（水产养殖专业论文）中华倒刺鲃胰蛋白酶的cDNA克隆与序列分析.pdf

西南大学硕士学位论文中文摘要 中华倒刺鱼巴胰蛋白酶的e d n a 克隆 与序列分析 水产养殖专业硕士研究生凌统 指导教师李英文副教授 摘要 胰蛋白酶f f r y p s i n ) 是动物消化道中一种主要的碱性蛋白水解酶，属于丝氨酸蛋白酶家 族，专一性水解赖氨酸或精氨酸羧基形成的肽键。其主要功能一是消化蛋白质食物，二是激 活所有胰腺分泌的酶原它可以有力迅速地激活其他蛋白酶原( 糜蛋白酶原、羧肽酶原、弹 性蛋白酶原) 而行使消化功能。在脊椎动物中，由胰脏的腺泡细胞的核糖体产生无活性的前 体一胰蛋白酶原( t r y p s i n o g e n ) 再进入胰腺运输管最后释放到肠腔，在那里被肠黏 膜细胞分泌的肠激酶活化面生成有活性的胰蛋白酶。通过比较不同动物编码胰蛋白酶的 m r n a 序列，可以了解其胰蛋白酶的结构特点以及与功能之间的关系进而揭示不同动物 对蛋白质消化能力差异的原因本研究对中华倒剌鳃胰蛋白酶原m r n a 进行了克隆和序列 测定，并对其核苷酸序列及推导氨基酸序列以及预溺的蛋白质高级结构进行了分析，主要研 究结构如下： l 中华倒刺喜巴胰蛋白酶基因的全长c d n a 序列 在对多种硬骨鱼类的胰蛋白酶基因进行了多重比对后设计了2 个特异性3 r a c e 引物， 以来自中华倒刺鳃胰腺的m r n a 为模板扩增得到了中华倒劁钯胰蛋白酶的3 端序列。根据 得到的3 端序列设计了一个用于扩增胰蛋白酶基因的中间片段的下游引物，又根据斑马鱼 的胰蛋白酶基因序列设计了一个上游引物，从而得到了中华倒刺鳃胰蛋白酶的中间片段序 列。再根据得到的中间片段序列设计了两组5 r a c e 特异性引物，从而得到了中华倒刺女e 胰 蛋白酶的5 段序列 对所得到的三段序列进行拼接，得到了中华倒剌鳃胰蛋白酶的e d n a 序列，它全长 s s 0 b p 。5 非编码区为2 9 b p ，编码区包括7 3 8 个核苷酸，编码一个长2 4 6 个氨基酸残基的蛋 白质前体，3 非编码区为8 0 b p 2 中华倒刺鸯巴胰蛋白酶基因推导氨基酸序列的分析 克隆得到的中华倒刺鳃胰蛋白酶的e d n a 全长s s 0 b p ，包括一个5 ，非编码物、一个编码 2 4 6 个氮基酸的开放阅读框、t a a 终止密码子和一个包括加尾信号和p o l y ( a ) 尾的3 非编 西南大学硕士学位论文中文摘要 码区编码区核苷酸长度为7 3 s b p ，编码2 4 6 个氨基酸，由信号肽( 1 4 个氨基酸) 、激活肽 ( 8 个氨基酸) 、催化三联体氨基酸残基( h i s - 6 3 a s p - 1 0 7 ，s e r - 2 0 0 ) 以及决定底物特异性的 保守性天冬氮酸残基( a s p - 1 9 4 ) 、1 2 个半胱氨基酸残基和联接肽构成。 3 中华倒刺童巴胰蛋白酶基因推导蛋白的分析及其结构预测 预测胰蛋白酶基因编码一个2 4 6 个氮基酸的多肽链，分子量m w = 2 6 5 5 2 d a 等电点 p i = 7 5 4 在氨基酸组成上，丝氮酸( s e t ) 含量最高。为1 1 7 9 h ：其次是甘氨酸、丙氨酸、 缬氨酸及亮氨酸，分别为8 9 4 、8 1 3 、6 9 1 n 、6 9 1 ：含有1 8 个带负电荷氨基酸( 1 0 个a s p + 7 个g l u ) 2 3 个带正电荷氮基酸( 1 1 个l y s + 7 个a r g + 4 个h i s ) 。二级结构预 测表明其二级结构主要由四种组成，即a - 螺旋、嘴角、随机卷曲和延伸链，随机卷曲是 最主要的二级结构。 关键词：中华倒刺刍巴胰蛋白酶r a c e 基因克陪 c l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s is o ft r y p s i ne d n a ins p i n i b a r b u ss i n e n s i s m a s t e rc a n d i d a t e ：l i n gt o n g s u p e r v i s o r ： a s s o c i a t ep r o f l iy i n g - w e n a b s t r a c t t r y p s i ni sak i n do fm a i na l k a l i n ep r o t e o l y t i ct f f l z y m c $ i na l i m e n t a r yc a n a l ，i tb e l o n g st ot h e f a m i l yo fs e r i n ep r o t e i n a s e ，a n ds p e c i a l yh y d r o l y z t h ep c p t i d eb o n df o r m e db yl y s i n e o r a r g i n i n e t r y p s i np l a y sac e n t r a lr o l ei np e r c s t i ce x o e r