检查评价其性能18) 。 所以， 对制 造商和液相色谱工作者都期望能有一种标准的检验程序， 以对色谱填料及对应色谱柱 的色谱 l 硕士论文色谱柱评价方法发展 表 1 . i s a x色谱柱评价方法 公司名称流动相样品名称 流速 ( m l / m i n ) 检测波 长( n m ) 545454545454 2222，山，山 、n卜 : 0l el 讹甲 醇 / 水= 3 0 1 7 0 ( v 八 ) h y peis i i tl ， e n 刀 0 k h z p o4， ph= 3 . 3 25.0乃 lzi h y pers i l 一 k e y s 加n e 异辛切乙醇(03 % 水) = 8 5 / 1 5 ( v l 亏 ) 肠恤e rs s h od e x th e n n o h y pers i l 一 k eys to n e 1 00 叭泊 5 0 mn 】 0 】 j l c n 硫酸钠 k h z p o 刁 ， p h =4. 6 8 苯甲酞胺、苯乙 酮 cmp、amp 、ump 、 g卜 ， p 甲苯、硝基苯、 邻硝基 苯胺、间硝基苯胺、对 硝基苯胺 丙酮 丙酮 尿啥咤、u mp 、a m p 、 gmp 表 1 .z s c x色谱柱评价方法 公司名称流动相样品名称 流速 ( ml /mi n ) 检测波长 ( n m) 254254254254254280254254 el i 把 乙睛 冰= 叨/6 创 v/v) 尿啼陡、 硝基苯、禁、菊0. 9 el i te乙睛/ 水二 75/2 5( v l v )苯甲酞胺、苯乙酮0 一 9 .025 1l h y pers i l乙睛/ 水=40 / 6 0 ( v 八 ) 异辛烷了 乙醇= 8 5/15 h ” 珍 r s i l 一 k e y s t one 尿喷咙、对径基苯甲酸乙 醋、对轻基苯甲酸j 一 醋、 禁、蕙 甲苯、 硝基苯、 邻一 硝基苯 胺 h y p e rs i l 一 k e y s to n e l oom m ol 几k h z p 认，尿哦咤、 胞核啥睫、鸟 嗓 0 一 8 p h =35 / 乙 睛刁0 / 1 0岭 no : l2 5 0 m m o ljl 硫酸钠丙酮 1 00%乙睛丙酮 5 0mm 。 比 磷酸缓尿啥睫、 胞咤、鸟普、腺 冲溶液， p h = 2. 5曹 硕上论文色谱柱评价方法发展 表1 .3 c 18 色谱柱评价方法 公司名称流动相样品 流速 ( ml l mi n ) 检测波长 ( 附 ) ”1.01.25 el i te 甲醇1 水 = 8 5 / 1 5 ( v 八 ) 乙睛/ 水铺5 l3 5( v l ， ) 2 5 4 2 5 4 5454545454545454545454 222，2，一2222内 乙睛/ 水= 6 0 z 4 0( vl 分 ) 八“0口oonlluno -，. 101111111 the rmo h y pe邝 1 1 - ke y s t o ne t 七 e n n o h y per s i l - k eys t o ne the n ” o h y per s i l - k e y s 1 0 n e 乙睛/ 水= 6 0 /4 0( v l v ) 甲醉/ 水= 5 5 /4 5( v l 亏 ) 岛津甲醇/ 水叼0 /3 0( v/ v ) 杜邦甲醇/ 水= 8 5 / 1 5 ( v l v ) 天津试剂二厂 s p bi o-ra d gls c i e n c e si n c . 