（环境工程专业论文）超临界色谱拆分手性唑类农药的研究.pdf

浙江工业大学硕士学位论文 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大 学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名：冯硕乞 日期：2c 私年月上夕日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“) 作者签名：冯砀血 刷醛轹椭 日期：l 如年，月) 罗日 日期：l 口年r 月哆。日 浙江工业大学硕士学位论文 超临界色谱拆分手性唑类农药的研究 摘要 由于手性药物和农药的两个对映异构体通常具有不同的生物活性 和毒性，甚至具有潜在的相反的药物反应，因此手性药物和农药对映 体的分离与制备研究具有重要意义。论文利用超临界流体色谱( s f c ) 和高效液相色谱( h p l c ) ，分别在2 种多糖手性柱上对几种典型手性 农药进行了对映体的拆分研究。 论文首先使用了s f c 和h p l c 两种色谱体系，在两种商品化多糖手 性柱c h i r a l p a ki b 和c h i r a l c e lo j 上拆分了三唑酮、已唑醇、戊唑醇、 烯效唑、腈菌唑、恶咪唑、抑霉唑7 种三唑类手性农药。考察了流动 相中极性添加剂种类、体积分数、手性固定相以及温度对手性分离的 影响。最后三唑酮、已唑醇、烯效唑、腈菌唑、恶咪唑在c h i r a l p a ki b 上获得了基线分离，而戊唑醇、抑霉唑则在c h i r a l c e l0 j 上获得了基线 分离。采用s f c 色谱体系，在c h i r a l p a ki b 柱上的最大分离度分别为 腈菌唑1 5 4 7 、三唑酮1 2 8 、己唑醇5 2 5 、戊唑醇1 8 5 、烯效唑2 2 8 、 恶醚唑1 0 6 和o 7 3 5 。腈菌唑、己唑醇、抑霉唑、戊唑醇、烯效唑在 c h i r a l c e lo j 柱上的最大分离度分别为1 0 2 、o 8 6 、3 9 8 、5 8 和1 4 2 。 采用h p l c 色谱体系，腈菌唑、抑霉唑在c h i r a l p a ki b 柱上的最大分离 度为9 1 1 和o 7 5 ，在c h i r a l c e l0 j 柱上的最大分离度则为2 1 2 和3 5 2 。 论文分别在两种商品化纤维素衍生物手性柱c h i r a l p a ki b 、c h i r a l c e l u 浙江工业大学硕士学位论文 0 j 上研究了三氯杀虫酯、苯霜灵、禾草灵、乙呋草黄4 种手性农药对 映体的分离。考察了流动相中极性添加剂种类、体积分数、手性固定 相、温度以及压力对手性分离的影响。最后，4 种药物都实现了基线分 离。采用s f c 色谱体系，三氯杀虫酯、苯霜灵、乙呋草黄、禾草灵在 c h i r a l p a ki b 柱上的最大分离度分别为1 4 7 、4 6 8 、3 0 3 和4 4 1 。苯霜 灵、禾草灵在c h i r a l c e lo j 柱上的最大分离度分别为3 1 8 和1 1 8 。采用 h p l c 色谱体系，苯霜灵、禾草灵在c h i r a l p a ki b 柱上的最大分离度分 别为5 4 4 和4 8 1 ，在c h i r a l c e lo j 柱上的最大分离度则为1 7 9 和1 3 6 。 关键词：手性固定相；对映体分离；超临界c 0 2 色谱；三唑类杀菌剂 i i 浙江工业大学硕士学位论文 s t u d yo ne n a n t i o m e rs e p a r a t i o no ft r i a z o l e c h i r a lf u n g i c i d e sw i t hs u p e r c r i t i c a lf l u i d c h r o m a t o g r a p h y a b s t r a c t m a n ye n a n t i o m e r so fc h i r a la g r i c u l t u r a lp e s t i c i d e ss h o wd i f f e r e n t b i 0 1 0 9 i c a la c t i v i t i e sa n dt o x i c i 坝s ot h es e p a r a t i o no fe n a n t i o m e r si sv e 巧 i m p o r t a n t i nt h i sp 印e r ，t h ee n a n t i o s e p a i a t i o no fs e v e r a lt y p i c a lc