（环境工程专业论文）重金属胁迫下海州香薷根际微域细菌群落结构和特异基因表达研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 植物根系及根际微生物的共同作用可以改变根际环境，影响土壤重金属的 生物有效性。合理调控植物根系生长及根际微生物群落结构，可以提高土壤重 金属污染生态修复( 尤其是植物提取) 的效率。根际微域是植物根系与土壤和 微生物作用最活跃的区域，也是根系对重金属最敏感的区域。因此，研究重金 属胁迫下根际微域土壤的微生物生态，有助于阐明污染胁迫下微生物植物的相 互作用机制。本论文以海州香薷为研究对象，采集浙江富阳铜冶炼厂周边重金 属污染土壤和未污染土壤，利用根际箱培养海州香薷。海州香薷在温室中生长 一段时间后，采集沿根系的不同根际微域土壤样品，采用原子吸收结合聚合酶 链式反应变性梯度凝胶电泳( p c r - d g g e ) 、分子克隆等现代分子生物学技 术，分析了植物根际微域的重金属形态和可溶性有机碳、根际不同微域的细菌 群落结构以及不同微域细菌运动基因和趋化基因的表达量。主要研究结论如 下： ( 1 ) 重金属的形态分析表明根际各微域土壤中总铜的含量显著低于未种植 物的对照土壤。根际不同微域各形态的铜含量存在差异，其中可交换态铜以成 熟区最高，为4 2 4m k g 。根际土壤中可交换态、碳酸盐结合态和铁锰氧化物 结合态的铜占总铜的比例均高于未种植物的对照土壤。其中以距根基部l c m 的 区域比例最高，约占总铜含量的8 1 7 ，而对照土壤中这三种形态的铜仅占总 铜的5 0 ，故距根基部1 c m 区域重金属潜在的生物有效性最高。 ( 2 ) 由于根系各生长区域的生长特征及其与周围土壤颗粒和根际微生物的 作用时间不同，根际微域土壤中d o c 的含量也不同。污染土壤中以距根基部 l c m 的区域含量最高，为4 7 1 1 0m g k g ；未污染土壤中以分生区最高，为 4 4 8 4 6m 姆，且从分生区到距根基部l c m 的区域d o c 含量逐渐降低。d o c 含 量的差异必然影响根际微域的细菌群落结构。 ( 3 ) d g g e 图谱s h a m o n 指数分析显示两种土壤中根际不同微域细菌的 s h 锄o n 指数从分生区到距根基部1 c m 的区域均呈下降趋势，细菌多样性降 低。s h a 彻o n 指数的变化与土壤中d o c 的含量具有一定的相关性。d g g e 图谱 主成分分析表明分生区、伸长区和成熟区的细菌群落结构特征较为接近，而与 距根基部1 锄区域的差异较大。 浙江大学硕士学位论文 ( 4 ) 对两种土壤d g g e 图谱中的特异性条带进行了克隆和测序鉴定发现 变形菌门( m 纪d 6 砌砌) 和放线菌门( 么甜砌d 6 口c 纪，砌) 是海州香薷根际主要 的细菌种群，且未污染土壤中克隆条带所在的属更分散、更多一些。重金属胁 迫使得异常球菌栖热菌门( 眈切d c d 钾螂砀p 门竹淞) 、酸杆菌门 ( 么c f 咖6 口c 据，蛔) 中的g p l 属等细菌种群在海州香薷根际消失，同时也诱导了 厚壁菌门( 砌聊f c 砒s ) 等另外一些菌属在污染土壤海州香薷根际的形成。 ( 5 ) 利用r t - p c r 技术分析了土壤中细菌运动基因( n i c ) 和趋化基因 ( c h e a ) 的拷贝数。细菌鞭毛可以响应根际微环境的改变，致使根际不同微域n i c 的拷贝数存在差异，根际各微域运动基因拷贝数的变化是其响应外界环境的一 种方式。两种土壤中根际各微域c h e a 的拷贝数均高于未种植物的对照土壤， 且均以分生区最高。根际不同微域c h e a 的拷贝数与d o c 含量有一定的相关 性，可溶性有机碳是细菌运动的重要趋化因子之一 关键词：根际；重金属有效性；可溶性有机碳；细菌群落结构；运动性；趋化 性 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ec o m b i n e de 虢c t so fr o o t sa n dm i c r o o 玛撕s m sc 觚c h a n g et 1 1 er h i z o s p h e r e e n v i r o n m e n t ，a 1 1 dt h 朗拥f e c tn l eb i o a v a i l a b i l i t ) ，o fh e a v ym e t a l 址s o i l r e a s o n a b l e r e g u l a t i o no f r o o t sa n dm i c r o b i a lc o m m 啪i t y 鳓m c t u r ei f lt h er h i z o s p h e r ec a ni m p r o v e t h ee 伍c i e n c yo fe c o l o 百c a lr e s t o r a t i o n r l l i z o s p h e r ei st h em o s ta c t i v cr e g i o no ft h e i n t e r a c t i o nb e 锕e e nr o o t sa n dm i c r o o r g “s m s 锄dt h em