甲醇/ 水= 8 0 1 2 厌 v l v ) 乙睛/ 水=40 2 6 0 ( v / v ) 甲醇 冰= 5 0/5侧 v/v) 乙睛/ 水=65 /3 5( v z v ) pha s e s ep 乙睛/ 水=60 了 4 0 ( v 加 ) the rmo h y pers i l - k e y s t o n e 甲醇 150 m m o l /lk h z p 认 荀0 /40 ( v z v ) 尿啥睫、硝基苯、禁、茹 尿嚓喧、苯乙酮、苯、甲 苯、 禁 茶碱、 对硝基苯胺、 苯甲 酸甲 醋、苯乙醚、邻二甲苯 尿啼咙、对轻基苯甲酸乙醋、 对羚基苯甲酸丁醋、禁、蕙 苯甲酞胺、苯乙酮、苯甲酮、 联苯 尿嗜吮、苯甲酸甲醋、甲苯、 蔡 尿啥吮、苯酚、4 一 氯一 硝基苯、 甲苯 苯、禁、联苯、菲 苯甲醇、苯甲醛、甲苯 苯甲醇、 苯甲醛、苯甲酸甲醋 苯乙酮，苯，甲苯 邻苯二甲 酸二甲酪，硝基苯， 苯甲醚，二苯胺，荀 尿啼吮、毗咤、 n-甲基苯胺、 从 琴二甲 基苯胺、 2， 6- 二氯一 硝基苯胺、甲苯 分离性能做出准确评价。因此，色谱柱评价方法的研究一直备受关注。 1 .2 色谱填料及色谱柱评价方法的分类 李海生191 和王明 娟 等 110 1 对色谱 柱 评价方 法作了 分类， 综合其 它文 献 11 1 报道， 可将 色谱填料及色谱柱评价方法分成两大类:色谱法和非色谱法131 。 硕士论文色谱柱评价方法发展 1 :21色谱法 色谱法是利用色谱手段对色谱填料及色谱柱性能进行表征。 这种方法的优点是一 般不需破坏色谱柱，无需使用其它昂贵的仪器，在不影响色谱性能的基础上做评价， 而且能更精细、 直观的反映不同色谱柱的性能差异。因此， 色谱法应用广泛， 一直是 科学研究的热点之一。 色谱法可以分为三类: 一类是在专门应用条件下的评价， 即针对某些实际样品的 分析提出 柱 效、 分辨率 和峰对称性要求121 ; 另 一类则是由 生 产厂 家提供的 评价方法， 大多选择常规实验室容易找到的3 4种中性组分作为测试物。高效液相色谱柱的评 价是生产厂家保证产品质量和用户深入了解其性能、 并有效应用所必需的。 一份合格 的色谱柱评价报告应给出色谱柱的基本参数， 如柱长、内径、填料的种类、 粒度、 色 谱柱的死体积、柱效、 不对称度和柱压降等.表 1 1 、1 .2 、1 .3中列出了国内外几个 知名色谱柱生产厂商所使用的反相色谱( rp) 、强阳离子交换色谱(s c x ) 、强阴离子交 换色谱(s a x ) 的评价方法。第三类是通过评价色谱柱的色谱性能来表征填料的性质 11 洲 41 。 一般选用特征差异较大的 探针物质进行测试， 并从中 选出能反映色谱柱保留特 征的参数来表征色谱填料的性能; 这些性能一般包括疏水性或疏水选择性、 硅轻基活 性、离子交换性能、金属残留量、以及对酸碱的分离性能。 l 2. 2非色谱法 非色谱法常采用红外光谱、 核磁共振等波谱分析方法115 ， 161 或元素分析仪115 一 川、 吸 附 法11 81 等 其 它 物理分 析 方 法 131 来 反 映 色 谱柱的 键合量、 键 合 方式、 是 否 封 尾、 比 表 面 积以及填料疏水性等。 该方法比 较适合填料的评价， 但对于色谱柱就需要破坏色谱柱 进行分 析， 而 且提供的 信息 也比 较粗略11 1 ， 所以 在实际应用中受到了限 制。 1 3色谱填料及色谱柱评价方法的发展及现状 气相色谱方法的发展为色谱分离特性做出确切的评价提供了先例，1970年麦克 雷诺10种探针溶质的提出，完满的解决了对气相色谱柱分离特性的评价方法。1971 年g r o b 溶质的出 现也对毛细管气相色谱柱化学活性的评价做出了重要的贡献1191。 反相色谱填料种类多、应用广泛，其性能研究成为研究热点。19 82 年 h. e n ge lh a r d 砂 20 1等 就c18 固 定 相的 性 质 对 选 择 性 的 影 响 作了 报 道， 提出 硅 胶 键 合 反 相 固定相的性质取决于硅胶的物理性质、 化学表面性质、以及键合硅烷的种类等等，比 较了c 18固定相的性质。为反相色谱填料及色谱柱评价奠定了基础。 硕士论文 色谱柱评价方法发展 表 1 .4 tan a ka 反相固定相评价条件 测定条件 ( 流动相)固定相性能 影响因素 k戊 ，( 80%甲醇) k虎 药 ， 瓜份 :( 8 0 %甲醇) k， 井 芍 瓜、 组，( 8 0 %甲醇) k 瓜， 肠 ( 3 0 %甲醇) ， . 爪， : .( 3 0 %甲醇/0一02m 。 