（发酵工程专业论文）虫草液体发酵及提高腺苷含量的研究.pdf

摘要 摘要 本实验通过筛选比较5 株冬虫夏草菌种，获得液体发酵生产冬虫夏草腺苷的较佳菌株 w x c s 。 研究了冬虫夏草w x c s 的摇瓶发酵培养基和培养条件。分别以蚕蛹粉水解液和花生粉 作为发酵培养基不同氮源进行正交实验，确定出影响腺苷含量的主要因素，进一步通过响 应面分析实验对蚕蛹粉水解液培养基进行优化，最后通过s a s 软件进行岭脊分析。得到两 种培养基：培养基a 为葡萄糖2 o ，花生粉1 5 ，麦芽糖1 o ，蚕蛹粉1 o ；培养基 b 为葡萄糖1 5 。麦芽糖0 8 ，蚕蛹粉o 5 l ，蚕蛹粉水解液2 5 。培养基a 发酵菌丝 体腺昔含量低，但菌体干重大：培养基b 发酵菌丝体腺苷含量高，菌体干重小。最佳培养 条件为：起始p h6 o ，培养温度2 2 ，摇瓶转速为1 5 吲m i n ，最佳培养时间8 4 h 。在上述 条件下，培养基a 和培养基b 发酵菌丝体腺苷含量分别为1 5 0 7m g 佗和3 0 0 lm g g ，菌体 干重分别为4 0 2 6 9 ，l 和2 2 ，1 6 9 ，l 。 以培养基a 进行了3 0 l 发酵罐放大实验，发酵罐培养条件：接种量l o ，转速 1 5 0 一2 0 0 r m i n ，通风o 5 一o 8 v m ，温度2 2 ，装液量2 0 l ，罐压o 0 5 m p a 。在此条件下发酵 6 0 h ，核苷类物质紫外o d 值0 9 5 9 ，腺苷含量为1 8 5 l m g ，菌体干重达到3 9 8 9 9 ，l 。 在培养基b 基础上，研究了不同预处理方法对腺苷含量测定的影响。采用热水浴浸提 法时，最佳的工艺条 牛为：浸提溶剂为7 5 甲醇，料液比1 ：5 5 ，浸提温度5 0 ，浸提时 间9 0 m i n 。在上述条件下，测得腺苷含量可达3 6 8 3 m g ，g 。 采用高压液相色谱法测定了冬虫夏草w x - c s 胞内核苷类物质含量，培养基a 发酵菌 丝体腺苷含量为l 1 85 lm g 、尿苷含量为3 2 6 3m g g 、鸟苷含量为2 3 2 2 m g ，g ：培养基b 发 酵菌丝体腺苷含量为4 0 9 2m g ；腺苷含量分别是药典规定的l8 5 0 倍和4 0 9 2 倍。 最后测定了冬虫夏草w x - c s 菌丝体中的其他有效成分，培养基a 发酵菌丝体甘露醇 含量为7 5 3 ，s o d 酶酶活为3 5 8 9 u 缱；培养基b 发酵菌丝体测得胞内含有1 7 种氨基酸， 其中必需氨基酸含量占氨基酸总量的4 0 4 3 ，甘露醇含量为6 7 5 ，s o d 酶酶活为 5 1 5 4 u 幢：与市场现有产品进行了比较，培养基b 菌丝体腺苷含量为金水宝胶囊的1 2 5 倍， 培养基b 菌丝体腺苷含量也高于百令胶囊；甘诺醇含量以百令胶囊最高，两种样品甘露醇 含量与金水宝相当，s o d 酶酶活以培养基b 发酵菌丝体最高，其次是培养基a 发酵菌丝 体，酶活分别是金水宝的2 4 j 4 和1 6 9 倍，百令胶囊的1 9 l 和1 3 3 倍。 实验中发现使用不同蛋白酶水解蚕蛹粉得到的水解液作为发酵培养基，菌丝体胞内核 苷类物质种类和腺苷含量均不同。蛋白酶】水解液发酵得到胞内核昔类物质单一，主要为 腺苷；蛋白酶n 水解液发酵得到胞内核苷类物质成分较多，菌丝体腺苷含量较蛋白酶i 水 解液低。蚕蛹粉和脱脂蚕蛹粉以蛋白酶i 水解，水解液作为培养基成分发酵，得到菌丝体 干重和腺苷含量也不相同，蚕蛹粉在上述两方面均高于脱腊蚕蛹粉。 关键词：冬虫夏草，液体发酵，腺苷，活性成分 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t b yc o r n p 舐s o no f 矗v ed j 丘毫r e n t d b e ，即葡萄糖是 主要影响因素，蚕蛹粉次之，花生粉和麦芽糖的影响较小，a b c d 四个因素的理论最优组 合为a 3 b l c 3 d 3 ，即葡萄糖2 0 ，花生粉1 5 ，麦芽糖2 0 ，蚕蛹粉1 0 。菌体千重为 4 0 2 6 9 ，l ，腺苷含量为1 5 0 7 m g 。从实验结果分析得知，当麦芽糖添加量大于1 0 时，对 0 d 值的影响不明显，从成本考虑，将麦芽糖固定在1 o ，最后确定a b c d 四个因素的组 合为：葡萄糖2 o ，花生粉1 5 ，麦芽糖1 o ，蚕蛹粉1 o ，定为培养基a 。 2 蚕蛹粉水解液作为发酵培养基成分对腺苷含量的影响 选用葡萄糖、麦芽糖、蚕蛹粉和蚕蛹粉永解液四个因素，各取三个水平，以腺苷含量 为指标，进行l 9 ( 3 4 ) 正交试验，其实验设计及分析结果见表2 - 8 和表2 9 。 趴 粥 7 6 7 n n c ； ， 。 ： 啪 研 l 互 互 m 2 7 9 7 ： ， 吃 l 王 z n l 8 0 ， ， ： ， 吃 孵 五 王 l m 6 o 2 6 0 ， ， 虻 加 如 l l z n 鼬 她 勋 r 7 8 9 直 d0 釜三主垒皇墨芏鋈墨堡鲞墨笠塑堑壅 表2 - 8 正交实验因子水平表l 9 ( 3 4 ) t a b l e 2 8n l e 诅b l eo f f a c t o ra r i dl e v e li l lb ( 3 4 ) o n l l o g o n a le x p 醯n e m 11oo 51 5 21 5lo 7 52 5 3 2 213 5 极差分析表明，各因素对虫草腺苷含量的影响程度为：a c b d ，即葡萄糖是影响腺 昔含量的主要因素，蚕蛹粉次之，随后是麦芽糖，蚕蛹粉水解液的影响最小，a b c d 四个 因素的最优组合为a 2 8 2 c l d 2 ，即葡萄糖1 5 ，麦芽糖1 o ，蚕蛹粉0 5 ，蚕蛹粉水解液 2 5 。 由极差分析得知，蚕蛹粉水解液对腺苷含量影响最小，因此将其浓度水平固定在2 5 ， 葡萄糖、麦芽糖及蚕蛹粉三个主要因素通过响应面试验进一步优化它们的浓度配比。 江南大学硕士学位论文 2 3 3 4 响应面试验优化最佳培养基 l 确定实验点 通过正交实验得知，葡萄糖、麦芽糖及蚕蛹粉三个因素对腺苷含量有着最重要的影响。 采用响应面分析，找出各因素及其之间的交互作用对腺苷含量的影响。因素的水平取值具 体如表2 1 0 ： 表2 1 0 响应面分析试验因素水平表 1 a b 2 - l o1 曲l eo f 6 l c t o r 强dl e v e li nr e s p 0 i l s e 飘j t f 犯em e t h o d 锄“y s i s 根据b o x b e i l l l i l i 【e n 的中心组合实验设计原理，进一步进行三因素三水平的响应面分析 实验，1 5 个实验点给出的实验结果如表2 1 1 所示。1 5 个实验点可以分为两类，其一是析因 点，自变量取值在x 1 、x 2 、x 3 所构成的三维顶点，共有1 2 个分析点；其余三个是零点， 为区域的中心点，零点试验重复3 次，用以估计试验误差。 2 数据分析 本试验采用s a s 来分析实验结果。分别以腺苷含量( m g ，g ) 及菌体干重( g l ) 为响应值， 考察三个因素对响应值的影响。根据表2 1 l 的试验结果，用s a s 统计分析软件进行多元回归分 析，所得的主要分析结果见表2 1 2 ，2 1 3 。从方差分析表中可以看出，对于以腺苷含量y l 为 响应值的回归方程中，方程的一次项、二次项及交互项的影响都是显著的，但以菌体干重y 2 为响应值的方程只有一次项是显著的，二次项及交互项作用影响均不显著。本次实验结果亦 说明，葡萄糖、麦芽糖及蚕蛹粉三个主要因素之间的相互作用关系对腺苷含量及菌体干重的 影响变化趋势并不一致，既菌体干重最高时腺苷含量并不是最高的，这可能与腺苷代谢有关。 由于腺苷含量是决定腺苷产量的主要因素，而且通过对实验结论分析得知，以腺苷含量为响 应值拟合的方程比以菌体干重为响应值拟合出的方程可信度更高，方程决定系数达到9 8 2 ， 结果能很好反映实际情况。因此，以腺苷含量为响应值对实验因子进行回归拟合，回归方程 如下： y 1 = 2 4 2 8 5 2 6 0 0 3 2 6 8 3 + x 1 一o 0 7 9 4 9 2 + x 2 + 0 0 6 6 7 5 1 + x 3 一o 1 7 8 3 7 3 + x 1 + x 1 + 0 0 7 9 2 1 5 + x l + x 2 o 0 4 3 7 6 2 + x 1 + x 3 + 0 0 0 6 0 9 3 + x 2 + x 2 + 0 0 3 7 6 6 9 + x 2 + x 3 一o 1 7 7 8 1 9 + x 3 + x 3 根据上述回归方程作出等值线及图响应面分析图，见图2 5 。 6 第二章冬虫夏草深层培养条件的研究 表2 1 l 响应面分析试验结果 t a b 2 - 1 1e x p e 血l e md e s i 驴a n dr c s u l to f r e s p o i l s es u r f a c em e t l i o d 锄a l y s i s 表2 1 2 回归方程偏回归系数的估计值 参数自由度参数估计y 1参数估计y 2 江南大学硕士学位论文 表2 1 3 回归方程方差分析表 ! ! ! ：三：! i ! 生! 竺! ! 型邕! 12 1 堡竖堡! ! i ! 翌! 旦型! ! 呈 回归项自由度平方和y l平方和y 2f 值y lf 值y 2 注：显著性在0 1 ，“显著性在1 o ，显著性在5 0 3 寻取最优值 通过岭脊分析，得出回归模型存在最大值点，y 1 的最大估计值为2 4 7 7 m g ，各因素的取 值分别为：葡萄糖为1 4 2 、麦芽糖为0 6 7 、蚕蛹粉为o 5 l ；y 2 的最大估计值为2 2 7 2 9 ，l ， 各因素的取值分别为：葡萄糖为1 5 7 、麦芽糖为1 0 2 、蚕蛹粉为0 5 1 ，定为培养基b 。 根据数据分析，综合考虑腺苷含量和菌体干重两个指标，确定最适培养基为葡萄糖1 5 ，麦 芽糖0 8 ，蚕蛹粉0 5 l 。