i u ep h y s i o l o g yb e c a u s ei t a c t sa st h e i r i g g e re n z y m ef o rt h ea c t i v a t i o no fa l lo t h e rp a n c r e a t i cd i g e s t i v ez y m o g e n s ，a sw e l l i t so w n i n a c t i v ep r e c u r s o r , l r y p s l n o g e n i nv e r t e b r 日a e s , t h en o n - a c d v i t yp r e c u r s o r 一t r y p s i n o g e n i s s y n t h e s i z e do nr i b o s o m e sa t t a c h e dt ot h ep a n c r e a t i ca e i n e rc e l l sm u g he n d o p l a s m i cr e t i c u l u m f a e g ) pt h e nt r a n s p o r t e dt ot h eg o l g ic o m p l e x , c o n c e n t r a t e da n d s t o r e dw i t h i ns e c r e t o r yg r a n u l e s ， s e c r e t e di n t ot h ep a n c r e a t i cd u c la n du l t i m a t e l yd i s c h a r g e di n t oi n t e s t i n e s ，w h e r ei ti sa c t i v a t e db y e m e m p e p t i d a s e t h r o u g ht h ec o m p a r a t i o no fm r n as e q u e n c e se n c o d i n gt r y p s i n i nd i f f e r e n t a n i m a l s , t h er e l a t i o n sb e l m 7 s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c sa n df u n c t i o n so ft r y p s i nm m a d ec l e a r , a n dt h er e a s o n sf o rd i f f e r e n c e si nd i g e s t i o no fp r o t e i n 勰e x p l o r e d i nt h ep r e s e n tr e s e a r c h t h e i r y p s i nm r n ai n , 霉, n i b a r b u sa i n e n s i jw a sc l o n e da n ds e q u e e d i t sn u c l e o t i d ea n dd e d u c e d a m i n oa c i ds e q u e n c ea n dt h ep r e d i c t e dp r o t e i ns t r u c c u t ew e r g 越m l y s e d ，m a i nr e s u l t sa l e a s f o i l o w s ： 1f u l l l e n g t he d n a s e q u e n c eo f t r y p s i n o g e ni ns p i n i b a r b u ss i n e n s i s t w os p e c i a l3 e d n ae n d sp r i m e r sw e md e s i g n e da f i 盯m u l t i p l ec o m p a r a t i o n sa m o n gt r y p s i n g e n e si nm a n yk i n dt e l e n s t e a n s 3 e d n ae n d ss e q u e n c eo fs p i n i b a r b u ss i n e n s i sw a sa c q u i r e d t h r o u g ha m p l i f i c a t i o no nt h et e m p l e to fm r n af r o mi t sp a l l c r e a s t w om i d d l es e g m e n tp r i m e r s u s e di nt h ea m p l i f i c a t i o no ft r y p s i ng e n e sw e d e s i g n e d t h es p r i m e rw a sd e s i g n e