o s ts e n s i t i v er e g i o nt oh e a v y m e t a l t h e r e f o r e ，e x p l o r i n gt h em i c r o b i a le c o l o g yo fs o i la r o u l l dr o 吣u n d c rh e a v y m e t a ls 缸e s s 、) 、，i uc o m r i b u t et 0h e l pc l 撕匆t h em e c h a l l i s m sb e t 、e e nm i c r o o 略a n i s m s a i l dp l a n t s 胁办d 舷砌妒跆刀如 绍w 邪u s e di i lt h j ss t u d y ，p o l l u t e da u l d 啪p o l l u t e ds o i l s w e r ec o l l e c t c df b mt h eh e a v y m e t a l - c o m 锄i n a t e dr e 舀o nn e a rac o p p e rs m e l t e ri n f u y a n gc 订yo fz h e j i a n gp r o v i n c e s o i ls a m p l e sa r o u l l dd i 侬- r e mr h j z o s p h e r ez o n e s o f e 印跆砒珊w e r ec o l l e c t e df o rt l l e 锄a l y s i so ft t l es p e c i a t i o no fh e a v ym e t a l ， d i s s o l v e do 昭a n i cc a r b o n ( d o c ) ，b a c t e r i a lc 伽m u m 够s 饥咖a n dt h es p e c i f i cg e n e e x p r e s s i o n p o l y m e r 硒ec h a i nr e a c t i o n - d e n a n l r i n gg r a d i e n tg e le l e c 仃o p h o r e s i s ( p c r - d g g e ) ，m o l e c u l a rc l o n i n g 锄dr e a lt i m e - p o l y m e r 邪ec h a i nr e a c t i o n ( i m p c r ) w e r e u s e dt 0 e x p l o 陀t h ee f f b c t so fh e a v ym e t a lp o l l u t i o no ni i l i c r o b i a le c o l o g yi n r h i z o s p h e r e t h em a i nc o n c l u s i o n sw e r e 硒f o l l o 、v s ： ( 1 ) hp o l l u t c ds o i l ，恤c o n t e mo ft 0 诅lc ui nt h er h j z o s p h e r ew 髂s i 鲥f i c 枷l y l o w e rt h a nt h a ti nt h ec o n t m ls o i l t h es p e c i a t i o no fc ui i ld i f f e r e n tz o n e sw 嬲v a r i o u s m a n 鹏z o n eh a dt i l el l i g h e s tc o n t e n to fe x c h a n g e a b l ec ui no u rs t u d y ，w l l i c hw 嬲4 2 4 m g 瓜g t h ep e r c e n t a g eo fe x c h a n g e a b l e ，b 0 岫dt oc 砒o n a t e s 锄db o u n dt 0f e m n o ) 【i d c st 0t o t a lc ui i lt h er h i z o s p h e r ew a sk g h e rt h a nt h a ti nt h ec o m r o ls o i l ，锄dt h e z o n ef 幻mt h ei n t e r f a c eo fr o o ta n ds t e m1 c mh a dt h eh i g h e s tp e r c e n t a g e ，w m c hw 豁 u pt o8 1 7 b u tt h ep e r c e n t a 萨i nc o n n 0 ls o i lw 豁j u s ta b o u t5 0 s o 吐屺z o n e 舶m t h ei m e r f 沁eo fr o o ta n ds t e mlc mh a dt h es 仃o n g e s tp o t e n t i a lb i o a v a i l d b i l i t yo fh e a v y m e