（外科学专业论文）三七总皂苷抑制人前列腺癌pc3细胞增殖、迁移及机制研究.pdf

目录 | | i i iiii iii i irl ll li i i i 19 010 2 0 中文摘要1 英文摘要4 研究论文三七总皂苷抑制人前列腺癌p c 3 细胞增殖、迁移及机制研 究 前言7日l j 舌7 材料与方法7 结果1 4 附图17 附表3l 讨 仑3 4 结论3 6 参考文献3 6 综述雄激素受体及雄激素受体辅助因子在前列腺癌中的作用3 9 致谢5 3 个人简历5 4 中文摘要 三七总皂苷抑制人前列腺癌p c - 3 细胞增殖、迁移及机制研究 摘要 前列腺癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤。该病早期症状隐匿，导致患者 就诊时常处于晚期从而失去手术机会。因此药物治疗对于改善晚期患者的 生存质量、延长生存期具有重要意义。三七总皂苷( t o t a lp a n a xn o t o g i n s e n g s a p o n i n s ，t p n s ) 是中药三七根中提取的药用成分，主要包括三七皂苷r 1 ( n o t o g i n s e n o s i d er 1 ) 、人参皂苷r g l ( g i n s e n o s i d er 9 1 ) 、人参皂苷r e ( g i n s e n o s i d er e ) 、人参皂苷r b l ( g i n s e n o s i d er b l ) 和人参皂苷r d ( g i n s e n o s i d er d ) 等。由于三七总皂苷具有活血化瘀的功能，由上述药 用化合物组成的三七总皂苷注射液已被广泛应用于心脑血管疾病的临床 治疗。近来研究结果证实，t p n s 及t p n s 中的部分单体成分具有抗肿瘤的 功能。然而，t p n s 对前列腺癌的作用尚不清楚，因此本研究通过观察t p n s 对体外培养的人前列腺癌p c 3 细胞增殖、凋亡及迁移的作用，并探讨其 作用机制，旨在为前列腺癌的辅助治疗及扩展t p n s 的临床应用提供实验 依据。 方法： 1人前列腺癌p c 3 细胞培养 将人前列腺癌p c 3 细胞传代培养，待细胞生长至7 0 左右时，进行 药物刺激。实验组细胞用不同浓度的t p n s 进行处理，对照组细胞用生理 盐水进行处理。 2细胞增殖分析 使用m t t 法及细胞计数法分别对实验组细胞和对照组细胞进行分 析，以测定t p n s 对p c 3 细胞增殖的影响。 3 流式细胞学分析 将各组细胞消化并吹打成单细胞悬液，经固定、洗涤、染色等过程后， 进行流式细胞学分析，以测定t p n s 对p c 3 细胞周期分布及凋亡的影响。 4 免疫细胞化学染色 将细胞接种于玻片上，经t p n s 处理后，将各组细胞用甲醛固定。经 t r i t o nx 一1 0 0 处理、封闭、一抗及二抗结合、d a b 显色等步骤后镜下计数 中文摘要 阳性细胞所占比例。 5伤口愈合实验 将p c 3 细胞接种于玻片上，待细胞至1 0 0 汇合时进行划痕，药物 处理2 4h 后计数迁移入损伤区的细胞数量。 6总r n a 提取及r t - p c r 反应 提取各组细胞的总r n a ，经定量后进行逆转录反应，之后将反应产 物用特异p c r 引物进行扩增。经电泳后半定量检测v c a m - 1 的表达变化。 7w e s t e r n 印迹分析 取等量细胞总蛋白，经s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，恒流电转 膜至n c 膜上，经脱脂牛奶封闭、一抗及二抗结合、化学发光等过程，对 特定蛋白进行检测。 8明胶酶图分析 取等体积细胞培养液，进行s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。之后经 复性、明胶酶反应、染色、脱色等步骤后检测各组细胞培养液中基质金属 蛋白酶2 ( m a t r i xm e t a l l 叩r o t e i n a s e s2 ，m m p 2 ) 的活性。 结果： 1t p n s 抑制p c 3 细胞增殖但不促进该细胞株凋亡 m t t 和细胞计数分析显示，t p n s 抑制p c 3 增殖活力( p o 0 5 ) 。 w e s t e m 印迹及免疫细胞化学染色结果表明，t p n s 处理p c 3 细胞后增殖 标志物p c n a 表达增加，增殖抑制基因p 2 1 a p l 表达水平降低( p o 0 5 ) 。 2t p n s 抑制p c 3 细胞迁移 伤口愈合实验显示，t p n s 对p c 3 细胞迁移有显著的抑制作用 ( p o 0 1 ) 。w e s t e r n 印迹及明胶酶图结果显示，迁移相关蛋白m m p 2 在 t p n s 处理后表达水平较对照组显著降低( p o 0 1 ) ；w e s t e m 印迹及r t - p c r 结果表明，t p n s 处理的p c 3 细胞后，血管细胞间黏附分子l ( v a s c u l a rc e l l a d h e s i o nm o l e c u l e1 ，v c a m 1 ) 表达水平显著下调( p o 0 1 ) ，该作用呈现 显著的时效及量效关系。