do nt h e b a s eo f t h es e q u e n c eo f z e b r a t i s h ( z b n or e r l o ) , a n dt h ea n t i s e n s e 弘i m 目w a sd e s i g n e do nt h eb a s e o ft h e3 e d n ae n d ss e q u e n c eo fs p i n i b a r b u ，$ i n e n s i $ ，t h e nt h em i d d l es e g m e n ts e q u e n c eo f 西南大学硕士擘位论文 荚文摘要 竹p s i ng e n e sw a sg o t a c c o r d i n gt ot h em i d d l es c g m a n ts e q u e n c e ，f o u rs p e c i a l5 e d n ae n d s p d m a mw e md e s i g n e d ，t h e n5 e d n ae n d ss e q u e n c ew a sa c q u i r e d f i n a l l y ，c o m b i n e da b o v et h r e e s e q u e n c e s , t h ec d n as e q u e n c eo f t r y p s i ni ns p i n i b a r b u ss i n e n ，i sw k n o w n ：i t sf u l l l c n g i l lw a s 8 5 0 b p ，i n c l u d i n ga5 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f2 9 b p , t r a n s l a t e dr e g i o no f7 3 8 b pw h i c he n c o d e da p r o t e i np r e c u r s o ro f 2 4 6 b pa n da3 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f 8 0 b p 2d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c ea n a l y s i so f s p i n i b a r b u ss i n e n s i st r y p s i n g e n e s t h ef u l ll e n g t ho fs p i n i b a r b u ss i n e n s i st r y p s i ne d n aw a s8 5 0 b p ，i ti n c l u d e da5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，a l lo p e nr e a d i n gf r a m ec o m p o s e do f 2 4 6a m i n o a c i d s ，as t o pc o d o n ( t a a ) a n d a3 u n t r a n s l a t e dr e g i o nw h i c hc o n t a i n e dap o l y a d a n y l a t i o ns i g n a la n dap o l y ( a ) t a i l t h eo p e n r e a d i n gf r a m ew a s7 3 5 b pi nl e n g t h , e n c o d e d2 4 6a m i n oa c i d s , i tw a sc o m p o s e do fa ns i g n a l p c 州d e ( 1 4a m i n oa c i d s ) , a c t i v a t i o np e p t i d e ( 8a m i n oa c i d s ) , t h es t r u c t u r a lf e a t u r e so f t r y p s i n s ： t h ec a t a l y t i ct r i a dh i s 6 3 。