h i r a l p e s t i c i d e s ( h e r b i c i d e ) w e r ei n v e s t i g a t e do nt w oc o n l i n e r c i a lp 0 1 y s a c c h a r i d e d e r i v a t i v ec h i r a lc 0 1 u n mu s i n gs u p e r c 打t i c a ln u i dc h r o m a t o g r a 【p h y ( s f c ) a n dh i 曲p e r f o m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a t f i r s t ， t h ec h i r a l s 印a r a t i o no fs e v e nt r i a z o l em n g i c i d e sw a s p e r f i 引r r n e do nc h i r a l c e l0 da n dc h i i a l p a ki bu s i n gs f ca n dh p l c t h e i n f l u e n c eo fc h i m ls t a t i o n a lp h a s e ，t e n l p e r a t u r e ，m o b i l ep h a s ea d d i t i v e sa n d i t sc o n c e n t r a t i o no nt h ee n a n t i o s 印a r a t i o nw a ss m d i e d a tl a s t ，f i v em n g i c i d e ss u c ha st r i a d i m e f o n ，h e x a c o n a z 0 1 e ，u n i c o n a z o l e ，m y c l o b u t a n i l ，a n d d if e n o c o n a z 0 1 eg o tb a s e l i n es e p a r a t i o no nc h i r a l p 狄i b o nc h i m l c e lo j ， o n l yt e b u c o n a z o l ea n di m a i z o l eg o tb a s e l i n es e p a r a t i o n u s i n gs f c ，t h e h i g h e s tr sv a l u e so fm y c l o b u t a n i l ，t r i a d i m e f o n ，h e x a c o n a z 0 1 e ，t e b u c o n a z o l e ，u n i c o n a z o l ea n dd i f e n o c o n a z o l eo nc h i r a l p a ki bw e r e15 4 7 ，1 2 8 ，5 2 5 ， 1 8 5 ， 2 2 8a n d1 0 6 o 7 3 5 r e s p e c t i v e l y ， t h e h i g h e s tr s v a l u e so f m y c l o b u t a n i l ，h e x a c o n a z o l e ，i m a i z o l e ，t e b u c o n a z 0 1 ea n du n i c o n a z o l eo n i i i 浙江工业大学硕士学位论文 c h i r a l c e lo jw e r e1 0 2 ，o 8 6 ，3 9 8 ，5 8a n d1 4 2r e s p e c t i v e l y u s i n gh p l c ， t h eh i g h e s tr sv a l u e so fm y c l o b u t a m la n di m a i z 0 1 eo nc h i r a l p a ki bw e r e 9 11a n do 7 5 ，o nc h i r a l c e l0 jw e r e2 1 2a i l d3 5 2 s e c o n d l y e t h o m m e s a t e ，d i c l o f o p - m e t h y l ，a c e t o f e n a t e ， a n d b e n a l a x y lw e r es e p a r 乏n e do nc h i r a l p a ki ba n dc h i r a l c e