比 k h z p o 心 ， p h =7一6 ) 苹 . 瓜 ， ， 试 30%甲醇/0 .02m 。 比 k h z p 0 4 ， p h = 2 . 7 ) 烷基量的多少 疏水性 空间选择性 氢键容量 与51 仇的表面积和键合量有关 与键合量有关 与硅烷改性剂的种类和键合量有关 与硅独基的量、封尾及表面覆盖度有关 离子交换能力 (p h =7.6 ) 固定相表面硅轻基的量和离子交换中心 离子交 换容量 (p h = 2 . 7)离子交 换中 心及硅胶预处 理 1 983 年p. c s adek lzl l等对反相色 谱作了 简单的 评价， 此后一些试探性的 研究 也相 继出 现122 一 刀 。 直到1 9 89年， 毛 川 a k a lzsl 等 提出 对用不同 方法制备的反 相c 1 8( 0 d s) 键合 固定相进行分类的方法， 并提出用6 个参数来评价反相固定相的特性， 如表 1 . 4 所示， 并将6 个参数组成平面六轴坐标，由每种c 18固定相对应各参数的数值构成一平面 六边形的图， 如图1 . 1 所示， 根据六边形各个角的突出或凹陷程度来大致判断每种反 相固定相的特性。 此报道首次将定性的色谱填料评价量化，易于比较，得到了色谱领 域的一致认同， 并被广泛的应用， 对今后这一领域研究产生了深远的影响。 但是在这 篇报道里没有提到死时间的标记，对于反相色谱无疑是一明显的缺憾。同年j u nk。 yam ag yuchi 和to s hi hi k o h anailz g-3 ， 1研究 了 固 定 相 的 含 碳 量 及 是否 封 尾 对 其 选 择 性的 影响。 r 止名分 r 苹曲八. 耸.。曲乳6 戊盆笨八，丁笨 r 笨业儿苹.。比2 . 7 笼井非几 ，翻兰晓黎 r 幽呼因几.笨. 图1 . 1 1 a n a k a评价固定相的平面六边形 硕士论文 色谱柱评价方法发展 19 00年h. e n ge th aj 月 t 和m 一j un gh ei m l32 1提出 一 种 新 的比 较 反 相固 定 相 性 质 的 方 法， 这种方法以硫服、苯酚、 甲酷、甲苯和乙苯等 10 邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、 从n ，- 二甲苯胺、苯甲酸 种不同性质的化合物作为样品，在不同流动相条件下比较反 相固定相的性能。 硫服用于标记死时间;甲苯和乙苯描述疏水性; 苯酚和苯甲酸乙酷 描述过酸和中性极性反应( ad di t io nal ac i di c and n e u t ra i po1 ari n t e r a c t 1 o ns) : 其它5 种胺 的同系物描述亲硅经基效应。 此方法同 样得到很多人的认同， 并于 1997年作了改进， 作为评价反相色谱柱的方 法1331。 1 995 年robe rt j. ste月 七 c k 等13 4 提出了比 较c ls和c s 色谱柱的 方法， 该方法以 尿 啥睫、 毗咤、 苯酚、 从 尸 . 二甲基苯胺、 4 一 丁基苯甲酸和甲苯6 个组分作为样品， 通过 比 较色谱柱对于极性和非极性化合物的保留时间、 对称度和选择性等指标， 反映出键 合相的疏水性和硅胶的活性。他们将一些市售色谱柱作比较并将比较数据制成图表， 方便了 其它使用者选择色谱柱。 2 0 00年在户1 么 il aka 工作基础上， eue rb y 和p eter ss on 将前述对反相固定相特性评价方法，扩展用于评价85种反相类型化学键合固定相， 并增加戊基苯作溶质测定理论塔板数作为评价色谱柱特性的第7 个参数。2003 年他 们又扩展到13 5 种不同类型化学键合固定相， 提供了大量实验数据， 并利用化学计量 学的主组分分析法， 对固定相分类方法做出有价值的评价， 也为提供统一可普遍接受 的反相键合相的标准分类检验方法做出了贡献。 加 03年 ， g. j. e p pert 和p. h ei tm annl35 1还 提 出 了 用 三 角 形 或 正 四 面 体 图 来 评 价固 定 相。 