（环境工程专业论文）金属硫蛋白突变体的构建、表达及工程菌对重金属的吸附.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间 年月日 是否保密否 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡麸均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：3 易靼己骂时同：沙，7 年占月力口日 学位论文作者獬：诊是笃导师签名：l 夕 签名日期：p 7 年月沙日签名日期：如。7 年? 月如日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 华中农业大学硕士研究生学位论文 摘要 本文以猴金属硫蛋白( m m t ) 为研究对象，采用p c r 技术和同尾酶手段，构 建了m m t 的突变体，获得了金属硫蛋白a 域单体( m t a ) 及二聚串连体( m t a 2 ) 、 三聚串连体( m 1 乜) 、四聚串连体( m t m ) 、五聚串连体( m t a s ) 。表达并纯化了 m t a ，测定了表达多聚串连体的工程菌抗镉能力，以及镉、锌吸附能力。主要结果 如下： 1 构建了m m ta 域表达载体，并用其转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，表达、纯化 后获得高纯度的m t a ，其镉结合能力与理论值一致。 2 结构预测显示，m t a 、m t a 2 、m t a 3 的二级结构中，a 螺旋依次增加，推测 突变蛋白的疏水性增强，蛋白质三维结构稳定。m t a 4 、m t a 5 二级结构中，a 螺旋 数目减少，尤其是m t c t 5 ，其a 螺旋几乎完全遭到破坏，疏水性大为降低，这可能造 成蛋白质空间结构的不稳定性。 3 构建了表达m m to r , 域多聚串连体的工程菌，获得了表达二聚串连体( m t o t 2 ) 、 三聚串连体( m t a 3 ) 、五聚串连体( m t a 5 ) 的工程菌( m t a 2 b l 2 1 、m t a 3 b l 2 1 、； m t a s b l 2 1 ) 。 4 0 5m m o l lc d 2 + 时，对照菌生长受到严重胁迫，工程菌表现出一定的抗性， 对m t a n b l 2 1 ，( n _ 2 ，3 ，5 ) 生长几乎没有胁迫。1 0m m o l lc d 2 + 时候，m t a s b l 2 1 表现出较强耐受能力。 5 在低浓度c d 2 + ( o 0 6 7m m o l l ) 时，表达有野生型猴金属硫蛋白的工程菌 ( m t b l 2 1 ) 表现出较高的镉吸附能力( o 0 6 1 5m m o l m g 细胞干重) ，随着镉浓度的 升高，这种趋势更加明显，在镉浓度为o 2 6 8m m o l l 时，m t b l 2 1 镉吸附量为o 0 9 3 m m o l m g 细胞干重，是对照( p g e x - 2 t b l 2 1 ) 的2 5 倍。0 5m m o l lc d 2 + 时，工 程菌对镉的清除能力明显高于对照，其中清除能力最强的是m t a 3 b l 2 1 ( 7 6 ) ， 其次是m t a 2 b l 2 1 ( 7 2 ) 。 6 m t b l 2 1 对锌吸附能力显著提高( o 1 1 8m m o l m g 细胞干重) ，而转化有m t a 串连突变体基因的工程菌对锌的吸附能力没有明显提高。 关键词：猴金属硫蛋白；镉；抗镉能力；吸附能力；突变体；串连体： s 、i s s m o d e l 华中农业大学硕士研究生学位论文 a b s t r a c t b a s e do np c ra n di s o c a u d a m e rt e c h n i q u e s as e r i e so fm o n k e ym e t a l l o t h i o n e i n ( m m l ) m u t a t i o n sw e r ec o n s m l c t e di n c l u d i n gm r a d o m a i no fm t ) ，m t a 2 ，m t a 3 , m t c t 5 ( 鑫c l u s t e ro f2 3 ，5d i r e c t1 - e p e a t so ft h e 口d o m a i n ) m t aw b l ge x p r e s s e da n d p u r i f i e da n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ep r o t e i nw c r ei n v e s t i g a t e d 皿er e s i s t a n c et oc d 2 + a n da d s o r p t i o nc a p a c i t yf o rc d 2 + 缸dz n 2 + b yt h ee n g i n e e r e db a c t e r i aw e