在以上优化条件下进行验证试验，共进行三批次2 5 0 m l 摇瓶试验， 结果见表2 一1 4 。证明分析结论与结果相符和，腺苷产量达到5 4 8 2 9 l 。 表2 1 4 优化条件下的验证实验 t 曲2 - 1 4v 甜i d a t i o ne x p e r i m e n to f o p m i z a t i o nc o n d i t i o n s r x e di e 忡i s ： 蚕蟠葡= o 5 第二章冬虫夏草深层培养条件的研究 图2 5 响应面法立体分析图 f 远2 5a n a l y s i si m a g eo f r e s p o n s es u r f a c em e t h o d 2 3 3 5 玉米浆粉和酵母粉对虫草腺苷产量的影响 玉米浆粉和酵母粉都富含丰富的营养因子，通过均匀实验考察二者对腺苷含量的影响。 实验方案及结果如表2 1 5 ： 表2 1 5 均匀设计实验表 t a b 2 15a n a l v s i so f u n i f o m l i t yd e s i n ee x d e r i m e n t 因素玉米浆粉酵母粉腺苷含量菌体干重 实验号、 ( m g )( g l ) 1 o o 11 8 3 92 3 8 1 2o 1o 32 4 0 62 3 0 9 3o 2o1 8 4 42 3 2 3 4o 3o 22 5 0 82 3 5 6 50 40 42 3 6 52 2 2 2 对照 002 4 7 02 2 1 5 均匀设计的特点是均匀分散，通过少量实验可以做每个因素的多个水平实验，寻求最优 工艺条件的简捷方法是直观分析法。通过分析可以看出，玉米浆粉和酵母粉的添加均有利 于菌体生长，但并不一定有利于腺苷合成，选择在培养基中添加玉米浆粉o - 3 ，酵母粉 1 9 江南大学硕士学位论文 0 2 ，腺苷产量可以达到5 9 3 0 8 m g l 。 2 3 3 6 无机盐对虫草腺苷含量的影响 无机盐是微生物活动不可缺少的物质，其主要功能是构成菌体的成分，作为酶的组成 成分，酶的激活剂或抑制剂，调节培养基的渗透压、p h 和氧化还原电位。其中，k + 、m g ” 对药用真菌液体培养菌丝的生长及腺苷的合成有促进作用。为此，分别将不同浓度的 k h 2 p 0 4 和m g s 0 4 5 h 2 0 添加到培养基中，为了考察多水平，实验采用均匀设计，具体方 案及结果如表2 1 6 ： 通过分析可以看出，原有无机盐添加量( 对照) 对于发酵培养基为最适添加量。对菌 体量来说，磷酸二氢钾浓度和硫酸镁浓度的增加，菌体于重变化不大；而二者的添加比例 对腺苷产量影响较大，这表明适宜的磷酸二氢钾浓度和硫酸镁浓度有利于虫草腺苷的产生 与分泌。 表2 1 6 均匀设计实验分析表 t a b 2 一1 6a n a l y s i so f 砌f o 珊毋d e s i n ee x p e r i m e n t 因素磷酸二氢钾硫酸镁腺苷含量菌体干重 实验号 ( m g )( g l ) 1o 10 1 51 8 2 2 2 2 4 7 20 3o 3 52 4 3 62 3 1 6 3o 5o 0 52 4 9 92 3 4 2 4o 7o 2 51 9 7 l 2 3 2 3 5o 9o 4 5 2 4 5 32 2 8 5 对照 0 1o 0 52 5 0 42 3 5 i 2 3 4 摇瓶发酵条件的优化 2 3 4 1 起始p h 对虫草液体发酵的影响 p h 是影响发酵过程的重要参数之一。p h 值的变化不仅影响菌丝体量和目标产物的产 量，而且d h 值还影响培养基中有机化合物的离子化和营养物质的溶解度，从而影响微生 物对基质的利用速度。此外，p h 值还会影响微生物细胞膜的电荷状况，引起膜的通透性的 变化，从而影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的积累。为了确定w x c s 最适起始 p h ，我们采用了不同的起始p h ，得到的实验结果见表2 1 7 。 2 0 第二章冬虫夏草深层培养条件的研究 ， 表2 一1 7 起始p h 对虫草液体发酵的影响 t a b 2 一1 7e 彘c t so f i l i i t i a lp ho f m e d i 啪o n l i q u i df e 咖e 删i o no f g d 咖j 胁e 脚捃 从表2 1 7 可以看出，p h 既影响菌体的生长，也影响腺苷的合成，菌体生长所需要的最 适p h 和腺苷合成所需要的最适p h 是不一样的，在起始p h 6 0 时，腺苷含量最高，而在p h 5 0 时，菌体量最大。因此结合虫草菌体生长和腺苷合成情况，控制起始p h 为6 o 最好。从终 了p h 可以看出，尽管发酵初期时p h 相差很大，但其终了p h 在4 9 5 6 之间作小范围的波 动。这说明虫草自身体系有很强的p h 调控能力，在一定的p h 范围内，能将p h 调整到合 适自身菌体生长和产物合成的范围内。 