lo ju s i n gs f ca n d h p l c t h ei n n u e n c eo fc h i r a l s t a t i o n a lp h a s e ，t e m p e r a t i h e ，p r e s s u r e ， m o b i l ep h a s ea d d i t i v e sa n di t sc o n c e n t r a t i o no nm e e n a n t i o s e p a r a t i o nw a s s t u d i e d a tl a s t ，a l lt h ef o u rp e s t i c i d ew e r eb a s e l i n es e p a r a t e d u s i n gs f c ， t h eh i g h e s tr sv a l u e so fa c e t o f e n a t e ，b e n a l a x y ，e t h o 向m e s a t ea n d d i c l o f o p - m e t h y lo nc h i r a l p a ki bw e r e1 4 7 ，4 6 8 ，3 0 3a n d4 4 1r e s p e c t i v e l y ；t h e h i g h e s tr sv a l u e so fb e n a l a x ya n dd i c l o f o p m e t h y lo nc h i r a l c e lo jw a s 3 1 8a n d1 1 8 u s i n gh p l c ，t h eh i g h e s tr sv a l u e so fb e n a l a x y la n d d i c l o f o p me t h y lo nc h i r a l p a ki bw e r e5 4 4a n d4 8l ，o nc h i r a l c e lo jw e r e 1 7 9a n d1 3 6 k e y w o r d s ：c h i r a ls t a t i o n a 巧p h a s e ；e n a n t i o m e rs 印a r a t i o n ；s u p e r c r i t i c a l n u i dc h r o m a t o g r a p h y ；t r i a z 0 1 em n g i c i d e 浙江工业大学硕士学位论文 目录 摘要i i a b s t r a c t i i i 第一章绪论1 1 1 选题背景与意义l 1 2 研究内容2 第二章文献综述1 2 1 手性化合物的拆分方法1 2 1 1 气相色谱法l 2 1 2 薄层色谱法2 2 1 3 高效液相色谱法3 2 1 4 毛细管电泳色谱法4 2 1 5 超临界流体色谱法4 2 1 6 色谱拆分技术的比较5 2 2 手性固定相6 2 2 1 多糖类手性同定相7 2 2 2 其它类型手性固定相1 0 2 3 手性固定相法的理论1 2 2 3 1 手性分离的基本概念1 2 2 3 2 手性固定相法分离机理1 3 2 3 3 手性分离的热力学1 5 2 3 4 样品峰的确认1 8 2 4 小结1 8 第三章7 种三唑类药物的对映体分离1 9 3 1 实验部分1 9 3 1 1 实验仪器和药品1 9 3 1 2 色谱条件2 0 3 2 在c h 曲1 p a l ( i b h 上的分离2 l 3 3 在c h i r a l c e lo j h 上的分离3 1 3 4 柱温对手性拆分的影响4 0 3 5 手性拆分的机理探讨4 5 3 6 小结4 5 第四章4 种杀虫剂和除草剂的对映体分离4 9 4 1 实验部分4 9 4 1 1 实验仪器和试剂4 9 4 1 2 色谱条件5 0 4 2 结果与讨论5 1 4 2 1 色谱体系对手性拆分的影响5 l 4 2 2 流动相极性添加剂手性拆分的影响；5 3 4 2 3 手性同定相结构对手性拆分的影响5 9 浙江工业大学硕士学位论文 4 2 4 柱温对手性拆分的影响6 0 4 2 5 压力对手性拆分的影响6 4 4 3 小结6 7 第五章结论与展望7 0 5 1 结论7 0 5 2 展望7 l 致谢7 9 研究生阶段发表的论文8 0 浙江工业大学硕上学位论文 符号说明 c s p s 手性固定相： c 1 1 i r a l p a ki b h 键合型商品柱纤维素3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯； c 1 1 i r a l c e lo j h 涂敷型商品柱纤维素4 甲基苯甲酸酯； h