a s p l 0 7a n ds e t 2 0 0a n dt h eo b l i g n t o r y a s p l 9 4 i na d d i t i o n ，1 2c y s t e i n e r e s i d u e s 粥f o u n d , f o r mt h es i xc o n s e r v e dd i s u l p h i d eb o n d s 3d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c ea n a l y s i sa n dp r o t e i ns t r u c t u r ep r e d i c t i o n o f s p i n i b a r b u s s i n e n s i s i ti sp r e d i c t e dt h et r y p s i ng e n e se n c o d eap e 两d ec h a i no f2 4 6a m i n oa c i d s ，w i t hm wo f 2 6 5 5 2 d aa n dp lo f7 5 4 i nt h ec o m p o s i t i o no fa m i n oa c i d s ，t h ec o n t e n to fs e f i n ei st h eh i g h e s t w h i c hu p t 0 1 1 7 9 9 6 ，a n d o l y c i n e ，a l a n i n e 。v a l i n , l c u c i n ea m8 9 4 、8 1 3 、6 9 l 、6 9 l r e s p e c t i v e l y ；a n dc o n t a i n1 8a m i n o a c i d s w i t h p o s i t i v ec h a t g c 0 0 a s p ，7 g i n ) a n d2 3 a m i n oa c i d s w i t hn e g a t i v ec h a r g e ( 11l y s ，7a r g ，4h i s ) i t ss e c o n d a r ys t r u c t u r em a i n l yc o n t a i n s * h e l i x ，p - t a m ， r a n d o ma n de x t e n d e ds t r a n d , a n dr a n d o mi st h em o s ti m p o r t a n tn n c k e y w o r d s ：s p i n i b a r b u ss i n e n s i st r y p sinr c e g e n ecio nin g 独创性声明 y 9 3 7 g 5 0 学位论文题目：圭坐剑剜鲤照蛋自鳖敛鱼旦丛直隆量度到金扭 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者： 珐倪 签字日期：乒j 哆年月坤日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：瘙桫导师签名： 签字日期：炒年月妒日 签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 日 邮编： 第1 章文献综述 1 1 中华倒刺鳃的研究概况 中华倒刺鳃( s p i n i b a r b u ss i n e n s i s ) 属于淡水温水性鱼类。在鱼分类学上属鲤形目、鲤科、自b 亚 科、倒刺鳃属。地方名：鸟鳞，青波、青板等。主要分布于长江中上游的干、支流水域中，是该流 域中重要经济鱼类，在长江、嘉陵江、岷江、沱江、渠江、酉水和赤水河等地均有分布。因其肉质 肥嫩、细美多脂、为产区上佳食用鱼，市场前景较好，是一种淡水名优鱼类的人工养殖对象。该鱼 个体大，生长较快，杂食性，饲养饵料来源广，适合于池塘、湖泊、水库、集约化中养殖。我国鱼 类学家对中华倒刺鳃进行了大量的研究，这些研究多集中在地理分布、资源调查与保护、外观形态、 年龄、生长和繁疆等生物学特性上 桂建芳等”l 采用肾细胞短期培养、空气干燥法制片制备染色体标本，进行染色体计数和核型分 析发现，中华倒刺鳃的染色体数目是2 n = 1 0 0 ，染色体臂数( n f ) 为1 5 0 核型为1 8 m + 3 2 s i n + 2 6 s t + 2 4 t 。并通过与其它鲤科鱼类染色体数目及核型比较分析认为中华倒刺鳃是由2 n ( 5 0 ) 一4 n ( 1 0 0 ) 然后经二倍化后形j 5 t 2 n = 1 0 0 的四倍体物种：并认为鳃亚科和鲤亚科中现存的四倍体种类可能都是由 一共同祖先经多倍化后自然选择演变而来的。 邴旭文等b 】对中华倒刺鳃的肌肉营养成分进行了分析，表明中华倒刺鳃肌肉( 鲜样) 中粗蛋白质量 分数1 9 2 2 粗脂肪质量分数1 9 6 水分质量分数7 7 0 ，灰分质量分数1 6 2 碳水化合物质量分数 o 1 s 。肌肉中含有1 7 种氨基酸，总量为7 3 6 1 ( 质量分甄干样) 其中7 种人体必需氨基酸( 不包括色 氮酸) 总量是3 2 2 6 ，占氨基酸总量的4 3 8 3 ；其必需氨基酸的构成比例基本符合f a o w h o 的标准。 中华倒刺钯的限制性氨基酸为( 蛋氨酸+ 胱氨酸h 缬氨酸和( 苯丙氨酸+ 酪氨酸) ，必需氨基酸指数( e a a i ) 为7 1 3 4 ，4 种鲜昧氨基酸总质量分数为2 4 2 2 杈干样) 脂肪酸中e p a 与d h a 质量分数分别为0 8 7 、 3 0 8 ，比其他经济鱼类均高。微量元素比值合理，有较高的食用价值与保健作用。 