以上结果表明，t p n s 抑制p c 3 细胞迁移的作用 可能与下调m m p 2 及黏附分子v c a m 1 的表达水平有关。 中文摘要 3 t p n s 激活p 3 8m a p k 通路 在t p n s 处理p c 3 细胞o 5h 时，p 3 8m a p k 磷酸化水平显著升高， 之后该蛋白的磷酸化水平开始逐渐降低，但仍维持较高水平( p o 0 1 ) 。 而e r k 及j n k 的磷酸化水平不明显。因此推测，“p 3 8m a p k 通路的活化 可能是t p n s 对p c 3 细胞作用的重要途径。 结论： 1t p n s 抑制人前列腺癌p c 3 细胞增殖，但不影响该细胞凋亡。 2 t p n s 抑制人前列腺癌p c 3 细胞迁移，下调m m p 2 及v c a m 1 的表 达水平。 3 t p n s 激活p 3 8m a p k 通路。 关键词：三七总皂苷；前列腺癌；增殖；迁移；凋亡 英文摘要 t o t a lp a n a x n o t o g i n s e n gs a p o n i n si n h i b i t sp r o l i f e r a t i o na n d m i g r a t i o no fh u m a np r o s t a t ec a n c e rp c - 3c e l l s a b s t r a c t i n h i b i t i o no fp r o l i f e r a t i o na n dm i g r a t i o ni sac o m m o ns t r a t e g yf o rt h e t r e a t m e n to fm a l i g n a n tt u m o r s t o t a lp a n a xn o t o g i n s e n gs a p o n i n s ( t p n s ) e x t r a c t e df r o mt h ep l a n tp a n a xn o t o g i n s e n gh a sb e e nw i d e l yu s e di nt h e t r e a t m e n to fc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e s p r e v i o u ss t u d i e sh a v eb e e np r o v e dt h a t t p n sa n ds o m ec o m p o n e n t si nt h et p n se x h i b i t e da n t i c a n c e re 仃e c t s h o w e v e r , t h ee f f e c t so ft p n so nh u m a np r o s t a t ec a n c e ra r es t i l lr e m a i n e du n c l e a r s o t h i ss t u d yw a sd e s i g n e dt oi n v e s t i g a t et h ea n t i c a n c e re f f e c t so ft p n so nh u m a n p r o s t a t ec a n c e rp c 一3c e l l s m e t h o d s ： 1c e l lc u l t u r e p c 一3c e l l sw e r ec u l t u r e di nr p m i 16 4 0m e d i u m c o n t a i n i n g1o o f f bs p c - 3c e l l sg r o w ni n t o7 0 c o n f l u e n c e sw e r et r e a t e dw i t ho rw i t h o u tt p n s 2p r o l i f e r a t i o na n a l y s i s m t t a s s a y sa n dc e l lc o u n t i n gw e r ep e r f o r m e dt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t s o ft p n so n p r o l i f e r a t i o ni np c 一3c e l l s 3f l o wc y t o m e t r y a n a l y s i s p c 一3c e l l sw e r eh a r v e s t e da n df i x e dw i t he t h a n 0 1 f o l l o w i n gw a s h e sw i t h p b s ，c e