2 3 4 2 温度对虫草液体发酵的影响 温度是发酵过程中重要的影响因素之一，本实验在2 0 、2 2 、2 4 、2 6 、2 8 等 5 个温度条件下，研究温度对虫草液体发酵的影响，结果如图2 6 ： 3 2 菩2 舞z 扭 毯2 2 2 5 2 4 一 是 2 37 蚓 2 2 悱 投 2 1 橱 2 0 1 8 2 0 2 22 42 62 83 0 温度( ) + 腺苷含量( m g g ) + 菌体干重( g l ) 图2 - 6 发酵温度对虫草液体发酵的影响 f i g 2 6e 丘e c t so f c l l l t 山et e m p e r a t i l r eo nl i q l l i df e 肿e n t a t i o no f c d 咖哆p s5 加e ，堪妞 从图2 6 中可以看出，在2 2 时菌丝体生长最好，腺苷也在2 2 时含量最高。但当温 度过高或过低，均会使菌丝体量及腺苷含量降低。 2 1 江南大学硕士学位论文 2 3 4 3 装液量对虫草液体发酵的影响 装液量的不同主要影响到溶氧大小，装液量小时，其液面较低，溶氧较充分；而当装 液量多时，其液面较高，会影响液面以下的溶氧状况，使整体的溶氧程度降低。为了确定 w x c s 菌株发酵的最适装液量，在2 5 0 i i ：l l 的三角瓶中分别装入不同体积的培养基，按相同 比例接入种子液，然后对测定结果进行比较，实验结果如图2 7 所示： 3 3 0 2 5 2 0 之 3 1 51 踟 卜 1 0 蛙 涠 5 0 02 55 07 5 1 0 01 2 5 1 5 0 装液量( m 1 ) + 腺苷含量( m g g ) + 菌体干重( g 几) 图2 7 装液量对冬虫夏草液体发酵的影响 f i g 2 7e 雎c t so fv o l 岫eo fm e d i 啪o n1 i q u i df e 珊e n t a t i o no fc d 咖印s 占f 九e 5 括 从图2 7 中可以看出，在装液量小于7 5 m l 时，随着装液量的增加，茵体干量逐渐提高， 腺苷合成也大幅提高；在装液量大于7 5 m l 后，菌体干重下降，腺苷含量大幅下降，说明 溶氧对腺苷合成代谢影响较大。溶氧适当既有利于腺苷合成也有利于菌体生长，故选取装 液量为7 5 m l 。 2 3 4 4 接种量对虫草液体发酵的影响 适宜的接种量是微生物生长和产物积累的前提。为确定最佳的接种鹭：选取2 、5 、 8 、l o 和1 5 的接种量进行实验，其结果如图2 8 所示。 奄5嘲扣牡琶 第二章冬虫夏草深层培养条件的研究 3 5 毫3 吲2 5 l 枷2 毯 1 5 468l o1 21 41 6 接种量( ) + 腺苷产量( m g l ) + 菌体干重( g 几) 2 5 2 4 2 4 2 3 2 3 2 2 2 2 毫 3 删 融 基 暖 图2 - 8 接种量对虫草液体发酵的影响 f i 9 2 8e 虢c t so f i n d c u l 啪s i z eo ni j q u i d 融m e n t a t i o no f ( 0 嘲牌芦曲聊坫西 由图2 8 中可以看出，当接种量从6 增加到1 2 时，腺苷含量和菌体干重都大幅增加， 且菌体干重变化也较大，当接种量超过1 2 后，二者均下降，但从图中的趋势看，下降幅 度相对较小，说明当接种量增加到一定程度后，菌体生长受到影响，从而影响代谢产物腺 苷的积累。因此考虑到种子液的需要量、菌体干重和腺苷含量等因素，本实验中采用1 2 的接种量。 2 3 4 s 摇床转速对对虫草液体发酵的影响 摇床转速对于摇瓶发酵而言。主要是影响溶氧大小，对以后的扩大发酵中溶氧的控制有 一定参考价值。分别选取了l o or ，m i n 、1 2 5 “i n i n 、1 5 0 “f n i n 、1 8 0 r m i n 进行实验，结果如 图2 9 所示。 o 3 倒 缸 栖 骚 3 5 3 0 2 5 2 4 2 3 蚓 h - 3 z z 蒿 2 1 2 0 朽1 0 01 2 51 5 0 1 7 52 0 0 摇床转速( r m i n ) + 腺苷含量( m g g ) + 菌体干重( g l ) 图2 9 摇床转速对虫草液体发酵的影响 f i g 2 9e 髋c t so f i n o c i l l u i l ls i z e0 nl i q u i df e 瑚e n t a t i o no f c o 埘阳弘s 加e 琳括 2 3 江南大学硕士学位论文 从图2 9 中可以看出，随着转速的增加。菌体干重和腺苷含量都大幅增加，菌体干重增 加幅度又较腺苷大，在转速达到1 5 0 r 玎【l i i l 时腺苷含量和菌体干重均达到最大，当转速进一 步增加，二者均下降，其中从图中趋势看菌体干重较腺苷含量下降的快，可能是因为转速 增大后腺苷合成受到的影响较菌体干重小，腺苷含量变化较小，但腺苷产量由含量和菌体 干重共同影响，最终导致腺苷产量下降。 