唐毅等棚对中华倒刺鳃苗种的耗氧率和窒息点进行了研究，表明在一定水温条件下，中华倒刺鳃 鱼种( 1 5 5 7 2 8 9 ) 耗氧率随鱼体体重的增加而降低。平均体长4 3 5c m ，均重1 5 5g 的个体，平均耗氧 率为0 4 2 0 2 mg ，g h ，窒息点为0 a 4 1 2 mg 儿。平均体长7 2 2cm ，均重7 2 8g 的个体，平均耗氧率为 o 2 2 2 2 mg g h ，窒息点为o 8 8 3 1mg ，l 水温与耗氧率里正相关 叶元土等1 4 1 通过肠道粘膜的扫描电镜观察分析发现，中华倒刺纪有较长的肠道和较发达的粘膜 皱褶，增加了对食物的消化、吸收接触表面积也增强了对食物的消化、吸收能力。同时，在中华倒刺 壹巴粘膜表面结构上也可发现在前、中、后各部位( 包括分泌孔的形态、分泌物、表面细胞结构、绒 毛或微绒毛结构) 有较大的差异，这与肠道的前、中、后各部位在功能上的差异有关，肠道前、中 部应主要为溥化、吸收。后部侧重于吸收功能。 在中华倒刺鳃的繁殖方面，黄文国l ，1 研究发现中华倒刺鳃的孵化时间比家鱼稍跃，在( 2 3 士2 c 之间，需4 3 小时方能出膜；在( 2 6 + 1 3 2 ) 时，3 6 小时即可出膜。孵化水温在1 9 2 8 之间，适宜 水温2 3 2 6 3 2 。上限水温为2 8 3 2 ，超过2 8 3 2 稚鱼即出现畸形，死亡；胚胎发育也出现停止，死 l 亡。 在生化研究方面，陈昌明等1 6 】在常温静水条件下，进行了硫酸铜、硫酸镉、醋酸铅和氯化汞对 中华倒刺钯鱼苗的急性毒性试验，结果表明：四种药物依次对中华倒刺b 鱼苗的9 6 hl c s o 分别为 0 2 8 m g l 、0 4 2mg l 一、2 1l i n g l 、0 4 0 m g l - l ；其安全浓度分别为：0 0 2 8 0 r a g l 、0 0 2 1 l m g l 1 、0 0 2 4 8 m g l - 1 、0 0 0 4 m g l 1 。张春霖等7 1 研究了金属离子对中华倒刺謇巴精子活力的影 响，发现c a 2 + ，m 9 2 + 浓度较高对糖子有明显的损伤作用。在0 。4 溶液中，出现精子聚集而死亡，远未达 到精子的抑制渗透压便引起绝大多数精子失去活力、死亡。并认为可能是由于高于精浆的c a 2 + ，m g + 浓度引起了精子某些生命过程发生障碍而导致精子活力下降甚至死亡。 1 2 胰蛋白酶的研究概况 1 2 1 胰蛋白酶简介 胰蛋白酶( u y p s i n ，e c 3 4 2 1 4 ) 是具有高度底物特异性的丝氮酸蛋白酶家族的成员之一。分子 结构中含有催化三联体氨基酸残基结构( h i s 、a s p 、s e r ) 和底物特异性决定残基天冬氮酸残基， 这一结构特点存在于从细菌到人类所有生物的胰蛋白酶中，因此各种生物的胰蛋白酶都其有相同 的催化机制哪。胰蛋白酶能够特异性地切断精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键，这种特异性来源于胰蛋 白酶s l 结合袋中天冬氨酸残基的负电荷与底劬| 肽链中p 1 端正电荷的匹配州胰蛋白酶中还含有多个 保守的半胱氨酸残基，这些半肮氨酸残基之问形成的二硫键是构成稳定的空间结构所必需的。 在脊椎动物中，由胰脏的腺泡细胞粗内质网状组织( r e r ) 上的核糖体产生无活性的前体 胰蛋白酶原，然后运输到高尔基体，再进入胰腺运输管，最后释放到肠腔，在那里被肠黏膜细胞分 泌的肠激酶活化而生成有活性的胰蛋白酶胰蛋白酶可以迅速地激活其它蛋白酶原( 胰凝乳蛋白酶 原、羧肽酶原、弹性蛋白酶原) 以及胰蛋白酶原而行使消化功能i 1 0 1 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹 性蛋白酶都是有胰腺产生的肽链内切酶。由于它们具有相似的三级结构以及氨基酸序列，被认为是 由共同的基因进化而来m 2 1 。 脊椎动物胰脏中含有大量的胰蛋白酶原，小鼠胰腺合成的蛋白质中有将近4 4 为胰蛋白酶原。 因为能够获得大量的胰蛋白酶，胰蛋白酶( 原) 一直是酶结构和功能研究的主要模型。1 9 3 1 年，n o r t h r o p 和k u n i t z l l 4 1 纯化得到了牛胰蛋白酶的结晶，1 9 6 4 年w a l s h 等测定了牛胰蛋白酶原的氨基酸序列， 1 9 7 4 年h u b e f 等【1 6 1 涮定了牛胰蛋白酶的三级结构。d a v i e 和n e u r a t h i ”l 研究了牛胰蛋白酶原被激活的 过程，通过水解n 端六肚_ v a l - a s p - a s p - a s p - a s p - l y s i i i l 被撤活。研究表明，猪【1 8 l ，绵羊【1 9 】以及人类 1 2 0 1 2 1 培哺乳动物均采用相同的激活方式。 1 2 2 胰蛋白酶的酶学研究 对胰蛋白酶酶学方面的研究主要集中在胰蛋白酶的分离纯化和动力学特性上。胰蛋白酶的分离 钝化，主要是利用蛋白之间特异性的差异进行分离，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解 度、极性、电荷和与其它分子的亲和性等。