i ee x a m i n e d n 呛 m a i nr e s u l t sa r eo u t l i n e da sf o l l o w s ： e x p r e s s i o nv e c t o rh a b o r i n gm t aw a sc o n s t r u c t e d a f t e re x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o n , h i g h l yp 面f i e dm t aw a so b t a i n c d i t sm e t a l a d s o r p t i o na b i l i t yi se o n s i s t a n tw i t ht h e t h e o r e t i c a lr e s u l t a c c o r d i n gt os e c o n d a r ys t r a c t u r ep r e d i c t i o n , i n c r e a s e dh y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o nw a so b s e r v e df o rm t a , m t a 2 m t a 3 h o w e v e ra - h e l i xw a sd e e r e a s c di l l m t a 4 、m t a 5 ，e s p e c i a l l y i nm t 蛳 e n g i n e e r e d b a c t e r i a e x p r e s s i n g t h ec l u s t e ro f 劓hw g l - ec o n s t r u c t e da s m t “b l 2 1 , m t a 卅b l 2 1 m t a 3 b l 2 1a n dn r r q 5 ，b l 2 1 t o x i c i t yt oc o n t r o lw 勰f o u n da n dn ot o x i c i t yo fc d 2 + t oe n g i n e e r e db a c t e r i aw a s o b s c r v e df o rm t 眈b l 2 l ，m t a 3 b l 2 1a n dm t a s b l 2 1i nt h ep r e s e n c eo f0 5m m o l l c d 2 + a sc d pc o n e e n l r a t i o ni n c r e a s e dt o1 0m m o l l , m t a s b l 2 1s h o w e dh i g h e r r e s i s t a n c e u n d e rl o wc o n c e n t r a t i o n so fc + ( o 0 6 7m m o l l ) ，t h ee n g i n e e r e db a c t e r i a e x p r e s s i n gm m t ( m t m l 2 1 ) e x h i b i t e ds t r o n g e ra d s o r p t i o ne a p a c i 够( o 0 6 1 5m m o l m g d r yw e i g h to fc e l l s ) a n dt h et e n d e n c yb e c a m em o r eo b v i o u sa sc d 2 + c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e dt o0 2 6 8m m o l l m t b l 2 1a d s o r b e dd o u b l ea m o u n t so fc ( o 0 9 3m m o l m g ) a sc o m p a r e dt ot h ec o n t r o lw h e nt h ec o n c e n t r a t i o nw a s0 2 6 8n u n o l l a m o n gt h e s e r i e so fe n g i n e e r e db a c t e r i a , m t a 3 b l 2 1r e m o v e dt h eg r e a s t e s tp e r c e n t a g ec d 2 + ( 7 6 ) ， f o l l o w e db ym 邶l 2 l ( 7 2 ) 1 1 他a d s o r p t i o nc a p a c i t yf o rz n 2 + b ym t b l 2 1m 1 1 8m m o l m gd r yw e i g h to f c e u s ) w a si n c r e a s e dd r a m a t i c a l l yw h i l e1 1 0s i g n i f i c a n ti m p r o v e m e n tw a so b s e r v e df o r t h eo t h e r e n g i n e e r e db a c t e r i a k e y w o r d s ：m o n k e ym e t a u o t h i o n e i n , m u t a t i o n s ，c l u s t e r , s w i s s - m o d e l 4 华中农业大学硕士研究生学位论文 1前言 随着现代工业的发展和人类自身活动的增加，全球重金属污染日益严重，其危 害相当可观。