l l sw e r es t a i n e dw i t hp r o p i d i u mi o d i d e c e l lc y c l ed i s t r i b u t i o na n d a p o p t o s i sw a sa n a l y z e dw i t hf l o wc y t o m e t e r 4 i m m u n o c y t o c h e m i s t r ys t a i n i n g p c - 3c e l l sw e r ef i x e d ，t h e nw a s h e dw i t hp b sa n dt r e a t e dw i t ht r i t o n x - 1 0 0 s p e c i f i cp r i m a r ya n ds e c o n d a r ya n t i b o d i e sw e r ea d d e da n dt h e n s t a i n e dw i t hd a b p o s i t i v ec e l l sw e r et h e nc o u n t e d 5w o u n d h e a l i n ga s s a y s t h ee 仃e c t so ft p n so np c 一3c e l l sm i g r a t i o nw a si n v e s t i g a t e dw i t hw o u n d h e a l i n ga s s a y s p c 一3c e l l sw e r es e e d e di n s i xw e l lp l a t e w h e nt h ec e l l s 4 r e a c h e d10 0 c o n f l u e n t ，t h ec e l lm o n o l a y e r sw e r es c r a t c h e d t h e nt h ec e l l s w e r ew a s h e dw i t hp bsa n dt r e a t e dw i t ho rw i t h o u tt p n sf o r2 4h m i g r a t i o n f o re a c hg r o u p sw a se v a l u a t e db ye e l lc o u n t i n g 6r t - p c rs e m i q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s t o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mp c 3c e l l s a f t e rt h eq u a n t i f i c a t i o na n d r e v e r s et r a n s c r i p t i o n a lr e a c t i o n ，t a r g e ts e g m e n tw a sa m p l i f i e dw i t hs p e c i f i c p r i m e r sb yp c ra s s a y s e l e c t r o p h o r e s i s w a sp e r f o r m e dt oa n a l y z et h e e x p r e s s i o nl e v e lo f v c a m - 1 7w e s t e r nb l o t t i n g t o t a lp r o t e i ni np c 3c e l l sw a se x t r a c t e da n dq u a n t i f i e d ，a n d t h e n s d s p a g ew a sp e r f o r m e d p r o t e i n sw e r eb l o t t e do n t on c m e m b r a n e t h e n t h en cm e m b r a n ew a si n c u b a t e dw i t hd e f a t t e dm i l k ，p r i m a r ya n ds e c o n d a r y a n t i b o d i e s s p e c i f i cb a n d s w e r ea n a l y z e dw i t hd i g i t a li m a g i n gs y s t e m 8 z y m o g r a p h ya n a l y s i s e q u a lv o l u m eo fm e d i u mi ne a c hg r o u pw a ss e p a r a t e db ys d s - p a g e ( w i t hg e l a t i n ) t h e nt h eg e lw a sw a s h e db yt r i t o nx - 1 0 