t a l ( 2 ) p l a l l t 印、) r t hi n c r e 嬲e dt i l ec o n t e n to fd o c i nr h j z o s p h e 溉1 kz o m 舶mt l 圮 m r e l c eo fr 0 0 t 柚ds 白哪! c mh a dt h ei l i 曲e s tc o m e n to fd o ci np o l l m e ds o i l ，w h i c h w 邪u pt 04 7 1 0m g l ( g h o w e v e r ，m e r i s t e m a t i cz o n ew a sm el l i 曲e s t z o n ei n 浙江大学硕士学位论文 u n p o l l u t e ds o i l ，锄dt h ec o n t e n to fd o cd e c r e a s e d 删砌l y 觚mm e r i s t e m a t i cz o 鹏 t 0t h ez o mo nt h ei i l t e r f 犯eo fr 0 0 t 锄ds t e m1 c m t h ed i 岱：r e n c ei 芏ld o cc o m e n t 、v o u l da a 宅c tm i c b i a lc o m m u n i 哆s m j c t u r eo ft h er h j z o s p h e r e ( 3 ) f r o mm e r i s t 锄a t i cz o n et 0t h ez o n e 丘o mt h ei n t e r f 砬eo f r o o t 锄ds t e ml c m ， 圮s h 锄n o nd i v e r s 姆i n d e xs h o w e dad 0 1 w 硼仃e n db o t hi n p o l l u t e da n d u n p o l l u t e ds o i l ，w l l i c hi n d i c a t e dt h a tb a c t e r i a lc o m m u n i t ) ，d i v e r s i 够d e c l i n e d c h a n g e s i nb a c t e r i a lc o m m u n i t ) ，d i v e r s i 谚w e r er e l e v a n tt ot h ec o m e mo fd o c p r i n c i p a l c o m p o n e ma n a l y s i s ( p c ：a ) r e s “t ss h o w e dm a tb a c t e r i a lc o m m u i l i t ) ，s t r u c t u r ci n “z o s p h e r ew 雒s i 鲥f i c a n t l yd i 船r e n t 劬mc o m r o ls o i l m o r e ，t h ez o n e 舶m m ei n t e r f a c eo fr o o ta n ds t e m1c mw 嬲a l s os e p 撇t e df b mo t h e rz o n e s ( 4 ) c l o n e 锄ds e q u e n c eo ft h es p e c i f i cb 锄d so nt h ed g g eg e ls h o w e dt h a t p 加纪d 6 础钯，蛔锄d 口c f 加d 6 叩纪，砌w e r et h ei m p o n a l l tb a c t e r i a l 乎- o u p s c o m p a r e dt 0 p o l l u t e ds o i l ，t l l eb a c t e r i a ls p e c i e si i l 1 p o l l u t e ds o i l w e r em o r ed i s p e r s e d s o m e s p e c i e sd i s 印p e a r e du i l d e rh e a v ym e t a ls n e s s ，s u c h 嬲眈加d 淞- z 阮，m 淞a i l dg p 1 o f 4 c f 如6 叩f p ，砌；a tt h es 锄et i m e ，胁耙甜纪sa n ds o m eo t h e rb a c t e r i 以s p e c i e sw e r e 南u i l di nd l i z o s p h e r eo fe 印膪刀沈溉 ( 5 )w e柚a l y z e d 也ee x p r e s s i o no fe n c o d e dp r o t e i nf l a g e l l i n ( n i c )锄d c h e m 酏a x i sg e 船( c h e a ) i i lr h i z o s p h e r eo fe 妒跆刀沈邶u s i n gr t - p c r t h ed i f j f e r e l l c e i nc o p yn 啪b e ro fn i cb e