全球每年排放到环境中的有毒重金属高达数百万吨，其中砷为1 2 5 万 吨，镉为3 9 万吨，铜为1 4 7 万吨，汞为1 2 万吨，铅为3 4 6 万吨，镍为3 8 1 万吨， 并且还在逐年增加。大量含有重金属污染物的选矿、化工、电镀、制革、农药、医 药、油漆、颜料等工业废水和城市生活污水被排入江河湖泊。这些污染物不仅严重 污染地表水与地下水，造成全球可利用水资源总量急剧下降，而且使土壤中重金属 含量增加，抑制植物的生长发育，促进植物早衰，降低产量，并通过根系进入植物 体，再通过食物链的传递和富集，最终在生物体内累积，破坏正常的生理代谢活动 甚至产生三致作用( 致癌、致畸、致突变) ，极大地危害了人类健康。因此，有效地 治理重金属污染废水、土壤成为当前十分迫切的任务。 1 1 环境重金属污染的微生物修复 传统的治理重金属污染的途径是通过物理和化学方法，其中包括：( 1 ) 用不含重金 属的土壤取代、稀释或覆盖被污染的土壤。( 2 ) 在土壤中加入某些无毒的化学试剂将 重金属转化成沉淀的形式从而将其固定。( 3 ) 利用重金属与阳离子交换树脂有较强 的结合能力，优先与树脂中的钠离子发生交换反应从而去除重金属。( 4 ) 漂白粉氧 化法，此法常用来处理电镀厂的含氰、镉废水，加漂白粉处理时，将氰根离子( c n 一1 氧化，镉离子则形成氢氧化镉沉淀。但是由于这些方法成本较高、工艺复杂、人力 物力消耗大，而且很难除去低浓度金属离子，所以不能大规模的应用，而且理化方 法往往会破坏土壤结构以及微生物区系，并且可能造成“二次污染”。 生物治理法作为一种新兴的高科技方法为大规模、低成本治理重金属污染带来 了希望。例如：可以利用细菌作为滤器来过滤污水中的c d 、h g 、p b 等重金属；利用 真菌来富集土壤中微量的银；利用植物去处空气、土壤、水体中的重金属污染即植 物修复；利用活性和非活性假丝酵母菌对铜、镉、镍进行吸附能力( 李春明等，1 9 9 8 ) 。 微生物通过螯合、离子交换吸收、氧化还原等机理修复重金属污染，具有效率 高、成本低等优点。有毒金属可被贮存在细胞的不同部位或被结合到胞外基质上， 通过细胞代谢( 专一性的代谢途径) 、表面生物大分子吸收转运、生物吸附( 利用活细 胞、无生命的生物量、金属结合蛋白和多肽或生物多聚体作为生物吸附剂) 、空泡吞 饮、沉淀和氧化还原反应等机理可使金属离子被沉淀、或被轻度螯合在可溶或不溶 性生物多聚物上或通过生物转化使其毒性降低，而易于回收。同时，细胞对重金属 盐具有适应性，通过平衡或降低细胞活性得到恒定条件：微生物积累重金属也与体内 华中农业大学硕士研究生学位论文 金属结合蛋白和肽有关。 微生物治理重金属污染是种很有前途的方法。以往这方面的研究主要集中在 对污染环境中的重金属抗性微生物或重金属吸附微生物的筛选。二十世纪末，人们 开始尝试把天然金属螫合蛋白或其合成酶在细胞内表达。s r i p r a n g 等在根瘤菌 ( m e s o r h i z o b i u ms p ) 中表达来源于拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 的植物螯合素合 成酶，工程茵对c d 2 + 吸附能力提高9 一1 9 倍( s r i p r a a g ，2 0 0 3 ) 。c h e n 等在大肠杆菌 ( e s c h e r i c h i a l c o l o 中表达了金属硫蛋白( m r ) 以及h 矿转运体系，提高了重组菌对 9 2 + 的结合能力及其对高浓度h 矿的耐受力( c h 肌，1 9 9 7 ) 。通过在e c o l i 的周质空 间中表达金属结合肽，重组菌对c d 2 + 、h f + 的吸附能力加强( p a z i r a n d e h ，1 9 9 8 ) 。 小鼠m t - i 在聚胞藻中诱导表达，转基因藻对金属耐受性为野生藻的2 倍( 郭祥学等， 1 9 9 8 ) 。将人肝m t i a 在鱼腥藻7 1 2 0 中诱导表达，重金属耐受性提高。在集胞藻 6 8 0 3 中表达人肝金属硫蛋白突变体p p 基因后，对低浓度铜离子( 1 0p m o l l ) 培养 基中铜离子的去除率可达8 2 ( 任黎等，1 9 9 8 ) 。将粗糙链胞霉( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 的m t 串连，并在大肠杆菌中表达，大肠杆菌对重金属的吸附能力提高，最高吸附 量是野生型的6 5 倍( m a u r o 等，2 0 0 0 ) 。要构建理想的工程菌需要考虑到以下因素。 