0a n di n c u b a t e di n 37 co v e r n i g h t t h eg e lw a ss t a i n e dw i t hc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e ，a n dm a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s2 ( m m p 2 ) a c t i v i t yw a se v a l u a t e db yt h ei n t e n s i t yo f t h e b a n d s r e s u l t s ： 1t p n si n h i b i t sp c 3c e l lp r o l i f e r a t i o n ，b u td o e sn o ta f f e c ta p o p t o s i s m t t a s s a y sa n dc e l lc o u n t i n gr e s u l t ss u g g e s t e d t h a tt p n si n h i b i t sp c _ 3 p r o l i f e r a t i o n ( p 0 0 5 ) w e s t e r n b l o t a n a l y s i s a n di m m u n o c ”o c h e m i s t r y s t a i n i n gs u g g e s t e dt h a tt p n sd o w nr e g u l a t e dp c n a a n du pr e g u l a t e dp 21 。1 p 1 ( p o 0 5 ) 2t p n si n h i b i t sp c 一3c e l lm i g r a t i o n w o u n dh e a l i n ga s s a y sr e s u l t ss h o w e dt h a tt p n si n h i b i t e dp c 一3m i g r a t i o n w e s t e r nb l o t t i n ga n dz y m o g r a p h ys u g g e s t e dt h a tt h el e v e lo fm m p 2w a s d e c r e a s e da f t e rt p n st r e a t m e n t ( p o 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fv a s c u l a r c e l l 英文摘要 a d h e s i o nm o l e c u l e1 ( v c a m - 1 ) w a sa l s os u p p r e s s e dw h e np c 一3c e l l sw e r e t r e a t e dw i t ht p n si nt i m e - a n dd o s e - e f f e c t m a n n e r ( p 0 0 5 ) 3t p n sa c t i v a t e sp 38m a p k p a t h w a y w h e np c - 3c e l l sw e r ee x p o s e dt ot h em e d i u mc o n t a i n i n gt p n s ( 4 0 0 m g l ) f o r0 5h ，p 3 8m a p kw a sd r a m a t i c a l l ya c t i v a t e d ( p 0 01 ) ，a n dt h e nt h e p h o s p h o r y l a t i o n l e v e lo f p 38 m a p kw a s s l i g h t l yd r o p p e d ，b u t t h e p h o s p h o r y l a t i o nl e v e lo fp 38m a p kw a ss t i l lh i g h e rc o m p a r e dw i t ht h e u n t r e a t e dg r o u p ( p o 01 ) h o w e r v e r , t h ee r ka n dj n k p a t h w a yw e r en o t a f f e c t e da f t e rt p n st r e a t m e n t t h e s er e s u l t s s u g g e s t e d t h a t p 38m a p k a c t i v a t i o nm i g h tb eo n eo ft h ek e yp a t h w a y sf o rt p n so np c 3c e l l s c o n c l u s i o n s ： 1t p n si n h i