t 、e e nd i 仃e r e mr h i z o s p h e r ez o n e sw 邪aw a yi n 、h i c h b a c t e r i a lr e s p o n d e dt 0e x t e 眦le n v i r o 砌e n t t h em e r i s t e m a t i cz o n eh a dt h el a r g e s t c o p yn u m b e ro fc h e ab o m i i lp o l l u t e da 1 1 du 1 1 p o l l u t e ds o i l t h ec o p yn u m b e ro fc h e a w a sr e l e v a n tt o 协ec o n t e n to fd o ct t l a tw a sa ni m p o r t a i l tc h e m o a t t r a c t a i l t 内r b a c t e r i a lm o v e m e n t k e ) 啊o r d s ：r 1 1 i z o s p h e r e ；h ea _ v ym e t a lb i o a v a i l a b i l i t ) ，；d i s s o l v e do 略a m cc a r b o n ； b a c t e r i a lc o m m 硼d t ys 仃u 曲肛e ；m o t i l i 够；c h e m o t a x i s 致谢 本论文是在导师施积炎教授的悉心指导和严格要求下完成的。恩师渊壤的 专业知识、严谨的治学态度、忘我的工作热情对我影响深远! 恩师所提供的良 好的科研条件和宽松自由的学术氛围，使我在学术方面得到了提高与锻炼。特 别是当我面对各种困难时，您始终给予我最大的鼓励与支持，循循善诱，使我 在求学道路上不断进步。本论文从选题、实验方案的设计与实施、以及论文撰 写与修改，每一步都倾注了恩师大量的心血和精力。在此，谨向恩师致以崇高 的敬意和最衷心的感谢! 感谢浙江大学环境保护研究所陈英旭教授、吴伟祥教授、林琦副教授、楼 莉萍副教授、王飞儿副教授、陈新才副教授、沈超峰副教授、梁新强副教授、 李文红老师、段壮芹老师、黄荣浪老师等在科研工作和学习生活中给予的指 导、关心和帮助。感谢浙江中医药大学生命科学学院袁晓凤副教授、浙江大学 国际纳米研究院洪旭涛老师在实验开展过程中所给予的指导和帮助，在此表示 衷心的感谢! 感谢实验中给予我无私帮助的于明革、张娴、李锋、吕豪豪、秦智慧、林 惠荣、申开丽、唐先进、杨建军、陈光村、陈蕾、梁芳、龙冬艳、刘晶静、刘 婷婷、李伟、龙碧波、余昱薇、杨远强、段德超、王莹莹、刘国防、余华东、 杨悦、李鑫、彭程、朱神海、吴一鸣、徐辰、陈玲桂、张曦、陈晨、崔静岚、 宋婕、张海、李若冰以及环保所的师兄师姐、师弟师妹们! 感谢好朋友姚静华、李英、苏苗苗、俞丹萍、戚韩英、张蕊、夏芳芳、徐 倩、仝瑞青、任文、赵莉莉、周石仙、刘璞和你们一起度过的美好时光令我 终生难忘! 衷心的感谢我的父母和亲人。在我多年的求学过程中，你们在物质和精神 上给予了我最无私的支持与帮助! 在此，谨以此篇献给所有关心、支持、帮助 我的人! 栾静 二零一二年一月于浙大紫金港 第一。章绪论 第一章绪论 1 1 引言 土壤是人类赖以生存的自然环境和农业生产活动的重要资源。但随着环境污染 和生态破坏日益严重，土壤污染已严重影响到人类的健康和生存，其中重金属污染 物对环境的影响和破坏作用尤为突出。据不完全统计，目前我国受重金属污染的耕 地面积近2 0 0 0 万l l i i l 2 ，大约占总耕地面积的1 5 ( 姚会敏等，2 0 0 6 ) 。华南地区某 些城市有5 0 的农田遭受汞、砷等重金属污染。广州近郊因污水灌溉导致的农田 污染面积达2 7 0 0 胁2 ，含有污染物的底泥的施用而造成的污染农田面积约1 3 3 3 l m l 2 ，污染农田面积占郊区总耕地面积的4 6 ( 戴军等，1 9 9 5 ) 。近年来，北京市 通惠河灌区土壤铅含量有所升高，凉水河灌区的锌、汞、镉等重金属含量也明显上 升。长期的污水灌溉已经引起了粮食等农作物中重金属镉浓度的累积，局部地区蔬 菜中的重金属含量超标( 朱桂珍，2 0 0 5 ) 。重金属是一类毒性比较大、且具潜在危 害性的无机污染物，可以在土壤和生物体内富集。相比于大气和水体中的重金属污 染物，土壤重金属污染具有隐蔽性、滞后性、累积性、较难治理和治理周期长、毒 性较大且容易被生物吸收的特点。重金属污染不仅导致土壤的退化、农作物产量和 质量的下降，而且还可以通过直接接触、食物链等途径危及人类和动物的生命健 康。传统的重金属污染土壤的治理方法成本较高，且对环境的扰动较大，近年来， 关于土壤重金属污染的生物修复技术的研究越来越多。生物修复主要包括植物修 复、微生物修复以及微生物植物的联合修复。微生物是土壤中生物类群最多、生 物量最大、对土壤生态系统的元素循环及土壤肥力影响最大的类群。据估计土壤中 仅原核生物的数量约有2 6 1 0 2 6 个细胞，其含有的n 、p 元素与陆生植物相当 ( 闵航，1 9 9 9 ) ，而全球的细菌种类数可达1 0 5 0 万之多( 东秀珠等，2 0 0 1 ) 丰富 的微生物种类不仅是维持正常土壤生态系统的重要因素，而且其多样性的变化还可 以作为土壤质量监测的敏感指标( 王远鹏，2 0 0 5 ) 。