e x ( h e x ) 正己烷； h p l c 高效液相色谱； i p a 异丙醇； t h f 四氢呋喃； k 容量因子，又称保留因子； 飚分离度； s f c 超临界流体色谱； t i s o 一手性选择温度，k ； u v 紫外检测器 t 卜死时间，蛐； t r 调整保留时间，m i n ； a 选择性因子，又称分离因子； 浙江工业大学硕上学位论文 1 1 选题背景与意义 第一章绪论 手性【1 】，英文名c h i r a l i t y 或h a i l d e d i l e s s ，是指分子结构互为镜像但又不能重合的 两个化合物之间彼此不能重合的性质，对生命有机体的生存起决定性作用。自然 界以及生命体中蕴藏着大量的手性分子，如氨基酸、单糖分子以及由它们构成的 多肤、蛋白质和多糖等，因此手性对我们的生活有很重要的影响，这在药物化学 领域尤为突出，已知的药物中约有3 0 4 0 具有手性。手性药物的对映体在普通条 件下具有相同的物理、化学性质，但在生物环境中所表现出的药效学和药代动力 学很可能存在很大的差异，大多数药物单一对映体疗效高，不良反应小，该类对 映体称为优对映体。而对于无活性或活性低的对映体称之为劣对映体，两个对映 体的生物活性之比称为优劣比值。在很多情况下，劣对映体不仅没有药效，而且 还可能部分抵消对映体的作用，甚至产生严重的不良反应。例如著名的反应停事 件，造成了数千例短肢畸胎的药物灾难，后来发现其致畸作用是由s 对映体所致， 而r 对映体是安全有效的。大多数手性药物及农药的各对映体在活性、药理和药 效等方面明显不同，表1 1 列出一些手性药物和农药的对映体不同生物活性。据统 计，目前市场上出售的手性药物中有8 0 9 0 是外消旋体【2 】，商业用途的1 7 0 多 个手性农药绝大多数也是以外消旋体形式出售和使用 3 4 】，对环境和生物存在巨大 的潜在风险，因此对映体分离具有非常重要的意义。 目前，h p l c 、s f c 等在手性对映物分离领域中均发挥着重要作用。其中，h p l c 使用普遍，又有大量的手性固定相( c s p s ) 可供选择，是最常用的色谱分离技术。 然而，h p l c 技术也存在分析时间过长，分离效率不高等缺陷，且对环境的污染和 工作人员的毒害较大，不利于环境保护。而s f c ( 一种流动相温度、压力均高于 或略低于临界点的绿色色谱分离技术) 与常规的h p l c 技术相比，具有体系的粘 度低、扩散和传质速率高等优点，引起了许多学者的浓厚兴趣。他们对h p l c 和 s f c 做了一些对比研究【5 ，6 】，发现s f c 的分离效率更高、分析时间更短，可以有效 地弥补h p l c 的不足。以超临界c 0 2 为流动相，s f c 不但比h p l c 更高效，而且 更环保，几乎不形成污染，因此，用于制备规模的超临界流体色谱对映体分离技 1 浙江工业大学硕士学位论文 术越来越受到青睐。很多大型制药公司都已拥有s f c 设备，并在讨论有关应用的 问题。s f c 正在从单纯地对对映体进行鉴定的分析规模，转向能生产几毫克到几 百克物质的半制备或制备规模【7 】 多糖衍生物手性固定相与对映体之间有很多不同的手性和非手性作用力，这 些作用力的强弱和性质也各不相同，使得其手性识别的机理非常复杂，虽然有很 多学者在这一方面进行了大量的研究，但到目前为止尚没有取得令人非常满意的 结果。因此，对多糖c s p s 的手性识别机理进行深入研究具有一定的理论及实际意 义。 表1 1对映体的不同生物活性 手性化合物构型生物效应 r 镇静剂 沙利度胺 s 强致畸作用 r 强致畸作用 2 乙基己酸 s 无致畸作用 r 避孕药 普萘洛尔 s p 一受体阻滞剂 r毒 氯丙二醇 s 抗生育活性 r r 致盲 乙胺丁醇 s s 抗结核 r 除草活性是外消旋体的2 倍 萘丙胺 s 无除草活性 r 强杀菌活性 烯唑醇 s 强植物生长调节功能 多效唑杀茵活性为：2 r ，3 r 2 s ，3 r 2 r ，2 s 2 s ，3 s r r 杀菌剂 氯霉素 s s 植物生长调节剂 1 2 研究内容 本论文的研究内容主要有以下几个方面： ( 1 ) 在c 1 1 i r a l c e lo j - h 和c h i 叩a ki b 两种手性柱上分别使用s f c 和h p l c 对 三氯杀虫酯、苯霜灵、禾草灵，乙呋草黄四种手性农药进行了拆分研究，并比较 2 浙江工业大学硕士学位论文 了两种分析方法的优劣。考察了流动相改性剂( 乙醇、异丙醇和甲醇) 以及柱温 和压力对拆分结果的影响，初步探讨了三种手性药物的手性识别机理。 ( 2 ) 在两种商品化的手性柱c h i r a l c e lo j h 和c 1 1 i 叩a l ( i b 上，对三唑酮、已 唑醇、戊唑醇、烯效唑、腈菌唑、恶咪唑、抑霉唑等7 种三唑类手性农药进行了 手性拆分研究，考察了流动相改性剂( 乙醇、异丙醇和甲醇) 以及柱温对拆分结 果的影响，并初步探讨了其手性识别机理。 浙江工业大学硕士学位论文 第二章文献综述 2 1 手性化合物的拆分方法 一直以来，对映体分离方法层出不穷。目前，对映体分离的方法主要分为两 大类色谱法和非色谱法。其基本原理大多是基于把对映体的混合物转换为非对映 异构体，然后利用它们在化学或物理化学性质上的差异使之分开。非色谱法主要 有：结晶法1 1 、化学拆分法【1 2 - 1 4 1 、萃取澍1 5 1 和酶拆分法【1 6 - 1 8 1 等。非色谱法大多操 作繁杂、费时、消耗大、收率不稳定，能拆分的手性对映体的种类有限，从而限 制了其广泛应用。目前研究和应用最多的还是色谱法，其不仅是对映体分析和纯 度测定的有力工具，而且还是制备和纯化的重要手段。 近年来，随着色谱理论的深入研究、技术的日臻完善、仪器及其组件的更新， 使之在手性物质分离分析领域显示出强大的优势【1 9 2 0 1 。应用于手性分离的色谱技术 主要包括气相色谱( g c ) 、薄层色谱( t l c ) 、高效液相色谱( h p l c ) 、毛细管 电泳色谱( c e ) 和超临界流体色谱( s f c ) 等。 2 1 1 气相色谱法 气相色谱法( g c ) 是较早用来进行对映体分离的一种色谱方法。具有速度快、 简单、灵敏等优点。g c 分离混合物所用的色谱柱主要是由玻璃或者塑化硅胶制作 的毛细管，采用g c 分析样品有一些前提，其中最重要的是样品的耐热性以及易挥 发性。间接法和直接法都能获得手性分离。后者包括流动相添加剂法，而g c 的流 动相是气体，因此，手性固定相( c s p ) 是g c 直接拆分的唯一方法。 气相色谱中用于分离对映体的手性固定相主要有以下几类：( 1 ) 以手性氨基 酸衍生物为选择体的二酰胺、二肽酯、二酰脲等，它们可分离许多手性化合物【2 1 1 。 异氰酸酯类和光气已成为多种化合物手性分离的万能试剂；( 2 ) 光学活性金属配 合物。s c h u r ig 【2 2 】提出了“络合气相色谱法 的概念，把手性分离气相色谱推广到 不足以生成氢键基团的化合物上。这一方法对分离信息素特别有用，但受到热稳 定性的限制；( 3 ) 环糊精衍生物。环糊精衍生物的出现为手性分离开辟了一个新 的途径，是最有前途的一种手性固定相。s a l l d 【2 3 】等于1 9 6 1 年首先把环糊精衍生物 浙江工业大学硕士学位论文 ( c d s ) 用作填充柱气相色谱的固定液。能够用g c 分离的手性农药中，9 0 以上 是在环糊精手性固定相的基础上实现的。目前商品化的手性气相色谱柱的固定相 基本上都是基于衍生化的环糊精如g t a ( 2 ，6 二o 戊基3 三氟乙酰基g 环糊精) 、 b d m ( 二0 甲基b 环糊精) 、b p m ( 2 3 ，6 三o 甲基b 环糊精) 、b p h ( ( s ) 2 羟丙基甲基b 环糊精) 、b p t ( 三氟乙酰基b p h ) 和g p t ( 三氟乙酰基g p h ) 等。( 4 ) 冠醚。周喜春等【2 川合成了一些冠醚修饰型手性固定液。曾昭睿等【2 5 】还合 成环糊精冠醚毛细管气相色谱手性固定相，还采用溶胶一凝胶技术制备了羟基苯并 冠醚毛细管气相色谱固定相，并测定了它的色谱性能【2 6 】。 间接衍生化法主要是在没有或缺少相应手性固定相的情况下而采取的一种检 测对映体比率和光学纯度的方法。如p 肾上腺素受体阻断药物的分斟2 7 1 。 与其它色谱技术相比，g c 的最大优点是其检测方法的多样性最常用的是氢火 焰离子化检测器( f i d ) ，还有一些选择性较强的检测器，如电子捕获检测器( e c d ) 等。当然，g c 手性分离也有其不足之处，不宜分离低挥发性、强极性或分子量大 的化合物，限制了其应用范围。 2 1 2 薄层色谱法 薄层色谱法( t l c ) 是最简便的色谱分离技术之一，其分离方式有手性试剂衍 生化法( c d r ) 、手性流动相添加剂法( c m p a ) 和手性固定相法( c s p s ) 【2 8 j ， 但应用较多的是手性固定相法。t l c 与其它色谱方法相比，其优越处在于能同时分 析许多样品，真正做到相同条件。另外，根据所用的方法，可使用不同的检测方 法以监测获得分离的化合物。用得最多的检测方法是紫外和荧光，此外便是显色 反应。更为优越的是分析物总能在板上找到，并且流动速率低的溶质也无需全部 洗脱。手性t l c 的一个显然不足在于离子交换柱是唯一可用于t l c 的商品化c s p ， 而用于g c 和h pl c 的c s p 则达上百种。大多数t l c 分离对映体用的是间接法，只有 少数报道有采用直接法在t l c 板上进行对映体分离。 