b i t sp c 一3c e l lp r o l i f e r a t i o nr a t h e rt h a ni n d u c i n g a p o p t o s i s 2t p n ss u p p r e s s e sp c - 3c e l l m i g r a t i o na n dd o w nr e g u t l a t e sm m p 2a n d v c a m - 1e x p r e s s i o n 3t p n sa c t i v e sp 38m a p k p a t h w a y k e yw o r d s ：t o t a lp a n a xn o t o g i n s e n g s a p o n i n s ；p r o s t a t ec a n c e r ； p r o l i f e r a t i o n ；m i g r a t i o n ；a p o p t o s i s 6 研究论文 三七总皂苷抑制人前列腺癌p c - 3 细胞增殖、迁移及机制研究 - 一 翮罱 前列腺癌是中老年男性常见的泌尿系统恶性肿瘤，近年来发病率逐渐 上升，且有年轻化的趋势。由于本病早期临床症状不明显，导致患者就诊 时常处于晚期从而失去手术治疗机会。因此药物治疗对于改善晚期患者的 生存质量、延长生存期具有重要意义。 三七( p a n a xn o t o g i n s e n g ) ，属五加科植物，兼有止血及活血祛瘀、 活脉通络等功效。三七总皂苷( t o t a lp a n a xn o t o g i n s e n gs a p o n i n s ，t p n s ) 是中草药三七根中提取的药用成分。三七总皂苷注射液( 又称血塞通注射 液或血栓通注射液) 是一种治疗心脑血管疾病的药物，该药己被广泛用于 冠心病、脑血栓等心脑血管疾病的治疗。以往研究发现，t p n s 可抑制肝 癌细胞增殖【1 】。但该药对于前列腺癌的作用尚不清楚，因此本文通过观察 t p n s 对体外培养的人前列腺癌p c 3 细胞株增殖、迁移及凋亡的影响并探 讨其作用机制，旨在为前列腺癌的辅助治疗及扩展t p n s 的临床应用提供 实验依据。 1 材料与仪器 人前列腺癌p c 3 细胞株 材料与方法 三七总皂苷注射液( 血塞通注射液 5 0m g m l ，生产批号：2 0 0 9 0 5 1 3 ) r p m i 1 6 4 0 培养基 胎牛血清( f e t a lb o v i n e $ e r t l m ， f b s ) 胰蛋白酶 四甲基氮偶唑蓝( m t t ) 台盼蓝 免疫组化试剂盒 北京协和细胞资源中心 云南昆明兴中制药有限责 任公司 g i b c o 公司 杭州四季青生物工程材料 有限公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 华美生物工程公司 北京中杉金桥公司 研究论文 d a b 显色试剂盒 小鼠抗1 3 - a c t i n 单克隆抗体 小鼠抗p c n a 单克隆抗体 小鼠抗c y c l i nd 1 单克隆抗体 小鼠抗c y c l i nb 1 单克隆抗体 小鼠抗p 2 1 c p 1 单克隆抗体 小鼠抗m m p 一2 单克隆抗体 兔抗b a x 多克隆抗体 兔抗b c l 2 多克隆抗体 兔抗v c a m 1 多克隆抗体 兔抗p - p 3 8 多克隆抗体 兔抗p 3 8 多克隆抗体 兔抗p - e r k 多克隆抗体 兔抗e r k 多克隆抗体 兔抗p - j n k 多克隆抗体 兔抗j n k 多克隆抗体 山羊抗兔二抗 山羊抗小鼠二抗 明胶 t r i t o nx 1o o t r i z o l r n a 酶抑制剂 m m l v 逆转录酶 o l i g od t d n t p t a qd n a 聚合酶 引物 化学发光试剂盒 流式细胞仪 c 0 2 孵箱 倒置显微镜 北京中杉金桥公司 s a n t ac r u z 公司 s a n t ac r u z 公司 s a n t ac r u z 公司 s a n t ac r u z 公司 s a n t ac r u z 公司 s a n t ac r u z 公司 s a n t ac r u z 公司 s a n t ac r u z 公司 s a n t ac r u z 公司 c e l ls i g n a l i n g 公司 s a n t ac r u z 公司 s a n t ac r u z 公司 s a n t ac r u z 公司 c e l ls i g n a l i n g 公司 c e l ls i g n a l i n g 公司 s a n t ac r u z 公司 s a n t ac r u z 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 i n v i t r o g e n 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 