目前， 色谱填料及色谱柱的评价方法越来越多， 与离子交换色谱和正相色谱相比， 反相色谱的评价研究比较多。 迄今致力于研究评价化学键合相色谱分离特性的化学文 献已 近百篇， 但至今也没有一个方法被广泛接受作为统一的评价标准。 在近些年的研究中， 一些机构也试图制定相关标准以利于色谱工作者的研究， 例 如美国国家标准局伽ati。 耐 insti l u t e ofs tand ard 如果用于分析多肤 和蛋白质等物质应选用孔径大的固定相。 随着大孔径基质填料的广泛使用， 已逐渐认 识到孔径对分离的重要性。 孔径对小分子量溶质影响较小， 而对大分子量的溶质则影 响较大。 孔径测量可利用氮气吸附法或利用汞孔径测定仪来完成。测定对象是散装填料， 也有报道利用体积排阻色谱的原理来评价预装柱的孔径i3) 。 含碳量可用元素分析仪测 定。 1 .4.2疏水性 卢佩章认为化合物在固定相上的保留是由溶质与固定相、 溶质与流动相及固定相 与流动相综合作用的结果， 其中固定相键合烷基的量起主要作用121 。 影响溶质保留的 键合相参数包括键合量、 键合相长度、 硅烷的官能团和相的类型等。 这些因素可简单 的归纳为: 疏水保留 取决于碳的总键合量131 。 疏水性可以 通过在标准条件下比 较非极 性物质的保留来评价，例如甲苯、菲和蕙等。 l 4 ) 硅轻基的活性 以硅胶为基质键合相的重要性质之一是硅胶表面残留硅轻基的活性。 由于空间位 阻效应，键合时，硅烷分子不可能与硅胶基质表面硅轻基全部发生反应，一般约有 50% 左右的硅胶表面可以被化学修饰，然后采用高反应活性的短链烷基硅烷试剂进 一步与残留的硅羚基反应， 也就是封尾， 增加基质覆盖度， 减少硅轻基的量。 封尾的 填料硅轻基数量明显减少， 但是也不可能完全消除硅轻基。 残留硅轻基不仅降低硅胶 表面疏水性， 也会对极性尤其是碱性化合物产生二次化学吸附使色谱峰拖尾， 降低键 合相的化学稳定性，影响重复性。 硅经基活性的评 价 方 法有很多， 例如: t an a k a l 明 以3 0ok甲 醇 / 水溶液做流动相， 以k ， . 。 因 瓜 ， ， 。 来表示反相固定相的硅轻基活性。 1 :4金属活性 硅胶的纯度对色谱特性的影响很大， 其中 最重要的是金属离子活性139 1 。在硅胶制 7 硕 七论文色讲柱评价方法发展 备过程中各种微量金属离子参与反应并与硅胶结合， 有研究表明铁和其它金属离子的 污染可造成峰的拖尾和柱效降低， v erzel e提出利用乙酞丙酮的保留测试金属活性， 也有方法采用 1 斗二轻基葱酿来测试金属活性。 1 .5色谱柱评价的性能指标 对于一般生产厂家的色谱评价报告， 主要性能指标包括死时间、 柱效、 不对称度、 柱背压以及容量因子等。 l 5. 1死时间 高效液相色谱中死时间是个非常重要的基础参数。 在进行色谱条件优化及定性鉴 定时都需要用到死时间， 因而如何准确地测定死时间具有重要的意义， 也一直是色谱 工 作 者 所 关 注的问 题 13 010 液相色谱死时间是指样品在整个色谱过程中完全不被保留、 通过整个色谱系统所 需 要 的 时 间 【401 。 在气相色谱中死时间的定义比较明确， 求取的方法亦比较成熟。 液相色谱中的基 本理论与气相色谱相同， 但液相色谱系统与气相色谱系统有很大差别， 如液体的扩散 系数和粘度要比气体大得多，溶质与固定相和流动相都有复杂的相互作用. 在色谱中测定死时间通常有两种方法，一是用所谓的无保留的探测物如尿嗜睫、 肠0 、 某些无机盐等直接测定; 二是根据同系物的保留时间用数学方法进行计算求取 死时间。 在反相色谱中，固定相为非极性物质， 而流动相一般为强极性的水、甲醇、乙睛 等， 采用n ano 3 、 n h z n o 3 、 尿喀睫、 硫腺等作为样品 进行死时间的测定， 一般可得 较接近的 结 果，以 满足理论与实际的需要 141 .42 1 。 对于正 相色 谱，固定 相的 极性较强， 且流动相为极性溶剂与非极性溶剂的混合物。 流动相中各组分分子与固定相分子之间 的相互作用是不可避免的; 因此， 正相色谱的死时间难以用实验测准。 