手性固定相法的技术关键在于制备不同的手性薄层板，常用的手性薄层板有 纤维素板及预涂纤维素的薄层板，可用于拆分氨基酸及其衍生物，二肽等对映体。 用非均相乙酰化方法制得的纤维素三醋酸( m c t a ) 制备成的薄层板可用于拆分氨 基酸衍生物、镇痛剂的苯酯、黄酮类化合物及一些具有重要生理活性的手性药物 浙江工业大学硕士学位论文 对映体；分子印记法是制备具有高选择性的合成高分子的方法，常用的载体有硅 胶及氨基、氰基、二醇基修饰的硅胶等，对氨基酸、糖及其衍生物、一些手性药 物都表现出亲和力，但是有些用做印记分子的物质溶解性差，对手性分离不利； 将手性选择剂化学键合到载体上，进行对映体分离的化学键合的手性薄层板主要 有p 环糊精( p c d ) 键合相薄层板、p r i c l 【l e 型手性薄层板、萘乙基脲型薄层板。 朱全红等【2 9 】将b c d 健合相用苯基异氰酸醋及3 ，5 二硝基苯甲酰氯进行衍生化，制 备了衍生化的b c d 键合相薄层板，在反相色谱条件下分离了氨基酸对映体及一些 临床常用的手性药物对映体如氧氟沙星等。 2 1 3 高效液相色谱法 高效液相色谱技术( h p l c ) 是2 0 世纪7 0 年代后期发展起来的，现已成为对映 体分离中最重要的一种手段。与g c 和t l c 一样，h p l c 也可以使用间接法和直接法 两种方式拆分对映体，直接法又分为手性流动相添加剂法和手性固定相法。每种 方法都有其优点和缺点。近年来，将外消旋棍合物在柱前衍生成非对映异构体， 再以非手性固定相加以分离的间接法用得少了，主要是因为出现了大量商品化的 h p l c 手性固定相。不过，仍有关于间接法分离对映体的报道。手性试剂的种类有 很多，常见的为以下几种：酞化试剂、胺类试剂、异( 硫) 氰酸酷类、氯甲酸醋 类、邻苯二醛( o p a ) 和手性硫醇等。采用手性固定相的直接法方便，并且可以应 用于制备级的分离，但是需要收集昂贵的手性柱来解决各种分离问题。流动相添 加剂法代表了简单、灵活，但不总是可用。因为流动相中的手性选择剂无法重复 利用，因此这种方法不能采用昂贵的试剂进行分离。 ( 1 ) 间接法 有大量的文献报导了利用手性试剂衍生化法分离含有各种官能团手性化合 物，这些官能团主要有氨基( 氨基化合物、氨基甲酸酯、尿素类、硫脲类和磺胺 类) 、羟基( 酯、碳酸酯、氨基甲酸酯) 、羧基( 酯和氨基化合物) 、环氧( 异硫氰 酸酯) 、烯烃( 手性铂络合物) 和硫醇( 硫酯) 等。但近些年的相关研究变得少了 起来，这主要是商品化的h p l c 手性固定相越来越多，但仍有一些研究者致力于 寻找新的和更好的手性衍生化试剂，并取得了一定的进展，如用来做氨基酸、氨 基醇和儿茶酚胺及天冬氨酸消旋酶衍生试剂的富含手性硫醇类试剂的n ( 叔丁基 3 浙江工业大学硕上学位论文 硫代氨甲酰) l 半胱氨酸乙酯 3 们。 ( 2 ) 直接法 手性流动相添加剂法常用的手性添加剂有离子对试剂、配体交换型试剂、蛋 白质亲和试剂、环糊精及其衍生物试剂、冠醚手性包合试剂和手性氢键作用试剂 等3 1 1 。如可以通过添加手性离子对试剂( + ) 樟脑磺酸来分离氨基醇类( b 阻断剂) ， 添加奎宁来分离羧酸类对映体；n 苄氧基羰基氨基乙酰基l 脯氨酸在分离b 阻断 剂时的手性选择性好于( + ) 樟脑磺酸【3 2 】。 2 1 4 毛细管电泳色谱法 毛细管电泳色谱法( c e ) 是2 0 世纪8 0 年代以来新兴的一种分离技术，由于 它具有高效、快速、简便等特点而被广泛应用于手性分离。c e 以高压电场为驱动 力，以毛细管为分离通道，依据样品各组分之间浓度和分配行为的差异而实现分 离【3 3 】。s t e p h e 和w r e n 【3 4 】对该法的分离机制进行了研究，用毛细管区带电泳及环糊 精作手性选择剂分离对映体的方式，推导得出数学模型，并用此从理论上阐述了 一些具体问题。此外，通过n m r 谱中的化学位移和谱峰分裂也可以分析其作用机 理。c h a n l ( 、，e t a d z e 等【3 5 】用1 3 c n m r 研究了用中性和带电环糊精拆分甲丙氨酯的手 性识别机理。 但是，c e 手性分离的理论尚待完善，对分离结果的预测性差，分离电中性化 合物仍是一个有待更好解决的问题【3 6 1 ，而且该方法还没有用于手性制备的报道。 2 1 5 超临界流体色谱法 超临界流体色谱法( s f c ) 是采用超临界流体为载体的一种分离技术，由 m o 谢e r 等人于1 9 8 5 年首次用s f c 实现手性分离【3 7 】。其在手性分离分析中的优势 表现为：( 1 ) 超临界流体的密度近于气体，比液体低得多，扩散系数在气体和液 体之间，具有较快的传质速度。