f e r m e n t a s 公司 上海生物工程技术公司 t h e r m o 公司 美国b e c k m a nc o u l t e r 公司 s a n y o 公司 o l y m p u s 公司 研究论文 光学显微镜o l y m p u s 公司 f r e s c o1 7 低温离心机t h e r m o 公司 c e n t r i f u g e5 4 1 5 d 离心机e p p e n d o r f 公司 电泳仪b i o r a d 公司 p t c 0 2 2 0p c r 仪b i o r a d 公司 超微量紫外可见光分光光度计t h e r m o 公司 血球计数板上海求精仪器有限公司 电转膜仪b i o r a d 公司 始兰一：! o o o 型化学发光及荧光影像日本富士公司 分析仪 一。一一。 酶标仪thermo公司 2 方法 2 1 细胞培养及分组 取人前列腺癌p c 3 细胞株，用含1 0 f b s 的r p m i 1 6 4 0 培养基培 养，待细胞生长达9 0 左右汇合后，用o 2 5 胰蛋白酶消化传代，至细 胞生长至7 0 左右汇合时进行实验。细胞分为对照组和实验组，各实验 组细胞加入不同浓度的t p n s 进行刺激，对照组加入与最大剂量药物处理 体积相等的生理盐水进行孵育。各组细胞于加药前换为含1 f b s 的 r p m i 1 6 4 0 培养基血清饥饿培养2 4h 。 2 2m 1 v r 分析 将处于对数生长期的p c 3 细胞接种于9 6 孔板，每孔1 0 0g l ( 约l x l 0 4 个细胞) ，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的t p n s ( 1 0 0 、2 0 0 、4 0 0 、8 0 0 、 1 6 0 0m g l ) 孵育1 2 、2 4 和4 8h 。之后每孔各加入m t t 溶液( 5m g m l ) 2 0p l 并于3 7 下孵育3h ，小心弃去培养液后每孔各加d m s o1 5 0 山，混 匀后在酶标仪上于5 7 0n m 处检测吸光度值( o d 值) 。以上各组设5 个复 孔，使用l o g i t 法计算t p n s 对p c 3 细胞的i c 5 0 值。 2 3 细胞增殖及细胞形态分析 将约3 1 0 4 个p c 3 细胞接种于1 2 孔板，待细胞贴壁后加入不同浓度 的t p n s ( 2 0 0 、4 0 0 、8 0 0m g l ) 孵育4 8h ，并采用4 0 0m g lt p n s 处理细 胞1 2 、2 4 和4 8h 以检测t p n s 对p c 3 细胞增殖抑制作用的时间特性。之 后将孔板置于倒置显微镜下照相以观察其形态变化。将以上各组细胞用 研究论文 o 2 5 胰蛋白酶消化并制备成单细胞悬液，台盼蓝染色后用常规细胞计 数法计数未被染色的活细胞数，以此表示各组细胞的增殖状态。以上各组 均设3 个复孔，每孔计数两次取其均值。 2 4 细胞总蛋白提取与w e s t e r nb l o t 分析 收集各组细胞，用冷p b s 洗涤3 次，将细胞重悬于细胞裂解液( 1 n p 4 0 ，15 0m m o l ln a c i ，5 0m m o l lt r i s h c l ，p h7 5 ，1o 甘油，1m m o l l n a 3 v 0 4 ，1m m o l lp m s f , lm m o l ld t t ) 中，冰浴3 0m i n ，并不断使用 漩涡振荡器促进细胞充分裂解。之后在4 。c 下，以8 0 0 0r p m 离心1 0m i n ， 收集上清，使用b r a d f o r d 法进行蛋白定量。 s d s 聚丙烯酰胺凝胶( p a g e ) 电泳：灌制1 0 的分离胶和4 的浓 缩胶。取等量蛋白样品( m m p 2 检测取等体积培养液) 与5 s d s 上样缓 冲液( 0 1m m o l lt r i s h c l ，p h6 8 ，2 0 甘油，0 1 溴酚蓝，1 0 p 巯基乙醇，4 s d s ) 混合均匀，1 0 0 沸水浴加热5m i n 使蛋白变性。冷 却后，用微量加样器加样于凝胶加样孔内。9 0v 稳压电泳约3 0m i n ，待 溴酚蓝进入分离胶后，换用1 2 0v 稳压电泳，至溴酚蓝前缘移动到凝胶底 部( 约2h ) ，取出凝胶。 电转膜：s d s p a g e 完毕后对凝胶进行电转膜( 转膜缓冲液为4 8 m m o l lt r i s ，3 9m m o l l 甘氨酸，1 3m m o l ls d s ，2 0 甲醇，p h9 2 ) 。 使用3 0 0m a 恒流电转膜5 0r a i n 。 封闭：转膜完毕，取出n c 膜，置于含5 脱脂奶粉的t b s t ( 10 m m o l lt r i s h c l ，p h8 0 ，15 0m m o l ln a c l ，o 0 5 t w e e n 2 0 ) 封闭液中， 于室温封闭2h 。 一抗结合：将封闭后的n c 膜置入t b s t 适当稀释的一抗溶液中，4 。