色谱工作者通 常采用正戊 烷或正己 烷作为样品进行测定， 由于这些样品在色谱体系中存在较大的保 留，使得测定结果与真正死时间之间存在较大的偏离i3 ，44。 1 .5. 2塔板数 通常，以理论塔板数作为柱效的衡量指标，当柱长一定时理论塔板数越大越好。 吕 硕十论文色谱柱评价方法发展 一支色谱柱的理论塔板越高， 则溶质从色谱柱上流出曲 线的方差或峰宽越小， 色谱峰 越尖锐， 表明 色谱柱对溶 质的 分离能力强， 即 柱效高 121 。 对于 现有的h p l c 方法， 新 柱的塔板数常用特定的 样品化合物、 采用标准的分离条件进行测定。 这种标准溶液的 选择因不同的色谱模式、不同的生产厂家而异。 色谱柱理论塔板数n的定义为: n = 1 6 ( t r / w ) 2( 1 . 1 ) 式中: tr是保留时间， w是峰底宽度。 为了避免测定基线宽度带来误差， 一般在实际 应用中使用以下公式: n = 5 .5 4 (tr 朋，。 尹 ( 1 . 2 ) 式中:tr是保留时间，w。是半峰高宽度。 表1 . 5在最佳测试条件下填充良好的h p l c色谱柱的塔板数 粒径 ( 林 m )柱长 ( c m ) 1 0 l 0 : 塔 板 数 n 6 ， 0 0 0 一 7 ， 0 弓 沁 8 ， 0 0 0 一 1 0 ， 0 0 0 7 j 洲 0 一，00 0 1 0 ， 0 0 0 1 2 ， 0 00 1 7.000 20，0 00 6 ， 0 0 0 一 7 j 洲 洲 ) 9，000 一 ! 1 ， o 0() 1 2 ， 0 0 0-1 4 ， 0 (x) 1 7 ， 0 0 0 一 2 0 ， 0 0() 、 1， 31勺 2557.51015 如果采用相对保留时间t r ( t r ， =tn 一 tr 。 ， t ro是死时间， 指与固定相不发生保留的 物质从进样直到 检测器出 现信号极大点的时间 145). ) 则可计 算出 有效 理论 塔板数n: n ， 一 5 .5 4 (tr，阴、 。 广( 1 . 3 ) 式(l . 1) 、 (l .2)、 (l .3) 是根据马丁的平衡塔板理论， 将色谱作为一个具有一定有效 塔板数的柱子来处理的， 即假定在一个塔板中固定相与流动相之间达到局部的平衡推 倒出来的。 这虽然与实际情况有所偏差， 但可描述色谱峰的展开与变宽， 可从试验曲 9 硕上论文色谱柱评价方法发展 线计算获得色谱信息，故被广泛应用。 塔板数不是一个恒定值， 受很多因素的影响， 例如柱外死体积、 测试条件及测试 仪器。 可以 通过以 下方法提高色谱柱理论塔板数: 色谱柱填充良 好: 增加色谱柱长度: 在一定范围内降低流速;采用小粒度的填料;采用低猫度流动相;升高色谱柱温度; 采用小 分子 化合 物作样品 等等 ( 小分子中 性样品， m 拌 2 0 0) 128 。 表1 . 5 表明了 填充 良好的各种长度与粒度的典型h p l c色谱柱在最佳测试条件下的塔板数。 1 :5 不对称度 色谱峰的峰型在色谱方法建立中也很重要， 所以色谱峰的不对称度也是色谱柱的 重要性能指标。 在色谱理论中一般假设色谱峰服从高斯分布，为对称的色谱峰， 但是 在实际色谱分离中却经常为不对称的峰。 不对称色谱峰能导致塔板数与分离度测定不 准 确 、 定 量 不 准 确 、 分 离 度 降 低与 检 不 出 峰 尾中 的 小 峰 、 保 留 值的 重 现 性 差 等问 题 128。 不对称度通常用不对称因子或拖尾因子来衡量。 峰不对称因子(a5) 在整个峰高的 1 0 %处进行测定，如图 1 . 2所示，a s=b /a。理想色谱柱的峰不对称因子为 0. 95一1 . 1 ( 绝对的 对称峰为a s=1 .0 )。 另一个定义峰形的有效方式是用拖尾因子(t0 。 拖尾因 子在整个峰高的5 % 处进行测定， 如图1 1 所示， t 介 (a十 b)/2 a 。 有些机构用它描述峰 的 不 对称性， 例如美国药典 【 91 。 这二者 之间是 可以 互相换算的， 峰不 对称因子与 拖尾 因子的关系如表 1 . 