2 3 4 6 优化后摇瓶培养的发酵过程曲线 在上面的摇瓶发酵工艺条件优化的基础上，在2 2 ，1 5 0 r m i n ，装液量7 5 m 抛5 0 m l ， 接种量1 2 ，培养6 天，测定不同时间的菌体量、腺苷含量、还原糖和p h ，以确定最适发 酵周期。其实验结果见图2 1 0 ，2 1 l 。 从图2 1 0 和图2 1 l 可以看出，在发酵过程中，随着摇瓶培养时间的延长，菌丝体量不 断增加，到第6 0 h 达到最大值，菌丝体干重为2 4 6 2 4 9 l ，再继续培养，菌丝体干重下降。 发酵液中腺苷随着培养时间的延长，开始合成，在第8 4 h 达最大值，含量为3 0 0 1 m g g ，腺 苷产量也达到最大值，为7 l ，7 9 4 m g ，l ，此后产量呈下降趋势。还原糖含量随着发酵进程不 断下降，且下降幅度很大，在6 0 h 以后，还原糖低于l g l 。发酵液的p h 从一开始下降，到 第7 2 h 时，p h 由初始6 0 降至最低4 3 9 ，随后p h 开始回升。由摇瓶培养的发酵过程曲线 可以看出，发酵时间在3 4 d 时，结束发酵，就可获得较高的菌丝体和腺苷产量。 3 0 3 2 5 2 0 蚓 蛊1 5 避l o 饕s 蝌0 02 4 培养时间( h ) + 还原糖( e l ) * 一菌体干重( g l ) + p h 值+ 腺苷含量( m g g ) 图2 1 0 虫草摇瓶发酵周期曲线 f i g 2 1 0t i m e c o u r s eo f c d r 咖c 印sj m 邸哼括i ns h 越n gn a s kc u l t u r e 18山v卿舡枷殛 避暑 9 8 7 6 5 4 3 2 l 0 第二章冬虫夏草深层培养条件的研究 7 5 3 6 0 釜 04 5 捌 l 3 0 垃 毯1 5 0 01 22 43 64 86 07 28 49 61 0 8 1 2 0 1 3 2 1 4 4 1 5 6 时间( h ) + 腺苷产量( g 几) 图2 一1 1 腺苷产量曲线 f i g 2 1 17 r i m e c o u r s eo f a d e n o s i n ey i e l di ns h a k i n gf l a s kc u l t u r e 2 43 0 l 发酵罐的扩大培养 由于花生来源广泛，价格较蚕蛹粉低，而腺苷产量也很高，所以本实验以菌株w x c s 为种子，以发酵培养基a 为配方，进行了3 0 升发酵罐放大实验，经多次上罐试验调整得发 酵罐培养最优条件：接种量l o ，转速1 5 0 2 0 0 r m i n ，通风0 5 o 8 v v m ，温度2 2 ，装液量 2 0 l ，罐压o 0 5 m p a 。由于花生培养基发酵产生的核苷类物质种类较多，所以腺苷含量以紫外 2 6 0 i l i n 一核苷类物质最大吸收波长处测得的o d 值为指标。在优化后培养基和培养条件下， 作3 0 l 发酵罐放大试验，其中一个批次发酵过程曲线见下图。由于其中一批次的发酵曲线见 图2 1 l 。 从图2 1 2 可以看出，虫草在生长过程中，经过短暂的调整期进入迅速生长期，这时发 酵液渐渐变粘，在发酵3 6 h 左右菌体量达到最大，之后下降并逐渐进入衰退期；溶氧下降 很快，在发酵1 0 h 左右时达到很低，之后基本处于不变，这说明菌体生长很旺盛；还原糖 在发酵初期下降较快，发酵2 4 h 后基本维持在一个很低的水平；p h 在1 2 h 后迅速下降，最 低为3 1 0 ，这主要是随着菌体的发育、生长和繁殖，大量的营养基质被代谢分解，有机酸 积累，从而导致p h 下降。在随后的阶段p h 处于3 1 0 左右，虫草在这个阶段进行核苷类物 质合成，6 4 h 后p h 迅速回升。 在整个发酵过程中，以还原糖不再下降和发酵液p h 回升作为终止发酵的根据，结果如 下：菌体干重达到3 9 8 9 9 l ，核苷类物质紫外o d 值0 9 5 9 ，腺苷含量为1 8 5 1 m g 幢，菌丝 体甘露醇含量为6 1 l ，+ s o d 酶酶活3 2 7 6u ，g 。 一一 兰鱼查兰型主量堡垒圭 5 0 4 0 疑3 0 登墨。 枢 l o o 2 - 5 主要结论 6 o o1 22 43 64 86 07 2 培养时问( h ) + 还原糖( g l ) * 菌体干重( g l ) + p h 值+ 0 喵 图2 1 23 0 l 发酵罐发酵曲线 f i g 2 - 1 2f e m e n t a t i o np e r f b m 锄c ei n3 0 lf b m e n t e r 1 本文通过液体发酵培养淘汰了生长较弱的k m 、y c s 、b c s 、4 株菌株，得到生长较 快、胞内腺苷产量较高的w x c s 菌株。 2 实验发现，使用不同蛋白酶水解蚕蛹粉得到的水解液作为发酵培养基，菌丝体胞内核苷 类物质种类和腺苷含量均不同。蛋白酶i 水解液发酵得到胞内核苷类物质单一，主要为腺 苷；蛋白酶i i 水解液发酵得到胞内核苷类物质成分较多，菌丝体腺苷含量较蛋白酶i 水解 液低。蚕蛹粉和脱脂蚕蛹粉以蛋自酶i 水解，发酵得到菌丝体千重和腺苷含量也不相同， 蚕蛹粉从上述两方面均高于脱脂蚕蛹粉。 