因此，研究重金属污染情况下 土壤的微生物生态具有重要意义，为土壤污染的生态修复提供科学依据。 浙江大学硕士学位论文 1 2 污染土壤重金属与微生物的相互作用研究进展 1 2 1 土壤重金属的形态及其生物有效性 有关土壤重金属的形态研究最早起源于化学形态的研究。化学形态通常可分为 三类：第一类是传统的化学形态，也就是含有目标元素的化合物以及目标元素的氧 化态；第二类是功能化学态，它可以反映目标元素所具有的功能或是行为；第三类 是操作上定义的形态，它根据提取样品所采用的试剂来定义的( u r c ，1 9 9 1 ) 。 土壤是由各种土壤矿物质、有机质以及土壤微生物等组成的一个多相复杂体 系，因此土壤重金属的形态比较复杂，在实际环境中很难以纯化合物的形式存在， 所以通常以功能化学态和操作上定义的形态对重金属加以表征( 杨建军，2 0 1 1 ) 。 在一定程度上，操作定义上的形态可以反映重金属元素与各固相组分的结合形态， 并用来评估土壤重金属潜在的迁移性和生物有效性。一般而言，操作上定义的重金 属形态主要包括可交换态( e x c ) 、碳酸盐结合态( c a r ) ，铁锰氧化物结合态 ( o x i ) 、有机结合态( 0 r g ) 、无形态铁结合态( a m o ) 、晶体结合态 ( c r y ) 以及残渣态( i 也s ) ，且从可交换态到残渣态，重金属的迁移性和生物有 效性逐渐降低( f i l g i l e 妇se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 土壤重金属形态分析常用的化学方法包括一步提取法和顺序提取法。一步提取 法是利用一种或几种提取试剂一次性提取土壤中的目标重金属元素，该方法主要用 于污染土壤重金属的短期迁移性和生物有效性的评价，以及污染土壤中的重金属对 农产品和地下水污染风险的评估( r a oe ta 1 ，2 0 0 8 ) 。一步提取法所使用的提取试剂主 要包括无机盐的提取剂和有机络合物的提取剂，但由于无机盐提取试剂不能对植物 吸收有机结合态重金属的过程进行有效的模拟，而土壤中的有些重金属元素绝大部 分以有机络合物的形态存在，因此无机盐提取试剂的应用具有一定的局限性；然而 有机络合物试剂对重金属的络合能力比较强，除无机矿物质吸附态的重金属外，还 可以络合非溶解性的有机结合态重金属，从而使得有机提取试剂的应用较为广泛 ( 杨建军，2 0 1 1 ) 。顺序提取法是根据土壤中各化学组分可以结合的重金属元素， 选用强度不同的提取试剂，采用逐级连续提取的方法使之分离，进而确定与土壤中 不同固相组分结合的重金属元素的含量，顺序提取法可以对土壤中重金属元素的长 2 第一章绪论 期释放能力以及环境风险进行评估( f i l g u e i r a se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。自从t e s s i e r 等人 ( 1 9 7 9 ) 采用顺序提取法研究了沉积物中重金属的形态分布以及这种形态差异对水 质的潜在影响后，该方法己被广泛的应用于土壤中重金属的形态分布研究根据连 续提取过程使用的提取试剂的强度以及土壤中不同固相组分之间的反应，将重金属 的化学形态分为可交换态( e x c ) 、碳酸盐结合态( c a r ) 、铁锰氧化物结合态 ( o x i ) 、有机结合态( o r g ) 以及残渣态( r e s ) ( t e s s i e re ta 1 ，1 9 7 9 ) 。 生物有效性( b i o a v a i l a b i l 时) 这个概念最早主要应用于毒理学和农业科学领 域，尤其是在农产品的安全、环境风险评估以及场地修复等方面具有重要的作用 ( e h l e r s & l u t h y ，2 0 0 3 ) 。生物有效性的定义在不同学科领域有所不同。环境学领域 的生物有效性主要指土壤所吸附的污染物质能被生物吸收利用或是产生毒效应的程 度( 陈英旭，2 0 0 8 ) 一般而言，生物有效性是指土壤中的重金属元素和疏水性有 机污染物可以被生物体吸收的程度，重金属的生物有效性通常取决于两个因素：一 方面决定于化学物质从土壤迁移到活体细胞的速率；另一方面受吸收和代谢速率的 制约( 戴树桂，2 0 0 5 ) 。2 0 0 3 年美国研究顾问委员会( u s n r c ) 把污染物对生物 体的作用过程概括为以下几个步骤：( a ) 土壤或沉积物中的固相结合态污染物质 的释放；( b ) 溶解性的污染物质向生物体内迁移；( c ) 颗粒态污染物质向生物体 的迁移；( d ) 污染物在生物膜表面发生的跨膜过程；( e ) 污染物对生物体内靶器 官产生的毒害作用。由于e 过程与土壤和沉积物质的关联性较小，所以生物有效性 主要包括a 、b 、c 、d 四个过程( e h l e r s & l u t l l y ，2 0 0 3 ) 。 