常用的分离纯化方法有凝胶过滤层析，离子交换层析、 2 西南大学硕士学位论文文献综述 i l l i 曼曼曼曼曼舅舅量鲁 亲和层析等。从许多动物中都已经分离出了胰蛋白酶，如鼠、狗、牛、猪及人类。也有很多鱼类的 胰蛋白酶得到分离纯化，如非洲肺鱼p r o t o p t e r u sa e t h i o p i c u sp z l 、鳕鱼g a d u sm o r h u a 2 3 ：1 北梭鱼 c a r a a s i u $ a l r a l l l j 刚、鲤鱼c y p r i n u sc a r p i o i z s i 、鳗鱼e n g r a u l i se n c r a s i c h o l u s 2 6 1 虹鳟o n c o r h y n c h u s m y k i s s i ”、鲻鱼m u g i l c e p h a l u s p 。i 、日本鲢e n g r a u l i s j a p o n i c u s 2 9 1 、大西洋鲑s a l m os a l a r 等。 鱼类胰蛋白酶的特性研究主要集中在酶活性、最适p h 值、最适温度、等电点等方面，对鱼类胰 蛋白酶动力学的研究进行总结得出：鱼类胰蛋白酶适宜p h 值一般在7 0 9 0 最适反应温度在3 0 6 0 c 范围内，等电点一般在4 5 6 0 范围内叫l 。此外还有一些学者进行了抑制剂对胰蛋白酶活力影响、 底物浓度对胰蛋白酶水解速度影响的研究。 尽管动物的胰蛋白酶具有相似的功能和作用机制，但不同种类的动物胰蛋白酶的活性还存在较 大差异。2 5 c 时鳕鱼c a d u s m o r h m p 2 1 和大马哈鱼o n c o r l o m c h u s k e t a p 的胰蛋白酶催化效率比牛 胰蛋白酶分别高1 7 倍和4 0 倍。但热稳定性和酸稳定性均低于牛胰蛋白酶；与此类似，大西洋鳕g a d u s m o r r h u a 的胰凝乳蛋白酶删l 和弹性蛋白酶m i 的催化效率也比哺乳动物高，这种差异可能与各种动 物胰蛋白酶一级结构中非同源序列有关。由于胰蛋白酶结构与功能的关系非常复杂，根据现有的研 究资料还难以对上述相关性做出具体判断。 1 2 3 胰蛋白酶基因的研究 随着以基因克隆表达为代表的分子遗传学的飞速发展，胰蛋白酶的分子生物学研究进入了一个 崭新的阶段。国外学者们已经成功地从多种生物中克隆到编码胰蛋白酶的基因，并对其序列进行了 较为详尽的研究，并且部分生物胰蛋白酶基因的异源表达己经成为现实同时，刹用所得基因序列 进行的系统进化分析等工作亦取得大量成就 无脊椎动物没有专门用于分泌胰蛋白酶的器官胰腺，其与脊椎动物胰蛋白酶行使功能的蛋自 水解酶多由中肠腺分泌，因而通常被称为胰蛋白酶样酶( t r y p s i n - l i k ep r o t e i n a s e ) 。它是一种重要的胞 外酶，具有与脊椎动物胰蛋白酶相同的活性位点及特异性作用底物，并与之有较高的相似性。一般 来说，昆虫胰蛋白酶原的长度为2 5 6 - p 氨基酸，有活性的胰蛋白酶的长度为2 3 2 个氨基酸现阶段无 脊椎动物胰蛋白酶基因的研究已经取得了较多的成果，其中尤以昆虫纲的研究最为详尽。果蝇 d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 删、埃及伊蚊a e d e sa e g y p t i 鲫、烟草天蛾m a n d u c as e x t a 3 8 1 家蚕勘m 幻 m o r i 删、棉铃虫h e l i c o v e r p at 。v n i g e r a 【加1 、美国牧草盲蝽l y g u ，l i n e o l a r i a 【4 l j 等昆虫胰蛋白酶基因， 大部分以e d n a 全长或片段的形式被克隆最l 序并进行了迸一步的分析 胰蛋白酶是甲壳动物体内最丰富的一种蛋白水解酶，这种酶己经从多种甲壳动物体内分离纯化 出来，并已经得到氨基酸序列，其中尤以太平洋白虾p e n a e u sv a n n a m e i 胰蛋白酶及其基因的研究最 为详尽。太平洋白虾丝氨酸基因的研究最早见于1 9 9 2 年，s e l l o sd 等人【4 2 j 对太平洋白虾肝胰腺中一种 具有胰凝乳蛋白酶和胶原蛋白酶活性的丝氮酸蛋白酶的c d n a 进行了分子克隆，他们根据已知的太平 洋自虾胰凝乳蛋白酶设计引物经p c r 扩增从该虾肝胰腺e d n a 文库中获得了两个克隆。两者之一 p v c 7 包含一条完整的用于编码丝氮酸蛋白酶的e d n a ，推断的氨基酸序列为一条长度为2 7 0 个氨基酸 西南大学硬士学位论文 文献综述 残基的前酶原，它拥有一段1 4 个氨基酸残基的高疏水性信号肽。这一点证明推断的酶原形式在经过 剪掉3 0 个氮基酸残基后才会成为2 2 6 个残基的成熟肽。k l e i nb 等i 4 3 1 19 9 6 年克隆并纯化了太平洋白虾 的胰蛋白酶发现有三种主要的同工酶形式，分子量为3 1 - 3 2 k d a 。