6 所示。 导致峰不对称度增加的因素有很多 起的柱床不均匀及非线性的等温分配线 厂家规定新色谱柱的a s 为0. 95一1 .30 诸如: 填料粒度分布过宽、 填充技术不佳引 残留硅轻基、 及金属离子活性等。 一般生产 实际分析中被测样品as 值一般小于 1 . 5 。 甲，口 1 。 % 峰 高 声冬 - - 。 二 一5 % 峥高 t . u压 ee 图 1 . 2峰不对称因子与峰拖峰尾因子的测定 硕士论文色谱柱评价方法发展 表 1 .6峰不对称因子与峰拖尾因子的关系 峰不对称因子峰拖尾因子峰不对称因子峰拖尾因子 1 。 01 . 01 . 91 . 6 1 . 61 . 42 . 52 . 0 l 5. 4柱压 柱压的大小是色谱柱是对流动相阻力的一种度量。 用球状微粒填充的色谱柱的压 力降可以用下式估算: p 一 3 0 0 0 l ” 1 ( todz 刃( 1 . 4 ) 式中p 是色谱 柱背压 印 51)， l 是色谱柱的长 度(c m ) ， n 流动相的 粘度(c p) ， 切 是色谱柱 死时间， dp是粒子的 直径 印 m ) 。 新柱的 压力降不得超过式(1 .4) 计算结果的30% 。 用不规则微粒填充的色谱柱压力 可能会高些。 一般色谱评价报告的反压力是在特定条件下测试的结果。 使用的操作条 件、 色谱柱尺寸和微粒粒度相同时， 填充良好的色谱柱的反压力应该是相似的。 柱压 也受很多因素的影响， 采用粒度均一的填料填充色谱柱可以降低柱压: 硅胶粒径对色 谱柱的压力具有很大的影响，硅胶粒子越小， 色谱柱的背压越大;色谱柱的背压还与 流动相的粘度有关。 一般长度为250 m m、 内径为4 1 1 1 1 1 1 ( 即250 x4 幻 n 们 。 ， l d . ) 的反相色谱柱压力多在80一 10 o kg / anz ( 流 速: 1 .o m l 角 l i n) ， 同 样 尺 寸的 离 子 交 换 色 谱 柱 压 力 在40一 70kg / anz 。 不 应在 超过z ookg / clnz 的 条 件下 长时 间 使用， 否则对 输液泵、 进样阀的 损害较大 12 。 l 5. 5保留值的重现性 不同色谱柱之间的保留时间或k 值的重现性可通过测定一系列的标准品来测定， 最好 包括极性分子与非极 性分子晰 1 。 色谱柱生 产厂家往往通过一 个试验评 价色谱柱的 性能， 在用户实验室可定期的重复试验， 以确定不同色谱柱之间的保留性能或应用期 间每支柱的性能。有时， 用户以一个相关化合物 ( 如药物) 进行鉴别更实际，用该化 合物以及典型的操作条件观察保留值的重现性。 当用标准条件操作时， 测试化合物的 保留时间 ( 或k 值)应极为接近。 硕士论文色谱柱评价方法发展 对于使用者而言， 同一生产厂家的色谱柱长期重复性对建立一个普适性强、 重复 性好的方法是一个重要因素。 1 :5 分离度 分离过程的根本目的是将混合物分离成单一的组分， 分离效能的评价可以采用分 离度( reso l ut i o n) 或分辨率。 且 p 分离度 r定义为两峰间距离的2倍与其底宽之和的商， r = 2 (tra 一 呱)l(叽十吻)( 1 . 5 ) 这是一个无量纲的参数， 它表明两个溶质峰彼此离得越远分离就越好， 且两个峰越尖 锐、 越窄则分离越好。 卜1 .5 是两组分的色谱峰基本分离的标志， 一般认为r=2 时两 组分的色谱峰达到基线分离。 1 .5. 7色谱柱使用寿命 色谱柱毕竟属于一种消耗品， 最终必将失效， 当其不再能保证特殊样品所需的性 能时，则应更换新柱。如果塔板数下降50%，或分离度约降至原值的3 /4，可能需要 更换新柱13 0 1 0 色谱柱的寿命与所用样品的类型有很大关系， 一般干净样品 ( 匀质溶液) ， 每支 色谱柱正常分析次数为 100 0 2 0 0 0次。干净样品其成分在每次样品进样之前应能完 全流出色谱柱。 对于更复杂和脏样品， 或那些临界分析的样品， 每柱的正常分析次数 为2 0 0 一 5 0 0 次 13 0 。 