圈 图1 1 生物有效性过程( e h l e 璐锄dl u t l i y ，2 0 0 3 ；戴树桂，2 0 0 5 ) f 谵1 11 1 1 ei l l 删旺a t i o f 即c e s s t t l eb i o a v a i l a b i l 时 土壤中重金属的生物有效性主要取决于土壤中重金属的总量及其赋存形态 ( f i l g u e i r a se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。一定程度上，重金属的总量决定了土壤中各化学形态重金 浙江大学硕士学位论文 属的含量，尤其是有效态重金属元素的含量。通常情况下，重金属元素的总量越 高，其生物有效性也相应的较高，所以重金属的总量长期被作为重金属污染土壤的 污染风险评估和环境质量评价的指标。然而，越来越多的研究发现不同形态的重金 属元素的生物有效性显著不同，因此重金属的化学形态在很大程度上决定了土壤中 重金属的生物有效性。研究表明，水溶态重金属的生物有效性最高，其主要以离子 形态和溶解性有机络合形态存在；而铁锰氧化物结合态重金属的生物有效性较低， 只有在适宜的氧化还原电位下才能被释放；而残渣态很难在环境扰动下释放，它主 要存在于土壤矿物晶格中，故而基本不具生物有效性( t e s s i e re ta 1 ，1 9 7 9 ) 。 因此， 土壤重金属化学形态的有效表征，对于土壤重金属污染的环境风险评价具有重要的 意义。 1 2 2 重佥属污染对土壤微生物及酶活性的影响 土壤微生物活性包括土壤中所有微生物( 包括真菌、细菌、放线菌、原生动 物、藻类及微小动物) 的总体代谢活性。微生物活性在维持土壤生态系统平衡方面 起着十分关键的作用。微生物种群的多样性与活性是表征土壤生态系统群落结构的 重要参数，不仅可以反映土壤环境质量的变化趋势，而且也是土壤生态系统微生物 活性的具体体现( 王远鹏，2 0 0 5 ) 当土壤受到来自于外界环境的重金属污染物的 胁迫时，微生物为了维持生存可能需要更多的能量，从而使土壤微生物的代谢活性 表现出发生不同程度的反应( 周启星，2 0 0 1 ) 。研究发现在砷矿区土壤的微生物数 量在砷胁迫下受到了显著的抑制( m a c u re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。有研究认为，在高浓度重金属 污染时，土壤中的微生物主要是利用有机碳进行能量代谢，并释放出二氧化碳；而 在低浓度重金属污染时，土壤中的微生物则可以把有机碳有效转化为生物量碳 ( c h a n d e r & b r o o k e s ，1 9 9 2 ) 。重金属含量影响土壤生态系统中微生物的呼吸及其代 谢，进而影响土壤中微生物的呼吸过程。k u n 的等( 1 9 9 9 ) 研究了不同形态的铜元素 对土壤微生物活性的影响，结果发现土壤中微生物毒性与铜的浓度相关性较好；加 入低浓度的c d 和z n 可以促进土壤微生物的呼吸作用，出现土壤的呼吸强度受重 金属的刺激而增强的现象( a c e v e se t a l ，1 9 9 9 ) 。 土壤微生物生物量是指小于5 0 0 0u m 3 土壤体积的微生物总量( 不包括活的植 4 第一章绪论 物体) ，它代表了参与调控土壤生态系统的能量和营养循环以及有机物质转化所对 应的生物量( f l i e s s b a c he ta 1 ，1 9 9 4 ) 。大量的研究表明，重金属污染可以造成土壤微 生物生物量上的变化。铅污染对土壤微生物生物量产生了严重的影响，矿区附近土 壤的微生物生物量显著低于离矿区较远的地区( k 锄d e l e re ta 1 ，1 9 9 6 ) 。杨元根 ( 2 0 0 1 ) 等人的研究发现，英国阿波丁市工业污染区的土壤微生物生物量都不同程 度的低于农村土壤。滕应等( 2 0 0 3 ) 的研究表明，浙江铅锌银矿区周围土壤的微生 物量显著偏低，可培养的细菌数量也明显降低。杨济龙( 2 0 0 3 ) 等研究结果得出结 论：蔬菜土壤中的微生物量与重金属的浓度呈负相关。k h 孤等( 1 9 9 8 ) 采用室内培 养的方法研究了重金属c d 、p b 和z n 对红壤微生物生物量的影响，结果表明重金 属浓度升高时，土壤微生物生物量表现为下降。还有研究指出，低浓度的重金属对 微生物的生长有刺激作用，使微生物的生物量碳增加，而当重金属总量升高到一定 浓度时，生物量则急剧下降，当重金属浓度为3 4 4 6m g 瓜g 时，微生物量仅为对照 土壤的2 2 ( f l i e s s b a c he ta 1 ，1 9 9 4 ) 。许炼烽( 1 9 9 9 ) 的研究发现，真菌受镉的抑制 作用最为明显，其次是细菌，这说明不同种类的微生物对重金属的耐受程度不同。 土壤酶活性的大小与重金属污染程度存在一定的相关性，这些酶既包括胞内酶 ( 脱氢酶等) 也包括胞外酶( 蛋白酶、磷酸酶等) 。通常情况下，重金属的浓度较 高时会对酶活性产生一定的抑制效果( b r o o k e s ，1 9 9 5 ) 。大量研究表明，酶的种类不 同，对重金属污染物的敏感程度也有差异。b e l i t s ) ，i l a 等( 1 9 8 9 ) 的研究表明，当重 金属元素c d 、p b 、和z n 的浓度分别为1 0m g 瓜g 、5 0 0m 埏和1 0 0 0m 眺g 时，活 性下降最为明显的是转化酶和脱氢酶。s 缸i 等( 2 0 0 1 ) 向土壤中添加质量分数分别为 5 0m g 瓜g 和2 5m g 瓜g 的几种金属离子，脲酶的活性均受到抑制。