1 1 1 目的菌 构建高效的工程菌，首先应该具备的条件就是一个理想的目的菌，目的菌是指 被选择用于构建环境污染修复工程菌的细菌。一般目的菌的遗传背景清晰，具有一 定的重金属吸附能力或抗性。革兰氏阳性菌( g + ) 与革兰氏阴性菌( g - ) 因其结构 的不同特点而各有优缺点。ec o l i 遗传背景清晰，通常被选择作为目的菌，但e c o l i 对重金属耐受力以及其对重金属的结合能力都十分有限，且不适于土壤环境污染修 复。因此人们不断尝试对具有一定重金属耐受力或重金属抗性的菌株的筛选与改造。 1 1 2 靶蛋白 理想的靶蛋白是构建高效工程菌的一个必须条件，这里的靶蛋白是指一类具有 重金属吸附能力的天然蛋白或人工合成短肽，它们通过特定系统在微生物体内表达 或展示在微生物特定位置，从而提高微生物对重金属的吸附能力。 经常应用的靶蛋白有金属结合短肽、植物螯合素、金属硫蛋白等。 1 金属结合短肽 多指一组富含组氨酸、半胱氨酸的金属结合短肽，它们对重金属的吸附往往缺 乏专一性。将六聚组氨酸通过l a m b 表达于e c o l i 表面，重组菌的重金属吸附能力 提高了1 0 倍( s o u s a 等，1 9 9 7 ) 。通过o m p c 在e c o l i 表面分别展示( h i s ) 6 与( h i s ) 1 2 ， 发现两者对重金属吸附能力比野生型提高，且后者提高倍数高于前者( c r u z 等， 6 华中农业大学硕士研究生学位论文 2 0 0 0 ) 。将多聚组氨酸( 6 h i ，通过o m p c 展示于e c o l i 表面，同一条件下检测，重 组菌对重金属吸附能力提高( x u 等，1 9 9 9 ) 。 2 植物螯合素( p h y t o e h e l a t i n sp c ) 植物螯合素是植物和真菌中天然存在的一类金属结合肽，含( g l u - c y s ) 2 - u g l y 结构，结合重金属能力比m t 强。实验证明p c 的保守结构( g l u - c y s ) 。g l y 与p c 具有相似的结合能力。将合成的p c ( 1 i pe c ) 展示于莫拉菌( m o r a x e l l as p ) 细胞表面， 重组菌对汞的吸附能力提高1 0 倍。表面分别展示有( g l u - c y s ) n g l y 【e c 8 ( n = 8 ) ， e c l l ( n = 1 1 ) ，e c 2 0 ( n = 2 0 ) 】e c o l i ，对重金属的吸附量分别达1 8 和6 0n m o l m g 细 胞干重。作为对比，还构建了m b p - e c 2 0 表达系统( m b pm a l t o s e - b i n d i n gp r o t e i n 麦 芽糖结合蛋白) ，结果表明该重组菌周质空间中c d 2 + 的富集量高于含有m t 的重组菌 ( b a e 等，2 0 0 2 ) 。将来源于a t h a l i a n a 的p c 转化入m e s o r b i d o p s i ss p 中表达，重组 菌对c d 2 + 的结合能力提高了9 1 9 倍( s f i p r a n g 等，2 0 0 3 ) 。 3 金属硫蛋白 金属硫蛋白富含半胱氨酸，对c d 、z n 、c u 有很高的亲和力。m t 对金属的吸 附能力并不能简单的认为是金属与m t 的结合，它还通过某些方式促进了细胞表面 其它结构与金属离子的结合，并通过对环境中生理生化过程的影响协同作用于该过 程。将小鼠m t 展示于富养罗尔斯通氏菌( r a l s t o n i ae u t r o p h a ) c h 3 4 表面，重组菌对 c d 2 + 吸附能力提高，释放重组菌于被c d 2 + 污染的土壤中，缓解了c d 2 + 对烟草的毒害， 促进了烟草的生长( 、，a l l s 等，2 0 0 0 ) 。 4 随机多肽库筛选 金属结合肽对重金属的结合缺乏专一性，限制了其在特定重金属污染领域的应 用。为提高工程菌对重金属的吸附能力，人们往往对靶蛋白进行改造。运用p s ，3 0 0 图像显示仪及计算机h y d r a 程序，对m t 分子进行改造。通过对m t a - a 结构域突 变体功能的研究发现m t a 2 结构域具有独立性，m t 抗自由基的活性中心可能存在 于a 2 域，且两结构域间的连接区对整个蛋白质功能行使起重要作用( 杨志伟等， 1 9 9 5 ) 。 通过体外筛选得到比天然金属结合肽具更强生物学功能的突变体，用于环境污 染修复，将具有重要意义。随机肽库展示技术是利用基因工程手段将合成的一组一 定长度的随机寡核苷酸片段与表面蛋白基因融合后克隆到特定的表达载体中，使其 表达产物以融合蛋白的形式展示在微生物细胞表面。每个细胞只展示其中一种多肽 序列，因此库容量极大，易于筛选与扩增，通过筛选可得到与靶分子特异性结合的 多肽。利用定点突变技术将金属硫蛋白的3 3 位半胱氨酸突变为蛋氨酸以研究金属硫 蛋白保守结构域功能，他们发现4 位天冬氨酸突变为半胱氨酸的突变体对c d 2 + 吸附 能力提高( y u 等，2 0 0 2 ) 。将通过噬菌体随机六肽库筛选得到的一个六肽序列与o m p a 融合表达后展示在大肠杆菌表面，工程菌对c a 2 + 的结合能力和耐受性均增强( m 自a m 等，1 9 9 8 ) 。