l 本论文的工作 在填料的诸多特性中，使用者最关心的是以这些填料装成色谱柱后的分离效率、 对指定溶质的 选择性、 在不同p h值介质中的稳定性、 不同批次 但同型号填料间重现 性以及较适宜的操作压力。 而对于生产者除关心以上问题外， 还关心用什么样的方法 来评价色谱柱， 对色谱柱进行质量控制。 通常，以指定的一组标准溶质为样品，测定 它们在色谱柱上的理论塔板数， 以作为柱效的衡量指标。 这种标准样品因不同的模式 而异。 一般生产厂家的色谱柱均附有色谱柱评价报告， 但是同类型的色谱柱随厂家不 同而评价方法不同。 在众多方法中很难看出哪一种方法更能客观或适合评价一类色谱 柱。本论文以评价方法作为研究对象，进行以下工作: 硕上论文 色谱柱评价方法发展 分别比较rp 色谱柱评价方法和 s a x色谱柱评价方法，以保留时间重复性、峰 面积重复性、 塔板数重复性和不对称度重复性考察评价方法的稳定性，以死时间、 塔 板数、 不对称度和各评价方法分析时间比较不同评价方法的特征， 以对生产者和使用 者提供参考。 基于以上比较研究，发展新的rp 色谱柱和s a x色谱柱评价方法。 硕士论文 色潜柱评价方法发展 反相色谱柱评价方法比较 引言 反相色谱柱评价所用的标准样品各不相同，一般生产者仅选用3 4 种中性，例 如芳香烃， 最多选用5 种， 使其色谱柱显出卓越的柱效， 这样可能隐藏了色谱柱存在 的 一些问 题1圳: 如果是 色谱工作者挑 选色谱柱， 则所用的 样品一般既 包含中 性组分也 包含酸碱性组分， 有极性组分也有非极性组分。 标准样品中基本上均含有标记死时间 的组分、 衡量色谱柱理论塔板数和不对称度的组分。目 前比较常见的用于标记反相色 谱死时间的物质是尿啼喧， 虽然很多资料证实尿嗜咙有保留， 但因其峰形相对较好等 原因一直得到广泛得应用。 衡量柱效的物质则千差万别， 一般以最后洗脱出的组分衡 量柱效。 反相色谱柱评价所选用的流动相一般为甲醇或乙睛一 水体系，部分评价方法的流 动相是甲醇或乙睛一 缓冲盐体系.对于生产厂家的评价条件，因其样品为中性样品， 流动相为前者;但对于含有酸碱性组分的样品，其流动相为后者。检测波长一般在 2 5 4 nln 下检测， 在此波长下甲醇、 乙睛和磷酸缓冲盐溶液均没有紫外吸收， 而且标准 样品多为含苯环的物质，在 2 54nm 波长紫外吸收强， 选择此波长检测可以避免流动 相紫外吸收的干扰。柱温一般在室温下测定，均不超过 30。柱压则为实测值，它 不仅与色谱柱有关，而且也取决于流动相的组成，以及评价色谱柱时的温度与流速。 不同评价方法的流速也不尽相同，对于内径为 0. 4 一0. scm 的色谱柱，一般采用 l m l 加in 。 进 样量一 般不 超过10 雌1461。 本实 验 采用 广泛 运 用的c18 色 谱 柱进 行 实 验， 考察、比 较部分生产厂家的评价方法， 给色谱工作者和生产者提供可供参考的数据， 也为进一步建立更为合理的评价方法提供依据。 2. 2实验部分 2. 2. 1实验仪器及试剂 2. 2.l i实验仪器 高效液相色谱系统由 大连依利特 ( eli t e) 分析仪器有限公司生产的p 2 30 高压恒 流泵、 u v 2 3 0+紫外一 可见检测器、 e c z o 03色谱数据处理工作站、 a s 2 30 自 动进样器、 a s3000自 动进样器、z w温度控制器组成。 p h计， 梅特勒 一 脱利多 ( 上海) 有限 公司 生产的 梅 特勒一 托利多d e i j a 3 20型p h 硕上论文色谱柱评价方法发展 计。 溶剂过滤器，a ut o sc i enc e仪器有限公司生产的隔膜真空泵及其玻璃组件( 滤杯、 滤瓶及滤头 ) 。 移液枪，g ils o n生产的p型移液器. 色谱柱， h ypersil b d s c 1 8 5 脚 ( 1 5 0 x4.6 n u n ， 1 :d ，大连依利特分析仪器有限公 司生产。 2. 2. 1 .2实验试剂 实验用水为蒸馏水经m ill i 一 q超纯水发生器去离子所得超纯水。 缓冲盐流动相均 经0. 45“ m滤膜过滤， 流动相经超声脱气。