k 觚d e l e r 等人 ( 1 9 9 6 ) 研究了1 3 种土壤酶发现，重金属对与碳循环相关的酶的抑制作用比较 小，而对与土壤氮、磷和硫相关的酶的抑制作用较明显；此外，轻度污染时芳基硫 酸酯酶、脱氢酶以及碱性磷酸酶的活性分别只为对照土壤的5 6 8 0 、5 4 6 9 和4 6 6 4 。k 锄d e l e r 等( 1 9 9 6 ) 报道了金属冶炼厂附近的土壤受重金属污染后各 种酶活性的变化情况：土壤脱氢酶、蛋白酶、硫酸酯酶和碱性磷酸酶的活性均受到 了明显的抑制作用。某些重金属元素是土壤酶的重要组成因子或辅助因子，但当重 金属浓度过高时就会对酶的活性产生抑制。不过多种重金属的复合污染对土壤酶活 浙江大学硕士学位论文 性的激活抑制机理更加复杂，尤以自然条件下重金属污染对土壤酶活性的作用机理 还有待进一步的研究( k 锄d e l e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 1 2 3 重金属污染对土壤微生物群落组成的影响 土壤微生物群落结构是指土壤微生物的种类和种间之间的差异，即所谓的微生 物多样性，包括生理功能上的多样性、细胞组成上的多样性以及遗传物质上的多样 性。土壤微生物群落结构是表征土壤生态系统群落结构及其功能稳定性的重要参 数，被认为是最具生物潜力的敏感性指标之一微生物群落结构的分析主要是采用 分子生态学的研究方法，通过对微生物群落的功能稳定性、生态学机理的描述以及 自然和人为因素的干扰对其群落结构的影响等，揭示土壤环境质量和微生物数量与 活性之间的关系( 王远鹏，2 0 0 5 ) 土壤微生物群落结构与重金属污染之间的相互关系一直是国内外研究学者关注 的热点。自上世纪7 0 年代以来，研究者在重金属对微生物数量及群落结构的影响 方面进行了大量的研究工作，所涉及的重金属元素主要包括c d 、c r 、p b 、c u 、 z n 、a s 、h g 等，污染大田的测定和盆栽模拟试验的研究结果表明，重金属对微生 物的毒性效应与其浓度密切相关，一般情况下，重金属浓度较低时对微生物的生长 有刺激作用，但随着重金属浓度的增加，抑制作用越来越明显，二者一般呈负相关 关系( 王远鹏，2 0 0 5 ) 。m o 仃e t t ( 2 0 0 3 ) 的研究也表明农田土壤的锌含量超标 时，土壤微生物群落的多样性大大降低。此外，不同种类的微生物对重金属的敏感 程度不同，对污染物的耐受程度也不尽相同，一般表现为真菌 细菌 放线菌，从 而导致微生物群落结构上的变化。研究者发现，污染严重的土壤中耐性细菌要比轻 污染土壤中的耐性细菌的数量多，土壤受锌、铅污染后，对纤维分解菌和木霉等菌 类起到抑制作用，但耐性比较强的大豆根瘤菌比无污染和轻污染土壤的数量要多 ( s u h a d o l ce ta 1 ，2 0 0 4 ) 。滕应等( 2 0 0 3 ) 采用b i o l o g 法研究了矿区侵蚀土壤微生物 的群落多样性，结果表明污染土壤和对照土壤中存在很大差异：污染最严重土壤的 b i o l o g 板的颜色变化最慢，总体的平均吸光度值最低；随着重金属含量的降低，这 些指数都呈现出上升的趋势。但由于微生物区系复杂性的特点以及研究方法上的差 异，不同的研究结果之间可比性比较差。 6 第一章绪论 杨晔等( 2 0 0 1 ) 在研究铅对微生物区系的影响时发现，铅浓度在5 0m g 瓜g 时，细菌的生长受到明显的抑制，而对放线菌的影响时而表现为抑制时而表现为刺 激，对固氮菌和真菌则具表现出明显的刺激作用。综合同类研究结果可以得出这样 的结论：( 1 ) 不同的微生物区系对重金属的敏感程度不同，其敏感性一般为细 菌 放线菌 真菌；( 2 ) 不同的重金属种类对微生物的毒性效应不同；( 3 ) 重金 属的生物毒性受到许多因素的影响和制约，尤以对土壤质地、p h 等的影响最大 ( 龚平等，1 9 9 7 ；顾宗濂，1 9 8 7 ) 。可见重金属污染胁迫会对土壤微生物的种群结 构产生较大的影响。 1 2 4 微生物对污染土壤中重金属环境化学行为的影响 微生物对重金属活化的促进作用主要是通过多种直接或间接的代谢活动完成 的。研究表明，真菌可以分泌有机酸、氨基酸等其他代谢产物以溶解重金属元素及 含有重金属的矿物( s i e g e l & h a w k i l l s ，1 9 8 6 ) 。c h a n m u g a t h 硒等( 1 9 8 8 ) 的研究表 明，在营养充分的条件下，微生物能促进土壤中重金属镉的淋溶；通过比较不同碳 源条件下微生物对重金属的溶解作用，发现在加入土壤有机质、麦秆的同时并利用 葡萄糖作为碳源时，未经灭菌处理的淋洗液中重金属离子的浓度明显高于灭菌处理 的( c h 锄m u g a t h 邪& b o l l a g ，1 9 8 8 ) ，这说明微生物的代谢活动促进了土壤中重金属 的活化。 微生物本身及其代谢产物都能吸附和转化土壤中的重金属元素。由于微生物细 胞表面带有电荷，因此可以吸附重金属离子，也可以通过对必需营养元素的摄取对 重金属离子进行主动吸收，并将吸附的重金属离子富集在细胞表面或细胞内 ( l e b e 叫e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。