通过对此虾消化酶c d n a 文库的 筛选，他们共获得了分别编码五种胰蛋白酶的c d n a 的五个克隆其中最长的一条c d n a 编码一段长 2 5 5 个氨基酸残基的前酶原它包含一段长1 4 - 1 - 残基的前导肚及1 4 个残基的高疏水性信号肽。蛋白质 序列比对显示太平洋白虾胰蛋白酶与鳌虾胰蛋白酶有较高的相似性( 7 4 ) ，而与哺乳动物和昆虫的 相似性较为相近均为约4 0 。k l e i n b 等州还在1 9 9 8 年对太平洋白虾胰蛋白酶多基因家族的基因组 结构和多态性进行了研究。通过现代分子生物学研究手段对该虾胰蛋白酶基因的表达研究表明，摄 食与蜕皮均影响胰蛋白酶基因的表达。太平洋白虾胰蛋白酶基因的表达在蜕皮的不同阶段也有不同， 在蜕皮的早前期( d 1 ) 其m r n a 的表达达到峥值，在( d 2 d 3 ) 期迅速下降，酶的催化活性也与此 趋势一致因此，至少可以部分证明白对虾胰蛋白酶合成的调控是在转录水平上完成的。对饥饿和 蜕皮对虾胰蛋白酶合成造成的影响进行比较。发现蜕皮造成的影响大于饥饿咐】。除太平洋白虾外其 他甲壳动物胰蛋白酶基因研究的较少，已见报道中获得胰蛋白酶基因序列的甲壳动物包括鳌虾 ( p a e t f a s t a c u sl e n i u s c u l u s ) 、堪察加蟹( p a r t d i t h o d e sc a m t s c h a t i c u ) 、墨吉对虾( p e n a e u sm o n o d o n ) 、三文 鱼虱( l e p e o p h t h e i r u s s a l m o n i s ) 、中国对虾( e e n c h i n e r 8 i s ) 、日本对虾( p e n a e u s j a p o n i c u s ) 、克氏原 鳌虾( e r o c a m b a r u sc l a i k f f ) 、口虾姑( o r a t o s g u i l l ao r a t o r i a ) f f o r # 华齿米虾( n e o c a r i d i n ad e n t i c u l a t e s i n e n s i s ) 近年来，国外学者在脊椎动物胰蛋白酶基因领域进行了较深入的研究，研究对象涉及范围较广， 囊括了从四口纲的七鳃鳗到哺乳动物人的大部分模式生物或重要物种。r o a c hjc 于1 9 9 7 年向 g e n e b a n k 提交了海产七鳃鳗( p e t r o m y z o n m a r i n m ) 编码胰蛋白酶的四条e d n a ，长度约8 6 0 b p ，均包含 有一段完整的开放阅读框。鱼类胰蛋白酶基因的研究涉及的物种较多，g e n e b a n k 已见报道的序列至 少包括红鳍东方纯( 孙t 抱纠r u b r i p e s ) ，欧洲海鲈( d i c e n t r a r c h u sl a b r a x ) ，日本风尾鱼( e n g r a u l i s j a p o n i c u s ) ，斑马鱼( d a n i or e r i o ) ，大马哈鱼( o n c o r h 2 m c h u sk e t a ) ，日本鲠鲡“n g u i l l a j a p o n i c a ) ，大西 洋缱鱼( g a d u sm o r h u a ) 。斑点沙鲈( p a r a l a b r a xm a c u l a t o f a s c i a t u s ) ，大西洋鲑鱼( s a l m os a l a r ) 日本比 目鱼( p a r a l i e h t h y so l i v a c e u 0 、奥利亚罗非鱼( o r e o c h r o m l s t 埘) 、尼罗罗非鱼( o r e o c h r o m i sn i l o t i c u s ) 、 岩剑带鳙( x i p h i s t e rm u c o s u s ) 、蓝盘丽鱼( s y r n p h y s o d o ma e q u i f a s c i a t u sh e r a l s i ) 、卵粒粗厝鲻( c h e l o n l a b r o s u s ) 、紫晴冠榭( a n o p l a r c h u s p u r p u r e s c e n s ) 等十多种。以大西洋鲑鱼为例，依据胰蛋白酶基因推 导出的蛋白质序列均具有1 2 个半胱氨酸残基，从而形成6 个= 硫键。五个克隆中的三个( s m r p - l ， s a l t r p ia 和s a l t r p - i ”具有非常相似的序列因而可能是同一基因位点的等位基因变体。其他两 个克隆( s a l t r p - t i 和s alt r p 1 1 d 则可能由各自独立的基因位点编码。s o u t h e r n 杂交分析显示鲑鱼基 因组中存在大量编码胰蛋白酶的基因位点。编码的胰蛋白酶因其氨基酸残基所带电荷不同而具有阳 离子和阴离子两种形式，带电氨基酸分散实验表明4 个胰蛋白酶基因克隆编码阴离子形式，另一个则 编码阳离子形式( m a l e r 等，1 9 9 5 ，删。