其余实验试剂及其规格如表2 . 1 所列。 2. 2. 2实验方法 以同一支色谱柱作为考察对象， 采用不同的评价方法进行评价， 通过考察以下指 标客观比较各种评价方法的优缺点， 一方面为色谱工作者和生产者提供可供参考的数 据，另一方面为下一步发展更为有效的评价方法提供参考。 2. 2. 2. 1相关指标 重复性:能够重现每次实验色谱图是非常重要的， 测试系统的重复性、 色谱柱批 间重复性、 或来衡量色谱柱使用情况的单支色谱柱的重复性都是建立于评价条件重复 性好的基础之上。 一般重复性的测定选用保留时间的重复性来衡量， 有时也用峰面积 的重复性， 因为本实验是比较色谱柱评价方法的重复性， 所以引入柱效和不对称度的 重复 性用于比 较。 文献147 !报道中 有用甲 苯 ( 中 性) 和从 琴二甲 基苯 胺 ( 碱 性) 进行 重复性实验。 实验中的标准样品的组分不完全相同， 为了方便比较， 统一以标准样品 中衡量柱效组分的保留值、 峰面积、 塔板数和不对称度的重复性作比较。 本实验以相 对标准偏差(rs d ) 衡量重复性。 塔板数:塔板数是衡量柱效的重要指标。为了实验数据的可靠性，实验采用 11 次重复实验结果的平均值。 不对称度:不对称度用以衡量色谱峰的对称性。数据采用 fl次重复实验结果的 平均值度量。 硕士论文 色谱柱评价方法发展 表2 . 1 实验试剂 试剂名称纯度生产产家 尿咄咤 硝基苯 蔡 荀 苯甲醉 苯甲醛 苯甲酸甲酷 茶碱 对硝基苯胺 苯乙醚 邻二甲苯 对羚基苯甲酸乙醋 对轻基苯甲酸一j 一 酷 葱 甲苯 邻苯二甲酸二甲酪 二苯胺 苯甲醚 甲醇 乙睛 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 色谱纯 色谱纯 5 1 脚a 沈阳市试剂一厂 东京化成( tcl) 上海市化学试剂公司 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市化学试剂一厂 f l u k a 天津市科密欧化学试剂开发中心 北京化工厂 北京金龙化学试剂有限公司 东京化成( tcl) 东京化成( tcl) 东京化成( tcl) 天津市科密欧化学试剂开发中心 北京化 f 厂 国药集团化学试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 t e di a t e di a 分析时间: 实验中所选用的方法均为生产商用于批量评价的方法， 分析时间无疑 是非常重要的参数。以标准样品最后出峰组分的保留时间的平均值度量。 死体积: 在实际色谱分离过程中，当将一个样品注射进色谱柱后， 几乎都可以观 察到一个小峰， 它将先于所有其它组分而第一个流出色谱柱。 通常认为， 这是在柱中 不保留的成分， 它所需的 流动相体积即代表死体积( deadvol ume ) v 。 。 根据定义， 死体 积与死时间的关系: vo 二 拐xf ( 2 . 1 ) 式中， 为色谱柱的死时间 ( m i n);f为流动相的流速 ( m l l m i n)。 硕士论文色谱柱评价方法发展 对于柱内径为0. 46cm 的色谱柱，可以下式估算: v o 阳0 . i l (2. 2 ) 式中，l是内径为0 .4 6cm色谱柱的长度(c m ) 。 根据式 (2 . 1) ， 结合实 验数据， 可以 计算出色谱柱的死体积， 同时根据式(2.2) 可以 估算出实验中色谱柱的死体积。 比较实验结果之间的差异及实验结果与直接计算结果 的差异。 表2. 2反相色谱柱评价方法比较实验的色谱条件 公司名称流动相样品 进样量 ( 卜 l ) 流速 ( m l / m i n ) 检测波 长( iun) 甲醇冰 e l i te 绍5 / 1 5 ( v z v ) 尿啼睫、硝基苯、蔡、荀 .025 乙睛/ 水 刊刃2 4 0 ( v 尹 亏 ) 尿啼咤、对轻基苯甲酸乙酣、 对轻基苯甲酸 j 醋、禁、蕙 k eys 1 0 n e t h e l ， 】 】 0 h y p e rs i l - k