重金属元素的吸附受微生物的表面结构的影响，重金属元素 可以被微生物的细胞壁和粘液层直接吸收或吸附。大肠杆菌k 1 2 的细胞外膜能吸 附3 0 多种重金属离子。王远鹏( 2 0 0 5 ) 的研究发现：菌丝体对重金属的吸附能力 与菌丝体和重金属的种类有关，根霉对某些重金属元素的最大吸附量的顺序为： p b 2 + z n 2 + 圮d 2 k u 2 + ，而尸d ，辔括f 讲姗的吸附顺序则为z n 2 sc u 2 c d 2 + p b 2 + ，说 明种类不同的真菌对重金属的吸附能力也表现出一定的差异。据报道，芽孢杆菌属 的菌株对重金属元素的吸附能力都很强( 黄淑惠，1 9 9 2 ) 。最大的螺旋蓝细菌吸附 浙江大学硕士学位论文 铬时，对铬的最大的吸附量为4 3 6 3m g 儋( d ac o s t a & d cf 啪c a ，1 9 9 8 ) 。用地农芽孢 杆菌对铅离子进行吸附，4 5 分钟后的吸附量达到2 2 4 8m g 儋( 刘月英，2 0 0 0 ) 。 微生物可以通过直接氧化或还原重金属元素，以改变土壤中重金属元素的价 态，重金属价态的改变又会涉及重金属的溶解性、迁移性和生态毒性的变化( 孙铁 衍等，2 0 0 l ；周启星，2 0 0 4 ) 研究表明，自然条件下，大多数微生物可以通过氧 化还原作用、脱烃和甲基化作用等参与到自然界中重金属的转化过程中，从而将土 壤中的重金属元素转化为无毒或低毒的形态( p a 打ae ta 1 2 0 0 6 ) 。某些细菌能将土 壤中的二价铅离子还原为不具毒性的胶体形态的铅，在厌氧条件下脱弧杆菌 ( 跳扰f 7 白啪，d ) 可将三价铁还原为二价铁，厌氧的固氨梭状杆菌( c f d s 护油姗 印) 能通过酶的催化作用将铁和氧化锰还原氧化( f r 锄c i s & d o d g e ，1 9 8 8 ) 。硫还原 菌可以通过两种途径将硫酸盐还原为硫化物，一种途径是在呼吸过程中将硫酸盐作 为电子受体被还原，另一种途径是同化过程中利用硫酸盐合成氨基酸，在通过脱硫 作用把s 2 分泌到细胞体外( c h a n m u g a t h a s & b o i l a g ，1 9 8 7 ) 。第一种途径已在废水处 理和土壤污染的净化中得到了应用，但需要非常严格的厌氧条件，第二种途径的优 点在于硫的还原受氧化还原电位的影响比较小( w a i l ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 。有报道指出，e c d ，f 可以将汞蒸气氧化为二价的汞离子，这主要与大肠杆菌分泌的过氧化氢酶等有 关( s m i mc ta 1 ，1 9 9 8 ) 。可溶性的汞( h 矿) 可以被环境中的好养微生物还原成可挥 发性的汞( h ，) ，并释放到空气中( 王新等，2 0 0 4 ) ，因此可以使用汞还原菌促 进二价汞的还原和挥发，以实现汞污染土壤的生物修复。微生物通过对阴离子的氧 化作用，释放可以与之结合的重金属离子。如氧化铁硫杆菌( 砌勋6 卯讲z 脚能氧化硫 铁矿、硫锌矿中的s 2 ，使z n 、f e 、c o 、a u 等元素以离子态的形式被释放出来 ( s e i l k oe ta 1 ，2 0 0 4 ) 。此外，微生物还可以通过氧化过程将含有砷元素的矿物分解。 研究者通过对3 株高温硫杆菌( 砌f d 6 口c f f f 淞批) 以及热氧化硫化杆菌 ( & ，珈6 卯珊螂舭删甜甜坍如孵撕) 氧化分解砷硫铁矿的研究，阐明了它们对砷 硫铁矿分解的促进机制( d o p s o n & l i n d s 仃o m ，1 9 9 9 ) 第一章绪论 1 3 植物根际效应及其与微生物的关系研究进展 1 3 1 植物的根际效应 由于植物根系的细胞组织脱落物和根系分泌物可以为根际微生物提供大量的营 养物质和能量，因此使得植物根际在微生物数量和活性方面均高于根外土壤，这种 现象被称之为植物的根际效应。由植物的根系、土壤微生物以及根系周围土壤所构 成的根际环境，其p h 、微生物的活性以及营养状况等均不同于与周围土体( 郑元 明等，2 0 0 5 ) 。重金属元素进入根际土壤环境后，受根际环境的影响发生价态和形 态上的改变。根际土壤中的有机酸等可以通过络合作用改变重金属元素的形态，重 金属离子能与酸性基团形成比较稳定的络合物。同时根系分泌物可以与土壤中移动 性较差的重金属结合，破坏土壤中重金属离子的平衡。此外，植物根系分泌的大量 有机物质以及植物残体进入土壤后也增加了土壤中有机物质的含量，因而影响了土 壤中有机物质的种类和数量( n o m 锄d e r & p r o s s e r ，2 0 0 0 ) 。有机物质对土壤中的一些 微生物类群具有诱导和刺激作用，可以改变土壤微生物的群落结构及其功能多样性 ( 龙健等，2 0 0 4 ) 。周建霞等( 2 0 1 1 ) 研究了6 个不同品种苎麻的根际和非根际土 壤的环境状况，结果表明根际土壤中大部分的土壤养分、微生物数量、酶活性均高 于非根际土壤；此外，根际环境中全氮、全磷、全钾含量、p h 值、微生物数量均 存在品种间的差异。肖春玲等( 2 0 1 1 ) 分析了油茶根际和非根际土壤中的真菌、细 菌和放线菌的数量，以及不同浓度的铝胁迫对根际和非根际土壤酶活