将随机多肽库构建于大肠杆菌的表面菌毛蛋白f i m h 粘附素上，经筛选 7 华中农业大学硕士研究生学位论文 获得了对p b 0 2 、c o o 、m n o z 、c r 2 0 3 和z n o 有较高专一结合性的多肽序列( s c h c m b r i 等，1 9 9 9 ) 。通过对源于木霉属( t r e e s e i ) 纤维素酶c e l 7 a 的c b d 中3 5 个氨基酸中 的1 1 个氨基酸位置用组合蛋白质工程的手段进行c b d 库( 库容量4 6x 1 0 8 ) 构建， 通过噬菌体展示技术筛选获得了8 个对n i 2 + 有特异吸附能力的c b d s ，然后将这8 个c b d s 分别与s p a 融合，并表达展示于山羊葡萄球菌( s a c c h a r o l y t i c u sc d r n o s u $ ) ， 工程菌对n i 2 + 的结合能力得到了不同程度的提高( w e r n e r u s 等，2 0 0 1 ) 。 应根据不同的需要选择靶蛋白，它本身的性质会影响融合蛋白的表达( s c h e m b r i ， 1 9 9 9 ) 。靶蛋白的不同会影响蛋白折叠过程及最终的三级结构，靶蛋白因氨基酸序列 疏水亲水性的不同会影响到融合蛋白的分泌效率。含有四个苯丙氨酸的靶蛋白因无 法正常分泌而得不到表达。但若将其切除或用丝氨酸替代，则能够正常表达( j o s e 等，1 9 9 6 ) 。替换靶蛋白部分氨基酸序列不失为一种好办法，但要不影响靶蛋白的正 常生理功能。 1 1 3 工程菌构建策略 把天然金属螯合蛋白或其合成酶在细胞内表达，从而提高微生物对重金属的解 毒和吸附能力。通常情况下，采用以下策略构建工程菌。 1 将靶蛋白序列插入合适表达载体中，该策略一般适用于已构建出在目的菌细 胞内可以有效表达的载体，多数为原核微生物如e c o l i 做为目的菌，已有较多种类 的表达载体，如p e t 系列、p o e x 系列表达载体，可以分别适用于不同种类e c o i l 蛋白表达的需要。外源蛋白的表达往往形成不稳定的产物，且产物鉴定纯化困难， 为了进一步提高蛋白稳定性及表达效率，可以采用融合表达的方法。它可以提高表 达产物的稳定性，方便外源蛋白检测、分离、纯化。在原核表达系统中已构建了几 种纯化外源表达产物的载体系统。谷胱甘肽转移酶( g s t ) 融合表达是一种较好的 外源蛋白纯化表达系统，外源蛋白通与谷胱甘肽的融合提高了稳定性，此外，谷 胱甘肽作为标签提高了外源蛋白纯化、鉴定的效率。常用于融合表达的标签还有多 聚组氨酸标签( h i s - t a g ) 、精氨酸标签( a r g - t a g ) 、钙调蛋白结合肽标签 ( c a l m o d u l i n - b i n d i n gp e p t i d e - t a g ) 、纤维素结合结构域标签( c e l l u l o s e - b i n d i n g d o m a i n - t a g ) 、麦芽糖结合蛋白标签( m a l t o s e - b i n d i n gp r o t e i n - l a g ) 等。 2 构建穿梭表达载体或分别适用于不同宿主的表达载体。目的基因分别在e c o l i 中扩增验证，在目的菌中表达。b a e 等将e c 2 0 与适用于e c o l i 的表达载体p i n c o p 连接，转化e c o l i 诱导表达e c 。然后，酶切获得含有i n p n c - e c 2 0 的片段，连入广宿 主穿梭表达载体p v l t 3 3 中，转化m o r a x e l l as p ，诱导表达e c 2 0 。其缺点是携带外 源目的基因的这种质粒载体进入受体细胞后容易丢失，导致外源基因丢失 ( k u h l e m e i m e r ，1 9 8 5 ：v a n ，1 9 9 0 ) 。但是可以通过选择标记经常筛选转基因菌株， 维持其相对的稳定性。此外，通过同源重组法将外源基因整合到目的菌染色体上则 8 华中农业大学硕士研究生学位论文 可实现外源基因的稳定遗传( 宋凌云等，2 0 0 1 1 。 3 利用外源基因整合平台系统。将在大肠杆菌中良好表达的金属结合肽基因序 列插入到t n 5 转座子p m 启动予下游，然后随机地插入目的菌染色体中。该系统适 于大多数革兰氏阴性菌。利用该系统，将m t 分别展示于恶臭假担胞菌( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) 、r a l s t o n i ae u t r o p h ac h 3 4 表面，重组菌对c d 2 + 的结合能力均得到提高，且 后者对高浓度c d 2 + 的耐受力增强( v a i l s ，2 0 0 0 ) 。建立基因整合平台系统是克服穿 梭表达载体在受体细胞内不能稳定维持的根本措施。根据d n a 同源重组的原理， 选择受体细胞染色体d n a 上一个合适的核苷酸序列区域作为外源基因整合的靶位， 并在基因表达盒的一侧或两侧组装与整合靶位同源的一个或两个合适d n a 片段， 构建相应的基因整合表达载体，成为一个基因整合平台系统。