3 通过正交实验及响应面分析实验对冬虫夏草w x c s 菌株的发酵培养基配方进行了优化， 得到培养基a 组成为：葡萄糖2 o ，花生粉1 ，5 ，麦芽糖1 o ，蚕蛹粉1 o ：培养b 组成为：葡萄糖1 5 ，麦芽糖0 8 ，蚕蛹粉0 5 1 ，蚕蛹粉水解液2 5 ：其它成分相同 为：玉米浆粉o 3 ，酵母 l ! ； 0 2 ，k h 2 p 0 1 ，m g s 0 4 7 h 2 0q 0 5 ，最终摇瓶发酵 腺苷含量分别达到1 5 0 7m g 和2 4 7 3 m g ；菌体干重分别达到4 0 2 6 9 l 和2 2 1 6 9 l 。 4 以培养基b 对冬虫夏草的摇瓶发酵工艺条件进行了优化，得到最佳培养条件为：起始p h 6 0 ，培养温度2 2 ，装液量7 5 m l ，2 5 0 m l ，接种量1 2 ，摇瓶转速为1 5 0 r m i n ，最佳培养 时间8 4 h 。在这些条件下，其腺苷含量和菌体干重分别为3 0 0 1 m g ，l 和2 3 9 2 6 9 l 。 5 以花生粉为主要氮源的培养基进行了3 0 l 发酵罐放大实验，得出发酵罐培养条件：接种 量1 0 ，转速1 5 0 2 0 0 r m i n ，通风o 5 一o 8 v v m 温度2 2 ，装液量2 0 l ，罐压o 0 5 m p a 。在 此条件下发酵6 0 h ，核苷类物质紫外o d 值0 9 5 9 ，腺苷含量为1 8 5 l m g ，菌体干重达到 3 9 8 9 9 ，l 。 覃loou蚓如牡鬻 留毛 5 5 4 3 l 第三章提取工艺对腺苷含量的影响 3 1 引言 第三章胞内腺苷含量测定预处理方法的优化研究 真菌经深层发酵产生大量菌丝体和发酵液，它们的化学成分复杂，种类繁多。虫草核苷 类物质，尤其是腺苷是其中的主要药用成分，对于其核苷类活性成分测定的预处理方法会 导致其失活，不能较准确的澳0 定其含量。 不同预处理方法对腺苷含量测定结果有很大影响，如提取溶剂、提取温度、提取时间、 料液比等。为此，我们对预处理过程中影响虫草腺苷含量的各个因素进行了研究，并运用 正交试验对工艺参数进行了优化，旨在建立一套既简便又能最大限度始获取虫草腺苷含量 的方法。 3 2 实验材料与方法 3 2 1 实验材料 经深层发酵所得的虫草菌丝体 3 2 2 主要仪器 j y 9 2 超声波细胞破碎机宁波新芝生物科技股份有限公司 匀浆机韩国l g 公司 其它设备同第二章。 3 2 3 实验方法 3 ，2 3 1 腺苷膝苷含量的计算 腺苷含量( m g 幢) = 腺苷( m g ) 菌体干重( g ) 3 2 3 2 腺苷检测方法 同第二章 3 3 结果与讨论 3 3 1 不同提取方法对腺苷含量的影响 因为虫草腺苷存在于菌丝体内，需要进行破碎，才能将胞内腺苷尽可能地完全提取出 来。所以本实验对超声波、热水浴浸提和回流三种提取方法及提取时间进行比较，其结果 见表3 1 。 江南大学硕士学位论文 表3 - l 提取方法对腺苷腺苷含量的影响 t a b 3 一le f r e c t so f 脚嬲斌i o nm e m o d so na d e n o s i n ec o n t e n t 从表3 1 中可以看出，当超声波时间超过3 0 m i n 后，可能由于变幅杆造成溶液局部高 温，破坏了腺苷成分，使得腺苷含量大幅下降，其最大腺苷含量比水浴浸提法要低，且超 声波法不宜在工业中大规模使用；当采用回流法时，随着回流时间的增加，腺菅含量逐渐 增加，但与水浴浸提法相比，相同时间内提取效果要差：水浴浸提随着时间增加，腺苷含 量变化不大，相对其他两种方法其腺苷提取效果要好一些，因此综合考虑，选择水浴浸提 法，浸提时间为9 0 m 试进行下一步实验。 3 3 2 虫草菌丝体腺苷含量测定预处理工艺的优化 3 3 2 1 不同浸提溶剂及溶剂浓度对腺苷含量的影响 根据核苷类物质的在不同溶剂中的溶解性不同，选择了水、甲醇和乙醇三种溶剂及不 同溶剂浓度进行了比较，结果如表3 - 2 所示。 从表3 - 2 可以看出，腺苷在有机溶剂甲醇和乙醇中的溶解度大于水，在甲醇中的溶解度 大于乙醇，并随着甲醇浓度的增加，腺苷含量迅速增加，在浓度7 5 时达到最大，为 3 1 4 l m g 佗，甲醇浓度进一步增加后，腺苷含量明显下降，可能是由于有机溶剂及其浓度改 变了细胞壁或细胞膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来。故选取7 5 甲醇作为提 取剂进行下一步实验。 第三章提取工艺对腺苷含量的影响 表3 2 浸提溶剂和溶剂浓度对腺苷含量的影响 t 抽3 二2e 船c t so f d i 彘r e n to r g a i l i cs o l v e n to na d e n o s i n ec on _ t e n t 3 3 2 2 不同浸提温度对腺苷含量的影响 在浸提过程中，温度对提取的效果影响很大，故需确定合适的浸提温度。本实验分别在 4 、2 5 、5 0 、8 0 等不同温度下提取9 0 m i n ，结果见图3 1 。 