t o h r u s u z u k i 等对日本比目鱼与其他硬骨鱼及哺乳动物之胰蛋 白酶基因进行系统进化分析发现，胰蛋白酶基因的倍增早于有鳍鱼类的分化i ”。 4 西南大学硕士学位论文 文献综述 两栖类动物胰蛋白酶基因仅见y a o i t a 等柙1 1 9 9 睥所作非洲爪蟾胰腺基因发育及甲状腺激素依赖 调控的研究他们分离到的爪蟾胰蛋白酶基因与哺乳动物有约7 0d a 的相似度。n o r t h e r n 杂交显示爪蟾 胰蛋白酶基因的转录在蝌蚪刚开始进食时被激活，在变态前达到峰值。接下来在前变态期开始被抑 制，变态过程中达到活性最低值。同样的基因在爪蟾成体时又被重新激活，但激活水平稍低。作为 动物变态动因的甲状腺激素可能在动物成熟前对胰蛋白酶基因的表达起负调控作用。 哺乳动物胰蛋白酶是酶学研究的晟为充分的。但其基因层面研究则相对薄弱，仅在几种模式生 物中有核酸序列及相关研究的报道。如p i n s k y 等嗍在) 9 8 5 年研究了狗( c c m s 印) 编码相反电荷胰 蛋白酶的全长m r n a 翻译水平的不同调控方式。h u e r o u 等1 5 0 ) 1 9 9 0 年的研究表明，分别编码牛( b o s t a u r u s ) 胰蛋白酶阴阳粒子等位酶的基因之间的相似度( 6 5 0 a ) 低于编码阴离子等位酶的基因与其 他哺乳动物胰蛋白酶基因之间的相似度( 7 3 鼾8 5 ) a ) 。这一点证明胰蛋白酶基因倍增早于进化上 的物种分化。除此以外，人( h o m o s a p i e n s ) 1 5 1 i 、家鼠( m u sm u s c u l u s ) 【竭的胰蛋白酶基因序列均已 获得近年来国外研究者还在哺乳动物呼吸道中发现了一种胰蛋白酶样酶，并获得了其基因序列， 如1 9 9 8 年y e m a o k a 等i s 克隆到了人类呼吸道胰蛋白酶样酶的c d n a ，h a n s e n 等p 4 1 $ j j ：1 生2 0 0 4 年获得了 家鼠及挪威大鼠呼吸道的胰蛋白酶样酶基因 1 2 。4 胰蛋白酶抑嗣因子 在猪p 5 】和鼠州，7 垮哺乳动物的胰腺组织及分泌物中分离纯化了两种胰蛋白酶抑制因子( p s t ii 和p s t i i i ) 其主要功能一般被认为是防止胰蛋白酶原在分泌到肠腔前被胰腺内的胰蛋白酶所激活。 由小鼠胰腺分离得到的两种p s l l 是由不同基因编码的”p s t li 可以通过肠促胰酶肽释放因子 ( c h o l e c y s t o k i n i n - r o l e a s i n g ) 刺激胰分泌物，而p s t l i i 对肠促胰酶肽释放因子及胰分泌物无明显作用 s g l 。 1 2 5 胰蛋白酶的应用研究 胰蛋白酶广泛的应用于轻工业、医药工业、畜牧业以及现代生物技术领域。 1 2 5 1 医用价值 在医药方面，主要可作为清创剂，消除刨伤部位坏死组织。如应用胰蛋白酶预防后发性自内障。 白内障患者术后晚期发生的后囊混浊或后发性白内障是目前影响自内障患者术后视力恢复的主要因 素，预防后发性白内障的发生有非常重要的实际意义刘欣华等【蚰1 对胰蛋白酶预防后发性自内障进 行了实验研究，以不同浓度胰蛋白酶对人晶状体前囊进行消化处理，观察上皮细胞的消除情况。结 果表明0 2 5 、0 2 胰蛋白酶溶液处理的晶状体前囊，晶状体上皮细胞可以完全脱落。o 1 胰蛋白 酶溶液处理晶状体前囊上皮细胞部分脱落。该结果可为临床应用胰蛋白酶清除晶状体上皮细胞防 治后发性白内障提供理论依据。 胰蛋白酶还可以与麇蛋白酶及抗过敏、抗炎药物共同到成急救药盘治疗毒蛇咬伤。使用方法简 便，易于保存和携带。经二百多例i 临床救治报告证明，急救药盒具有高效、速效、广谱及安全的特 5 西南大学硕士学位论文 文献综述 点，为毒蛇咬伤的治疗开辟了一条新途径，值得广泛推广使用n ”。 利用试验动物进行胰蛋白酶相关病理生理学研究也是胰蛋白酶医药学应用的一个主要方面。程 锦轩 6 2 ) 1 9 9 2 年在建立牛、猪主动脉血管内皮细胞培养方法的同时。采用建成的6 - k e t o - p g f l q 放射免疫 测定法( r 1 a ) 观察胰蛋白酶对牛、猪主动脉内皮细胞释放前列环素( p g l 2 ) 的影响，以期为进一步 探讨它对内皮细胞的药理作用与p g l 2 的关系提供理论依据。高军等1 6 3 2 0 0 0 年探讨了胰蛋白酶原激活 肽( t a p ) 在预浏大鼠试验性急性胰腺炎严重程度的意义指出血浆t a p 浓度可以作为预测急性胰 腺炎严重程度的指标宋东奎等州】2 0 0 2 年在家兔上的研究结果指出：胰蛋白酶可以用作基质溶解剂， 加速e d t a 对草酸钙结石的溶解、并减轻e 叽a 引起的炎性反应。 与胰蛋白酶相关的胰蛋白酶抑制剂及类胰蛋白酶等在医药领域也有广泛应用价值。如李克生等 m j 研究发现，牛肺胰蛋白酶抑制剂对b 1 6 黑色素瘤试验性肺转移及小鼠l e w i s 肺癌转移都有明显抑制 作用类胰蛋白酶则与某些疾病有着密切的关系。研究表明b - 类胰蛋白酶与过敏性疾病密切相关， 在哮喘病人和过敏性鼻炎病人的支气管灌洗液、过敏性眼炎患者的泪水中以