只要将含有外源基 因的d n a 片段插入基因表达盒的克隆位点，就有可能定位整合到受体细胞染色体 d n a 的整合靶位上，稳定地随染色体d n a 的复制而复制，并在表达盒启动子的 控制下进行有效的表达( 路延笃等，2 0 0 0 。 1 2 金属硫蛋白及其突变体 金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ，简称m r ) 是一类低分子量，富含半胱氨酸，对 c d 、z n 、c u 有很高的亲和力的蛋白质。1 9 5 7 年，m a r g o s h e s 和v a l l e e 首次从马肾 中分离得到，以后陆续在其它生物中发现，m t 广泛存在于哺乳动物，植物、真菌、 蓝细菌中也有类似蛋白。1 9 6 0 年，k a g i 和v a l l e e 首次将其提纯。m t 的合成受到重 一金属、生长因子、第二信使及各种压力、疾病等多种因素的诱导，在生物体内具有 重要的生物学意义。参与生物体的重金属解毒；微量元素存储、代谢和转运；自由 基的清除；拮抗电离辐射并对集体生长、发育、生殖、衰老、免疫、应急乃至肿瘤 发生等许多方面都具有重要作用( 茹炳根，1 9 9 1 ) 。随着对m t 研究的深入，m t 的 结构、结构与功能关系、结合金属种类以及m t 基因的表达与调控逐渐被揭示。关 于研究金属硫蛋白的国际会议也多次召开，金属硫蛋白的研究已成为生物化学、分 子生物学、医学及环境保护等领域的热门课题。 1 2 1m t 的定义和基本特性 m t 是指一种低分子量、富含半胱氨酸、类似于哺乳动物典型m t 结构的金属 结合短肽。典型的哺乳动物m t 特点如下：分子量低，一般6 - 7 k d ；金属含 量高，每分子一般含有7 1 2 个金属离子；半胱氨酸含量高，2 0 3 3 ，无二硫键、 芳香族氨基酸以及组氨酸；具有保守的半胱氨酸位置及c y s - x c y s 结构；具有 特征金属巯基化合物的光学特性两个结构域a 和b 。 金属硫蛋白种类丰富，为了避免混乱，所以采用统一的命名方式。 9 华中农业大学硕士研究生学位论文 a p o m e t a l l o t h i o n e i n 为m t 的脱金属形式，也可以称为硫蛋白( t h i o n e i n ) 。m t 前冠 以金属名称特指含有该金属的m t ，金属名称下可注以数字表示每分子m t 含有的 金属原子数目。如c d 7 m 了，表示该金属硫蛋白含有7 个镉原子。如果m t 含有多种 金属，则按照金属含量的多少，依序加在m t 名称前。如( c d s z n 2 ) - m r ，表示该 h f r 每分子含有5 个镉原子和2 个锌原子。 一些来源于植物、微生物等的金属硫蛋白，具有m t 类似的结构与性质，但是 并非完全符合上述定义，如某些生物中，其分子量可小于5 k d 或者大于1 5 k d ，c y s 含量小于1 5 或者含有芳香族氨基酸与组氨酸。故而将此类与哺乳动物差异较大的 低等动物、植物、微生物等生物体中的一些金属结合小肽命名为“类m r 屯戈“金属结 合硫肽”( m e t a l - - t h i o l a t ep o l y p e p t i d e s ) ( k a g i ，1 9 8 7 ) 。 1 2 2m t 的分类 根据马肾m t 的典型结构，以马肾m t 一级结构作为标准，m t 分为三类( k a g i ， 1 9 8 4 ) 。 。 第一类：多肽链中的c y s 的位置与马肾m t 中c y s 位置一致，m t 由位于氨基 端和羧基端的两个c y s 丰富区和中间的分割区构成，它们是由基因编码的单体蛋白。 多数哺乳动物的m t 属于此类，如鼠m t 、猴m t 。此类又可以分为四个类型：m t - i 、 m t - h 存在于所有组织中，m t - m 主要存在于脑中和m t - i v 存在于多数哺乳动物的 层状和磷质表皮细胞组织( e b a d i ，1 9 9 5 ) 。近年来，从脑组织中发现了类由6 8 个 氨基酸组成的富含c y s 的金属结合蛋白，结构上与m t 高度同源，功能上差异很大， 最初称之为类m t ( m t - l i k e ) ( u c h i d a ，1 9 9 1 ) ，也被成为m t - i i i 或生长抑制因子( g r o w t h i n h i b a t ef a c t o r ，g i f ) ( u c h i d a ， 1 9 9 3 ) 。m t - l i k e 和许多疾病的发生如早老性痴呆症 ( a l z h e i m e r sd i e a s e ，a d ) 关系密切。 第二类：低分子量，富含c y s 的金属结合蛋白，其肽链中c y s 的位置与哺乳动 物相似，却不同于哺乳动物m t ，此类m t 不具有哺乳动物m t 保守的半胱氨酸位 置，c y s 残基散布于整个蛋白质序列中。它们也是由基因编码的单体蛋白。如蓝细 菌m t 、酵母m t 和小麦胚中存在的m t - e c 蛋白( e a r l yc y s 1 a b e l l e dp r o t e i n ) ( k a w a s h i m a ，1 9 9 2 ) 。