c 缓慢摇动过夜。以下是本实验所用一抗的稀释比例： 小鼠抗1 3 - a c t i n 单克隆抗体 小鼠抗p c n a 单克隆抗体 兔抗b c l 2 多克隆抗体 兔抗b a x 多克隆抗体 小鼠抗c y c l i nd 1 单克隆抗体 小鼠抗c y c l i nb1 单克隆抗体 小鼠抗m m p 2 单克隆抗体 1 ：1 0 0 0 l ：5 0 0 1 ：4 0 0 l ：4 0 0 l ：2 0 0 1 ：2 0 0 1 ：1 0 0 研究论文 兔抗v c a m 1 多克隆抗体l ：3 0 0 兔抗p - p 3 8 多克隆抗体 1 ：8 0 0 兔抗p 3 8 多克隆抗体 l ：3 0 0 兔抗p - j n k 多克隆抗体 1 ：8 0 0 兔抗j n k 多克隆抗体 1 ：8 0 0 兔抗p e r k 多克隆抗体 1 ：8 0 0 兔抗e r k 多克隆抗体 l ：8 0 0 洗膜：取出n c 膜放入装有适量t b s t 的平皿中，室温洗膜，每次5 m i n ，共4 次。 二抗结合：将n c 膜置入相应t b s tl ：5 0 0 0 稀释的二抗溶液中，于室 温结合反应1h 。 洗膜后用化学发光试剂盒检测抗体结合区带。采用凝胶成像分析软件 对待测区带的信号强度与内参照区带信号强度的比值进行相对定量分析。 2 5 免疫细胞化学染色 将细胞接种于玻片上，待细胞生长至6 0 左右汇合时换用含1 f b s 的r p m i 1 6 4 0 饥饿2 4h 。之后应用不同浓度的t p n s ( 2 0 0 、4 0 0 、8 0 0m g l ) 进行处理。4 8h 后取出玻片，用p b s 溶液清洗3 次，每次2 m i n ，之后用 4 多聚甲醛固定1 5m i n 。然后用p b s 清洗标本3 次，每次2r a i n 。之后 用o 5 t r i t o nx 1 0 0 ( p b s 配制) 常温孵育。2 0m i n 后用p b s 清洗标本 3 次，各2m i n 。用3 过氧化氢孵育15m i n 以阻断内源性过氧化物酶活 性，之后用p b s 冲洗标本3 次每次2m i n 。然后用5 的正常山羊封闭血 清室温孵育2 0m i n 。弃去封闭血清后，用抗p 2 1 a p l 抗体( p b s 稀释至1 ：5 0 ， 阴性对照滴入不加一抗的p b s ) 在湿盒内于4 。c 下孵育过夜。次日，弃去 一抗，并用p b s 溶液清洗3 次，每次5m i n 。之后用标记的二抗工作液于 湿盒内室温孵育。3 0m i n 后用p b s 溶液清洗标本5 次，每次2m i n 。滴加 辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，孵育3 0m i n ，之后用p b s 溶液洗3 次，每次5r a i n 。滴加新配制的d a b 试剂显色，于显微镜下控 制显色时间，并用自来水终止显色。最后，用苏木精复染，自来水冲洗终 止染色后，脱水、透明、中性树胶封片，并于显微镜下观察。 结果判断：光镜下p 2 1 a p l 表达阳性细胞的细胞内呈现特异棕褐色。根据 染色强度和阳性细胞数进行半定量分析。选择5 个高倍镜视野，采用 研究论文 i m a g e p r op l u s6 0 生物医学图象分析系统随机记数5 0 0 个细胞阳性表达率 = ( 阳性细胞数5 0 0 ) 1 0 0 。以上实验重复3 次，取其均值。 2 6 流式细胞学分析 将各组细胞用o 2 5 的胰酶彻底消化，并吹打成单细胞悬液。4 。c 下 5 0 0g 离心5m i n ，弃上清后用预冷的p b s 溶液轻轻吹悬，并再次于4 。c 下 5 0 0g 离心5m i n ，反复洗涤3 次后用7 0 的预冷乙醇溶液轻轻吹悬并于 4 。c 下固定过夜。检测前，于4 。c 下5 0 0g 离心1 0m i n ，弃去上清后p b s 漂洗2 次。之后将细胞重悬于1m l 碘化丙啶( p i ) 染液( 5 0i ，t g m lp i ， 2 5g g m lr n a s e ，o 5 t r i t o nx 1 0 0 ) 中，于4 。c 摇床避光染色3 0m i n 后， 5 0 0 目筛网过滤，除去细胞团块，采用流式细胞仪( f l o wc y t o m e t e r ，f c m ) 对约1 0 0 0 0 个细胞的d n a 进行定量分析，再结合计算机软件计算出各组 p c 3 细胞周期的时相分布和凋亡状态。 2 7 伤口愈合实验 将p c 3 细胞接种于玻片上，待细胞生长至1 0 0 汇合后用无菌t i p 头在玻片上划痕，用p b s 冲洗被刮下的悬浮细胞。之后将玻片置于含不 同浓度t p n s ( o 、2 0 0 、4 0 0 、8 0 0m g l ) 的r p m i1 6 4 0 培养液中继续孵育。 2 4h 后取出玻片，经固定和结晶紫染色后于低倍镜下观察伤口愈合情况。 任取1 0 个视野计数迁移入损伤区的细胞数量，以此表示p c 3 细胞的迁移 活性。 