e v 蛹 缸 垃 氆 02 04 06 0 温度( ) 图3 - l 提取温度对腺苷含量的影响 f i g 3 - le 仃b c t so f t e m p e m n l r eo na d e n o s i n ec o n t e m 从图3 - 1 中结果可以看出，随着温度的升高，腺苷含量逐渐升高。当温度为5 0 时， 其腺苷含量达到最大值，较2 5 提高了1 6 ；当温度升至8 0 时，腺苷含量下降，可能是 温度过高对腺苷造成了破坏。采用浸提温度s o 为宜。 4 2 ，3 8 6 4 2 3 3 2 2 2 2 江南大学硕士学位论文 在虫草腺苷的提取过程中，所添加的料液比对提取效果有较大的影响。在实验中分 成五组每组按7 5 早醇体积与同等质量的湿菌丝体比分别为2 ：1 、3 ：1 、4 ：1 、5 ：1 、 6 ：l 调配，在5 0 下提取9 0 m i i l ，然后测定腺苷含量，结果如下： 3z 5 3 1 5 o 童3 0 5 篓2 r 9 5 瞰2 8 5 2 ，7 5 34 5 6 _ 涟料比 图3 2 料液比对腺苷含量的影响 f 嘻3 1 2e 丘色c l so fa d d m gs o l v e mv 0 l 啪eo na d e n o s i n ec o m e n t 由图3 2 可知，溶剂添加量是影响腺苷提取效果的一个重要因素。当加液量从2 ：1 增 加至5 ：1 时，腺苷含量有明显提高，再增加液料比，反而使腺苷含量下降，同时也增加了 浓缩工艺的困难，因此选用料液比为l ：5 较好。 3 3 ，2 4 正交实验确定虫草腺苷含量测定预处理条件 根据以上单因素实验结果，在实验中采用l “3 3 ) 正交实验，进行了浸提时间、温度和 料液比正交实验，从而得到腺苷含量测定预处理的最佳工艺条件。其实验设计及分析结果 见表3 3 和表3 4 。 由正交实验结果分析可知，在实验所选的水平范围内，各因素对腺苷含量影响的主次 顺序为：c b a ，影响最大的是c 辩液比，其次是b 浸提温度，最小的是c 浸提时间。最 优组合为a 2 8 2 c 3 ，即在5 0 温度下，加入菌丝体质量5 5 倍的7 5 甲醇，浸提9 0 m i n ，所 得菌丝体腺苷含量可达3 6 8 3 m g 幢。 表3 3 正交实验因子水平表b ( 3 3 ) t a b 3 3t h et a b l eo ff a c t o ra i l dl e v e 】i l 】b 0 3 ) d n l ) d g o n a je x p 盱洒e 丑t 水平 因素a 时间m i n b 温度- c 料液比 1r 04 01 ：4 5 2 9 05 0l ：5 o 3 0 墨三主壅塾三兰壁堕茎全量堕墅堕 表3 - 4 正交实验结果的极差分析 t a b 3 - 4e 船e m ev a l u e 趾a l y s i so f o m l 0 9 0 n a le x p e 抽e n t 实验 舅妻腺苷含量( m g ) a bc 1 1 2 2 3 9 2 9 7 9 5 1 4 9 0 4 3 2 3 l 2 3 l 2 3 8 9 3 5 9 4 9 6 9 4 2 3 2 j 2 l 3 1 2 8 5 3 l 9 2 8 4 l o 0 3 9 2 9 2 1 3 0 7 1 3 3 0 5 2 9 6 3 3 6 8 3 2 8 6 8 3 0 5 1 2 7 4 2 3 ，2 5 0 r ! - 4 7 1 o 5 6 l1 5 0 8 3 4 主要结论 1 通过对超声波、热水浴浸提和回流三种提取方法对冬虫夏草菌丝体腺苷含量的比较， 结果发现采用热水浴浸提法对冬虫夏草菌丝体腺苷提取较回流和超声波处理效果好。 2 比较了不同预处理工艺条件对腺苷含量测定的影响，优化了腺苷含量预处理工艺条件， 得到了最佳的工艺条件为：浸提溶剂为7 5 甲醇，料液比1 ：5 5 ，浸提温度5 0 ，浸提时 间9 0 m i i l ，在上述预处理条件下测得的腺苷含量为3 6 8 3 m g 。 2 3 4 5 6 7 8 9 h b 虹 江南大学硕士学位论文 4 1 引言 第四章冬虫夏草菌丝体有效成分测定 冬虫夏草是一种药用真菌，由冬虫夏草菌寄生在虫草蝙蝠蛾幼虫上所形成的子座与幼虫 僵体干燥而得，是我国的一种名贵中药材，素与人参、鹿茸齐名，具有补肺益肾之功效，亦 是一种极理想的温性滋补剂。经过深层发酵所产生的冬虫夏草菌丝体中含有许多有效成份， 如甘露醇有抗自由基、抗氧化的作用；另外还含有虫草多糖、维生素、氨基酸、s o d 及一些 重要的无机元素等等，因此对这些成份的测定具有重要意义，能直接指导在治疗过程中的临 床应用。 4 2 材料与方法 4 2 1 供试材料 菌株经液体培养8 4 h 的发酵液。 