e e 蛋白由8 1 个氨基酸组成，含有1 7 个c y s ，其中1 4 个参 与c y s - x - c y s 基元形成。 第三类：非典型非直接基因产物的m t ，也称为类m t ( m t - l i k e ) 、金属硫肽 ( m e t a l - t h i o l a t ep o l y p e p t i d e s ) 或重金属结合体。第三类m t 由酶催化合成的长度不 同的肽链。主要存在于植物中，因此又被称为植物络合肽( p h y t o c h e l a t i n s ，简称p c s ) 。 1 0 华中农业大学硕士研究生学位论文 1 2 3 m t 的性质 1 可诱导性：m t 的最大特点是可诱导性，其基因上游存在着可诱导的增强子。 哺乳动物的m t 可由许多因素诱导，例如过剩的内源因子如激素、第二信使、生长 因子、过量的金属，如镉( c d ) 、锌( z n ) 、铜( c u ) 、汞( l 曲、金( a u ) 、银( a g ) 、镍0 哪) 等不同形式的压力等。真菌、蓝细菌及植物中均发现了可诱导现象。 可诱导性是在基因转录水平上的初级调控。现己掌握了动物和真菌m t 基因的 顺式作用金属调控元件( t h i e l e ，1 9 9 2 ) ，而且p a l m i t e r 等人率先报道了应用这些元件 控制外源基因在转基因动物中的表达，并得到了广泛的认证。反式作用金属反应元 件也已被鉴定和纯化( l a b b e , 1 9 9 1 ) ，而且分别克隆得到了动物和蓝细菌的这类元件， 并在酵母中进行了克隆表达和特性研究( l a b b e ，1 9 9 3 ) 。 2 金属结合特性：大量实验证明m t 的积累与金属离子浓度的提高有关，并与这 些离子的结合相关，这说明了m t 在过量重金属的解毒方面的作用。删除m t 基因 后，在真菌细胞和原核细胞中观察到了细胞对提高痕量金属浓度的超敏感性 ( h y p e r s e n s i t i v i t y ) 。同时在动物、真菌及原核细胞中观察到了m t 基因的放大现象 ( a m p l i f i c a t i o n ) 。使之对特定痕量金属离子抵抗能力大大增强。蓝细菌在m t 位置的 突变缺失体s m t ，表现出对过量z n 2 + 、c d 2 + 抗性的降低，在z n 2 + 代谢及c d 2 + 的解毒 反应中丧失作用。 ” 3 抗氧化特性：在中国仓鼠( c h o ) 细胞内表达m t 的反义结构( a n t i s e n s e s t r u c t u r e ) ，结果表明随着细胞内m t 表达水平的提高，因氧化压力诱导引起的d n a 链的断裂被减轻。说明b i t 具有抗氧化的作用。 1 2 4m t 的功能 金属硫蛋白结构保守，分布广泛，在机体内有重要的生物学功能。 1 重金属结合能力 金属硫蛋白保守的半胱氨酸位置及c y s - x - c y s 结构，可以有效的络合重金属， 其中结构域a 含有1 1 个半胱氨酸，可以络合4 个镉原子，结构域b 含有9 个半胱氨 酸，可以络合3 个镉原子。定点突变其中的半胱氨酸为组氨酸，可以降低金属硫蛋 白的重金属结合能力( m a r c ，2 0 0 1 ) 。 2 重金属解毒 由于金属硫蛋白的金属结合能力，生物体通过合成金属硫蛋白降低重金属对自 身的损害。在人工培养的哺乳动物细胞株中，金属硫蛋白基因的大量扩增可以产生 过量的金属硫蛋白分子，从而使其具备对c d 的较高抗性。但是含c d 金属硫蛋白又 被认为是造成长期c d 毒性中对肾脏造成损伤的一个诱发性因素。参与激素和发育 华中农业大学硕士研究生学位论文 过程的调节，增强机体对各种应激的反应。 3 参与必需微量元素的储存、运输和代谢 m t 具有很强的金属离子结合能力，而微量元素大多数是金属元素，使之能充 当c u 和z n 等必需微量元素的储存蛋白，以满足机体的需要。m t 对小肠c u 和z n 的吸收具有调节作用，小肠m t 的水平与c u 和z n 的吸收呈反比：肝脏中m t ，控 制着z n 的摄取和积累，限制z n 的摄入，不能促进z n - m t 合成，而且使z n 从m t 中释放出来。体外实验表明，勐和c u - m t 对许多辅酶有激活作用。将锌指蛋白转 录因子s p l 与脱金属硫蛋白( a p o - m t ) 共同保温，z n 会脱离转录因子而结合到a p o - m t 上形成z n - m t 。 1 2 5m t 的结构 迄今为止，发现的真核微生物中的m t 只含有单一的金属结合域，低等动物如 甲壳类的蟹中，m t 具有2 个b 结构域，而a 结构域则出现在较高等的动物中，果 蝇是动物m t 基因家族中唯一与其他成员没有同源性的例子，只有一个结构域。 哺乳动物m t6 7k d ，一级结构最显著的特点是富含c y s ，且c y s 具有保守性 ( 图1 所示) 。通过圆二色和晶体结构研究发现，m t 分予中不含q 螺旋和8 折叠片， 而存在一种十分坚固的构象，因此它具有很强的抗热性和抵抗蛋白酶消化的能力。 