与h p l c 相比，s f c 不但分析时间更短，手性分 离效率更高【3 8 删，还能有效减少传输过程中的阻力，使得将多根色谱柱串联增加 柱效的分析方法成为可能。b e o g e r 【4 5 】曾将1 1 根2 0 c m 硅胶填充柱串联起来，在s f c 条件下获得了2 2 0 ，o o o 的塔板数。b 硼 1 l l 抓等人使用s f c 分离一种混合药物( 含有 4 浙江工业大学硕士学位论文 4 个立体异构体) 时，发现无论是在a d 柱还是o d 柱上都不能单独实现药物的基 线分离，但如果将两根柱子串联使用，他们能在1 5 分钟内拆开这4 个异构体晰】。 a l e x a n d e r 等人则联合o d 柱和硅胶柱，在s f c 上分离了由肉桂腈和苯代丙腈组成 的混合药物( 两种药物又互为对映体) 【47 1 。( 2 ) 超临界流体具有很强的溶解能力， g e i s e r 等学者在分离h y d r o c m o r i d es a l t so f 锄i n e ( 盐酸胺盐) 时发现该类物质不 溶于高效液相的正相体系，而在超临界c 0 2 和甲醇的混合体系中溶解度却很高【4 8 1 。 ( 3 ) s f c 系统既可使用h p l c 检测器也可使用g c 检测器，如质谱、氢火焰离 子化检测器，这有利于手性药物中痕量组分的检测和定性分析。( 4 ) 可作流动相 的超临界流体物质较多易得，与h p l c 相比，对环境的污染及操作人员的毒害 较少。s f c 的流动相易于去除，使得s f c 成为制备光学纯药物的极具潜力的技术。 s f c 分离手性化合物可分为直接法和间接法两种，直接法包括使用手性固定 相和手性流动相。目前，手性固定相直接分离法是超临界流体色谱法中发展最快 的领域，_ 般在超临界流体中加入少量的极性溶剂( 甲醇、乙醇等) ，或者添加 剂( 酸或碱) ，这样既可覆盖固定相表面的活性部位，又可增加流动相的洗脱强 度和选择性，提高了分离效率。 超临界流体色谱亦是一种制备分离技术，已应用于食品、医药、生物及石油 等多种领域，在药物方面，已有研究报道制备纯对映体达到了千克级。d a u h r 啪g 【4 9 】 研究发现超临界c 0 2 色谱是一种比高效液相色谱效率更高、更直接的制备分离技 术，制各拆分了几百克的手性药物。w e l c h 【5 川和g a d ，【5 1 1 也报道了超临界流体色谱制 各拆分了千克级的手性药物。 手性固定相法分离对映体是目前超临界流体色谱和高效液相色谱中研究和应 用最多的一种方法，在本章第二节中将对其进行较详细的评述。 2 1 6 色谱拆分技术的比较 各类色谱拆分技术分离对映体的优缺点见表2 1 。在各种手性色谱技术中，高 效液相色谱法适用对象广泛，尤其为非挥发性和热稳定性差的手性药物的拆分提 供了更为有效地途径。超临界流体色谱则拥有更高的传质速率和扩散系数，具有 高效、简单、快捷的特点，且对环境几乎无污染。两种技术互为补充，并可以与 红外、质谱、核磁共振联用，为复杂样品的快速定性和定量分析提供了方便的途 浙江工业大学硕士学位论文 径。 表2 1色谱拆分技术的优缺点 色谱技术优点缺点 气相色谱法 分离效率高易消旋化，难制备 超临界流体色谱法高分离效率，适用范围广，可用于制备高压，设备要求较高 分离效率高，不需要手性柱，添加剂用量少，适 毛细管电泳法柱容量小，难制备 用范围广 高效液相色谱法分离效率高，应用广泛成本较高，有污染 2 2 手性固定相 色谱法是手性分离分析的重要手段【5 2 】，而具有不对称手性中心或手性识别能 力的手性固定相( c s p s ) 的开发与研究，是手性色谱的前沿，也是手性色谱发展 的关键和核心【5 3 1 。高效液相色谱利用手性固定相分离对映体的研究始于2 0 世纪7 0 年代后期，现已开发出用于高效液相色谱的手性固定相的种类已有上千种，其中 商品化的高效液相色谱手性固定相也己超过2 0 0 多种【5 4 5 6 】。而基于h p l c 开发的 手性固定相也能应用于s f c 上，这也为s f c 的发展创造了有利条件。人们通过各 种研究来发展更有效的新型的手性固定相，或改进现有的手性固定相，如基于纤 维素和直链淀粉衍生物、大环抗生素、手性冠醚、蛋白质、环糊精和具有光学活 性的合成小分子的p i r k l e 型手性固定相等都成功地应用于手性分离，并对手性固定 相的手性识别机理进行了大量的研究【5 7 5 8 1 。 根据不同的目的，h p l c 手性固定相有不同的分类方法。如被广泛采用的w 萄n e r 分类方法，是按照手性固定相与溶质之间的相互作用机理而分为五类【5 9 矧，具体 见表2 2 。按照手性固定相的来源进行分类，又可分为天然型、半合成型和合成型 旧，具体见表2 3 。