2 8 明胶酶图分析 用s d s p a g e 明胶酶图检测m m p 2 活性。配制8 的分离胶( 含o 2 明胶) 和4 的浓缩胶。经细胞计数标定后，各组分别取等量培养液与 上样缓冲液( o 1m m o l l t r i s h c l ，p h6 8 ，2 0 甘油，o 1 溴酚蓝，4 s d s ) 混匀，上样于凝胶加样孔内。4 。c 条件下恒压( 1 2 0v ) 电泳约2h 左右( 电泳缓冲液：2 5m m o l l t r i s ，2 5 0m m o l l 甘氨酸，o 1 s d s ) ，当 溴酚蓝前沿移动至凝胶底部约1c m 处时停止电泳。 明胶酶消化反应：电泳结束后，凝胶经2 5 t r i t o nx 1 0 0 漂洗3 次， 每次1 5m i n ，除去凝胶中的s d s ，使明胶酶复性；弃去漂洗液，加入反 应缓冲液( 5 0m m o l l ir i s h c i ，p h8 0 ，5 0m m o l ln a c i ，10m m o l lc a c l 2 ) 中，于3 7 下孵育过夜，使明胶酶充分水解凝胶中的明胶。 染色及脱色：反应结束后，弃去反应缓冲液，加入考马斯亮蓝染色 研究论文 ( o 2 5 考马斯亮蓝r 2 5 0 ，4 0 甲醇，1 0 乙酸) 约3h ；弃去染色液， 加入脱色液( 4 0 甲醇，1 0 乙酸) 脱色1h 左右，并不断更换脱色液直 至蓝色背景下白色条带清晰为止。采用凝胶成像系统进行密度扫描和相对 定量分析。 2 9 总r n a 提取及r t - p c r 采用t r i z o l 法提取p c 3 细胞总r n a ，将1m lt r i z o l 直接加入各组细 胞培养瓶中，用移液器吹打数次以促进细胞裂解。将细胞裂解液移至e p 管中，加入2 0 0l x l 氯仿，盖紧管盖并将e p 管颠倒混匀约1 0s ，室温静置 2m i n 后于4 c 下1 2 0 0 0 r p m 离心1 5m i n 。将水相移至一新管中，加入1m l 异丙醇沉淀r n a 。2 0 。c 沉淀样品过夜，于4 c 条件下1 2 0 0 0r p m 离心样 品1 5m i n 。移去上清，加入7 5 乙醇洗涤沉淀，之后于4 c 条件下7 5 0 0r p m 离心1 0m i n 。去上清，干燥r n a 沉淀后，将r n a 溶解于约2 0 ld e p c 处理水中。 使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳鉴定r n a 浓度及纯度。取等 量r n a 加入d e p c 处理过的p c r 管，加入o l i g od t 、d n t p ，7 0 变性 1 0r a i n ，迅速冰上遇冷5m i n ，短时离心，依次加入5 xr tb u f f e r 、r n a s e i n h i b i t o r 、m m l v 逆转录酶，建立反转录反应体系。轻轻混匀，短时离心。 4 2 温浴lh ，9 4 加热5m i n 终止反应，之后立即置于冰上降温。随后， 以c d n a 为模板，进行p c r 检测以下各指标的m r n a 水平。引物序列如 下： v c a m 1 上游引物5 - c a a a t c c t t g a t a c t g c t c a t c 3 下游引物5 - t t g a c t t c t t g c t c a c a g c 3 1 3 - a c t i n上游引物5 - c c t t c c t g g g c a t g g a g t c c t g 3 下游引物5 - g g a g c a a t g a t c t t g a t c t t c 3 p c r 总反应体系为2 0m ，包括l 山逆转录产物，以上各引物( 1 0p m 0 1 ) 各取2 “l ，d n t p ( 2m m o l l ) 1p l ，i o x p c r 反应缓冲液( 含t r i s h c l1 0 0 m m o l lp h 8 4 ，m g c l 21 5m m o l l ，b s a2 0p g m l ，k c i5 0 0 m m o l l ) 2 “l ， t a qd n a 聚合酶( 5u t 1 ) 0 2p l ，无菌水补齐至2 0 斗1 。 p c r 扩增条件： 9 4 预变性5m i n ，而后9 4 c 变性3 0s ，5 3 退火3 0s ，7 2 延伸3 0 s ，3 0 个循环之后，7 2 再延伸1 0m i n ，扩增片段长度为1 2 4b p 。 研究论文 以1 3 - a c t i n 为内参照，扩增长度为2 0 2b p 。p c r 扩增产物用2 琼脂 糖凝胶电泳分离后，扫描成像，用凝胶成像分析系统进行密度分析，分别 计算v c a m 1 扩增片段和1 3 - a c t i n 条带的积分光密度( i n t e g r a lo p t i c a l d e n s i t y ，i o d ) 。以v c a m 1 扩增片段p a c t i n 的i o d 比值进行半定量