三级结构为哑铃型结构，具有两个结构域，其羧基端3 0 一6 l 位氨基酸为结构域， 氨基端1 - 2 9 位为p 结构域，a 结构域与p 结构域呈彼此独立的球形结构，通过中间 连接区使整个分子呈哑铃型。晶体结构分析表明，为了更适于结合金属，多肽链盘 绕着金属离子而各形成三个回折。a 结构域含有1 1 个c y s 残基结合4 个z n 或者c d ( 如图2 所示) ，或者5 - 6 个c u ；8 结构域含有9 个c y s 残基，结合3 个z n 或者c d ， 或者5 - 6 个c u ( 如图3 所示) 。 m d p n c s c s l g g s c k s s c a c i ( n c k c t s c k 571 3 1 51 92 12 42 6 2 9 k s c c s c c p 、，g c s 隧o 金g c v c 的g a a d 婚 r c c a 3 33 43 63 74 14 44 85 。5 75 9 6 0 图1 哺乳动物金属硫蛋白一级结构及金属结合位点 f i g 1t h ep r i m a r ys t r u c t u r eo fm a m m a l i a nm t a n di t sm e t a lb i n d i n gs i t e s 华中农业大学硕士研究生学位论文 图2 哺乳动物金属硫蛋白结构域及镉结合位点 f 培2s t r u c t u r eo fm a m m a l i a nm t n d o m a i na n dt h ec d - b m d i n gs i t e s 图3 哺乳动物金属硫蛋白p 结构域 f i g 3s t r u c t u r eo fm a m m a l i a nm t pd o m a i n 1 2 6m t 金属结合特性及其突变体 m t 对不同金属离子的亲和力不同。其稳定性次序为：h g ，a g c u c d z n 。 而且m t 的两个结构域对不同金属离子的亲和力也存在差异，它们对c d 的络合常 数相差1 0 0 0 倍，c d 优先结合于a 结构域，然后才结合b 结构域；但是它们与c u 、 z n 的结合恰恰相反。若把c d t - m t 和z n 7 m t 混合，则c d 从的c d 7 - m t 的p 结构 域向z n t - m t 的a 结构域转移，取代下来的z n 7 - m t 的a 结构域中的z n 向c d 7 - m t 的1 3 结构转移。由此可见，m t 对金属的结合是可逆而迅速的，且两个结构域在结 构和功能上具有相对独立性。基于这一特点，本实验构建了。结构域突变体，并对 1 3 华中农业大学硕士研究生学位论文 单独表达的n 结构域及表达有a 结构域串连突变体的工程菌进行了研究。 1 2 7 串连多聚体构建 在不破坏多肽空间构象的前提下，有目的的串连表达重金属结合多肽，从而可 以获得更强重金属结合能力的蛋白质。将六聚组氨酸通过l a m b 展示于e c o f i 表面， 重组菌的重金属吸附能力提高了l o 倍( s o u s a 等，1 9 9 7 ) 。通过o m p c 在e c o l i 表 面分别展示( h i s ) 6 与( i - i i s ) n ，发现两者对重金属吸附能力比野生型提高，且后者提高 倍数高于前者( c r u z 等，2 0 0 0 ) 。将( 6 h i s h 、( 6 h i s ) 2 、( 6 h i s ) 3 、( 6 h i s ) 6 、( 6 h i s ) 1 2 ( 6 h i s h s ，通过o m p c 展示于e c o l i 表面，同一条件下检测，重组茵对重金属吸附能 力依次提高( x u 等，1 9 9 9 ) 。将来源于粗糙脉胞霉( n e u r o s p o r ac f t b $ a ) 的m t 串 连体在e c o l i 中表达，重组菌对c d 2 + 的吸附能力提高6 5 倍( m a u r o 等，2 0 0 0 ) 。将 酵母金属硫蛋白( y m t ) 串连体在酵母表面展示表达，结果显示，四聚体重金属 吸附能力提高5 9 倍，八聚体提高8 7 倍( k u r o d 等，2 0 0 6 ) 。 1 3 研究目的及意义 如前所述，开发对重金属具有超强抗性和积累能力的微生物是解决重金属环境 污染的一种很有途的方法。但是，在污染环境中对重金属具有高抗性和高积累能力 的微生物对于正常环境的适应能力下降，它们的生长率低。而对自然界中那些生长 良好并具有高生物量的微生物，由于它们具有较低的重金属富集能力和抗性，也不 适合用在环境治理方面。于是人们就尝试对微生物进行遗传改造，使其兼具两种特 性。 哺乳动物金属硫蛋白从基因到蛋白质高级结构的研究已经相当深入，实验证明 该蛋白能和重金属( 尤其是c d ，t 4 9 ，z n ) 特异地、稳定地结合，起到解毒的作用。 利用基因工程的方法，人们已将哺乳动物m t 基因克隆到微生物细胞内，使工程菌 获得了对重金属的抗性。串连表达m 仇结构域，可以提高工程菌对镉吸附能力和特 异性，从而运用于环境重金属污染修复领域。 基于猴金属硫蛋白两个结构域在结构和功能上具有相对独立性，本实验计划构 建