在各类c s p s 中，由o k 锄o t o 等发展起来的多糖类手性固定相己 被证明是一类性能良好的高效液相色谱手性固定相，其中涂敷和键合型的纤维素 和直链淀粉衍生物手性固定相在分离分析对映体方面具有互补性，极大地拓展了 这类手性固定相的应用范围，是目前研究和使用最广泛的手性固定相之一。多糖 类手性固定相的优点是【6 2 】：( 1 ) 它们是天然活性物质，容易得到；( 2 ) 它们的 葡萄糖单元的羟基易被衍生化，容易制备出各种选择性的手性固定相；( 3 ) 多糖 6 浙江工业大学硕上学位论文 类c s p s 的载样量大，在大规模制备色谱应用上有很大潜力；( 4 ) 普适性强，适用 于许多光学异构体的拆分。 表2 2 高效液相色谱手性固定相按w a i n e r 分类 类型 作用机理 样品与c s p 之间主要靠吸引排斥作用联系在一起，主要是舡兀 l 类型i 或p i n d e 型 作用，氢键作用和偶极堆积作用 类型i i在手性空穴内含有多种吸引作用和包含作用，如纤维素衍生物 类型i i i包含作用，如环糊精类型手性固定相 类型通过形成金属非对映异构体诱导手性识别( 手性配体交换色谱) 类型v疏水作用和极性作用，如蛋白质手性固定相 表2 3高效液相色谱手性同定相按其来源分类 来源类 型手性选择剂 蛋白如白蛋白，糖蛋白，酶，卵转铁蛋白等 低聚糖 如二糖，麦芽糖糊精，伐，p 爿一环糊精等 天然物多糖如纤维素，直链淀粉，淀粉，葡聚糖，肝素，果胶等 抗生素如万古霉素，替考拉宁，瑞斯托菌素，阿沃菌素等 低分子物质如氨基酸，胆酸，生物碱，酒石酸等 改性低聚糖如环糊精衍生物，环糊精聚合物等 半合成化合物改性多糖如多糖氨基甲酸酯，多糖酯类等 改性低分子离子交换剂 小分子化合物p i 瑚e 型手性选择剂，受体分子，冠醚 | 合成化合物 螺旋的聚合物聚丙烯酰胺，聚丙烯酸脂等 2 2 1 多糖类手性固定相 多糖类化合物如纤维素和直链淀粉是自然界中大量存在的有光学活性的生物 聚合物。纤维素和直链淀粉是d ( + ) 葡萄糖以p - l ，4 - 糖苷键或a - l ，4 - 糖苷键相连而 7 浙江工业大学硕士学位论文 形成的高度有序、呈螺旋型空穴结构的光学活性天然高分子，其结构如图2 1 所示。 每个葡萄糖单元具有5 个手性碳原子，故由n 个葡萄糖单元构成的纤维素分子将有 5 n 个手性中心。因而作为主体分子能为客体分子提供一个良好而易得的手性环境， 而且葡萄糖单元2 ，3 ，6 位上的3 个羟基易被衍生成酯或醚类，从而降低纤维素的极 性，引入含有可产生氢键氢键、偶极偶极、兀7 c 键及立体选择等效应的取代基， 从而提高手性识别能力如图2 2 所示，因此制备大量的纤维素和直链淀粉衍生物更 具使用价值。 ) i ： “、。延、 1 41 6 7 删。 有时一种药物能同时被多种固定相分离，但拆分效果各有不同。a d ，o d 两种固定 相都能在s f c 上基线分离阿苯达唑二甲基亚砜、奥芬达唑、阿苯达唑三种肠道驱虫 剂，但o d 柱的分离效率更高( 分析时间更短，分离度更高) 【7 0 7 1 1 。据文献报道， b e m a l 等人曾在s f c 上用a d 和o d 两根手性柱分离了酮康唑以及4 种1 3 二氧戊烷衍 生物，实验结果表明a d 柱更适合于拆分酮康唑，而在拆分1 3 二氧戊烷衍生物时， o d 柱的拆分效果更好【7 2 7 4 1 。多种固定相互相补充，扩大了拆分范围，使手性分离 有了更多的选择。将s f c 与质谱联用，g a r z o t t i 等人在a d ，o d ，o j 三根手性柱上 以2 0 乙醇为流动相梯度洗脱了咪康唑，益康唑，硫康唑等2 0 种药物，最后o j ， 8 浙江工业大学硕士学位论文 o d ，a d 分别拆开了1 0 ，9 ，1 6 种药物7 5 1 。在s f c 上拆分美托洛尔，烯丙洛尔，氧 烯洛尔等1 8 种p 阻滞剂时，s v e n s s o n 等人发现a d 柱只能分离其中5 种药物，但o d 柱却分离了1 5 种。这次实验还发现样品的分子结构对手性选择性有很一定影响， 随着样品分子中n 原子上取代基的自由度降低，对映体的手性选择性升高【7 6 1 。 表2 - 4 商品化涂敷型多糖衍生物手性柱 商品名化学名称 取代基厂家l o c h k a l c e lo a 纤维素三醋酸脂 一c c h 3 c h i m l c e lo b 纤维素三苯甲酸脂 旬一 一c 氐 彦 c l i m l c e lo c 纤维素三( 4 氯苯基氨基酸脂) 一l _ 旬 一 一c n h 氐 房 c t l i 】r a l c e lo d 纤维素三( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲 一g 一；j n c h i r a l