4 2 2 主要试剂 高碘酸钾 生化试剂 l 一鼠李糖生化试剂 醋酸铵生化试剂 冰醋酸 分析纯 乙醇分析纯 盐酸分析纯 乙酰丙酮 分析纯 甲醇分析纯 甲醇色谱纯 乙腈 色谱纯 w s t - s o d 酶试剂盒 鸟苷、尿昔 标准品 金水宝胶囊、百令胶囊 中国医药集团上海化学试剂公司 上海化学试剂二厂 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 江苏汉邦科技有限公司 江苏汉邦科技有限公司 日本同仁化学研究所 s i g m a 公司 购于药店 第四章冬虫夏草茵丝体有效成分测定 4 2 3 主要仪器设备 安捷伦液相色谱仪：美国a g i l e m 公司 其它设备同第二章。 4 2 4 实验方法 4 2 4 1 腺苷含量测定 1 测定方法： i p l c ，色谱条件同第二章。 2 含量计算方法：样品有效成分含量( ) = 4 2 4 2 甘露酵样品制各 样品峰面积核苷物质标准品浓度 标准品蜂面积样品浓度 菌丝体6 0 烘干，伽适量去离子水，超声波破碎1 5 m i n ，离心，取上清液待测。 4 2 4 3 甘露醇含量浸4 定 比色法【5 9 】，以甘露醇作为标准品。 4 2 4 4 氨基酸含量分析 1 色谱分析条件 色谱条件色谱柱：4 o 1 2 5 m m c l 8 ；柱温：4 0 ；流速：1 o m i n ；波长：3 3 8 姗、 2 6 2 n r n ( p r o ) ；流动相：( a ) 2 0 m m o l 醋酸钠溶液、( b ) 2 0 m m o l 醋酸钠溶液：甲醇：乙腈= 1 ： 2 ：2 ( v ，v ) ：检测器：紫外检测器 2 供试样品处理 称取样品2 0 0 m g ，放入特制的玻璃水解管中，加入6 nh c l 8 m l ，抽真空，待真空度达 到要求后维持1 0 m i n ，封口，1 1 0 水解2 4 h ，冷却。将水解液转移至5 0 m l 容量瓶中，用超 纯水洗涤水解管三次，定容。过滤，取滤液1 m l 于1 0 1 1 1 l 烧杯中，6 0 水浴，真空干燥器中 蒸干，根据样品的称重和蛋白质含量，定量加入一定体积的o 0 2 n h c l ，在空气中放置3 0 m i n ， 用高效液相色谱仪测定其氨基酸含量。 4 2 4 5s o d 酶酶活测定 1 样品制备；菌丝体6 0 烘干，加适量去离子水，超声波破碎1 5 m 址，离心，取上清液待测。 2 测定方法：s o da s s a y 硒t w s t 试剂盒。 3 工作液制备： w s t 工作液：吸取1 i i l l 的w s t 原液至1 9 l i 的b u 位rs o l u t i o n 中，即可。 酶工作液的制备：吸取1 5u l 酶液至2 5 m l 的d i l 嘶o n b u 髓r 中。即可。 4 实验操作：使用9 6 孔酶标板，在样品和b l a n k 2 孔中各加入2 0ul 的待测样品，同时在 一一兰壹垄兰翌主兰堡垒查 b l a l l l 【l 和b l a n k 3 各加2 0 i ll 的双蒸水；在各个孔中加入2 0 0 pl 的w s t 工作液；加2 0 ul 的d i l u n o nb u 彘r 到b l a n k 2 和b i a n k 3 中：用多道移液器加2 0 ul 的酶工作液到b l a n k l 和待 测样品中：3 7 保温2 0 m i i l 后读数。酶活以5 0 抑制率为一个酶活单位0 m l 。 4 3 结果与分析 4 3 1 腺苷含量测定 4 3 1 1 样品1 发酵培养基a 所得虫草腺苷提取液为样品1 。高压液相图谱中梯度洗脱液为甲醇，水 磷酸从3 9 7 ，o 0 5 至6 0 4 0 o 9 5 ，腺苷、尿苷、鸟苷标准品及样品l 进样，进样量5pl ，此 时腺苷保留时间为7 4 9 0 m i n ，尿苷的保留时间为7 8 0 6 m i n ，鸟苷的保留时间为9 7 0 9 m i n 。 结果如图4 1 所示 5 h l 一，- u - ，- - - - - - - r r - ，- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 一 1 61 j矗m a g _ i t om b 第四章冬虫夏草茵丝体有效成分测定 图4 - 1 腺苷标准品( a ) 、尿苷标准品( b ) 、鸟苷标准品( c ) 及样品l ( d ) 肿l c 图谱 盹4 - lc h r o m a t o g r a mo f a d e n o s ms t d ( a ) 嘶d i n es t d 嘞g 啪i n es t d ( c ) s 锄p l el ( d ) 表4 - 1 样品1h p l c 图谱分析结果 t a b 4 - 1h p l cs p e c t n l ma n a l y s i sr e s l l l to fs 锄p l el 峰号 保留时间核苷类物质 标准品浓度样品含量 ( m m ) ( u 卧i l l )( m 眺) 1 7 4 4 0 腺苷 4 8 1 8 5 l 2 7 8 0 5 尿苷7 6 3 2 6 3 3 9 6 2 9 鸟苷 5 3 2 3 2 2 从图4 一l 可以看出，发酵培养基a 菌丝体中核苷类物